Made available in DSpace on 2015-07-22T20:50:09Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2010-11-24 / O ultrassom (US) vem sendo amplamente utilizado para melhorar a eficiência de transfecção de vetores não-virais. No entanto, o mecanismo pelo qual o US promove a entrega de DNA nas células ainda é pouco entendido. Este fenômeno é normalmente atribuído a sonoporação. Porém, com base em experimentos anteriores realizados em nosso laboratório, suspeitamos que outro mecanismo esteja envolvido no processo de captação de DNA. Para estudar o mecanismo de entrega, um vetor plasmideal expressando EGFP (pEGFP-N3, 4,7 kb) foi utilizado para transfectar células NIH3T3 com um aparelho de US terapêutico sem a adição de microbolhas. Em condições de insonação de 2 W/cm2, duty cycle de 20% por 30s o US promoveu cerca de 40% de eficiência de transfecção, mas com 1 W/cm2 resultou em níveis muito baixos de transfecção. Fixados esses parâmetros, também foi avaliada a produção de espécies reativas de oxigênio (ROS), o aumento da concentração intracelular de cálcio ([Ca2+]i) e as alterações no potencial de membrana através de microscopia confocal. A produção de ROS foi aumentada durante a insonação, sendo interrompida logo que o US foi desligado. A [Ca2+]i também foi aumentada durante a exposição ao US, mas seus níveis não retornaram ao basal durante os 3 minutos de observação. Porém, 1 W/cm2 não foi suficiente para mobilizar o cálcio durante a insonação, e o influxo de cálcio teve início apenas 12 segundos após o término do US. Quando expostas ao US, as células também apresentaram mudanças no potencial de membrana atingindo um estado de hiperpolarização, retornando ao estado normal logo que o US foi desligado. A alteração desses três parâmetros pelo US sugere que a entrega de DNA plasmideal deva ocorrer por endocitose. Por fim, utilizando DNA plasmideal fluorescente, mostramos que esta molécula entra na célula via endocitose mediada por clatrina. / Ultrasound (US) has been widely used to improve the efficiency of non-viral vector transfection. However, the mechanism that enables the uptake of plasmid DNA in cells by US insonation is poorly understood, but it is typically attributed to sonoporation. Based on our previous results, we hypothesized that other mechanisms, such as endocytosis, are involved in this process. To explore the mechanism of plasmid DNA uptake, a plasmid vector expressing EGFP (pEGFP-N3: 4.7 kb) was used to transfect NIH3T3 cells using a therapeutic US without microbubbles and was monitored in real-time using a confocal microscope. We achieved about 40% transfection efficiency when we applied 2 W/cm2 with 20% of duty-cycle for 30 s, but 1 W/cm2 resulted in a very low level of transfection. In these experiments, the production of reactive oxygen species was augmented during the insonation but was stopped soon after turning off the US. Calcium influx was also augmented during the insonation, but its level did not return to basal levels following the 3-min observation period. However, 1 W/cm2 was not sufficient to mobilize calcium influx during the insonation, and calcium influx began 12 s after turning off the US. US insonation also changed the cell membrane potential to promote a hyperpolarization state, which returned to the normal state soon after turning off the US. The alteration of these parameters by US indicates the uptake of plasmid DNA by endocytosis. Finally, using a fluorescently labeled plasmid, we showed that this molecule enters into cells via clathrin-mediated endocytosis, not via caveolin-1. / TEDE / BV UNIFESP: Teses e dissertações

Made available in DSpace on 2014-08-20T13:32:59Z (GMT). No. of bitstreams: 1 tese_vinicius_farias_campos.pdf: 556217 bytes, checksum: 4c9dc7811c567f171aaebfafce2d2254 (MD5) Previous issue date: 2011-07-29 / Nanobiotechnology has provided new scientific and technological knowledge in distinct areas making it a priority area of research in developed and developing countries. The sperm-mediated gene transfer (SMGT) technique may become more simple, efficient and cost-effective technique for the generation of transgenic animals. The development of nanocomposites able to carry foreign DNA into the nucleus of cells with greater efficiency allows techniques such as SMGT be improved. The NanoSMGT is a technique used to generate transgenic animals in which nanotechnology is used to enhance the ability of sperm to capture exogenous DNA. The objective of this study was to determine whether cationic nanopolymer or halloysite clay nanotubes are able to transfect the exogenous DNA to unsorted and sex-sorted bovine sperm then evaluate whether these sperm are able to transmit transgene to in vitro fertilized bovine embryos. Using real-time PCR, we found that the cationic nanopolymer is capable of introducing exogenous DNA into unsorted and sex-sorted bovine sperm without negative effects to sperm motility and viability. Was also demonstrated for the first time that cationic nanopolymer or halloysite clay nanotubes are able to increase both the sperm DNA transfection of as the transmission of the transgene to bovine embryos produced in vitro. These results demonstrate that NanoSMGT can be a viable technique for producing transgenic bovine embryos. / A nanobiotecnologia tem proporcionado novos avanços científicos e tecnológicos em diversas áreas do conhecimento tornando-se assim área de pesquisa prioritária em países desenvolvidos e em desenvolvimento. A transferência gênica mediada por espermatozóides (SMGT) poderá se tornar a técnica mais simples, eficiente e com melhor custo-benefício para a geração de animais transgênicos. O desenvolvimento de nanocompósitos capazes de carrear o DNA exógeno para o interior de células com maior eficiência permite que técnicas como a SMGT sejam aperfeiçoadas. A NanoSMGT é uma técnica utilizada para a geração de animais transgênicos onde a nanotecnologia é utilizada para incrementar a habilidade dos espermatozóides em capurar o DNA exógeno. O objetivo do presente trabalho foi de verificar se nanopolímero catiônico ou nanotubos de haloisita são capazes de transfectar o DNA exógeno para o interior de espermatozóides bovinos sexados e não sexados e em seguida verificar se estes espermatozóides transfectados são capazes de gerar embriões bovinos transgênicos. Utilizando PCR em tempo real, verificou-se que o nanopolímero catiônico é capaz de introduzir o DNA exógeno em espermatozóides bovinos sexados e não sexados sem danos para a motilidade e viabilidade espermática. Também foi demonstrado pela primeira vez que o nanopolímero catiônico ou os nanotubos de haloisita são capazes de incrementar tanto a transfecção de DNA em espermatozóides como a transmissão do transgene para embriões bovinos produzidos in vitro. Estes resultados demonstram que a NanoSMGT pode ser uma técnica viável para a produção de embriões bovinos transgênicos.

Dentre as vantagens do sistema de expressão gênica em células de drosófila observa-se ainda o estabelecimento rápido de linhagens estáveis de células que secretam de forma eficiente a proteína recombinante. Temos estabelecidas populações de células co-transfectadas S2AcGPV e transfectadas S2AcGPVHy. O objetivo deste trabalho é a comparação da expressão de GPV em células S2 co-transfectadas com os vetores pAcGPV (vetor de expressão) e o pCoHygro (vetor de seleção) ou transfectadas com um único vetor pAcGPVHygro (contendo o vetor de expressão e seleção). As populações obtidas foram analisadas em relação à expressão de GPV em imunoensaios: teste ELISA, Dot Blot, géis de SDS-PAGE, Western Blot, citometria de fluxo (FACS) e microscopia confocal. Os ensaios de imunofluorescência em citometria fluxo (FACS) realizados demonstraram que as células transfectadas e co-transfectadas estão expressando a proteína GPV. Valores entre 0,3 e 4 mg/107 células foram obtidos. Além disso, anticorpos anti-GPV foram capazes de reconhecer a proteína GPV . / Among the advantages of the system of gene expression in cells drosófila there is still the rapid establishment of stable cell lines that secrete efficiently the recombinant protein. We have established populations of cells co-transfected S2AcGPV and transfected S2AcGPVHy. The objective of this study is a comparison of the expression of GPV in S2 cells co-transfected with vector pAcGPV (vector of expression) and pCoHygro (vector of selection) or transfected with a single vector pAcGPVHygro (containing the vector of expression and selection gene). The populations were analyzed in relation to the expression of GPV in immunoassays: ELISA test, Dot Blot, the SDS-PAGE gels, Western Blot, flow cytometry (FACS) and confocal microscopy. Tests of immunofluorescence in flow cytometry (FACS) have shown that cells co-transfected and transfected are expressing the protein GPV. Values between 0.3 and 4 mg/107células were obtained. Moreover, anti-GPV were able to recognize the protein GPV.

Modelos humanizados de porco são muito importantes para pesquisa biomédica e desenvolvimento de novas drogas e tratamentos. Além de ser um melhor modelo para doenças humanas do que animais de menor porte devido sua maior semelhança fisiológica, anatômica, de metabolismo e tempo de vida, o modelo suíno ainda permite suprimento ilimitado de órgãos para transplante. Apesar dessas vantagens, a expressão gênica inconsistente de animais transgênicos tornam a criação e avaliação desses animais muito dispendiosas, imprevisível e não permite a comparação de resultados de animais diferentes de maneira apropriada. Nesse estudo descrevemos uma nova técnica utilizando o promoter endógeno para a geração de um protocolo de substituição de genes com padrão clonal (transplante clonal de genes) sem clonagem de células, preservando a expressão genética e sua regulação intactas. Esse protocolo é reprodutível e pode ser aplicado para mais de um alvo genético, permitindo geração rápida de linhas transgênicas de animais (14-20 dias) com potencial de se tornar o novo padrão para geração de animais transgênicos de grande porte Suínos / Humanized pig models are very important for biomedical research, and drugs and treatment development. Not only it is a better model for diseases than smaller animals because of its closer physiology, anatomy, metabolism and life span, it also may provide unlimited organs for transplantation. In spite of all this advantages, inconsistent gene expression in transgenic animals make its generation and evaluation expensive, unpredictable and do not allow proper outcome comparison between different animals. In this report we describe a reproducible technique utilizing the endogenous promoter for generation of a clonal pattern gene replacement protocol (clonal gene transplant) without cell cloning, maintaining the normal gene expression and its regulation. This protocol is reproducible and applicable to more than one gene target, allowing fast generation of transgenic animals cell lines (as low as 14-20 days) and could become the new standard for transgenic large animal generation

O desenvolvimento da imunoterapia do câncer baseada em células dendríticas (DCs) é alvo de vários estudos. Para tumores sólidos, a abordagem baseada no uso de DCs alogenêicas fundidas com células tumorais tem se mostrado relativamente eficaz. Por outro lado, esta estratégia necessita uma massa tumoral considerável de cada paciente para a geração das células híbridas. Para contornar este problema o uso de DCs transfectadas com mRNA tumoral, o qual pode ser amplificado in vitro a partir de uma pequena amostra inicial do tumor, tem sido investigado. Para isto, uma transfecção eficiente e tradução correta do mRNA tumoral nas DCs são etapas críticas. Sabendo-se que as DCs de pacientes com câncer possuem atividade aloestimuladora defeituosa, DCs derivadas de doadores saudáveis poderiam ser uma alternativa para induzir uma resposta imune mais eficiente. Assim, este trabalho pretendeu aprimorar a metodologia de transfecção de DCs alogenêicas, derivadas de monócitos de doadores saudáveis, com mRNA de antígenos tumorais (survivina e RPSA) super-expressos na leucemia linfóide crônica (LLC) e avaliar sua capacidade em estimular a resposta linfocitária. Ao mesmo tempo, foram estabelecidas as metodologias para amplificação e síntese do RNA destes antígenos tumorais específicos, assim como do RNA mensageiro total, contidos nas células tumorais de pacientes com LLC. Os resultados mostraram ser possível a amplificação do mRNA total extraído das células leucêmicas com manutenção da expressão dos antígenos tumorais. Ainda, várias condições de transfecção com mRNA da survivina, transcrito in vitro, foram testadas, encontrando-se na lipofecção, a melhor maneira de transfectar as DCs. A lipofecção mostrou-se com baixa toxicidade quando comparada à técnica de eletroporação. Observou-se uma eficiência em torno de 40% de células transfectadas num intervalo de tempo entre 12 e 48 horas. Estas células foram usadas como estimuladoras em ensaios de proliferação usando-se linfócitos T alogenêicos como células respondedoras. As células transfectadas com mRNA da survivina foram capazes de estimular resposta linfoproliferativa com maior produção de IFN-gama, avaliado por ELISA. Além disso, a transfecção não alterou o padrão de expressão dos marcadores de superfície característicos das DCs. Estes dados mostram que a transfecção das DCs com mRNA pode afetar a resposta imune induzida por estas APCs. Nossos resultados suportam o uso de DCs transfectadas com mRNA para produção de vacinas anti-tumorais e mostram a survivina como um potente antígeno indutor da resposta linfocitária. / The development of dendritic cell (DC)-based cancer immunotherapy has been the target of many studies. For solid tumors, a promising approach based in allogeneic DCs fused to tumor cells has been relatively effective. On the other hand, this approach needs large tumor samples to generate enough DC-tumor cell hybrids. To overcome this problem, tumor mRNA-transfected DCs can be used, since mRNA can be amplified in vitro and allow unlimited vaccine production. For this, efficient transfection and optimal translation of tumor mRNA in DCs are critical. Moreover, DC derived from cancer patients has defective alostimulatory activity. In this case, DC derived from healthy donors may be an alternative to induce immune response more efficiently. Here, we established the methodology of allogeneic DC transfection with mRNA for tumor antigens (survivin and RPSA) overexpressed in chronic lymphocytic leukemia (CLL), and evaluated their ability for T cell stimulation. At the same time, we established mRNA amplification and mRNA in vitro transcription methodology for specific tumor antigens and total messenger RNA, present in CLL tumor cells. Our results showed it to be possible to amplify total mRNA derived from leukemic cells maintaining tumor antigen expression. Moreover, several transfection conditions using survivin mRNA obtained from in vitro transcript reactions were evaluated, defining lipofection as the better way to transfect DC. We obtained nearly 40% of transfected DCs between 12 and 48 hours. Transfected DCs were used as stimulator cells in proliferation assays using allogeneic T cells as responder cells. Survivin mRNA transfected DCs were able to stimulate T cell proliferation with increased IFN-gama production, measured by ELISA. Furthermore, the transfection did not change the pattern of surface molecules expression characteristic of DC. These data show that mRNA DC transfection can affect immune responses induced by these APCs. These findings support the use of tumor mRNA transfected DCs for anti-cancer vaccine production and show survivin as a potent antigen to induce T cell responses.

As proteínas que contem domínios ricos em leucina (LRR) mediam interações macromoleculares que estão envolvidas em muitos processos biológicos como infecção bacteriana em células hospedeiras e respostas imunológicas de plantas. Estudos anteriores em nosso laboratório identificaram um gene que codifica uma proteína contendo 6 LRRs (LaLRR17) em L. (L.) amazonensis. O LaLRR17 é um gene com expressão estágio regulada sendo abundantemente expresso na fase amastigota. Seqüências homólogas ao gene LaLRR17 foram encontradas em todas as espécies de Leishmania analisadas. Esse trabalho tem como objetivo a caracterização da proteína homóloga em L. (L.) major (LmLRR17). Anticorpos obtidos contra seqüências conservadas das proteínas LaLRR17 e LmLRR17 permitiram o estudo da abundância protéica em diferentes estágios do parasita. Curiosamente, a proteína LmLRR17 foi encontrada em maior abundância em promastigotas procíclicos em vez de amastigotas. Linhagens hiperexpressoras da proteína LmLRR17 ou expressoras da proteína LaLRR17 em fusão com o epitopo viral myc foram obtidas. As proteínas quiméricas foram expressas seguindo o mesmo padrão observado na cepa selvagem. O fenótipo desses mutantes foi avaliado mediante infecções de macrófagos in vitro. A hiperexpressão da proteína LmLRR17 em L. (L.) major não alterou o fenótipo da infecção in vitro. Por outro lado, a expressão da proteína heteróloga, LaLRR17, em promastigotas de L. (L.) major levou a incremento na virulência com maior número de células infectadas e de parasitas por célula. Esses resultados indicam que a expressão da proteína LmLRR17 em L. (L.) major é fortemente regulada. Esse trabalho também mostra que a expressão da proteína LaLRR17 em L. (L.) major leva a um aumento na infectividade. / Proteins containing leucine rich repeats (LRR) are known to be involved in macromolecular interactions in many processes such as signal transduction, cell-adhesion, RNA processing, apoptosis, disease resistance and immune response. A previous study in our laboratory identified a L. (L.) amazonensis gene encoding a protein containing 6 LRRs (LaLRR17). LaLRR17 is a stage-regulated gene expressed with increased abundance in the amastigote stage. Highly conserved homologues of LaLRR17 were found in all Leishmania species analyzed. Therefore, the aim of this study was to characterize the homologous protein of L. major (LmLRR17). Antibodies raised against peptide sequences common to LaLRR17 and LmLRR17 allowed the study of the steady-state protein abundance. Interestingly, LmLRR17 protein was found to be up-regulated in procyclic promastigotes, instead of amastigotes. Mutants of L. (L.) major overexpressing a myc-tagged version of LmLRR17 or of LaLRR17 protein were obtained. In these parasites, the chimeric proteins were expressed following the same pattern of expression observed in the wild type parasites. The phenotype of these mutants was assessed in vitro through macrophage infections. Overexpression of LmLRR17 protein in L. (L.) major resulted in an unaltered phenotype. On the other hand, overexpression of LaLRR17 in L. (L.) major induced an increase in virulence with a higher number of infected cells and intracellular parasites. These results indicate that the expression of LmLRR17 protein in L. major is tightly regulated and the expression of the heterologous LaLRR17 protein increased infectivity in vitro.

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:35:11Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2010-02-05Bitstream added on 2014-06-13T20:26:13Z : No. of bitstreams: 1 goncalves_fs_dr_jabo.pdf: 3109118 bytes, checksum: 5a4b81536e1b9bd9d62a0e42796b675b (MD5) / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / O fator de transcrição Oct-4 é bem conservado entre as espécies e é conhecido por ser expresso em embriões e células-tronco embrionárias (CTE), sendo um importante marcador da pluripotência. Recentemente, foi relatado que a combinação de Oct-4 com três outros fatores de transcrição Klf-4, c-Myc e Sox2 foram capazes de reprogramar células somáticas a um estado indiferenciado pluripotente, chamadas células-tronco pluripotentes induzidas (“células iPS”), as quais apresentam várias das mesmas propriedades das CTE incluindo a pluripotência, auto-renovação e proliferação. O objetivo desse estudo foi avaliar a funcionalidade do promotor Oct-4 de eqüino em CTE de murinos. Três vetores plasmidiais expressando GFP (“green fluorescent protein”) sob o controle do promotor Oct-4 de equinos, camundongo e quatro vetores lentivirais, também contendo o gene reporter GFP e os promotores Oct-4 de equinos, camundongo e humanos, pLZ2-ecOCT-EGFP (meq) (sequência equivalente de camundongos), pLZ2-ecOCT-EGFP (heq) (sequência equivalente de humanos), pLZ2-mOCT-EGFP e pLZ2-hOCT-EGFP, respectivamente, foram construídos. Todos os vetores também contêm um sítio de resistência à blasticidina que permite a seleção das células estáveis e das células transduzidas. Essas construções plasmidiais foram verificadas se funcionavam eficientemente, bem como o efeito do promotor Oct-4 em transfectar transientes e estáveis CTE. As construções com promotor Oct-4 de camundongo, humano e eqüino (sequência análoga à de camundongo) produziram somente 6% de células GFP positivas com intensidade de fluorescência (IF) >1000 pela análise em citômetro de fluxo, enquanto que o plasmídeo contendo o promotor Oct-4 de eqüino (sequência equivalente à de humanos) produziu menos células GFP positivas (>3%) com IF >1000, quando... / The pluripotency transcription factor Oct-4 is well conserved among species and is known to be expressed in embryos and embryonic stem (ES) cells; it is being an important pluripotency marker. It was recently demonstrated that the combination of Oct-4 with three other factors Klf-4, c-myc and Sox2 were able to reprogram somatic cells to a pluripotent and undifferentiated state. These cells known as induced pluripotent stem (iPS) cells share several properties with ES cells including self-renewal, proliferation and pluripotency. The aim of this study was to assess the functionality of the horse Oct-4 promoter in mouse ES cells. Three plasmids vectors expressing GFP (green fluorescent protein) under the control of the horse, mouse and four lentivirus vectors also containing reporter gene GFP and horse, mouse and human promoters, pLZ2-ecOCT-EGFP (mouse sequence equivalent), pLZ2-ecOCT-EGFP (human sequence equivalent), pLZ2-mOCT-EGFP and pLZ2-hOCT-EGFP, respectively, were built. All these vectors also contain a blasticidin resistance cassette to allow selection of transfected stable cells and transduced cells. Afterwards, to assess the functionality of the Oct-4 promoter all plasmids were tranfected the into transient and stable mouse ES cells. Constructs with mouse, human and horse (mouse analog sequence) Oct-4 promoter produced only 6% GFP positive cells with fluorescence intensity (FI)>1000 by 20 FACs assay, while plasmid horse (human analog sequence) Oct-4 promoter produced less GFP positive cells (>3%) with FI>1000, when compared with the positive control and among groups. However, GFP expression was not present in stable cells, whereas there were Blasticidin-resistant colonies-forming from 6 days post-transfection. To optimize the system in mouse ES cells, pLZ2-mOCT-EGFP and pLZ2-hOCT-EGFP lentivectors, were tested as controls. It was used HIV-1-derived... (Complete abstract click electronic access below)

Made available in DSpace on 2016-08-17T18:39:44Z (GMT). No. of bitstreams: 1 4615.pdf: 2688296 bytes, checksum: 18c8fbe6fb83004856a32c02827d70f5 (MD5) Previous issue date: 2011-11-22 / Universidade Federal de Sao Carlos / Rabies is a zoonotic viral disease caused by a virus of the genus Lyssavirus that affects several species of mammals. Rabies remains a global public health threat that kills more than 55,000 people per year mainly in developing countries, this disease once established do not have a specific treatment. The RV envelope is composed of a glycoprotein, known as a unique antigen capable of conferring immune response against the rabies, and therefore, is the focus of research for development an efficient and safe recombinant vaccine based on this viral antigen. Cell line stably transfected S2 Drosophila melanogaster have been used in the production of many heterologous proteins and has been studied for the production of the rabies virus glycoprotein (RVGP) in our laboratory. This approach involves the selection of high producing cell populations; procedure that requires considerable periods of time (months), increasing management and costs of production. In this sense, in recent decades, many systems focused on the expression of heterologous proteins by transient expression of genes, were analyzed because they allow obtaining significant quantities of recombinant protein in a short period of time (weeks). For the use of transient transfection technology can be found a variety of methods and available agents, such as electroporation, cationic lipids, cationic polymers and calcium phosphate precipitated. The choice and optimization of each of them depends mainly on the cell type and protein being expressed. Thus, the objective of this study was to evaluate the transient expression of the glycoprotein gene of rabies virus (RVGP) in insect cells of Drosophila melanogaster S2 lineage, evaluating the vehicles transfection: calcium phosphate, cationic lipid (Cellfectin) and cationic polymer (ExGen500 and JetPEI). In order to determine the most efficient transfection agent, experiments were performed in 6 well plate and bottle of 100 mL of culture, which analyzed the influence of cell density, the concentration of DNA and transfection reagent volume on the expression of RVGP assessed by ELISA and fluorescence microscopy. Yields ranging from 50-90 ng/107cel were obtained in different experiments on multiwell plate, suggesting strong effect of ratio DNA: transfection agent used. Comparison of transfection agents showed no significant differences. In transfections made in suspension culture was analyzed the effect of the plasmid (whether or not the signal of BiP cell secretion) on the expression RVGP. When we used the plasmid containing the signal BiP (pMTiRVGP) were obtained 160 ng/107cel of RVGP production, and 200 ng/mL of volumetric production without significant differences between the different transfection agents. However, significant differences were found when we used the plasmid not containing the signal BiP (pMTRVGP), with the RVGP production was 60 ng/107cells in cells transfected with Cellfectin, ExGen500 and calcium phosphate, except in cells transfected with JetPEI was reached a production of 120 ng/107cells. In preliminary experiment bottle type "spinner" with a working volume of 60 mL were achieved expressions of 140 ng/107cel of RVGP in cells transfected with JetPEI and calcium phosphate. This suggests that optimization of culture conditions and transfection are possible to increase recombinant protein expression in cultured on a large scale. / A raiva é uma enfermidade causada por um vírus do gênero Lyssavirus que afeta várias espécies de mamíferos. Esta doença apresenta um alto custo social e econômico principalmente em países em desenvolvimento. Na superfície do vírus da raiva está localizada a glicoproteína do vírus, reconhecida como antígeno capaz de conferir resposta imunológica contra a raiva, sendo, o foco de pesquisas no desenvolvimento de uma vacina recombinante. Células da linhagem Drosophila melanogaster S2 estavelmente transfectadas têm sido usadas na produção de muitas proteínas heterólogas e tem sido estudada para a produção da glicoproteína do vírus da raiva (RVGP) em nosso laboratório. A abordagem para a obtenção de linhagens recombinantes estáveis envolve a seleção de populações celulares altamente produtoras; sendo um processo que requer consideráveis períodos de tempo (meses), uma elevada manipulação e altos custos de produção. Neste sentido, nas últimas décadas, muitos sistemas focados na expressão de proteínas heterólogas através da expressão transiente de genes foram analisados, porque eles permitem a obtenção de quantidades consideráveis de proteína recombinante em um curto período de tempo (semanas). Para o uso da tecnologia de transfecção transiente pode ser encontrada uma variedade de métodos e agentes disponíveis, tais como eletroporação, lipídeos catiônicos, polímeros catiônicos e fosfato de cálcio. Assim, o objetivo deste trabalho foi avaliar a expressão transiente do gene da glicoproteína do vírus da raiva (RVGP) em células de inseto da linhagem Drosophila melanogaster S2, avaliando os veículos de transfecção fosfato de cálcio, lipídeo catiônico (Cellfectin) e polímero catiônico (ExGen500 e JetPEI). A fim de determinar o agente de transfecção mais eficiente, foram feitos experimentos em placa de 6 poços e frasco de cultivo de 100mL, onde foram analisados a influência da densidade celular; a concentração de DNA, o volume do reagente de transfecção sobre a expressão da RVGP analisada através do método de ELISA. Quantidades de RVGP que variaram entre 50-90 ng/107cel foram obtidas nos diferentes experimentos feitos em placa, sugerindo um efeito da relação DNA: agente de transfecção. A comparação entre os agentes de transfecção não mostrou diferenças significativas. Nas transfecções feitas em cultura em suspensão foi analisado o efeito de transfectar o plasmídeo para expressão de RVGP contendo ou não o sinal de secreção celular BiP. Quando foi usado o plasmídeo contendo o sinal BiP (pMTiRVGP) foram atingidas valores de RVGP de 160 ng/107cel e produções volumétricas de 200 ng/mL, porém sem diferenças significativas entre os diferentes agentes de transfecção. Entretanto, foram encontradas diferenças quando foi usado o plasmídeo não contendo o sinal BiP (pMTRVGP), onde a produção de RVGP foi de 60 ng/107cells nas células transfectadas com Cellfectin, ExGen500 e fosfato de cálcio, porém as células transfectadas com JetPEI obtiveram uma produção de 120 ng/107cels de RVGP. Em experimento em frasco de cultivo tipo spinner com volume de trabalho de 60 mL, foram atingidas expressões de RVGP de 140 ng/107cel para células transfectadas com JetPEI e fosfato de cálcio, sugerindo que otimizações nas condições de cultivo e transfecção ainda podem ser testadas visando aumentar a expressão da proteína recombinante em cultivos em larga escala.

Modelos humanizados de porco são muito importantes para pesquisa biomédica e desenvolvimento de novas drogas e tratamentos. Além de ser um melhor modelo para doenças humanas do que animais de menor porte devido sua maior semelhança fisiológica, anatômica, de metabolismo e tempo de vida, o modelo suíno ainda permite suprimento ilimitado de órgãos para transplante. Apesar dessas vantagens, a expressão gênica inconsistente de animais transgênicos tornam a criação e avaliação desses animais muito dispendiosas, imprevisível e não permite a comparação de resultados de animais diferentes de maneira apropriada. Nesse estudo descrevemos uma nova técnica utilizando o promoter endógeno para a geração de um protocolo de substituição de genes com padrão clonal (transplante clonal de genes) sem clonagem de células, preservando a expressão genética e sua regulação intactas. Esse protocolo é reprodutível e pode ser aplicado para mais de um alvo genético, permitindo geração rápida de linhas transgênicas de animais (14-20 dias) com potencial de se tornar o novo padrão para geração de animais transgênicos de grande porte Suínos / Humanized pig models are very important for biomedical research, and drugs and treatment development. Not only it is a better model for diseases than smaller animals because of its closer physiology, anatomy, metabolism and life span, it also may provide unlimited organs for transplantation. In spite of all this advantages, inconsistent gene expression in transgenic animals make its generation and evaluation expensive, unpredictable and do not allow proper outcome comparison between different animals. In this report we describe a reproducible technique utilizing the endogenous promoter for generation of a clonal pattern gene replacement protocol (clonal gene transplant) without cell cloning, maintaining the normal gene expression and its regulation. This protocol is reproducible and applicable to more than one gene target, allowing fast generation of transgenic animals cell lines (as low as 14-20 days) and could become the new standard for transgenic large animal generation

O desenvolvimento da imunoterapia do câncer baseada em células dendríticas (DCs) é alvo de vários estudos. Para tumores sólidos, a abordagem baseada no uso de DCs alogenêicas fundidas com células tumorais tem se mostrado relativamente eficaz. Por outro lado, esta estratégia necessita uma massa tumoral considerável de cada paciente para a geração das células híbridas. Para contornar este problema o uso de DCs transfectadas com mRNA tumoral, o qual pode ser amplificado in vitro a partir de uma pequena amostra inicial do tumor, tem sido investigado. Para isto, uma transfecção eficiente e tradução correta do mRNA tumoral nas DCs são etapas críticas. Sabendo-se que as DCs de pacientes com câncer possuem atividade aloestimuladora defeituosa, DCs derivadas de doadores saudáveis poderiam ser uma alternativa para induzir uma resposta imune mais eficiente. Assim, este trabalho pretendeu aprimorar a metodologia de transfecção de DCs alogenêicas, derivadas de monócitos de doadores saudáveis, com mRNA de antígenos tumorais (survivina e RPSA) super-expressos na leucemia linfóide crônica (LLC) e avaliar sua capacidade em estimular a resposta linfocitária. Ao mesmo tempo, foram estabelecidas as metodologias para amplificação e síntese do RNA destes antígenos tumorais específicos, assim como do RNA mensageiro total, contidos nas células tumorais de pacientes com LLC. Os resultados mostraram ser possível a amplificação do mRNA total extraído das células leucêmicas com manutenção da expressão dos antígenos tumorais. Ainda, várias condições de transfecção com mRNA da survivina, transcrito in vitro, foram testadas, encontrando-se na lipofecção, a melhor maneira de transfectar as DCs. A lipofecção mostrou-se com baixa toxicidade quando comparada à técnica de eletroporação. Observou-se uma eficiência em torno de 40% de células transfectadas num intervalo de tempo entre 12 e 48 horas. Estas células foram usadas como estimuladoras em ensaios de proliferação usando-se linfócitos T alogenêicos como células respondedoras. As células transfectadas com mRNA da survivina foram capazes de estimular resposta linfoproliferativa com maior produção de IFN-gama, avaliado por ELISA. Além disso, a transfecção não alterou o padrão de expressão dos marcadores de superfície característicos das DCs. Estes dados mostram que a transfecção das DCs com mRNA pode afetar a resposta imune induzida por estas APCs. Nossos resultados suportam o uso de DCs transfectadas com mRNA para produção de vacinas anti-tumorais e mostram a survivina como um potente antígeno indutor da resposta linfocitária. / The development of dendritic cell (DC)-based cancer immunotherapy has been the target of many studies. For solid tumors, a promising approach based in allogeneic DCs fused to tumor cells has been relatively effective. On the other hand, this approach needs large tumor samples to generate enough DC-tumor cell hybrids. To overcome this problem, tumor mRNA-transfected DCs can be used, since mRNA can be amplified in vitro and allow unlimited vaccine production. For this, efficient transfection and optimal translation of tumor mRNA in DCs are critical. Moreover, DC derived from cancer patients has defective alostimulatory activity. In this case, DC derived from healthy donors may be an alternative to induce immune response more efficiently. Here, we established the methodology of allogeneic DC transfection with mRNA for tumor antigens (survivin and RPSA) overexpressed in chronic lymphocytic leukemia (CLL), and evaluated their ability for T cell stimulation. At the same time, we established mRNA amplification and mRNA in vitro transcription methodology for specific tumor antigens and total messenger RNA, present in CLL tumor cells. Our results showed it to be possible to amplify total mRNA derived from leukemic cells maintaining tumor antigen expression. Moreover, several transfection conditions using survivin mRNA obtained from in vitro transcript reactions were evaluated, defining lipofection as the better way to transfect DC. We obtained nearly 40% of transfected DCs between 12 and 48 hours. Transfected DCs were used as stimulator cells in proliferation assays using allogeneic T cells as responder cells. Survivin mRNA transfected DCs were able to stimulate T cell proliferation with increased IFN-gama production, measured by ELISA. Furthermore, the transfection did not change the pattern of surface molecules expression characteristic of DC. These data show that mRNA DC transfection can affect immune responses induced by these APCs. These findings support the use of tumor mRNA transfected DCs for anti-cancer vaccine production and show survivin as a potent antigen to induce T cell responses.