Submitted by Nuzia Santos (nuzia@cpqrr.fiocruz.br) on 2013-08-07T13:30:22Z No. of bitstreams: 1 Tese_MarceleNevesRocha.pdf: 3850783 bytes, checksum: e18bb3542328e15691057c221725ec86 (MD5) / Made available in DSpace on 2013-08-07T13:30:22Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Tese_MarceleNevesRocha.pdf: 3850783 bytes, checksum: e18bb3542328e15691057c221725ec86 (MD5) Previous issue date: 2013 / As Leishmanioses são doenças negligenciadas. O tratamento dos pacientes é a principal medida de controle, porém a quimioterapia das Leishmanioses apresenta dificuldades incluindo: toxicidade dos medicamentos disponíveis, via de administração parenteral e resistência natural de algumas cepas. O método de teste de drogas clássico in vitro baseado na contagem microscópica de macrófagos infectados apresenta limitações por ser laborioso, não automatizado e sujeito a variações do observador. Deste modo, a busca por novos métodos de triagem de drogas faz-se necessário. O estabelecimento de métodos semi-automatizados contribuiria para aumentar a eficiência da busca de novas drogas contra Leishmania. Neste trabalho, a cepa de Leishmania amazonensis (PH8) foi transfectada com a proteína vermelha fluorescente (RFP). Os parasitos transfectados foram avaliados segundo parâmetros celulares e de susceptibilidade aos fármacos leishmanicidas tradicionais e derivados do propranolol. Os parasitos selvagens (WT) e transfectados (RFP) foram analisados pela Citometria de Fluxo e Microscopia de Fluorescência sendo facilmente discriminados por estas técnicas. Em geral, não foram observadas diferenças na susceptibilidade entre as cepas WT e RFP frente às moléculas testadas. Os parasitos RFPs foram submetidos ao teste de drogas com posterior leitura no fluorímetro para a padronização do método fluorimétrico. O método fluorimétrico se mostrou bastante reprodutível em relação ao método clássico. Entretanto, durante a padronização do método, mudanças na concentração das drogas foram necessárias bem como a determinação de um ponto de corte nos valores de IC50. Este trabalho também avaliou a atividade leishmanicida dos derivados das poliaminas e complexos metálicos de lapachol utilizando-se o método clássico. Não só os derivados do propranolol, mas também os das poliaminas e lapachol se mostraram tóxicos paracélulas de Hepatoma humano (HepG2). Este trabalho possibilitou pela primeira vez a utilização de parasitos RFPs como modelo de um teste de drogas semi-automatizado. / The leishmaniasis are neglected diseases. Patient treatment is the main control measure, however leishmanisasis chemotherapy faces several problems including: drug toxicity, the administration rout and natural drug resistance. Also, the classical in vitro drug testing method, which is based on microscopically counting the number of infected macrophages is rather limited, laborious cannot be automated and is subjected to variations due to observer. For this reason, the search for new methods and establishment of semi-automated methos id necessary to improve the efficiency of new drugs discovery. In this present work, Leishmania amazonensis strain PH8 was transfected with the red fluorescent protein (RFP). Transfected parasites were evaluated for their cellular parameters and susceptibility against traditional drugs and novel propranolol derivates. Wild type (WT) and transfected (RFP) parasites were analyzed by flow citometry and fluorescent microscopy. Overall we did not observe any difference in drug susceptibility between WT and RFP parasites. RFP parasite were then submitted drug susceptibility test and analyzed by fluorimeter. The fluorimetric method showed a comparable reproducibility to the standard method. However, during experimentation, some adjustments on drug concentrations were necessary to determine IC50 threshold values. Additionally, in this work, weevaluated the activity of polyamine derivates and (metalic lapachol complexes) against leishmania by the classical method. Propranolol derivates, polymaine and metalic lapachol complexes were shown to be citotoxic as shown by HepG2 cell cultures. This work was the first to show the use of RFP parasites as a model for drug screening in a semi-automated method.

Made available in DSpace on 2016-04-20T12:39:28Z (GMT). No. of bitstreams: 2 eudislaine_carvalho_ioc_mest_2013.pdf: 1777151 bytes, checksum: 5c17debede158ac9bc7692a3a408b4ba (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2013 / Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Oswaldo Cruz. Rio de Janeiro, RJ, Brasil / As doenças transmitidas por insetos vetores são de grande importância para saúde pública. No Brasil, as principais doenças compreendem a malária, doença de Chagas, leishmaniose, dengue e febre amarela. O inseto vetor flebotomíneo é o principal transmissor da leishmaniose. Porém, também são vetores de outros agentes patogênicos e hospedeiros de diversos outros microrganismos, tais como bactérias, fungos e arbovírus. Os arbovírus são biologicamente transmitidos entre hospedeiros vertebrados por insetos hematófagos. Sua distribuição ocorre de forma global, porém a maioria é encontrada em áreas tropicais, onde as condições climáticas permitem a transmissão durante todo o ano. Os arbovírus do gênero Vesiculovírus, Orbivírus e Phlebovírus são os mais comuns encontrados em flebotomíneos. Além destes gêneros isolados do próprio inseto, os vírus Mayaro e do Oeste do Nilo também são capazes de infectar uma linhagem celular (LL5) da espécie Lutzomyia longipalpis. A resposta imune é essencial para os artrópodes sobreviverem aos agentes patogênicos, as principais vias envolvidas na resposta imune de artrópodes incluem a via Imd, Toll e Jak/Stat. Os artrópodes possuem diversos mecanismos contra infecção viral, entre eles a apoptose, a via de RNA de interferência (RNAi) e a autofagia. O mecanismo utilizado pela maioria dos vetores é o silenciamento da expressão gênica dos vírus através da via do RNAi Esta via é amplamente conservada em diferentes espécies e se baseia na complementariedade do RNA dupla fita (dsRNA) para degradação de mRNA, sendo assim uma resposta sequência específica. A via Jak/Stat também tem sido associada à resposta antiviral. O gene responsivo a vírus, Vago, atua como um interferon like e é responsável pela ativação de Jak/Stat. A única descrição que existe sobre a resposta antiviral em flebotomíneos é uma resposta inespecífica, que é ativada por qualquer dsRNA. Como não se tem conhecimento preciso dos mecanismos de defesa antiviral neste inseto, nosso trabalho avalia o papel de diferentes componentes do sistema imune no mecanismo de defesa antiviral em células LL5. Realizamos dois modelos eficientes de infecção com vírus VSV e mimetização da infecção, através de transfecção de poly I:C (dsRNA), em células LL5 e em células Aag2 de A. aegypti para o estudo da resposta antiviral. Após a infecção ou transfecção de dsRNA avaliamos o perfil de expressão de alguns genes da resposta antiviral: Dicer 2, Vago, Stat, Defensina e Atg18. LL5 apresentou uma resposta a infecção com VSV diferente das células Aag2, sendo que nestas células a dsRNA é capaz de ativar uma resposta antiviral contra VSV, diferentemente das células LL5. Sugerimos também que a resposta antiviral de LL5 contra infecção com VSV ocorra através do mecanismo de autofagia, pois, outros genes clássicos da via de RNAi e Jak/Stat (Dicer, Vago e Stat) não foram modulados positivamente neste modelo / Insect-borne diseases have a great importance in public health. In Brazil, the main diseases transmitted by insects include malaria, Chagas disease, leishmaniasis, dengue and yellow fever. Sandflies are the main vectors of leishmania parasites, but may also harbors and even transmit other pathogens such as bacteria, fungi and arbovirus. The arboviruses are biologically transmitted between vertebrate hosts by hematophagous insects. Its distribution occurs globally, but mostly in tropical areas, where climatic conditions may allow transmission throughout the year. The arbovirus of the genus Vesiculovirus, Orbivirus and Phlebovirus are commonly found in sandflies. In addition, the Mayaro virus and West Nile virus are also able of infecting Lutzomyia longipalpis cell line (LL5). The immune response is essential for arthropods to survive the pathogens infection and the major pathways involved in this immune response are Imd, Toll and Jak/Stat pathways. The arthropods have diverse mechanisms against viral infection, including apoptosis, the RNA interference pathway (RNAi) and autophagy. The mechanism used by most of the vectors is the silencing of gene expression through the RNAi pathway. This pathway is conserved among different species and is based on degradation of mRNA complementary to double-strand RNA (dsRNA), thus being a sequence-specific response. The Jak/Stat pathway has also been associated with antiviral response The virus responsive gene, Vago, acts as an interferon-like and is responsible for activation of Jak/Stat. The only information regarding the antiviral response in sandflies is a non-specific response, which is activated by any dsRNA. Since there is no precise knowledge of the antiviral defense mechanism in this insect, our study evaluated the role of different components of the immune system in antiviral defense mechanism in LL5 cells. We used two efficient models of infection with VSV virus and mimicking the infection by transfection of poly I:C (dsRNA) in LL5 cells and Aag2 cells of Aedes aegypti to study the antiviral response. After infection or transfection of dsRNA we evaluated the expression profile of some genes related to antiviral response: Dicer 2, Vago, Stat and Atg18. LL5 and Aag2 showed different responses to VSV infection, and in Aag2 cells the dsRNA is able to activate and antiviral response against VSV, differently in LL5 cells. We also suggest that the antiviral response of LL5 against VSV infection occurs through the mechanism of autophagy, because other classical genes of the RNAi and Jak/Stat pathways were not positively modulated in this model

Objetivos: avaliar a eficiência da transfecção do brônquio isquêmico com phVEGF 165 e investigar a presença de revascularização sistêmica, no brônquio isquêmico, após três dias da aplicação deste plasmídio. Metodologia: cães submetidos a broncotomia e dissecção circunferencial hilar foram distribuídos aleatoriamente para receber a aplicação de terapia gênica com 50 μg de phVEGF 165 (grupo VEGF, n = 9) ou de solução fisiológica 0,9% (grupo controle, n = 9) no brônquio isquêmico. Após três dias, em 10 animais sobreviventes, coletamos amostras do brônquio isquêmico para extração do RNAm total e nos outros 7 cães, injetamos corante microvascular na aorta canina. Analisamos, nos segmentos de brônquio isquêmico, a expressão gênica (RT-PCR) e a expressão protéica do VEGF (imunoistoquímica anti-VEGF), além de verificar a presença de vasos da submucosa brônquica preenchidos com corante microvascular. Resultados: o grupo VEGF apresentou 100% dos brônquios com vasos da submucosa brônquica preenchidos com corante microvascular, enquanto que, no grupo controle, não houve evidências de vasos corados. Também o grupo VEGF mostrou a expressão gênica (p = 0,000) e protéica (p = 0,015) mais intensa que o grupo controle. Conclusão: o sucesso na transfecção do brônquio isquêmico com plasmídio phVEGF 165 estimulou a revascularização sistêmica em três dias.

A identificação de genes relacionados com resistência a compostos antiparasitários tem contribuído para um melhor entendimento do mecanismo de ação de alguns desses compostos. Utilizando a estratégia que permite a indução de super-expressão após transfecção gênica, isolamos dois loci relacionados com resistência ao análogo tóxico de purina, tubercidina (TUB). Em um desses locus identificamos um ortólogo do gene TOR (TOxic nucleoside Resistance) em L. (L.) major (TOR-Lm), capaz de conferir altos níveis de resistência a TUB. A identificação e localização cromossomal do segundo locus foi obtida, mas os testes funcionais em presença de TUB não foram tão significativos quanto os obtidos após a transfecção do TOR-Lm. Na segunda parte desta dissertação avaliamos a eficácia da associação de TUB com um inibidor específico do transporte de nucleosídeos em mamíferos, nitrobenziltioinosina (NBMPR), visando reverter a toxicidade de TUB apenas no hospedeiro. Demonstramos que TUB tem uma potente ação anti-parasitária em culturas de Leishmania spp., e que o inibidor NBMPR é capaz de proteger células mamíferas de camundongos infectados da ação tóxica de TUB. / Gene identification associated with drug resistance has contributed to a better understanding of the mechanism of action of anti parasitic compounds. Using transfection and over-expression selection strategy we isolated two loci related with the resistance of tubercidin (TUB), a toxic analog purine. In the first locus we identified an ortholog of the TOR gene (TOxic nucleoside Resistance) in L. (L.) major (TOR-Lm), capable to render wild cells resistance to TUB after transfection and over-expression. Chromosomal location and identification of the second locus was done, but functional tests in the presence of TUB were not as significant as those obtained after TOR-Lm transfection. In the second part of this work, we evaluate the effectiveness of the association of TUB with an inhibitor specific to the mammals nucleoside transport, as nitrobenzylthioinosine (NBMPR), aimed at reversing the TUB toxicity only on the host. We first demonstrate that TUB has a potent anti-parasitic action in cultures of Leishmania spp. Then, we discuss the capacity of the NBMPR inhibitor to protect infected macrophages from the toxic effects of TUB.

A identificação de genes relacionados com resistência a compostos antiparasitários tem contribuído para um melhor entendimento do mecanismo de ação de compostos antileishmania. Pouco se sabe sobre o mecanismo de ação do análogo de purina tubercidina (TUB) em Leishmania. Utilizando a estratégia de superexpressão após transfecção gênica, isolamos um locus de Leishmania (Leishmania) major, de 31 kb, capaz de conferir níveis de resistência quatro vezes maior que o parasita selvagem. Várias deleções desse locus foram geradas e a construção de 3 kb (pSNBR/3kbClaI-EcoRI) também conferiu níveis de resistência quando comparado ao parasita elvagem. Através de análises no genoma de L. (L.) major, localizamos esse locus no cromossomo 31 e, no fragmento de 3 kb, um gene que codifica para uma proteína com função desconhecida até o momento (LmjF.31.2010). Esta proteína foi relacionada com resistência a TUB em todas as linhagens transfectadas analisadas (cosTUB2 e pSNBR/3kbClaI-EcoRI), assim denominamos LmjF.31.2010, de proteína relacionada com resistência a TUB (PRRT). A quantificação relativa de transcritos de mRNA na construção pSNBR/3kbClaI-EcoRI apresentou níveis altos de transcritos da PRRT. Foram gerados ainda mutantes de L. (L.) major e L. (L.) amazonensis resistentes a TUB e estes se apresentaram bem adaptados a concentrações altas de TUB, apresentando razão de resistência maior que 200 vezes, quando comparado com os respectivos parasitas selvagens. A PRRT também foi relacionada na resistência a TUB nos mutantes gerados, pois houve amplificação gênica de prrt. Os resultados obtidos neste trabalho fornecem dados para inferir a importância da PRRT no mecanismo relacionado com resistência a TUB. / The identification of genes associated with resistance to antiparasitic compounds has contributed to a better understanding of the mechanism of action of compounds against Leishmania. Little is known about the mechanism of action of purine analog tubercidin (TUB) in Leishmania. Using a strategy of gene overexpression after transfection, we isolated a locus of Leishmania (Leishmania) major, 31 kb, capable of conferring fold resistance four times greater than the wild type parasite. A set of deletions of this locus were generated and a 3 kb construction (pSNBR/3kbClaI-EcoRI) conferred fold resistance twice than the wild type. Analysis of L. (L.) major genome, located this locus on chromosome 31 and on 3 kb fragment we identified a gene encoding a protein with unknown function (LmjF.31.2010). This protein has been related to TUB resistance in all strains analyzed (cosTUB2 and pSNBR/3kbClaI-EcoRI), so we named mjF.31.2010 of protein related with resistance to TUB (PRRT). Relative quantification of mRNA transcripts in the construction pSNBR/3kbClaI-EcoRI showed high levels of PRRT transcripts.Mutants of L. (L.) major and L. (L.) amazonensis resistant to TUB were also generated and these were well adapted to high TUB concentrations, presenting fol resistance greater than 200 times when compared with their respective wild type. The PRRT was also related to TUB resistance mutants generated by PRRT gene amplification. Despite the high fold resistance presented by TUB resistant mutants, the ratio of expression of these mutant PRRT transfected and wild was similar to the wild type.

Objetivos: avaliar a eficiência da transfecção do brônquio isquêmico com phVEGF 165 e investigar a presença de revascularização sistêmica, no brônquio isquêmico, após três dias da aplicação deste plasmídio. Metodologia: cães submetidos a broncotomia e dissecção circunferencial hilar foram distribuídos aleatoriamente para receber a aplicação de terapia gênica com 50 μg de phVEGF 165 (grupo VEGF, n = 9) ou de solução fisiológica 0,9% (grupo controle, n = 9) no brônquio isquêmico. Após três dias, em 10 animais sobreviventes, coletamos amostras do brônquio isquêmico para extração do RNAm total e nos outros 7 cães, injetamos corante microvascular na aorta canina. Analisamos, nos segmentos de brônquio isquêmico, a expressão gênica (RT-PCR) e a expressão protéica do VEGF (imunoistoquímica anti-VEGF), além de verificar a presença de vasos da submucosa brônquica preenchidos com corante microvascular. Resultados: o grupo VEGF apresentou 100% dos brônquios com vasos da submucosa brônquica preenchidos com corante microvascular, enquanto que, no grupo controle, não houve evidências de vasos corados. Também o grupo VEGF mostrou a expressão gênica (p = 0,000) e protéica (p = 0,015) mais intensa que o grupo controle. Conclusão: o sucesso na transfecção do brônquio isquêmico com plasmídio phVEGF 165 estimulou a revascularização sistêmica em três dias.

Orientadores: Lucimara Gaziola de La Torre, Adriano Rodrigues Azzoni / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia Química / Made available in DSpace on 2018-08-20T20:39:39Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Balbino_TiagoAlbertini_M.pdf: 2581790 bytes, checksum: 674a2d22b439ef811cbfb642774f6d4d (MD5) Previous issue date: 2012 / Resumo: Esta pesquisa teve como objetivo o desenvolvimento tecnológico de processo microfluídico para a obtenção de vetores não virais, baseados na complexação eletrostática entre lipossomas catiônicos (LC) e DNA plasmideal (pDNA) destinados à terapia e vacinação gênica. O desenvolvimento desse processo foi comparado ao processo convencional "bulk", que, a partir da simples mistura manual entre as soluções ou em sistema de vórtice, gera dificuldade no controle do tamanho destas estruturas e pode produzir variações nos resultados biológicos e na estabilidade coloidal. Já o processo microfluídico, que utiliza dispositivos que processam pequenas quantidades de fluidos (10-9 a 10-18 litros), permite a complexação eletrostática em regime contínuo, com o controle das condições difusionais, o que também permite melhor controle do tamanho destes complexos. Metodologicamente, o trabalho foi dividido em três principais etapas: na primeira parte, foi realizado o estudo físico-químico, estrutural e biológico dos complexos pDNA/LC obtidos por processo "bulk". Nessa etapa, verificou-se a correlação das propriedades físico-químicas e estruturais dos complexos com o processo de transfecção in vitro em células HeLa. A segunda parte do trabalho visou à otimização da produção de lipossomas catiônicos em dois dispositivos microfluídicos, com uma única e com dupla focalização hidrodinâmica, de modo a se obter lipossomas similares aos estudados na primeira parte do trabalho. Na utilização do segundo dispositivo, foi possível operar em vazões volumétricas mais altas quando comparadas ao primeiro. Por fim, na terceira parte, foi realizado o estudo da complexação entre LC e pDNA por processo microfluídico também em dois diferentes dispositivos, um similar ao utilizado na segunda parte do trabalho, com focalização hidrodinâmica única, e outro com blocos regulares nas paredes do microcanal, o que aumenta a área de contato entre os fluidos. Os complexos formados no primeiro dispositivo apresentaram melhores respostas biológicas in vitro, as quais foram similares às do processo "bulk". No segundo dispositivo, ensaios de acessibilidade de sonda de fluorescencência ao DNA indicaram alteração na associação entre LC e DNA. Dessa forma, a partir dos resultados, conclui-se que os dispositivos microfluídicos estudados são uma alternativa promissora para a formação de LC e também sua complexão com pDNA em modo contínuo, tanto pela potencialidade tecnológica quanto biológica, o que contribui para o desenvolvimento de produtos farmacêuticos que veiculam DNA e que são destinados à terapia e vacinação gênica / Abstract: This research aimed at the technological development of microfluidic process for nonviral carriers production based on the electrostatic complexation between cationic liposomes (CL) and plasmidal DNA (pDNA) for gene and vaccine therapy applications. The development of this process was compared to the conventional bulk process, in which the solutions are mixed followed by the simple hand shaking or brief vortexing, what generates difficulties on the particles sizes control and can affect the biological functionality and colloidal stability of the formulations. In contrast, microfluidic process, which uses devices that manipulate small amounts of fluids (10-9 to 10-18 liters), allows the electrostatic complexation in continuous mode, controlling diffusion conditions, which also allows the colloidal control of the obtained formulations. Furthermore, microfluidic devices have minimum dimensions and operate with low energy consumption. Methodologically, the present work was carried out in three mean steps: in the first step, the physicochemical, structural and biological characteristics of the pDNA/CL complexes obtained by the bulk process were studied. In this step, it was possible to verify the correlation of physicochemical and structural properties with the transfection phenomenon in vitro of HeLa cells. The second part of this work focused the optimization of the production of CL through two microfluidic devices, with single and double hydrodynamic focusing, to obtain similar CL to those of the first step of this work. By employing the second device, it was possible to operate at higher volumetric flow rates than the first one. Finally, in the third step, it was explored the complexation between CL and pDNA via microfluidic process also in two different microfluidic devices; the first was similar to that employed in the second part of this work, with a single hydrodynamic focusing, and a second one with patterned microchannel walls, which increase the surface contact area between the fluids. The complexes formed in the first device showed better biological results in vitro, which were similar to the complexes formed in the bulk complexation method. In the patterned device, the experiments of the DNA accessibility to fluorescent probe pointed out modifications between the pDNA and CL association in the complexes. In conclusion, we showed that the studied microfluidic devices are a promising alternative for the production of CL and the complexation with pDNA in continuous mode, because of the technological and biological potentialities, which contributes to the development of feasible processes, for the production of new pharmaceutical products for gene and vaccine therapies / Mestrado / Desenvolvimento de Processos Biotecnologicos / Mestre em Engenharia Química

A leishmaniose é causada por protozoários do gênero Leishmania e no Brasil, as principais espécies causadoras da leishmaniose cutânea são Leishmania (V.) braziliensis e Leishmania (L.) amazonenses. O tratamento da leishmaniose apresenta diversas dificuldades, portanto é fundamental a descoberta de novos fármacos ativos, podendo ser detectada em células cultivadas in vitro e também em animais íntegros, através da técnica de bioimageamento. Neste trabalho, propusemo-nos a produzir linhagens de L. (V.) braziliensis e L. (L) amazonenses expressoras de luciferase e caracterizar o comportamento das linhagens mutantes em testes de sensibilidade a fármacos e de infecção in vitro e in vivo. Foi confirmada a emissão de luz pelas linhagens mutantes das duas espécies de Leishmania, em promastigotas e amastigotas. O comportamento das linhagens mutantes obtidas em relação a curvas de crescimento, sensibilidade aos fármacos tamoxifeno e anfoterina B em promastigotas, perfil de infectividade e sobrevivência em macrófagos e sensibilidade de amastigotas à anfotericina B foi comparado ao comportamento das linhagens parentais, não sendo observadas diferenças significativas. Camundongos BALB/c infectados com a linhagem expressora de luciferase de L. (L.) amazonenses desenvolveram lesões comparáveis aos animais infectados com a cepa selvagem, sendo possível quantificar a carga parasitária nesses animais por bioimageamento. Os resultados obtidos neste trabalho indicam que os parasitas mutantes expressores de luciferase obtidos podem ser utilizados em testes de sensibilidade a fármacos tanto in vitro como in vivo, representando um avanço metodológico nessa área de pesquisa. / Leishmaniasis is caused by protozoan parasites in Brazil, the main causative species of cutaneous leishmaniasis are Leishmania (Viannia) braziliensis and Leishmania (Leishmania) amazonenses. The treatment of leishmaniasis presents several difficulties, and the discovery of new active drugs for the treatment of leishmaniasis is therefore fundamental. The enzyme luciferase is a reporter widely used in screening tests for new drugs. This enzyme catalyzes the oxidation of luciferase in the presence of ATP emitting light that can be detected in cultured cells in vitro as well as in intact animals, using the technique of bioimaging. In this work, we sought to produce strains of L. (V.) braziliensis and L. (L) amazonenses expressing luciferase and characterize the behavior of these mutant strains in drug susceptibility tests and in in vitro and in vivo infections. Production of light was detected in mutants of both species, in all life cycle stages. Mutant strains were compared to their corresponding parental lines as to their growth pattern, infectivity and survival profile in macrophages and sensitivity to amphotericin B and tamoxifen. No significant differences were observed for these parameters. BALB/c mice infected with the luciferase expressing line of L. (L.) amazonenses developed lesions comparable to those in animals infected with the wild-type strain. The parasite load in these animals was quantified through bioimaging. The results obtained of this study indicate that the mutant parasites expressing luciferase can be used for drug susceptibility testing in vitro and in vivo, representing a methodological advance in this area of research.

Pouco se sabe sobre o mecanismo de ação da pentamidina, um composto utilizado no tratamento das leishmanioses. Para uma melhor compreensão do mecanismo de ação assim como o mecanismo de resistência à pentamidina, foi isolado um gene que codifica um membro da família de transportadores ABC, chamado PRP1 capaz de conferir resistência à pentamidina em formas promastigotas e amastigotas de Leishmania spp. O tratamento dos transfectantes que superexpressam a PRP1 com pentamidina em presença de concentrações não tóxicas de verapamil, um inibidor de transportadores ABC, foi capaz de reverter a resistência mediada por esse transportador. Foram ainda isolados nesse estudo duas linhagens de L. amazonensis resistentes à pentamidina. A análise molecular dos parasitos indicou que esses mutantes não apresentaram nenhuma amplificação de DNA, inclusive do gene PRP1 que também não se mostrou superexpresso em ambas as linhagens. As duas linhagens resistentes à pentamidina tiveram sua resistência revertida quando tratadas com verapamil, indicando que o mecanismo de resistência nesses mutantes pode estar associado a um transportador ABC. Os resultados obtidos nesse estudo fornecem dados para uma melhor compreensão do mecanismo de resistência à pentamidina e sugerem um provável potencial da associação pentamidina e verapamil no tratamento da doença. / Little it is known about the mechanism of action of pentamidine, an compound used for leishmaniases chemotherapy. To understand the mechanism of action and resistance of pentamidine, it was isolated a gene that codifies a member of ABC transporter family, named as PRP1 able to confer pentamidine resistance in promastigotes and amastigotes of Leishmania spp. Treatment of transfectants overexpressing PRP1 with pentamidine in presence of non toxic concentration of verapamil, an inhibitor of ABC transporters, was able to reverse the drug resistance mediated by this transporter. Two lines of L. amazonensis resistant to pentamidine were selected. Molecular analysis of parasites indicated that these mutants do not contain amplified DNA, including the PRP1 gene either not associated with overexpression in both lines. The two lines resistant to pentamidine had their resistance reversed when treated with verapamil, indicating that the mechanism of resistance may be associated to an ABC transporter. The results of this work lead to new insights for a better understanding of the mechanism of of resistance suggesting a probably potencial of pentamidine and verapamil association in the chemotherapy.

Pouco se sabe sobre o mecanismo de ação da pentamidina, um composto utilizado no tratamento das leishmanioses. Para uma melhor compreensão do mecanismo de ação assim como o mecanismo de resistência à pentamidina, foi isolado um gene que codifica um membro da família de transportadores ABC, chamado PRP1 capaz de conferir resistência à pentamidina em formas promastigotas e amastigotas de Leishmania spp. O tratamento dos transfectantes que superexpressam a PRP1 com pentamidina em presença de concentrações não tóxicas de verapamil, um inibidor de transportadores ABC, foi capaz de reverter a resistência mediada por esse transportador. Foram ainda isolados nesse estudo duas linhagens de L. amazonensis resistentes à pentamidina. A análise molecular dos parasitos indicou que esses mutantes não apresentaram nenhuma amplificação de DNA, inclusive do gene PRP1 que também não se mostrou superexpresso em ambas as linhagens. As duas linhagens resistentes à pentamidina tiveram sua resistência revertida quando tratadas com verapamil, indicando que o mecanismo de resistência nesses mutantes pode estar associado a um transportador ABC. Os resultados obtidos nesse estudo fornecem dados para uma melhor compreensão do mecanismo de resistência à pentamidina e sugerem um provável potencial da associação pentamidina e verapamil no tratamento da doença. / Little it is known about the mechanism of action of pentamidine, an compound used for leishmaniases chemotherapy. To understand the mechanism of action and resistance of pentamidine, it was isolated a gene that codifies a member of ABC transporter family, named as PRP1 able to confer pentamidine resistance in promastigotes and amastigotes of Leishmania spp. Treatment of transfectants overexpressing PRP1 with pentamidine in presence of non toxic concentration of verapamil, an inhibitor of ABC transporters, was able to reverse the drug resistance mediated by this transporter. Two lines of L. amazonensis resistant to pentamidine were selected. Molecular analysis of parasites indicated that these mutants do not contain amplified DNA, including the PRP1 gene either not associated with overexpression in both lines. The two lines resistant to pentamidine had their resistance reversed when treated with verapamil, indicating that the mechanism of resistance may be associated to an ABC transporter. The results of this work lead to new insights for a better understanding of the mechanism of of resistance suggesting a probably potencial of pentamidine and verapamil association in the chemotherapy.