Orientador: Márcio Garcia Ribeiro / Coorientador: José Paes de Almeida Nogueira Pinto / Banca: Antonio Carlos Paes / Banca: Hélio Langoni / Banca: Maria de Lourdes Ribeiro de Souza da Cunha / Banca: Nilson Roberti Benites / Resumo: O presente estudo avaliou a qualidade microbiológica, as características físicoquímicas e a presença de resíduos de antimicrobianos em leite de mulheres, vacas e cabras, bem como investigou a multirresistência bacteriana à antimicrobianos e a detecção de genes e produção de toxinas em linhagens de Staphylococcus spp. Foram colhidas 240 amostras de leite de mulheres encaminhadas ao Banco de Leite Humano (BLH) de Botucatu, SP, 200 amostras de leite de vacas com mastite e 200 de vacas sem mastite. Iguais quantidades de amostras de leite foram colhidas de cabras com e sem mastite. Dentre os tetos amostrados de vacas e cabras com mastite, 85,50% e 97,50% respectivamente acusaram mastite subclínica no CMT. A mastite clínica foi observada em 14,50% dos tetos de vacas e 2,50% dos tetos de cabras amostrados. A presença de micro-organismos em leite de vacas e cabras sem mastite foi verificada em cerca de 25,00% das amostras de leite testadas, alertando para a presença de animais portadores de patógenos no rebanho. A acidez dornic do leite de mulheres revelou que 95,42% encontraram-se dentro dos limites aceitáveis pela Rede Nacional de BLH. O aporte calórico do leite humano (LH) apresentou ampla variação nos teores de creme, gordura e valor energético. A acidez dornic do leite de vacas e cabras com e sem mastite apresentaram ampla variação indicando que outros fatores, além da contaminação microbiana do leite, podem interferir nos índices de acidez titulável. Staphylococcus spp. e Enterobacter spp. foram os isolados mais frequentes em amostras de LH. Streptococcus spp., Staphylococcus spp. e Corynebacterium bovis foram os micro-organismos mais comumente... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: The present study evaluated the microbiological quality, the characteristics physicist-chemistries and the presence of antimicrobials residues in milk of women, cows and goats, as well as investigated the bacterial multidrug resistance and the detection of genes and/or toxin production in Staphylococcus spp. strains. Was collected 240 milk samples from women referred to the Human Milk Bank (HMB) in Botucatu, 200 milk samples from cows with mastitis and 200 cows without mastitis. Equal amounts of milk samples were collected from goats with and without mastitis. Among the sampled cows and goats teats with mastitis, 85.50% and 97.50% respectively accused subclinical mastitis on CMT. Clinical mastitis was observed in 14.50% of cows teats and 2.50% of the sampled goats teats. The presence of microorganisms in milk from cows and goats without mastitis was found in about 25.00% of the milk samples tested, warning of the presence of pathogens from animals in the herd. Dornic acidity of woman's milk revealed that 95.42% were within acceptable limits by the National Network of HMB. Calorie intake of human milk (HM) showed wide variation in the amounts of cream, fat and energy value. Dornic acidity of cows and goats milk with and without mastitis showed wide variation indicating that other factors in addition to microbial contamination of milk can interfere with acidity indices. Staphylococcus spp. and Enterobacter spp. were the most frequently isolated in samples of human milk. Streptococcus spp., Staphylococcus spp. and Corynebacterium bovis were the microorganisms most commonly isolated in milk cows with and without mastitis. In milk samples from goats with and without... (Complete abstract click electronic access below) / Doutor

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Biologia Molecular, 2013. / Submitted by Albânia Cézar de Melo (albania@bce.unb.br) on 2013-07-05T13:19:18Z No. of bitstreams: 1 2013_HarryMoralesDuque.pdf: 4746729 bytes, checksum: ed7f8beb39d7b64ee26f813c8d6ac30a (MD5) / Approved for entry into archive by Guimaraes Jacqueline(jacqueline.guimaraes@bce.unb.br) on 2013-07-08T14:11:40Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2013_HarryMoralesDuque.pdf: 4746729 bytes, checksum: ed7f8beb39d7b64ee26f813c8d6ac30a (MD5) / Made available in DSpace on 2013-07-08T14:11:40Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2013_HarryMoralesDuque.pdf: 4746729 bytes, checksum: ed7f8beb39d7b64ee26f813c8d6ac30a (MD5) / As peçonhas escorpiônicas têm sido alvo de pesquisas por possuírem componentes com diversas atividades biológicas, as quais são responsáveis pelas alterações fisiológicas observadas no escorpionismo. Dentre esses componentes, estão as toxinas que agem em canais para potássio (KTxs), as quais têm sido caracterizadas e divididas em subfamílias segundo a sua estrutura primária. O objetivo desta pesquisa foi procurar novas KTxs na peçonha do escorpião colombiano Tityus sp. utilizando duas estratégias: a transcritômica e a proteômica. Uma biblioteca de cDNA foi construída, a partir da glândula de peçonha do escorpião e da sua peçonha foram isoladas e caracterizadas KTxs por cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC), espectrometria de massa do tipo MALDI-TOF/TOF e tipo ESI. Os peptídeos isolados foram testados por meio da técnica eletrofisiológica de patch clamp (whole cell). A partir da biblioteca de cDNA, foram caracterizadas cinco sequências precursoras que codificam prováveis KTx: três delas são pertencentes à subfamília α-KTx15, uma à subfamília α-KTx12 e uma à subfamília α-KTx18. Da peçonha, foram sequenciadas outras quatro KTxs com massas moleculares de 2430, 3590, 3640 e 4171 Da. Estas KTxs foram + capazes de diminuir a corrente de K em células do gânglio dorsal de ratos. A caracterização destas novas KTxs reflete o amplo espectro de expressão deste tipo de toxinas e as variadas estratégias moleculares utilizadas pelos escorpiões para produção de componentes neuroativos. ______________________________________________________________________________ ABSTRACT / The venom scorpions have been object of investigations by its different activities biological from components, which are responsible by the physiologic alterations observed in the scorpionism. Within these components, the toxins that target potassium channels (KTxs) are present, which have been characterized and divided according primary structure. The aim was search new KTxs in the Colombian scorpion Tityus sp. venom using two strategies: the transcriptomic and proteomic. The scorpion venom gland a cDNA library was constructed, and from venom, KTxs were characterized using high performance liquid chromatographic (HPLC), mass spectrometry MALDI-TOF/TOF and ESI type technical. The isolated peptides were tested with patch clamp (whole cell) electrophysiological technique. Four precursors likely KTxs were characterized: three α-KTx15, one α-KTx12 and one α-KTx18 like subfamilies. Additionally, four KTxs-like were sequenced from scorpion venom with molecular masses 2430, 3590, 3640 and 4171 Da. These slightly decreased levels potassium current on dorsal root ganglion. The characterization these new KTxs reveals a wide spectrum of KTxs-type toxins and one varied molecular strategy for neuroactive compounds production also.

Tese (doutorado)—Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Biologia Animal, 2010 / Submitted by Jaqueline Ferreira de Souza (jaquefs.braz@gmail.com) on 2011-04-13T01:50:07Z No. of bitstreams: 1 2010_KarlaGraziellaMoreira.pdf: 5870747 bytes, checksum: c510bba8a941297dcaa731f50f36d8a5 (MD5) / Approved for entry into archive by Jaqueline Ferreira de Souza(jaquefs.braz@gmail.com) on 2011-04-13T01:52:03Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2010_KarlaGraziellaMoreira.pdf: 5870747 bytes, checksum: c510bba8a941297dcaa731f50f36d8a5 (MD5) / Made available in DSpace on 2011-04-13T01:52:03Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2010_KarlaGraziellaMoreira.pdf: 5870747 bytes, checksum: c510bba8a941297dcaa731f50f36d8a5 (MD5) / As serpentes corais pertencentes ao gênero Micrurus possuem uma peçonha rica em proteínas e peptídeos biologicamente ativos. No entanto, estudos bioquímicos e farmacológicos com os componentes desses venenos são escassos devido à grande dificuldade de coleta, manutenção em cativeiro das serpentes e a pequena quantidade de veneno obtida em cada extração. O presente estudo descreve o isolamento, a determinação da massa molecular e o seqüenciamento completo e parcial de algumas moléculas biologicamente ativas presentes no veneno de Micrurus frontalis. Os componentes foram purificados após vários passos de fracionamento em cromatografia líquida de fase reversa. A pureza e as massas moleculares foram determinadas por espectrometria de massa de tipo MALDI-TOF e electrospray (ESI). As sequências de aminoácidos dos componentes nativos e dos peptídeos gerados após proteólise foram determinadas por degradação de Edman e sequenciamento De novo. Foram identificadas toxinas da família de três-dígitos, PLA2 e waprinas. As toxinas do tipo três dígitos receberam o nome de Frontoxinas (FTx) I a VI. As FTx I, II, III e VI possuem 4 ligações dissulfeto conservadas e são estruturalmente similares às ?-neurotoxinas de cadeia curta. Já as FTx IV e V apresentaram alta similaridade com ?-neurotoxinas de cadeia longa, com 10 resíduos de cisteína conservados. Quando aplicadas em junção neuromuscular de rã, as FTx II, III e IV reduziram a amplitude dos potenciais de ação em miniatura de maneira tempo- e concentração-dependente, sugerindo que essas FTxs bloqueiam os receptores nicotínicos de acetilcolina. As PLA2 foram identificadas após o sequenciamento de fragmentos, os quais apresentaram alta similaridade com PLA2 de elapídeos. Uma nova família de proteínas ofídicas, a waprina, foi encontrada na peçonha de M. frontalis. Esta toxina, pouco abundante no veneno, possui quatro ligações dissulfeto conservadas e recebeu o nome de Miwaprina, em virtude da alta identidade com waprina de Naja nigricollis. As FTx I, V, VI, as PLA2s e a Miwaprina, não foram submetidas à testes biológicos devido à quantidade insuficiente de amostra purificada. Este trabalho corresponde ao primeiro estudo de caracterização da estrutura primária e biológica de componentes isolados a partir do veneno de M. frontalis, abrindo perspectivas não só para a identificação dos demais componentes, como também do provável papel dos mesmos na captura de presas e nos envenenamentos. _____________________________________________________________________________ ABSTRACT / Coral snakes (Micrurus genus) venoms contain a wide spectrum of biologically active proteins and peptides. The major obstacle to study Micrurus venoms is the small amount of material that can be collected. Therefore, the biochemistry and pharmacology of components from coral snakes venoms are mostly unknown. In this study we describe the isolation, molecular mass determination, complete and partial amino acid sequencing of short and long -chain three-finger toxins, PLA2 and waprin isolated from Micrurus frontalis venom. Components were purified using multiple steps of RP-HPLC. Molecular masses were determined by MALDI-TOF and ESI ion-trap mass spectrometry. The amino acid sequences of toxins were determined by sequencing of overlapping proteolytic fragments by Edman degradation and by De novo sequencing. The three-finger toxins were named Frontoxin (FTx) I-VI. The amino acid sequences of FTx I, II, III and VI predict 4 conserved disulphide bonds and structural similarity to previously reported short-chain -neurotoxins. FTx IV and V each contained 10 conserved cysteines and share high similarity with long-chain - neurotoxins. At the frog neuromuscular junction FTx II, III and IV reduced miniature endplate potential amplitudes in a time-and concentration-dependent manner suggesting Frontoxins block nicotinic acetylcholine receptors. Fragments of isolated PLA2 were determined and share high similarity scores with PLA2 from other Elapids. The waprin member possesses four conserved disulfide bonds and showed high identity with waprin from Naja nigricollis venom. Because of the significant sequence similarity with WAPs, the molecule was named Miwaprin. Due the insufficient amount of purified FTx I, V, VI, PLA2s and Miwaprin, these toxins were not submitted to the biological assays. These are the first complete primary structure characterization of M. frontalis snake venom toxins.

Orientador: Helia Harumi Sato / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia de Alimentos / Made available in DSpace on 2018-07-23T08:34:02Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Soares_GiselleAlessandraMartins_M.pdf: 4381145 bytes, checksum: fcb9bc0ce7d561d086a301e6465ddc3d (MD5) Previous issue date: 1998 / Resumo: O objetivo deste trabalho foi caracterizar e purificar a toxina "killer" produzida pela linhagem de Saccharomyces cerevisiae Y500-4L, previamente selecionada de mosto de fermentação de usina de álcool e com alta capacidade fermentativa. A capacidade de leveduras produzirem toxina "killer", pode conferir uma vantagem seletiva sobre linhagens sensíveis crescendo em competição. Toma-se portanto, necessário a caracterização da toxina para o estudo da aplicação das linhagens com atividade "killer" em processos fermentativos. A linhagem "killer" de S. cerevisiae Y500-4L, mostrou alta atividade "killer" contra as leveduras Fleischmann e Itaiquara, e também contra as linhagens. A linhagem "killer" de S. cerevisiae Y500-4L, mostrou alta atividade "killer" contra as leveduras Fleischmann e Itaiquara, e também contra as linhagens"killer" padrões K2 (S. diastaticus NCYC 713), K4 (Candida glabrata NCYC 388) e Kll (Torulopsis glabrata ATCC 15126). E mostrou ser sensível as toxinasproduzidas pelas leveduras padrões "killer" K8 (Hansenula anomala NCYC 435), K9 (Hansenula mrakii NCYC 500), KI0 (Kluyveromyces drosophilarum NCYC 575) e Kll (Torulopsis glabrata ATCC 15126). A linhagem de S. cerevisiaeY500-4L, mostrou-se neutra às linhagens Kl (S. cerevisiae KL88), K2 (S. diastaticus NCYC 713), K3 (S. capensis NCYC 761), K4 (Candida glabrata NCYC 388), K5 (Debaryomyces vanrij NCYC 577), K6 (Kluyveromyces marxianus NCYC 587), K7 (Pichia membranaefaciens NCYC 333) e Hansenula sp Y66-1. A linhagem de S. cerevisiae Y500-4L, não apresentou plasmídio M-dsRNA e provavelmente o caráter genético responsável pelo fenótipo "killer" é codificado por genes cromossomais. Em ensaios para a perda do fenótipo, a linhagem S. cerevisiae Y500-4L apresentou maIOr resistência ao tratamento com cicloheximida e temperatura elevada (40°C) do que a levedura S. cerevisiae padrão "killer" K1. A produção máxima da toxina "killer" foi obtida em meio YEPD após 24 horas a 25°C em meio estático, coincidindo com o final da fase exponencial de crescimento. A toxina bruta de S. cerevisiae Y500-4L, apresentou maior atividade "killer" na faixa de pH 4,1-4,5 e temperatura de 22-25 °C; e maior estabilidade na faixa de pH 3,8-4,5 a -10°C. A toxina "killer" foi totalmente inativada após 1 hora de incubação a 40°C em pH 4,1 , em meio líquido. O peso molecular da toxina purificada foi estimado em 18 a 20 kDa, através de SDS-PAGE / Abstract: The objective of this research was to characterize and purify the killer toxin produced by Saccharomyces cerevisiae Y500-4L, a yeast selected for its high fermentative and killer capacities. The capacity to produce killer toxin can confer a selective advantage over more sensitive strains competing to grow in the same environment. Its is therefore important to characterize the toxin in order to apply killer strains in fermentative process. The killer yeast S. cerevisiae Y500-4L showed considerable killer activity against the Fleischmann and Itaiquara comercial brands of yeasts and also against the standard killer yeast K2 (S. diastaticus NCYC 713), K4 (Candida glabrata NCYC 388) and K11 (Torulopsis glabrata ATCC 15126). However S. cerevisiae Y500-4L showed sensitivity to the killer toxin produced by the standard killer yeasts K8 (Hansenula anomala NCYC 435), K9 (Hansenula mrakii NCYC 500), K10 (Kluyveromyces drosophilarum NCYC 575) and K11 (Torulopsis glabrata ATCC 15126). The strain S. cerevisiae Y500-4L was resistant to the killer toxins produced by the yeast strains K1 (S. cerevisiae KL88), K2 (S. diastaticus NCYC 713), K3 (S. capensis NCYC 761), K4 (Candida glabrata NCYC 388), K5 (Debaryomyces vanrij NCYC 577), K6 (Kluyveromyces marxianus NCYC 587), K7 (Pichia membranaefaciens NCYC 333) andHansenula sp Y66-1. No M-dsRNA plasmid was detected in the S. cerevisiae Y500-4L strain, and these results suggest that the genetic basis of toxin production is encoded by chromosomal DNA. The strain S. cerevisiae Y500-4L was more resistante to cycloheximide and incubation at elevated temperatures (40°C) than the killer yeast S. cerevisiae K1. The maximum production of killer toxin in YEPD medium was obtained after 24 hours of incubation at 25°C, which coincided with the end of the exponentia1 growth phase. The killer toxin of S. cerevisiae showed greatest activity between pH 4.1 and 4.5 and between 22 and 25°C, and stability in the range from pH 3,8 to 4.5 at -10°C. The killer toxin was inativated by heating at 40°C for 1 h at pH 4.1. The mo1ecu1ar weight of the purified toxin was estimated at about 18 to 20 kDa by SDS-PAGE / Mestrado / Mestre em Ciência de Alimentos

Orientador: Lea Rodrigues-Simioni / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciencias Medicas / Made available in DSpace on 2018-08-12T14:03:09Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Galbiatti_Charlene_M.pdf: 3708573 bytes, checksum: eb349f7f5062bd08e487dc8ae3c13167 (MD5) Previous issue date: 2008 / Resumo: No presente trabalho foram estudados os efeitos neuromusculares da toxina Bmaj-9 isolada do veneno de Bothrops marajoensis no laboratório de química de proteínas da Unicamp. Esta toxina foi ensaiada: nas preparações biventer cervicis de pintainho, nervo frênico diafragma de camundongo e no músculo gastrocnêmio de camundongo. Em preparações de ave, a Bmaj-9 causou bloqueio neuromuscular completo irreversível nas concentrações de 5, 10 e 20 µg/mL, sem afetar as contraturas evocadas pela adição exógena de ACh (110 µM). Além disso mostrou-se pouco ativa na preparação nervo frênico diafragma de camundongo. A Bmaj -9 não interferiu na resposta muscular a estímulos elétricos direto em preparações de biventer cervicis de pintainho previamente curarizadas. Ensaios bioquímicos mostraram que a Bmaj-9 exibiu uma pronunciada atividade fosfolipásica quando comparada a do veneno bruto. Assim, submetendo-se preparações incubadas com a toxina a baixa temperatura (22 °C), observou-se a ausência do seu característico efeito bloqueador neuromuscular. A análise histológica in vitro mostrou que esta fração em baixas concentrações não causou alteração morfológica significativa embora tenha determinado um leve aumento na liberação da enzima creatinoquinase. Em altas concentrações, no entanto, foi observado algum dano muscular na região periférica do músculo. In vivo, a Bmaj-9 causou uma discreta alteração morfológica e também um leve aumento nos níveis de CK após injeção intramuscular, mostrando uma correlação positiva entre os efeitos dos parâmetros estudados - lesão muscular e liberação de CK, esses dados, em nada se comparam aos efeitos de venenos ou toxinas tipicamente botrópicas. O registro do PM mostrou que a Bmaj-9 (10 µg/mL) não produziu despolarização da membrana muscular, e a medida do conteúdo e do tamanho quânticos, em preparação nervo frênico-diafragma de camundongo, mostrou que houve um leve aumento nos valores do conteúdo quânticos após 15 minutos de incubação. Após 60 minutos de incubação, o efeito da Bmaj-9 sobre os valores do conteúdo e tamanho quânticos foram, respectivamente: 70,5 ± 11 e 0,21 ± 0,06 mV. Estes não foram significativamente diferentes quando comparados com os valores controle (68,0 ± 8,9 e 0,17 ± 0,04 mV). Estes resultados sugerem que o bloqueio da transmissão neuromuscular, causado por esta toxina em baixas concentrações, seja muito provavelmente devido a uma ação pré-sináptica, resultado de sua interação com a membrana do terminal nervoso motor. / Abstract: In the present work, the neuromuscular effects of the toxin Bmaj-9 isolated from the venom of Bothrops marajoensis in the laboratory of chemistry of proteins at Unicamp were studied. This toxin was assayed in biventer cervicis preparations of little chicken, phrenic diaphragm nerve of mice and in gastrocnemius muscles of mice. In birds preparation, Bmaj-9 caused irreversible complete neuromuscular blockade in the concentrations of 5, 10 and 20 µg/mL not affecting the contractures caused by the exogenous addition of Ach (110 µM). Moreover, Bmaj-9 was not very active in the phrenic diaphragm preparation of mice. It has not interfered in the muscular response to direct electrical stimuli in biventer cervicis preparations of little chicken previously curarized. Biochemical assays showed that Bmaj-9 exhibited pronounced phospholipase activity when compared to crude venom. Thus, when preparations incubated with the toxin were submitted to low temperatures (22°C), the absence of the characteristic neuromuscular blocking effect of the fraction was observed. The histological analysis in vitro showed that even having determined a low increase on the release of the creatino-kinase enzyme, low concentrations of this fraction did not cause significant morphological alteration. Nevertheless, in high concentrations some muscular damages in the peripheral region of the muscle were observed. In vivo, Bmaj-9 caused a slight morphological alteration and also a discrete increase on the CK levels after intramuscular injection, showing a positive correlation among the effects of the parameters studies - muscular lesion and CK release. These data obtained with Bmaj-9 are extremely inferior to the ones obtained with bothropic venoms or toxins. The registration of the resting membrane potential showed that Bmaj-9 (10 µg/mL) did not produce depolarization of the muscular membrane and the measurement of the content and quantum size, in phrenic diaphragm preparation of mice, showed that a slight increase on the quantum amount was detected after 15 minutes of incubation. After 60 minutes of incubation, the effect of Bmaj-9 over the content and quantum size values was 70.5 ± 11 and 0.21 ± 0.06 mV, respectively; these values were not significantly different when compared to control values (68.0 ± 8.9 and 0.17 ± 0.04 mV). These values suggest that the blockade of the neuromuscular transmission caused by this toxin in low concentrations is probably due to a pre-synaptic action resulting from the interaction of the toxin with the membrane of the motor nerve terminal. / Mestrado / Mestre em Farmacologia

O desenvolvimento de biossensores é um tema de pesquisa bastante promissor, uma vez que permite monitorar diversas classes de substâncias, que muitas vezes apresentam grande interesse nas mais diversas áreas da ciência. Biossensores são pequenos dispositivos que utilizam componentes biológicos como elementos de reconhecimento, ligados a um sistema dedetecção, transdução e amplificação do sinal gerado na reação com o analito-alvo. Podem ser utilizados diversos elementos, sendo os principais, atualmente, aqueles baseados em aptâmeros e nanomateriais, por sua alta especificidade e sensibilidade. Seu potencial de utilização varia desde a detecção e tratamento de doenças ou a medição de componentes nos fluidos biológicos, até o monitoramento ambiental e prevenção de contaminação e bioterrorismo. Neste projeto foi desenvolvido um biossensor eletroquímico cujo objetivo é identificar toxinas inoculadas em pacientes que sofreram acidentes com animais peçonhentos. Foram utilizados os anticorpos/imuniglobulinas comerciais e a peçonha bruta de jararaca (Bothrops) para fazer o estudo/desenvolvimento do biossensor. Neste trabalho foram apresentados os resultados da imobilização dos anticorpos (imunoglobulinas) sobre o eletrodo de trabalho, bem como sua resposta eletroquímica utilizando voltametria cíclica. As soluções utilizadas foram de NaCl 0,9% e tampão fosfato (0,1 mol.L-1) com pH=7,4 por ser bem próximo ao pH fisiológico, pois, posteriormente quer se investigar em plasma sanguíneo. Os voltamogramas cíclicos e a microscopia eletrônica de varredura mostraram a diferença do eletrodo com e sem a imobilização das imunoglobulinas, evidenciando que o biossensor é eficaz para o sistema analisado, sendo promissor aos estudos. Com o biossensor construído, foi investigada a resposta eletroquímica relativa à interação antígeno-anticorpo (veneno-soro) para analisar a interação específica entre eles, sendo o resultado positivamente o esperado. / The development of biosensors is a research topic very promising, since it allows you to monitor various classes of substances, which often exhibit great interest in several areas of science. Biosensors are small devices that use biological recognition elements and components, bound to a selfAdetecting system, transduction and amplification of the signal generated in the reaction with the target analyte it. Various elements, the main currently those based on aptamers and nanomaterials for their high specificity and sensitivity can be used. Their potential use varies from the detection and treatment of diseases or measurement of components in biological fluids to the environmental monitoring and contamination prevention and bioterrorism. In this project we developed an electrochemical biosensor whose objetico is inoculated identify toxins in patients who have suffered accidents with poisonous animals. Antibodies / commercial imuniglobulinas and the crude venom of pit viper (Bothrops) were used to study / development of the biosensor. In this work the results of immobilization of antibodies (immunoglobulins) on the working electrode and its electrochemical response using cyclic voltammetry were presented. The solutions used were 0.9% NaCl and phosphate buffer (0.1 mol L-1) of pH = 7.4 to be close to physiological pH and therefore further investigated whether in blood plasma. Cyclic voltammetry and scanning electron microscopy showed the difference of the electrode with and without immobilization of immunoglobulins, indicating that the biosensor is effective for the system analyzed, and promising to studies. With the biosensor constructed, we investigated the electrochemical response on the antigen-antibody (venom antiserum) interaction to analyze the specific interaction between them, the result being positively expected.

Orientador: Brenda Paula Figueiredo de Almeida Gomes / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Odontologia de Piracicaba / Made available in DSpace on 2018-08-22T13:34:38Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Duque_ThaisMageste_M.pdf: 4524163 bytes, checksum: caf90cf8c083cc156cb48692e4b59821 (MD5) Previous issue date: 2013 / Resumo: A doença periodontal crônica atinge as estruturas de suporte dos dentes e é uma das causas mais importantes da perda dos dentes em adultos. Essa doença de longa duração que não regride com a terapia, já pode ter causado uma alteração irreversível na polpa, mesmo quando clinicamente, responde de forma positiva aos testes de sensibilidade pulpar. Os lipopolissacarideos (LPS) presente nas paredes das bactérias Gram negativas e citocinas pró inflamatórias funcionam como fatores estimulantes para a resposta imune, causando destruição óssea e exacerbando o processo inflamatório. Assim, o objetivo do presente estudo foi avaliar a influência do tratamento endodôntico em pacientes com doença periodontal crônica, através da análise microbiológica por pcr, quantificação de endotoxinas e monitoramento de citocinas pró inflamatórias em bolsas periodontais e canais radiculares. Foram selecionados 15 dentes com envolvimento periodontal crônico e sensibilidade pulpar positiva. Após o preparo químico mecânico (PQM), os dentes foram divididos em três grupos: G1- sessão única (n=5); GII - Ca(OH)2 associado à clorexidina gel 2% (CHX-gel) (n=5); GIII - Ca(OH)2 + Solução salina (SS). Amostras foram coletadas em três diferentes momentos da terapia endodôntica: inicial, após PQM e após medicação intracanal (MIC) por 30 dias, através de cones de papéis apirogênicos/estéreis. Os microrganismos foram identificados através da técnica molecular do PCR simples (16S rDNA) com o uso de primers específicos para Fusobacterium nucleatum, Prevotella intermédia, complexo vermelho (Porphyromonas gingivalis, Tannerella forsythia e Treponema denticola), Gemella morbillorum e Parvimonas micra. Para quantificação de endotoxina foi realizado o teste Lisado de Amebócito Limulus (LAL) e, para a quantificação de citocinas IL1 ?, IL1 ?, TNF ? e PGE2, foi utilizado o ensaio imunoenzimático ELISA. Os resultados mostraram que após 1 ano, dos 15 dentes tratados, 5 foram extraídos. Os outros 10 dentes apresentaram melhora no quadro clínico relacionada à profundidade de sondagem e mobilidade. Nas bolsas periodontais iniciais, pelo menos um dos microrganismos do complexo vermelho estiveram presentes em 12/15 amostras e os 3 juntos estiveram presentes em 6/15. Amostras do canal inicial mostraram a presença de Parvimonas micra e Fusobaterium nucleatum detectadas em 80% dos casos. Não houve associação entre as bactérias encontradas inicialmente nas bolsas e nos canais radiculares. Após o PQM e uso de MIC por 30 dias, houve redução do conteúdo microbiano em ambos os sítios. A concentração de endotoxinas nas bolsas periodontais iniciais foram altas (192,81 EU/mL), mas após o PQM, uma redução (19,65 EU/mL) significativamente estatística foi observada. Os canais radiculares apresentaram concentrações de endotoxinas quase nulas (0,1 EU/mL), sendo compatível com o estado pulpar e assim se manteve durante as outras coletas. Avaliando as medicações testadas, a redução de LPS nas bolsas apresentou melhores resultados com o uso do Ca(OH)2 associado à solução salina (p< 0,05). Houve redução de todas as citocinas pró inflamatórias, quando comparadas às coletas iniciais e após o uso da medicação das bolsas e dos canais, sendo esta estatisticamente significativa em relação a IL1? e TNF?. Não houve correlação positiva entre citocinas e endotoxinas nas bolsas periodontais. Conclui-se que o complexo vermelho está presente na doença periodontal e que a presença de uma medicação intracanal diminui a concentração do LPS e de citocinas inflamátorias nos canais radiculares e bolsas periodontais / Abstract: The chronic periodontal disease affects the supporting structures of the teeth and is a major cause of tooth loss in adults. This long-term illness that does not regress with therapy, may have already caused an irreversible change in the pulp, even when clinically responds to pulp sensitivity tests. The lipopolysaccharide (LPS) present in the walls of gram negative bacteria and inflammatory cytokines act as factors for stimulating the immune response, causing bone destruction and increasing inflammation. The objective of this study was to evaluate the influence of endodontic treatment in patients with chronic periodontitis using microbiological analysis by pcr, endotoxin quantification and monitoring of inflammatory cytokines in periodontal pockets and root canals. Samples were taken from 15 teeth with chronic periodontal involvement and positive pulp sensitivity was selected. After chemical mechanical preparation (MCP), the teeth were divided into three groups: G1- one visit (n = 5), GII - Ca(OH)2 associated with chlorhexidine gel 2% (CHX-gel) (n = 5) ; GIII - Ca(OH)2 + saline solution (SS). Samples were collected at three different times in endodontic therapy: initial, after MCP and after intracanal medication (ICM) for 30 days, through paper cones apirogênics / sterile. The microorganisms were identified by PCR simple molecular technique (16S rDNA) by using specific primers for Fusobacterium nucleatum, Prevotella intermédia, red complex (Porphyromonas gingivalis, Treponema denticola and Tannerella forsythia), and Parvimonas micras. For quantification of endotoxin was performed the Limulus Amebocyte Lysate (LAL) test and for the quantification of cytokines IL-1 ?, IL-1 ?, TNF ? and PGE2 was used ELISA immunoenzymatic assay. The results showed that after 1 year, 15 of the treated teeth, 5 were extracted. The other 10 teeth showed improvement related to probing depth and mobility. In the initial periodontal pockets, at least one of the microorganisms of the red complex were present in 12/15 samples and 3 together were present in 6/15. Canals samples showed the presence of Parvimonas micra and Fusobaterium nucleatum detected in 80% of cases. There was no association between the bacteria found in the pockets and root canals. After the CMP and use of ICM for 30 days, there was reduction of microbial content in both places. The initial endotoxin concentration in periodontal pockets were high (192.81 EU / ml), but after the CMP the reduction (19.65 EU / ml) was statistically significantly observed. Root canals showed low concentrations of endotoxin (0.1 EU / mL), being compatible with state of the pulp and maintained for other samples. Accordin the tested medications, reduction of LPS in the pockets showed better results with the use of Ca(OH)2 associated to saline solution (p <0.05). There was a reduction of all inflammatory cytokines when compared to the initial samples and after use of the dressing in pocktes and canals, being statistically significant in relation to IL1? and TNFa. There was no positive correlation between endotoxin and cytokines in periodontal pockets. In conclusion the red complex is present in the periodontal disease and that the presence of dressing decreases the concentration of inflammatory cytokines and LPS in root canals and periodontal pockets / Mestrado / Endodontia / Mestra em Clínica Odontológica

Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro Tecnológico, Programa de Pós-Graduação em Engenharia Química, Florianópolis, 2015. / Made available in DSpace on 2016-05-24T17:43:23Z (GMT). No. of bitstreams: 1 338959.pdf: 2630801 bytes, checksum: 1fe313f811f3f373047ae5985be6a34f (MD5) Previous issue date: 2015 / As abelhas são conhecidas por suas ferroadas e produção melífera, mas raramente são reconhecidas por uma determinada proteína benevolente em seu veneno chamada melitina. A melitina é um peptídeo hemolítico antimicrobiano amplamente conhecido pelos seus efeitos terapêuticos. O interesse nas propriedades medicinais, especialmente na propriedade anticancerígena da melitina, tem aumentado consideravelmente nos últimos anos. Porém, visto que alguns dos constituintes do veneno de abelha podem apresentar ação deletéria, decorrente do seu potencial alergênico, faz-se necessária a obtenção de melitina com elevado grau de pureza para eficiente aplicação na área farmacêutica. O presente trabalho teve o objetivo principal de desenvolver um processo para obtenção de melitina em escala analítica visando a aplicação deste peptídeo em formulações farmacêuticas, produzindo, desta forma, produtos com elevada tecnologia e valor agregado. A utilização de técnicas robustas, como ultracentrifugação e filtração, permitiu eliminar a maioria dos componentes presentes no veneno, contendo, ao final, somente biomoléculas com propriedades físico-químicas semelhantes à melitina. A utilização destas técnicas, em conjunto com RP-HPLC, permitiu obter melitina com um alto grau de pureza em escala analítica. Dessa forma, foi elaborado um protocolo de purificação da melitina, alcançando-se uma pureza estimada maior que 85 %. A análise econômica do processo de purificação da melitina demonstrou a viabilidade econômica na implantação desta tecnologia. O menor custo específico ocorre com a ampliação da escala a partir de 100 vezes a escala analítica, no qual o custo encontrado, nas condições operacionais propostas, é inferior ao aplicado atualmente. Ainda, é possível otimizar o processo visando melhor rendimento. A elaboração de um sistema de entrega controlada da melitina a partir de nanopartículas lipídicas sólidas foi proposta neste trabalho. Os resultados obtidos até o momento mostram que é possível obter NLSs estáveis de ácido esteárico com potencial aplicabilidade para encapsulação de melitina. Para a comprovação de eficiência farmacológica desse sistema proposto, uma avaliação adequada é necessária.<br> / Abstract : Honeybees are famous for their stings and sugary residues, yet seldom do they gain recognition for a certain benevolent protein in their venom called melittin. Melittin is an antimicrobial hemolytic peptide widely known for its therapeutic remedies. Interest in the medicinal properties, especially the anticancer property of melittin, has increased tremendously in recent years. However, since some of bee venom constituents can have deleterious effects, because of its allergenic potential, it is necessary to obtain melittin with high purity for its effective application in the pharmaceutical field. This study had the main objective to develop a process for obtaining melittin in analytical scale aiming the pharmaceutical application of this peptide, producing thus products with high technology and added value. The use of robust techniques such as ultracentrifugation and filtration allowed to eliminate most of the components present in the venom, remaining in the sample after these steps, only biomolecules with similar features to melittin. The use of these techniques in conjunction with RP-HPLC allowed obtaining melittin with a high degree of purity on an analytical scale. Thus, we designed a purification protocol for melittin, achieving an estimated purity greater than 85 %. The economic analysis of the melittin purification process showed the economic viability of the implementation of this technology. The lower specific costs occur with the scale-up from 100 times the analytical scale, in which the costs found within the operating conditions proposed are lower than those currently marketed. It is still possible to optimize the process to better performance. The development of a delivery vehicle of melittin based on solid lipid nanoparticles was proposed in this paper. The results obtained so far show that it is possible to obtain stable NLSs of stearic acid with potential applicability for encapsulation of melittin. For demonstrating pharmacological effectiveness of this proposed system, more tests are needed.

Orientadores: Lea Rodrigues Simioni, Maria Alice da Cruz-Holing / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas / Made available in DSpace on 2018-08-04T01:17:53Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Moura_PriscilaRandazzode_M.pdf: 4111122 bytes, checksum: 4edbe32ec7d6b0ac303c94e564c0a4e6 (MD5) Previous issue date: 2004 / Resumo: Os efeitos miotóxicos dos venenos botrópicos são inquestionáveis pela exuberante manifestação clínica e são extensivamente relatados na literatura. Já os efeitos neurotóxicos têm sido descritos sob condições in vitro, em preparações neuromusculares, com pouca ou nenhuma evidência clínica. O objetivo do presente trabalho foi o de contribuir para o conhecimento sobre a farmacologia da bothropstoxina-I (BthTX-I), o principal componente do veneno de Bothrops jararacussu, em suas dimensões pré- e pós-sinápticas. Esta toxina reproduz os mesmos efeitos in vitro do veneno bruto, quais sejam, bloqueio neuromuscular e mionecrose. Como ferramenta farmacológica utilizou-se o íon manganês ('Mn POT.2+¿), capaz de prevenir o efeito bloqueado r da BthTX-I, mas não ainda investigado o seu efeito protetor sobre a miotoxicidade da BthTX-I. Para isso foram utilizadas as preparações nervo frênico-diafragma (NFD) e extensor digitorum longus (EDL) de camundongos. A neurotoxicidade foi avaliada pelas técnicas mio gráfica e eletrofisiológica, enquanto a miotoxicidade pelas técnicas histológica (determinação da porcentagem das fibras lesadas e determinação da área transversal das fibras musculares) e bioquímica (determinação da creatinoquinase, CK). ... Observação: O resumo, na íntegra, poderá ser visualizado no texto completo da tese digital / Abstract: Various Bothrops snake venoms produce neuromuscular blockade in avian and mammalian nerve-muscle preparations in vitro that is partly mediated by myotoxins. Bothropstoxin-I (BthTX-I) is the principal myotoxin present in Bothrops jararacussu venom and contributes to the neuromuscular blockade and myonecrosis caused by the venom in vitro. In this work, we investigated the ability of manganese (Mn2+) to prevent the neuromuscular blockade caused by BthTX-I in mouse phrenic nerve-diaphragm (pND) and extensor digitorum longus (EDL) preparations. Conventional electrophysiological and myographic techniques were used to study the neurotoxicity while myotoxicity was assessed based on the release of creatine kinase (CK) and on histological analysis. ... Note: The complete abstract is available with the full electronic digital thesis or dissertations / Mestrado / Farmacologia / Mestre em Farmacologia

Orientador: Sergio Marangoni / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-07-20T13:19:43Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Toyama_MarcosHikari_M.pdf: 3761928 bytes, checksum: 04541e5732f168a5aa6a88fd209fc89a (MD5) Previous issue date: 1995 / Resumo: As neurotoxinas escorpiônicas têm sido classificadas em duas grandes categorias: as a -toxinas (encontradas em espécies do Velho Mundo) que retardam a inativação dos canais de sódio e as ß-toxinas (provenientes de espécies do Novo Mundo), que induzem um estado persistente de despolarização das membranas de células excitáveis (neurônios). A TsTX-V foi obtida por cromatografia de troca iônica em CM-Cellulose 52 e teve seu grau de pureza confirmado por cromatografia de fase reversa em HPLC e por eletroforese em PAGE-SDS Tricina. A estrutura primária da TsTX-V foi determinada por degradação automática de Edman, a partir da proteína pura carboximetilada e reduzida e de seus digestos peptídicos obtidos por Tripsina e Protease V8. Sua seqüência, 64 resíduos de aminoácidos e uma massa molecular, calculada através da somatória dos resíduos, de 7,2 kDa, contendo oito resíduos de cisteina. Testes eletrofisiológicos realizados em nervo vago de coelho mostraram que a toxina TsTX-V (0,03µg/mL) induz um prolongamento do potencial de ação das fibras B do nervo vago devido ao retardo na inativação do canal de Na+. A 0,3µg/mL ela induz também uma despolarização do nervo. Esses efeitos são irreversíveis e podem ser abolido por tetrodoxina (200 - 500 mM), mas não por um aumento da concentração de potássio no meio externo. Estes resultados demosntraram que TsTX-V é uma a-toxina (Arantes et aI., 1994). Em ilhotas de Langerhans, isoladas de ratos, a TsTX-V (a-toxina) potencializou a secreção de insulina, na ausência ou na presença de 8,3 mM de glicose. A Ts-g potencializou a secreção de insulina por 8,3 mM de glicose. A toxina TsTX-V (5,6 mg/ ml) induziu um aumento do efluxo de 86Rb+ cerca de 2,0 a 2,4 vezes em relação ao induzido por 8,3 mM de glicose em ilhotas de Langerhans. Este efeito foi persistente e lentamente reversível. Efeito similar foi observado em presença de (110 mM) de veratridina, substância que retarda a inativação de canais de sódio sensíveis a voltagem. Estes dados sugerem que a toxina TsTX-V prolonga o período de despolarização das células B, ativando indiretamente os canais de K+ dependente de voltagem, mantendo, desta forma, a permeabilidade da membrana ao K+, medida indiretamente pelo efluxo de 86Rb+, mateve-se elevada.. A estrutura tridimensional da toxina TsTX-V foi determinada através de modelagem molecular, utilizando-se para isso os dados cristalográficos da toxina CsE-V3, cujas coordenadas estão depositadas em banco de dados, e da toxina AaH II. De um modo geral, ela tem as feições típicas das neurotoxinas de escorpiões, como a formação em a.-hélice e as três folhas b antiparalelas, mas diferindo quanto à disposição das alças J e B, e da região N-terminal e Carboxi terminal, quando comparados com a toxina do Androctonus autralis Hector (AaH II). O dendograma obtido através das similaridades e coincidências de resíduos e do alinhamento das estruturas secundárias mostra que as toxinas do Novo Mundo podem ser subdivididas em três subgrupos: duas (beta) b e uma (alfa) a / Abstract: Antimamals scorpion neurotoxins are classified in two groups: a-toxins (from the Old World species) that induce a slowing down of the inactivation of the sodium channel, and b-toxins (from the New World species), that induce a persistant depolarization of excitable cell membranes. TsTX-V was obtained by ion-exchange chromatography on CM-Cellulose 52 and its of purity was confirmed by reverse phase chromatography and Tricine SDS-PAGE. Primary structure of TsTX-V has been determined by automatic Edman degradation from the reduced and carboxymethyled protein and digestic peptide obtained by Protease V8 and Tripsin. Its sequence shows, a total of 64 aminoacid residues, a calculated molecular weight of 7200.and eight cysteine residues. Electrophysiological assay performed on the vagus nerve of rabit, showed that TsTX-V (0,03 ).mg/mL) induce a persistent depolarized state during long time on B fibers, this effect was abolished by addition of tetrodoxin (200 - 500 mM) but not abolished by high externaI potassium depolarization. Those effects characterized TsTX-V as a-toxins.(Arantes et al, 1994) On isolated rat islets of Langerhans TsTX-V induced insulin secretion in both absecence or presence os glucose (8,3 mM)presence of glucose 8,3 mM, but in absence any effect was observed. However, Tsg (b toxin) potentiated insulin secretion in the presence of glucose 8,3 mM. TsTX-V (5,6 mg/mL) induced a 86Rb+ outflow increase, 2,0~2,4 fold the rate of the marker outflow in the presence of 8,3 mM glucose. This effect was persistent and slowly reversible, showing similarity to that induced by 100 mM veratridine, an agent that prolong the open period of Na+ channel, delaying their inactivation. This suggested that, by extending the depolarized period, TsTX-V indirectly affect b cells voltage dependent K+ channels, thus increasing K+ permeability. Homology studies performed with TsTX-V and other scorpion neurotoxins revealed common folding among them, for example the presence of highly conserved regions and residues and the presence of eight cystein residues at same locations. The three-dimensional structure of TsTX-V was determined by modeling from crystalographic determined structure of CsE-V3 and AaH II. TsTX-V has conserved a and b structure present in other scorpion neurotoxins. Basically its three-dimensional structure is similar to CsE-V3 and AaH lI, but differs in the folding patterns in the J and B loops. Computer simulation performed on the three-dimensional structure obtained by molecular modeling, shows that the C-terminal and N-terminal loops have a great degree of freedom. On the other hand J and B loops did not show great diferences in its leght spatial disposition whem compared with atoxic fraction TsTX-VI or Ts-g (b toxins) / Mestrado / Bioquimica / Mestre em Ciências Biológicas