A pré-eclâmpsia (PE) é causa importante de mortalidade fetal e materna. Existem evidências que a resistência à insulina esteja implicada em sua fisiopatologia. A via Akt/PKB (Akt/ Proteína quinase B) é estimulada pela insulina e exerce várias funções vitais como crescimento, sobrevivência e metabolismo celular. O objetivo do trabalho foi comparar a expressão da Akt/PKB em placentas de pacientes normais e com pré-eclâmpsia estimuladas com insulina. Foram utilizadas amostras de placenta de 12 pacientes normais e de 12 pacientes com PE foram coletadas, estimuladas com insulina e analisadas por Western blot para quantificação da expressão da proteína Akt/PKB basal e fosforilada em serina473. Como resultados, a estimulação das amostras com a insulina foi comprovada quando comparamos grupos estimulados (1,14 ± 0,10) e não estimulados (0,91 ± 0,08), P< 0,001. A atividade da via da Akt/PKB fosforilada em serina473 foi semelhante entre placentas de mulheres normais (1,26 ± 0,16) e com PE (1,01 ± 0,11), P = 0,237. Concluímos que não há diferença de fosforilação na via da Akt/PKB, após estimulação com insulina, em placentas de pacientes com PE e normais. Contudo, não podemos descartar alterações desta via de sinalização na PE sem analisarmos os substratos da Akt/PKB quando estimulados. / Preeclampsia (PE) is an important cause of fetal and maternal mortality around the world and there are evidences that insulin resistance has been implicated in the pathophysiology of preeclampsia. Akt/PKB pathway is stimulated by insulin and performs several vital functions as growth, survival and cellular metabolism. Objective: to investigate stimulates expression of Akt/PKB pathway in the placenta, of normal and preeclampsia parturient. Method: samples were collected from 12 normal patients and 12 PE patients, stimulate and analyzed by Western blot to quantify the proteins expression in signaling of Akt/PKB. Results: stimulation of insulin samples was confirmed when comparing stimulated groups (1.14 ± 0.10) and non-stimulated (0.91 ± 0.08), P <0.001. The Akt/PKB phosphor (Ser473) was not different in placenta of the normal (1.26 ± 0.16) and PE (1.01 ± 0.11) groups, with P = 0.237. Conclusions: there was no difference of phosphorylation in Akt/PKB pathway, after stimulation with insulin, in placentas of normal and PE patients. However, we cannot discard effects in this signaling pathway as pathophysiology of PE, because it is still necessary to analyze the substrates stimulation of this pathway.

Glioblastoma (GB) é o tumor cerebral humano mais frequente e maligno. O prognóstico dos pacientes com GB permanece alarmante, principalmente devido à baixa eficácia das estratégias terapêuticas atuais além da natureza invasiva desse tipo de câncer. Uma característica de tumores sólidos é apresentar áreas hipóxicas. Microambientes hipóxicos contribuem para a progressão do câncer, resistência ao tratamento e ao prognóstico ruim da doença. Dessa forma, neste trabalho, desenvolvemos um modelo in vitro que se aproxima ao microambiente hipóxico tumoral in vivo. Nossos resultados sugerem que a privação de oxigênio (PO) em combinação com ausência de soro forneceu um ambiente favorável à desdiferenciação das células C6 em células tronco tumorais (CTT). A doxazosina (DOX), um antihipertensivo utilizado na clínica, apresenta efeitos antitumorais em diversos tipos de câncer. Assim, avaliamos o efeito antitumoral da doxazosina em linhagens de glioma de rato (C6) e humano (U138-MG) e a toxicidade do fármaco em culturas primárias de astrócitos e culturas organotípicas de hipocampo. A doxazosina induziu morte celular nas linhagens de glioma e apresentou baixa neurotoxicidade. Além disso, o fármaco inibiu a via da PI3K/Akt e ativou GSK-3β e p53, resultando em indução de apoptose e parada no ciclo celular na fase G0/G1. Considerando a importância da mitocôndria na plasticidade de células tumorais e a resistência ao tratamento apresentada pelos GB, nós analisamos os efeitos da DOX nas interações entre núcleo e mitocôndrias. A DOX induziu biogênese mitocondrial e apoptose nas células C6 e diminuiu secreção de TNF-α. Ao analisar a estrutura química da DOX, encontramos diversas características que indicam que ela possui autofluorescência. Dessa forma, caracterizamos a autofluorescência da DOX em diversos meios. Observamos que há um padrão de distribuição do fármaco nas células C6: ele se encontra ao redor do núcleo e parece estar vesiculado. A superexpressão do receptor do fator de crescimento epidermal (EGFR) está relacionada às formas mais malignas e resistentes de GBs. Portanto, analisamos se a ação antiglioma da DOX está envolvida com EGFR. O tratamento com DOX foi capaz de diminuir os níveis de p-EGFR. O co-tratamento de DOX e AG1478 (inibidor de receptores de tirosina cinase) diminuiu a fosforilação de EGFR e causou necrose. Em vista disso, nossos resultados sugerem que o mecanismo de ação da DOX envolve sinalização de EGFR. Por fim, nós avaliamos os efeitos da DOX livre e nanoencapsulada (DOX-NC) em modelos in vitro e in vivo de glioma. Demonstramos que a DOX-NC induziu morte celular em linhagem de glioma em concentrações 100 vezes menores do que as que utilizamos para a DOX na sua forma livre. Além disso, analisamos o efeito da DOX-NC em culturas organotípicas de hipocampo e, da mesma maneira que o observado com a DOX, a DOX-NC demonstrou baixa toxicidade e diminuiu a área tumoral in vivo, sendo seletiva para células cancerosas. Nesta tese, alteramos o microambiente in vitro de células de glioma, avaliamos os efeitos antitumorais da doxazosina em sua forma livre e nanoencapsulada. Além disso, utilizamos modelos de glioma in vitro e in vivo e em diversos parâmetros celulares, descrevemos a autofluorescência do fármaco e também utilizamos essa característica para avaliar a captação e a distribuição da doxazosina em células de glioma. Nossos resultados contribuíram para aproximar os modelos de estudo com o que ocorre em gliomas in vivo e para evidenciar o potencial terapêutico da doxazosina como um agente antiglioma com baixa toxicidade neural e sistêmica. / Glioblastoma (GB) is the most frequent and malignant human brain tumor. The prognosis of patients with GB remains dismal, mainly due to the low effectiveness of current therapeutic strategies and the invasive nature of this type of cancer. A characteristic of solid tumors is the presence of hypoxic areas. Hypoxic microenvironments contribute to cancer progression, resistance to treatment, and poor prognosis of the disease. Thus, we developed an in vitro model that approximates the hypoxic tumor microenvironment found in vivo. Our results suggest that OD in combination with absence of serum provided an environment favorable to the dedifferentiation of C6 cells in cancer stem cells. Doxazosin (DOX), an antihypertensive used in the clinic, has antitumor effects in several types of cancer. Thus, we evaluated the antitumor effect of DOX on rat (C6) and human (U138-MG) glioma cell lines and drug toxicity in primary astrocyte cultures and organotypic hippocampal cultures. DOX induced cell death in glioma lines and showed low neurotoxicity. In addition, the drug inhibited the PI3K/Akt pathway and activated GSK-3β and p53, resulting in induction of apoptosis and cell cycle arrest in the G0/G1 phase. Considering the importance of mitochondria in the plasticity of tumor cells and the resistance to treatment presented by glioblastomas, we analyzed the effects of DOX the interactions between nucleus and mitochondria. DOX induced mitochondrial biogenesis and apoptosis in C6 cells, and decreased TNF-α secretion. When analyzing the chemical structure doxazosin, we find several characteristics that indicate that it has autofluorescence. Thus, we characterized the autofluorescence of DOX in several media. We observed that there is a pattern of distribution of the drug in the cell: it is around the nucleus and appears to be vesiculated. Overexpression of the Epidermal Growth Factor Receptor (EGFR) is related to the more malignant and resistant forms of GBs. Therefore, we analyzed whether the antiglioma action of DOX is involved with EGFR. DOX treatment was able to decrease p-EGFR levels. Co-treatment of DOX and AG1478 (a receptor tyrosine kinase inhibitor) decreased EGFR phosphorylation and caused necrosis. Thus, our results suggest that the mechanism of action of doxazosin involves EGFR signaling. We evaluated the effects of free and nanoencapsulated doxazosin (DOX-NC) in in vitro and in vivo models of glioma. We demonstrated that nanoencapsulated doxazosin (DOX-NC) induced cell death in a glioma line at concentrations 100 times lower than those used for doxazosin in its free form. In addition, we analyzed the effect of DOX-NC on organotypic hippocampal cultures and, in the same way as observed with DOX, DOX-NC demonstrated low toxicity and decreased tumor area in vivo, being selective for cancer cells. In this dissertation, we altered the in vitro microenvironment of glioma cells, we evaluated the antitumor effects of doxazosin in its free and nanoencapsulated form. In addition, we used glioma models in vitro and in vivo and analyzed several cellular parameters, we described the autofluorescence of the drug and also used this characteristic to evaluate the uptake and distribution of doxazosin in glioma cells. Our results have contributed to approximate the study models with what occurs in gliomas in vivo and to evidence the therapeutic potential of doxazosin as an antiglioma agent with low neural and systemic toxicity.

Introdução. A Hiperplasia Prostática Benigna (HPB) é uma condição prevalente na senescência masculina, caracterizada pelo aumento não maligno das células do tecido epitelial e principalmente estromal da próstata. Já foi demonstrado que a ligação dos androgênios ao seu receptor (AR) tem papel vital para o desenvolvimento prostático, mantendo não só a função tecidual, mas também sua possível contribuição para a patogênese de doenças prostáticas. Alguns estudos têm sugerido que o aumento dos hormônios IGF e Insulina circulantes podem afetar direta ou indiretamente a sinalização molecular promovendo o crescimento prostático. Uma proteína importante, componente da via de sinalização dos receptores de Insulina e IGF, é a Akt/PKB. Esta proteína está relacionada com a regulação do metabolismo, apoptose e a proliferação celular. Entretanto, os eventos moleculares que levam a interação dos receptores Insulina e IGF com o Receptor de Androgênios (AR) ainda foram bem estabelecidos. Objetivos. O objetivo deste trabalho foi estabelecer uma técnica de estimulação pela insulina e IGF-I em tecido prostático e em células provenientes de pacientes com HPB, avaliar a fosforilação da Akt/PKB, e a fosforilação do AR. Materiais e Métodos. Participaram deste estudo 15 pacientes com HPB oriundos do Hospital de Clínicas de Porto Alegre para análise das proteínas Akt/PKB e AR. A análise proteica foi realizada a partir da técnica de western blot. Os protocolos de estudo e os termos de consentimentos foram aprovados pelo comitê de ética local e nacional. Resultados. Foram realizadas duas técnicas de estimulação, uma com insulina em fatias de tecido de HPB e outra com insulina e IGF-I em suspensão celular de HPB. Ocorreu um aumento na fosforilação da proteína Akt/PKB nas células de HPB estimuladas com insulina (P=0,0113) quando comparadas com a condição controle pelo tempo de 10 minutos. Foi visto um aumento na porcentagem da fosforilação do AR quando as células foram estimuladas com insulina. Conclusão. É possível avaliar a via de ativação da Akt/PKB em um modelo de células prostáticas derivadas de Hiperplasia Prostática Benigna sob estímulo da Insulina por 10 minutos. Neste modelo, também é possível avaliar a fosforilação do Receptor de Androgênios. A padronização da técnica de estimulação in vitro poderá ser útil para novas pesquisas. Estes achados podem vir a elucidar um possível mecanismo intracelular de interação entre a transdução do sinal de Insulina e IGF-I e a fosforilação do Receptor de Androgênios, e assim, possivelmente contribuir para o entendimento da proliferação celular na HPB. / Benign prostatic hyperplasia (BPH) is a prevalent disease characterized by high levels of prostate cell proliferation. The interaction of androgen hormone with its receptor (AR) has a central role in the development of prostate growth, maintaining the tissue function as the pathogenesis of the prostate disease. Increased levels of circulating insulin and IGF can directly and/or indirectly affect different signaling pathways and promote prostatic growth. The protein AKT/PKB, member of the insulin/IGF pathway, participates in metabolism, apoptosis and cell proliferation regulation. The molecular events related to the interaction of IGF-I and insulin receptor in BPH have not been defined yet. The aim of this study were to establish an in vitro protocol with insulin or IGF-I stimulation in prostatic tissue from BPH and to evaluate both Akt and AR phosphorylation. Samples were obtained from 15 BPH patients and the Akt and AR proteins were analyzed by western blot. Slices of prostatic tissues from BPH patients were stimulated with insulin. Fragmented and dissociated prostatic tissues were stimulated with insulin or IGF-I.BPH cells stimulated with insulin for 10 minutes showed higher percentage of AR and Akt phosphorylation in relation to control (P= 0.0113). These findings may suggest that insulin and IGF-I signaling pathways may contribute to distinct signals to common downstream components in response to both insulin and IGF-I for BPH development. Our study has established insulin or IGF-I stimulation of BPH cells and can contribute to elucidate a possible intracellular interaction mechanism of AR phosphorylation.

O aumento da longevidade da população mundial tem como consequência uma maior prevalência de doenças neurodegenerativas. A Doença de Alzheimer (DA) é a desordem neurodegenerativa mais prevalente e a principal causa de demência após os 60 anos. A DA caracteriza-se por um crescente declínio na função mental e memória do paciente. Esses sintomas são acompanhados pela presença de alterações estruturais no tecido cerebral: os emaranhados neurofibrilares constituídos pela proteína tau hiperfosforilada e as placas senis constituídas pelo peptídeo beta-amiloide (A ). O peptídeo A tem sido considerado o principal responsável pelos processos de disfunção sináptica, morte neuronal e consequente declínio cognitivo dos pacientes com DA. O cenário atual ao qual se enquadram nossos conhecimentos sobre a etiologia, fisiopatologia e terapêutica da DA ainda não permitem um entendimento completo e satisfatório sobre essa doença e seu tratamento. A curcumina, um polifenol de origem vegetal, tem atraído considerável interesse devido aos seus potenciais benefícios à saúde humana. Alguns estudos têm demonstrado que a curcumina possui propriedades antioxidantes, antiinflamatórias e anti-amiloidogênicas em modelos animais de DA. Entretanto, as bases moleculares para a sua neuroproteção ainda não estão totalmente esclarecidas. Neste trabalho, avaliamos diversos mecanismos que são modulados pela curcumina em modelos in vivo e in vitro de toxicidade induzida pelo peptídeo A 1-42. Inicialmente, demonstramos que o co-tratamento com curcumina reduziu a morte celular induzida pela exposição ao peptídeo A por 48 h em culturas organotípicas de hipocampo de ratos. Em paralelo, a curcumina preveniu a redução da proteína sinaptofisina, a geração de espécies reativas, a ativação astrocitária e microglial, bem como, a alteração na secreção de importantes mediadores inflamatórios. Além disso, o mecanismo envolvido com sua neuroproteção pode estar associado com a regulação da fosforilação da proteína -catenina e da modulação da via de sinalização PI3K, através da regulação dos substratos Akt e GSK-3 , visto que o uso do inibidor LY294002 bloqueou o efeito neuroprotetor da curcumina. Diante da intensa ativação astrocitária observada no primeiro capítulo, investigamos o efeito da curcumina na reatividade astrocitária em cultura primária de astrócitos expostos ao peptídeo A . Neste trabalho observamos que os mecanismos de proteção da curcumina envolvem a prevenção da ativação da proteína JNK e a regulação do perfil de sumoilação de astrócitos, visto que a superexpressão de SUMO-1 diminui a reatividade astrocitária induzida pelo peptídeo A . Além do efeito neuroprotetor contra a morte celular, a curcumina demonstrou ter efeitos benéficos na transmissão sináptica, evitando a diminuição da excitabilidade neuronal em fatias organotípicas de hipocampo de ratos expostas por 24 h ao peptídeo A e este efeito parece estar associado com a modulação das proteínas CaMKII e sinapsina I. Para a avaliação do efeito neuroprotetor da curcumina no modelo in vivo de toxicidade ao peptídeo A 1-42, devido a sua baixa biodisponibilidade, comparamos a eficiência de nanocápsulas de curcumina e curcumina livre na prevenção dos danos cognitivos induzidos pela injeção icv do peptídeo A . De modo interessante, observamos um significativo aumento do desempenho in vivo da curcumina nanoencapsulada, a qual apresentou efeitos similares ou melhores com uma dose 20 vezes menor do que a dose efetiva de curcumina livre. Os mecanismos de neuroproteção da curcumina neste modelo parecem envolver o fator neurotrófico BDNF e a via de sinalização PI3K/Akt. Juntos, nossos resultados não somente confirmam o potencial da curcumina no tratamento dos processos neurodegenerativos como também oferecem uma via efetiva para melhorar o efeito neuroprotetor da curcumina através da nanobiotecnologia. / The increased longevity of the population has resulted in a higher prevalence of neurodegenerative diseases. Alzheimer’s disease (AD) is the most common neurodegenerative disorder and the leading cause of dementia in persons over 60 years. The AD is characterized clinically by progressive impairments in cognition and memory. These clinical features are accompanied by the presence of structural changes in brain tissue: neurofibrillary tangles formed by hyperphosphorylated tau protein and amyloid plaques formed by amyloid beta-peptide (A ). A has been considered the main processes responsible for synaptic dysfunction, neuronal death and subsequent cognitive decline in patients with AD. The current scenario of our knowledge of the etiology, pathophysiology and therapy of AD does not allow a full and satisfactory understanding of this disease and its treatment. Curcumin, a naturally occurring polyphenol, has attracted considerable interest for its beneficial potentials for human health. Over the past decade, studies have been shown that curcumin is associated with antioxidant, anti-inflammatory and anti-amyloidogenic properties in models of AD; however, the molecular basis for its neuroprotection is not yet fully understood. In this study, we evaluated several mechanisms that are modulated by curcumin in in vitro and in vivo models of A 1-42-induced toxicity. Initially, we demonstrated that co-treatment with curcumin reduced the cell death induced by exposure to peptide A for 48 h in organotypic hippocampal slice cultures. In parallel, curcumin prevented the reduction of synaptophysin protein, generation of reactive species, astrocytic and microglial activation and the changes in the release of important inflammatory mediators. Furthermore, the mechanism involved in this neuroprotection may be associated with regulation of phosphorylation of -catenin protein and modulation of PI3K signaling pathway, by regulating the substrates Akt and GSK-3 , since the use of inhibitor LY294002 blocked the neuroprotective effect of curcumin. Given the intense astrocytic activation observed in the first study, we investigated the effect of curcumin on astrocytic reactivity in primary culture of astrocytes exposed to A 1-42. In this study we observed that the protective mechanisms of curcumin involve the prevention of JNK activation and regulation of SUMOylation profile of astrocytes, whereas overexpression of SUMO-1 reduces astrocyte reactivity induced by A . Besides the neuroprotective effect against cell death, curcumin shown to have beneficial effects in synaptic transmission, avoiding the reduction of neuronal excitability in organotypic hippocampal slices exposed for 24 h to A 1-42 and this effect could be associated with CaMKII and synapsin I modulation by curcumin. For evaluating the neuroprotective effect of curcumin in an in vivo model of A -induced toxicity, due to its poor bioavailability, we compared the efficiency of curcumin-loaded lipid-core nanocapsules and free curcumin in preventing cognitive impairments induced by icv injection of A 1- 42. Interestingly, we observed a significant increase in the in vivo performance of nanoencapsulated curcumin, which presented similar or better neuroprotective results in a dose 20-fold lower compared to the effective dose of free curcumin. The neuroprotective mechanisms of curcumin in this model appear to involve the neurotrophic factor BDNF and PI3K/Akt signaling pathway. Taken together, our results not only confirm the potential of curcumin in treating neurodegenerative processes but also offer an effective way to improve the neuroprotective efficiency of curcumin through nanobiotechnology.

A caracterização de vias de sinalização alteradas em células tumorais, e a validação de fármacos inibidores de transdução de sinal que interajam com as mesmas de modo a atuar como terapia principal ou adjuvante no tratamento de neoplasias sólidas e hematopoiéticas, é um campo de grande interesse em oncologia. A necessidade da caracterização de novos alvos moleculares advém da incidência considerável de recidivas, quadros de quimiorresistência e efeitos adversos associados ao tratamento com os agentes antitumorais clássicos. Nesta tese, desenvolvemos a hipótese de que o fator de transcrição NFκB poderia estar envolvido com processos de proliferação, antiapoptose e quimiorresistência em células neoplásicas, caracterizando-se como um potencial alvo para interferência farmacológica. Para isso, avaliamos: i) o papel de NFκB na resposta celular a ERO e no controle da decisão entre morte e proliferação celular; ii) o estado de ativação de NFκB em modelos tumorais in vitro e in vivo; iii) o potencial citotóxico e seletividade dos inibidores de NFκB, seus mecanismos de ação, atividade em células neoplásicas e em linhagens quimiorresistentes. Para isso, foram utilizadas abordagens in vitro (cultivos celulares), in vivo (modelo animal de implante tumoral), e análises de bancos de expressão gênica através de ferramentas de biologia de sistemas. Os resultados demonstraram que NFκB está superestimulado em linhagens de leucemia e de glioblastoma quando comparado com leucócitos e astrócitos não-transformados. O tratamento com inibidores farmacológicos de NFκB causou morte celular programada em um mecanismo seletivo para células tumorais, potenciando os efeitos de antitumorais clássicos tanto em linhagens selvagens quanto em células quimiorresistentes. Além disso, os inibidores BAY117082 e curcumina apresentaram atividade in vivo em modelo animal de glioma sem evidência de citotoxicidade aguda. Em suma, os dados aqui apresentados sugerem que o fator de NFκB constitui-se um potencial alvo para inibição farmacológica no tratamento de neoplasias. Neste contexto, a diversidade da expressão de NFκB em diferentes tipos tumorais e a segurança associada ao uso clínico de seus inibidores permanece por ser avaliada. / Characterization of new molecular targets is one of the most important challenges in oncology. In this context, there is a growing interest in characterization of deregulated cell signaling pathways in solid and hematopoietic cancer cells in order to leverage the development of specific cell signaling inhibitors to act as principal or adjuvant therapy, and to circumvent the frequently observed chemoresistance and relapse in cancer patients. In this study, we hypothesized that the transcription factor NFκB could be involved on proliferation, antiapoptosis response and chemoresistance in cancer cells thus being a potential target for pharmacological interference. Attempting to test this, we evaluated: i) the role of NFκB in cell response against reactive oxygen species and in control of cell death and proliferation signaling; ii) NFκB activation status in cancer and noncancerous cells in vitro and in vivo; iii) cytotoxicity, selectivity and mechanisms of action of NFκB inhibitors in glioma and leukemia cells besides its biological activity against chemotherapy-resistant cell lines. Experiments were performed based on in vitro (cancer cell lines and primary cultures) and in vivo (tumor implants) models of cell growth. Moreover, in some experiments, bench-directed analysis of public gene expression databases followed by bioinformatic approach was used to ensure the significance and reliability of experimental data. Our findings showed an overstimulation of NFκB in leukemic and glioblastoma cell lines compared to healthy leucocytes and non-transformed astrocytes, respectively. Treatment with pharmacological inhibitors of NFκB induced programmed cell death in a cancer cells selective manner and potentiated the effects of classical anticancer drugs in both wild-type and chemoresistant cell lines. Indeed, the pharmacological NFκB inhibitors BAY117082 and curcumin showed significant anticancer efficacy in a model of brain-implanted gliomas without evidence of acute toxicity. Overall, the herein presented data suggest that NFκB is a potential target for cell death induction in leukemia and glioblastomas. Evaluation of its expression profile in different type of cancers beyond testing efficacy and safety of NFκB pharmacological inhibitors for clinical usefulness remains to be investigated.

A caracterização de vias de sinalização alteradas em células tumorais, e a validação de fármacos inibidores de transdução de sinal que interajam com as mesmas de modo a atuar como terapia principal ou adjuvante no tratamento de neoplasias sólidas e hematopoiéticas, é um campo de grande interesse em oncologia. A necessidade da caracterização de novos alvos moleculares advém da incidência considerável de recidivas, quadros de quimiorresistência e efeitos adversos associados ao tratamento com os agentes antitumorais clássicos. Nesta tese, desenvolvemos a hipótese de que o fator de transcrição NFκB poderia estar envolvido com processos de proliferação, antiapoptose e quimiorresistência em células neoplásicas, caracterizando-se como um potencial alvo para interferência farmacológica. Para isso, avaliamos: i) o papel de NFκB na resposta celular a ERO e no controle da decisão entre morte e proliferação celular; ii) o estado de ativação de NFκB em modelos tumorais in vitro e in vivo; iii) o potencial citotóxico e seletividade dos inibidores de NFκB, seus mecanismos de ação, atividade em células neoplásicas e em linhagens quimiorresistentes. Para isso, foram utilizadas abordagens in vitro (cultivos celulares), in vivo (modelo animal de implante tumoral), e análises de bancos de expressão gênica através de ferramentas de biologia de sistemas. Os resultados demonstraram que NFκB está superestimulado em linhagens de leucemia e de glioblastoma quando comparado com leucócitos e astrócitos não-transformados. O tratamento com inibidores farmacológicos de NFκB causou morte celular programada em um mecanismo seletivo para células tumorais, potenciando os efeitos de antitumorais clássicos tanto em linhagens selvagens quanto em células quimiorresistentes. Além disso, os inibidores BAY117082 e curcumina apresentaram atividade in vivo em modelo animal de glioma sem evidência de citotoxicidade aguda. Em suma, os dados aqui apresentados sugerem que o fator de NFκB constitui-se um potencial alvo para inibição farmacológica no tratamento de neoplasias. Neste contexto, a diversidade da expressão de NFκB em diferentes tipos tumorais e a segurança associada ao uso clínico de seus inibidores permanece por ser avaliada. / Characterization of new molecular targets is one of the most important challenges in oncology. In this context, there is a growing interest in characterization of deregulated cell signaling pathways in solid and hematopoietic cancer cells in order to leverage the development of specific cell signaling inhibitors to act as principal or adjuvant therapy, and to circumvent the frequently observed chemoresistance and relapse in cancer patients. In this study, we hypothesized that the transcription factor NFκB could be involved on proliferation, antiapoptosis response and chemoresistance in cancer cells thus being a potential target for pharmacological interference. Attempting to test this, we evaluated: i) the role of NFκB in cell response against reactive oxygen species and in control of cell death and proliferation signaling; ii) NFκB activation status in cancer and noncancerous cells in vitro and in vivo; iii) cytotoxicity, selectivity and mechanisms of action of NFκB inhibitors in glioma and leukemia cells besides its biological activity against chemotherapy-resistant cell lines. Experiments were performed based on in vitro (cancer cell lines and primary cultures) and in vivo (tumor implants) models of cell growth. Moreover, in some experiments, bench-directed analysis of public gene expression databases followed by bioinformatic approach was used to ensure the significance and reliability of experimental data. Our findings showed an overstimulation of NFκB in leukemic and glioblastoma cell lines compared to healthy leucocytes and non-transformed astrocytes, respectively. Treatment with pharmacological inhibitors of NFκB induced programmed cell death in a cancer cells selective manner and potentiated the effects of classical anticancer drugs in both wild-type and chemoresistant cell lines. Indeed, the pharmacological NFκB inhibitors BAY117082 and curcumin showed significant anticancer efficacy in a model of brain-implanted gliomas without evidence of acute toxicity. Overall, the herein presented data suggest that NFκB is a potential target for cell death induction in leukemia and glioblastomas. Evaluation of its expression profile in different type of cancers beyond testing efficacy and safety of NFκB pharmacological inhibitors for clinical usefulness remains to be investigated.

Esse estudo foi conduzido para testar a influência do estado redox sobre a modulação de proteínas envolvidas em vias de sinalização intracelular, associadas à sobrevivência/crescimento e morte celular, na hipertrofia cardíaca compensada induzida pelo hipertireoidismo experimental. Os hormônios da tireóide induzem crescimento cardíaco fisiológico e, a ativação das vias de sinalização da Akt e das MAPKs, parece contribuir na ação desses hormônios sobre o coração. Estresse oxidativo está envolvido nas respostas cardíacas em diversas situações fisiológicas e patológicas, assim como pode atuar na modulação de proteínas envolvidas em processos de sinalização. Glutationa e tiorredoxina são os principais sistemas mantenedores do ambiente intracelular reduzido, através do controle dos níveis de tiós (-SH), consequentemente, podem contribuir na regulação dos sistemas de sinalização. Ratos Wistar foram divididos em 4 grupos (n=6-7/grupo): controle, vitamina E (20 mg/Kg/dia, s.c., 14 dias), L-tiroxina (T4) (12 mg/L na água de beber por 14 dias) e T4+vitamina E. Materiais e Métodos: Parâmetros morfométricos (índice de hipertrofia cardíaca (IHC = mg coração/g corporal); índice de congestão hepática e pulmonar), glutationa reduzida (GSH, μmol/g), glutationa oxidada (GSSG, μmol/g), estado redox (razão GSH/GSSG), atividade da tiorredoxina redutase (TrxR, nmol/min, mg prot) e níveis de peróxido de hidrogênio (H2O2, nmol/g) foram mensurados no tecido cardíaco. A expressão das proteínas tiorredoxina-1 (Trx-1), Akt, ERK1/2 e JNK (MAPKs), Bax (pró-apoptotica), Bcl-2 (pró-sobrevivência), caspase-3, AIF (fator indutor de apoptose) e do fator de transcrição Nrf-2, foram quantificados por Western blot. Resultados: O tratamento com o ʟ-tiroxina foi efetivo no desenvolvimento do hipertireoidismo. Níveis plasmáticos de T4 (μg/dl) e T3 (ng/dl) aumentaram nos grupos hipertireoideos comparados aos controles. Depois dos 14 dias de tratamento, o grupo T4 apresentou hipertrofia cardíaca (4,06 ± 0,38 mg/g) comparado ao controle (2,41 ± 0,15 mg/g) e essa resposta foi reduzida significativamente no grupo T4+vitamina E (3,65 ± 0,27 mg/g). Sinais da congestão de órgãos não apresentaram diferença entre os grupos. Níveis de GSSG e H2O2 aumentaram significativamente (33% e 43%, respectivamente) no grupo T4 em comparação ao controle, sendo significativamente atenuados pela administração de vitamina E no grupo T4. A razão GSH/GSSG foi reduzida significativamente (28%) no grupo T4 em comparação ao controle. Nenhuma alteração foi observada nos níveis de GSH, na atividade da TrxR e na expressão da Trx-1 e Nrf-2. A expressão da Akt total reduziu nos grupos hipertireoideos em comparação aos seus controles e, a expressão da fosfo-Akt reduziu nos grupos vitamina E, T4 e T4+vitamina E quando comparados ao controle. Foi observado aumento significativo da expressão da fosfo-ERK1/2, assim como da razão fosfo-ERK/ERK total nos grupos hipertireoideos em comparação aos controles. Nenhuma alteração foi encontrada na expressão da JNK, fosfo-JNK, AIF e na razão da Bax/Bcl-2, por outro lado, observou-se aumento (53%) da caspase-3 nos T4 em comparação ao controle. Conclusão: Com base nos resultados obtidos, ao final dos 14 dias de tratamento com L-tiroxina, pode-se concluir que a resposta hipertrófica cardíaca parece estar com sua função compensada, uma vez que não foram observados sinais de insuficiência cardíaca. A redução de GSSG e H2O2 promovida pela administração de vitamina E se mostrou associada à diminuição do crescimento da massa cardíaca nos animais hipertireoideos. O sistema tiorredoxina não se mostrou fundamental para a manutenção do estado redox nesta fase. A Akt parece não contribuir significativamente para a resposta hipertrófica nesse período de tratamento. O aumento da fosforilação da ERK1/2, associado a não ativação da JNK, pode ser o responsável pela resposta trófica cardíaca compensada nos animais hipertireoideos. O aumento da caspase-3, efetora de morte, indica que pode esse período possuir início da ativação apoptótica. Os dados em conjunto reforçam a ideia de que, nessa fase, há moderado desbalanço redox cardíaco, sem haver início de sinalização que favoreça a hipertrofia cardíaca patológica, porém com provável início de sinalização pró-apoptótica, a qual pode contribuir para o desenvolvimento da disfunção cardíaca. / This study was conducted to test the redox status influence in the modulation of some proteins involved in pro-survival and pro-apoptotic intracellular signaling pathways in the compensate cardiac hypertrophy induced by hyperthyroidism. Thyroid hormones (T4 and T3) induce physiological cardiac growth and activation of Akt and MAPKs signaling pathways. Those may contribute to these hormones effects on the heart. Oxidative stress is involved in cardiac responses under several physiological and pathological situations, as well as can act in the modulation of proteins involved in the signaling process. Glutathione and thioredoxin are the main antioxidant systems in the intracellular environment that can contribute to the regulation of signaling redox-sensible. Material and Methods: Male Wistar rats were divided into four groups (n= 6-7/group): control, vitamin E (20mg/Kg/day s.c. 14 days), ʟ-thyroxine (T4) (12mg/L in drinking water for 14 days) and T4+vitamin E. Morphometric parameters [cardiac hypertrophy index (mg heart/g body weight), liver and lung congestion index (wet/dry weight)], reduced glutathione (GSH, μmol/g) and glutathione dissulfide (GSSG, μmol/g), redox status (GSH/GSSG ratio), the activity of thioredoxin reductase (TrxR, in nmol/min/mg protein) and hydrogen peroxide steady-state concentration (H2O2, nmol/g) were measured in cardiac tissue. Thioredoxin-1 (Trx-1), NF-E2-related factor-2 (Nrf-2), Protein Kinase B (PKB or Akt), Extracellular Signal-Regulated Kinase 1/2 (ERK1/2), c-Jun n-Terminal Kinase (JNK), Bax (pro-apoptotic)/Bcl-2 (pro-survival) ratio (Bcl-2 family proteins, respectively), Caspase-3 (proteases involved in apoptotic process) and Apoptotic-Inducing Factor (AIF) myocardial protein expression were quantified by western blot. Results: The hormone treatment was effective in the development of hyperthyroidism. The serum T4 (in μg/dL) and T3 (in ng/dL) increased significantly in hyperthyroid groups when compared to control groups, at the end of treatment. After 14 days, T4 group presented cardiac hypertrophy (4.06 ± 0.38 mg/g) when compared to control (2.41 ± 0.15 mg/g) and, this response was significantly reduced in T4+vitamin E (3.65 ± 0.27 mg/g). Congestion signs were not observed. Levels of GSSG and H2O2 increased significantly (33% and 43%, respectively) in the T4 group compared to control and this was reduced by vitamin E administration to the T4 group. The GSH/GSSG ratio was significantly reduced in the group T4 (28%) when compared to control. Any change in the levels of GSH, TrxR activity and the Trx-1 and Nrf-2 expression was observed. Total Akt expression was reduced in the hyperthyroid groups when compared to their respective controls and the p-Akt expression was significantly reduced in vitamin E, T4 and T4+vitamin E compared to control. The p-ERK1/2 expression and p-ERK/Total ERK were significantly increased in the hyperthyroid groups compared to controls. No changes were observed in the JNK, p-JNK, AIF and Bax/Bcl-2 ratio expression, but Caspase-3 increased 53% in T4 group compared to control. Conclusion: We concluded that after 14 days of treatment with L-thyroxine, cardiac hypertrophy response would have a compensated function, since no signs of congestive heart failure were seen. It was observed association between GSSG and H2O2 reduction, by vitamin E administration, and cardiac mass decreased in the hyperthyroid animals. The thioredoxin system appears to be not primordial to redox environment maintenance in this phase. The Akt seems not to contribute significantly to the hypertrophyc response in these period of treatment. The increase in p-ERK1/2, associated with an inalteration of JNK, could be responsible for a compensate cardiac hypertrophy phenotype in the hyperthyroid animals.Caspase-3 increase indicates that this period may represent the beginning of apoptotic activation. The overall results reinforce the idea that, in this period, there is moderate cardiac redox imbalance, with no signals that favors the pathological cardiac hypertrophy, although with probable onset of proapoptotic signaling, which may contribute to the development of cardiac dysfunction.

O aumento da longevidade da população mundial tem como consequência uma maior prevalência de doenças neurodegenerativas. A Doença de Alzheimer (DA) é a desordem neurodegenerativa mais prevalente e a principal causa de demência após os 60 anos. A DA caracteriza-se por um crescente declínio na função mental e memória do paciente. Esses sintomas são acompanhados pela presença de alterações estruturais no tecido cerebral: os emaranhados neurofibrilares constituídos pela proteína tau hiperfosforilada e as placas senis constituídas pelo peptídeo beta-amiloide (A ). O peptídeo A tem sido considerado o principal responsável pelos processos de disfunção sináptica, morte neuronal e consequente declínio cognitivo dos pacientes com DA. O cenário atual ao qual se enquadram nossos conhecimentos sobre a etiologia, fisiopatologia e terapêutica da DA ainda não permitem um entendimento completo e satisfatório sobre essa doença e seu tratamento. A curcumina, um polifenol de origem vegetal, tem atraído considerável interesse devido aos seus potenciais benefícios à saúde humana. Alguns estudos têm demonstrado que a curcumina possui propriedades antioxidantes, antiinflamatórias e anti-amiloidogênicas em modelos animais de DA. Entretanto, as bases moleculares para a sua neuroproteção ainda não estão totalmente esclarecidas. Neste trabalho, avaliamos diversos mecanismos que são modulados pela curcumina em modelos in vivo e in vitro de toxicidade induzida pelo peptídeo A 1-42. Inicialmente, demonstramos que o co-tratamento com curcumina reduziu a morte celular induzida pela exposição ao peptídeo A por 48 h em culturas organotípicas de hipocampo de ratos. Em paralelo, a curcumina preveniu a redução da proteína sinaptofisina, a geração de espécies reativas, a ativação astrocitária e microglial, bem como, a alteração na secreção de importantes mediadores inflamatórios. Além disso, o mecanismo envolvido com sua neuroproteção pode estar associado com a regulação da fosforilação da proteína -catenina e da modulação da via de sinalização PI3K, através da regulação dos substratos Akt e GSK-3 , visto que o uso do inibidor LY294002 bloqueou o efeito neuroprotetor da curcumina. Diante da intensa ativação astrocitária observada no primeiro capítulo, investigamos o efeito da curcumina na reatividade astrocitária em cultura primária de astrócitos expostos ao peptídeo A . Neste trabalho observamos que os mecanismos de proteção da curcumina envolvem a prevenção da ativação da proteína JNK e a regulação do perfil de sumoilação de astrócitos, visto que a superexpressão de SUMO-1 diminui a reatividade astrocitária induzida pelo peptídeo A . Além do efeito neuroprotetor contra a morte celular, a curcumina demonstrou ter efeitos benéficos na transmissão sináptica, evitando a diminuição da excitabilidade neuronal em fatias organotípicas de hipocampo de ratos expostas por 24 h ao peptídeo A e este efeito parece estar associado com a modulação das proteínas CaMKII e sinapsina I. Para a avaliação do efeito neuroprotetor da curcumina no modelo in vivo de toxicidade ao peptídeo A 1-42, devido a sua baixa biodisponibilidade, comparamos a eficiência de nanocápsulas de curcumina e curcumina livre na prevenção dos danos cognitivos induzidos pela injeção icv do peptídeo A . De modo interessante, observamos um significativo aumento do desempenho in vivo da curcumina nanoencapsulada, a qual apresentou efeitos similares ou melhores com uma dose 20 vezes menor do que a dose efetiva de curcumina livre. Os mecanismos de neuroproteção da curcumina neste modelo parecem envolver o fator neurotrófico BDNF e a via de sinalização PI3K/Akt. Juntos, nossos resultados não somente confirmam o potencial da curcumina no tratamento dos processos neurodegenerativos como também oferecem uma via efetiva para melhorar o efeito neuroprotetor da curcumina através da nanobiotecnologia. / The increased longevity of the population has resulted in a higher prevalence of neurodegenerative diseases. Alzheimer’s disease (AD) is the most common neurodegenerative disorder and the leading cause of dementia in persons over 60 years. The AD is characterized clinically by progressive impairments in cognition and memory. These clinical features are accompanied by the presence of structural changes in brain tissue: neurofibrillary tangles formed by hyperphosphorylated tau protein and amyloid plaques formed by amyloid beta-peptide (A ). A has been considered the main processes responsible for synaptic dysfunction, neuronal death and subsequent cognitive decline in patients with AD. The current scenario of our knowledge of the etiology, pathophysiology and therapy of AD does not allow a full and satisfactory understanding of this disease and its treatment. Curcumin, a naturally occurring polyphenol, has attracted considerable interest for its beneficial potentials for human health. Over the past decade, studies have been shown that curcumin is associated with antioxidant, anti-inflammatory and anti-amyloidogenic properties in models of AD; however, the molecular basis for its neuroprotection is not yet fully understood. In this study, we evaluated several mechanisms that are modulated by curcumin in in vitro and in vivo models of A 1-42-induced toxicity. Initially, we demonstrated that co-treatment with curcumin reduced the cell death induced by exposure to peptide A for 48 h in organotypic hippocampal slice cultures. In parallel, curcumin prevented the reduction of synaptophysin protein, generation of reactive species, astrocytic and microglial activation and the changes in the release of important inflammatory mediators. Furthermore, the mechanism involved in this neuroprotection may be associated with regulation of phosphorylation of -catenin protein and modulation of PI3K signaling pathway, by regulating the substrates Akt and GSK-3 , since the use of inhibitor LY294002 blocked the neuroprotective effect of curcumin. Given the intense astrocytic activation observed in the first study, we investigated the effect of curcumin on astrocytic reactivity in primary culture of astrocytes exposed to A 1-42. In this study we observed that the protective mechanisms of curcumin involve the prevention of JNK activation and regulation of SUMOylation profile of astrocytes, whereas overexpression of SUMO-1 reduces astrocyte reactivity induced by A . Besides the neuroprotective effect against cell death, curcumin shown to have beneficial effects in synaptic transmission, avoiding the reduction of neuronal excitability in organotypic hippocampal slices exposed for 24 h to A 1-42 and this effect could be associated with CaMKII and synapsin I modulation by curcumin. For evaluating the neuroprotective effect of curcumin in an in vivo model of A -induced toxicity, due to its poor bioavailability, we compared the efficiency of curcumin-loaded lipid-core nanocapsules and free curcumin in preventing cognitive impairments induced by icv injection of A 1- 42. Interestingly, we observed a significant increase in the in vivo performance of nanoencapsulated curcumin, which presented similar or better neuroprotective results in a dose 20-fold lower compared to the effective dose of free curcumin. The neuroprotective mechanisms of curcumin in this model appear to involve the neurotrophic factor BDNF and PI3K/Akt signaling pathway. Taken together, our results not only confirm the potential of curcumin in treating neurodegenerative processes but also offer an effective way to improve the neuroprotective efficiency of curcumin through nanobiotechnology.

Orientador: Kleber Gomes Franchini / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciencias Medicas / Made available in DSpace on 2018-08-11T13:49:24Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Clemente_CarolinaFernandaManfrediZambon_D.pdf: 14683053 bytes, checksum: 740572fd1e2c19884bc045a5fafe828f (MD5) Previous issue date: 2008 / Resumo: Doenças do coração cursam frequentemente com hipertrofia do miocárdio. Estímulos mecânicos e neuro-humorais são sinalizadores críticos para o crescimento hipertrófico dos cardiomiócitos nos vários processos patológicos. Neste contexto, estudos indicam que a quinase de adesão focal (FAK), uma proteína tirosino-quinase que participa dos mecanismos de sinalização por integrinas, é uma mediadora importante do crescimento hipertrófico do ventrículo esquerdo (VE). Este estudo teve como objetivo avaliar a influência da FAK na indução da hipertrofia e na deterioração do VE induzidas por sobrecarga pressórica crônica em camundongos através de estratégia de interferência por RNA. A coarctação da aorta em camundongos induziu a hipertrofia do VE acompanhada pelo aumento da expressão e atividade da FAK no miocárdio. A infusão de siRNA específico para FAK (siRNAFAK), via veia jugular, levou ao silenciamento gênico prolongado da FAK (~70%) no VE normal e também no hipertrófico. O knockdown da FAK foi confirmado nos miócitos e fibroblastos cardíacos provenientes do VE de camundongos. O silenciamento da FAK foi acompanhado tanto da prevenção como regressão da hipertrofia do VE. A função do VE foi preservada e a taxa de sobrevivência foi maior nos camundongos tratados com siRNAFAK, apesar da persistência da sobrecarga pressórica. Estes achados foram paralelos a atenuação do crescimento hipertrófico dos cardiomiócitos e da expressão do marcador de hipertrofia ß-MHC no VE sob sobrecarga pressórica. O silenciamento da FAK também atenuou o aumento da fibrose intersticial, conteúdo de colágeno e atividade da metaloproteinase-2 (MMP-2) no VE submetido ao estímulo mecânico. Em fibroblastos extraídos de corações hipertróficos, o silenciamento da FAK foi concomitante à diminuição da expressão de MMP-2. Assim, estes dados indicam que a sinalização mediada pela FAK é necessária não apenas para o desenvolvimento, mas também para sustentar a hipertrofia em resposta a sobrecarga pressórica crônica / Abstract: Hypertrophy is a critical event in the onset of failure in chronically overloaded hearts. Mechanical stress and neurohumoral factors signaling factors have been considered the main triggering stimuli for the installation of hypertrophy in cardiac myocytes in a variety of pathological process. In this context, focal adhesion kinase (FAK), a key protein of the integrin signaling pathway, has attracted particular attention as a mediator of hypertrophy induced by increased load. This study was performed to address the influence of FAK in the pathophysiology of cardiac hypertrophy and failure induced by chronic pressure overload in mice using RNA interference methodology. Aortic constriction in mice induced left ventricle (LV) hypertrophy and increased expression and phosphorylation of FAK. Intrajugular delivery of specific small interfering RNA induced prolonged FAK silencing (~70%) in both normal and hypertrophic LVs. Studies in cardiac myocytes and fibroblasts harvested from LVs confirmed the ability of the systemically administered specific small interfering RNA to silence FAK in both cell types. Myocardial FAK silencing was accompanied by prevention, as well as reversal, of load-induced left ventricular hypertrophy. The function of LVs was preserved and the survival rate was higher in banded mice treated with small interfering RNA targeted to FAK, despite the persistent pressure overload. Further analysis indicated attenuation of cardiac myocyte hypertrophic growth and of the rise in the expression of ß-myosin heavy chain in overloaded LVs. Moreover, FAK silencing was demonstrated to attenuate the rise in the fibrosis, collagen content, and activity of matrix metalloproteinase-2 in overloaded LVs, as well as the rise of matrix metalloproteinase-2 protein expression in fibroblasts harvested from overloaded LVs. This study indicate that FAK is necessary not only to the development but also to sustain LV hypertrophy in response to chronic pressure overload / Doutorado / Medicina Experimental / Doutor em Fisiopatologia Medica

Peptídeos sinais determinam o crescimento, desenvolvimento e defesa das plantas. RALF (Rapid Alkalinization Factor) é um peptídeo de sinalização ubíquo no reino vegetal e que está envolvido com a expansão celular. Os peptídeos RALF em arabidopsis estão organizados em uma família multigênica de 37 membros, alguns com expressão tecido-específica, outros expressos em toda a planta. Os mecanismos envolvidos na expansão celular são regulados por vários hormônios, entre os quais as citocininas. A relação existente entre os peptídeos RALF e os demais hormônios é pouco conhecida e um melhor entendimento dessa relação poderá auxiliar na modulação dos processos de crescimento e desenvolvimento vegetal por engenharia genética. O objetivo desse trabalho foi estudar a relação entre o peptídeo AtRALF e as citocininas, principalmente no que diz respeito aos efeitos de ambos no crescimento e desenvolvimento das raízes. Para isso, selecionou-se as isoformas AtRALF1, AtRALF19 e AtRALF34 que apresentam diferentes padrões de expressão. Os resultados sugerem que AtRALF19 e AtRALF34, ambas expressas em toda a planta, contribuem mais com a transdução de sinal da citocinina do que a isoforma AtRALF1, com padrão de expressão específico de raízes. Os peptídeos AtRALF19 e 34 reprimem parcialmente a expressão dos genes reguladores de resposta, ARRs tipo-A, que são reguladores negativos da via de sinalização de citocinina. / Peptides signals influence the growth, development and plant defense. RALF (Rapid Alkalinization Factor) is a ubiquitous signaling peptide in the plant kingdom and is involved in cell expansion. The RALF peptides in arabidopsis are organized in a multigene family of 37 members, some with tissue-specific expression, others expressed throughout the plant. The mechanisms involved in cellular growth are regulated by various hormones, including cytokinins. The relationship between RALF peptides and other hormones is poorly understood and a better understanding of this relationship assists in modulating the processes of plant growth and development. The aim of this work was to study the relationship of AtRALF peptide with cytokinins, especially with regard to the effects of both in the growth and development of roots. For this, we selected the AtRALF1, AtRALF19 and AtRALF34 isoforms that have different expression patterns. The results suggest that AtRALF19 and AtRALF34, both expressed throughout the plant, contribute more to cytokinin signal transduction than isoform AtRALF1, with specific expression pattern in roots. The AtRALF19 and 34 repressed the expression of type-A Arabidopsis Response Regulators (ARRs), whose products act as negative regulators of cytokinin signaling.