In dieser Arbeit wurde die funktionelle Rolle und Regulation des murinen Transkriptionsfaktor Foxp3 untersucht. Der erste wesentliche Teil zur Analyse der funktionellen Rolle war dabei die Erzeugung einer BAC- transgenen Maus. Hierfür wurde ein Zielgenvektor mit der kodierenden Region des eYFPs und einer dualen Selektionskassette sowie die Methode des ET- Klonierens verwendet. Leider war die homologe Rekombination des Zielgenvektors in den BAC nicht erfolgreich. Es kam zu einer ungeklärten Rekombination mit Fremd- DNS. Die Erzeugung der transgenen Maus wurde nach diesem Ergebnis eingestellt, und es wurde mit einer von unserem Kooperationspartner zur Verfügung gestellten BAC- transgenen Maus weitergearbeitet. Diese Maus, die DEREG- Maus, wurde nach dem gleichen Prinzip erstellt, wie die in dieser Arbeit gestartete transgene Maus, an Stelle des eYFPs trägt die DEREG- Maus die kodierenden Region des GFPs und des Diphtheria- Toxin- Rezeptors. Mit dieser Maus wurden erste Analysen zur Überprüfung der transgenen Maus unternommen. Es wurde die Koexpression von GFP und Foxp3, sowie die Depletion der Foxp3+ T- Zellen mittels Diphtheria- Toxin analysiert. Als nächstes wurde die funktionelle Rolle des Transkriptionsfaktors Foxp3 analysiert. Als einer der ersten Schritte wurde die Stabilität von Foxp3 in vivo überprüft und gezeigt, dass T- Zellen, die das Foxp3- Protein exprimieren, bis zu 14 Tage in vivo stabil sind. Weiterhin wurde die Stabilität der Foxp3- Expression in in vitro Kulturen nach Induktion durch TGF-beta untersucht. Die induzierten Tregs zeigten keine stabile Foxp3- Expression und auch bei der Methylierungsanalyse der TSDR zeigten diese T- Zellen nicht das für ex vivo isolierte Foxp3+ T- Zellen beschriebene Methylierungsmuster. Die Stabilität scheint mit der Demethylierung der TSDR zu korrelieren. Die induzierten Tregs zeigten neben dem nicht stabilen Foxp3- Phänotyp auch eine von der Foxp3- Expression abhängige Suppression von naiven Zellen im in vitro Proliferations- Test. Im dritten Teil der Arbeit wurde die Struktur und Regulation des Transkriptionsfaktors Foxp3 untersucht. Der Lokus wurde auf konservierte Regionen im Vergleich zu den Spezies Maus, Mensch, Ratte, Huhn, Schimpanse, Hund und Frosch untersucht. Die in Floess*, Freyer* et al. (63) gefundenen Region TSDR enthält einen hochkonservierten Bereich. Die Region wurde auf mögliche Transkriptionsfaktor- Bindungsstellen hin analysiert, und ebenfalls wurden in diesem Bereich Histon- Modifikationen für die Acetylierung der Histone H3 und H4, sowie Tri- Methylierung des Lysin4 des Histons H3 gefunden. Die TSDR wurde in Luciferase- Tests auf ihre transkriptionelle Aktivität hin getestet und zeigte einem Enhancer ähnliche unterstützende Aktivität. Die Methylierung der TSDR in den Luciferase- Tests führte zu einer Reduktion der transkriptionellen Aktivität. Deletionsmutanten der TSDR konnten den Bereich für die transkriptionelle Aktivität weiter einschränken und zeigten ein 275pb großes Fragment auf, in welchem viele interessante, mögliche Transkriptionsfaktor- Bindungsstellen und auch die größte Anzahl der differentiell methylierten CpG- Motive liegen. / The aim of the study was to analyze the function and regulation of the transcription factor Foxp3. In a first step we designed a BAC-transgenic mouse with eYFP under the control of the Foxp3 promoter. For creating these mice we use the ET- cloning method. The step of homologous recombination of the target vector into the BAC failed. Because of that, we decided to work in cooperation with the group of Tim Sparwasser from Munich and their BAC- transgenic mouse called DEREG- mouse. This mouse expresses the coding region of eGFP fused to the diphtheria- toxin- receptor under the control of the Foxp3 promoter. Therefore Foxp3+ T cells can be easily detected by eGFP expression and can even be depleted by diphtheria- toxin- application. We confirmed the co- expression of Foxp3 and eGFP and furthermore tested the functionality of the depletion- process of Foxp3+ T cells by treatment with diphtheria- toxin. In a second study, we analyzed the stability of Foxp3 expressing cells in vivo. Therefore we transferred Foxp3+ T cells in syngenic mice and analyzed these cells after 14 days for their Foxp3- expression. Furthermore, we tested the induction of Foxp3 expression through TGF-beta and the suppressive activity of these cells. We also analyzed those cells for their methylation pattern, comparing cells, which showed an induction of Foxp3- expression after one week of culture with TGF-beta to cells, which received TGF-beta for one week and were then restimulated in the absence of TGF-beta. The stability of Foxp3 expression seems to correlate with the demethylated state of the TSDR (Treg Specific Demethylated Region). To get a closer look on the region called TSDR in the murine foxp3 locus, we decided to analyze this region under different aspects. First, we checked for putative binding sites of transcription factors by database analysis of the TSDR. We also analysed histon modifications, such as acetylation of histon H3 and H4 and tri- methylation of lysine 4 at histon3, in this region. Presence of these modifications hinted an epigenetic regulation of Foxp3 involving the TSDR. In a last step, the transcriptional activity of TSDR was tested to delineate whether the TSDR serves as an alternative promoter or acts as a regulative element like an enhancer. Luciferase assays showed that TSDR is a regulative enhancer element, which loses transcriptional activity when methylated. Deletion mutants determined the most important fragment of the TSDR.

Das 1817 erstmals schriftlich erwähnte Selen galt lange Zeit nur als toxisch und sogar als procancerogen, bis es 1957 von Schwarz und Foltz als essentielles Spurenelement erkannt wurde, dessen biologische Funktionen in Säugern durch Selenoproteine vermittelt werden. Die Familie der Glutathionperoxidasen nimmt hierbei eine wichtige Stellung ein. Für diese sind konkrete Funktionen und die dazugehörigen molekularen Mechanismen, welche über die von ihnen katalysierte Hydroperoxidreduktion und damit verbundene antioxidative Kapazität hinausgehen, bislang nur unzureichend beschrieben worden. <br><br> Die Funktion der gastrointestinalen Glutathionperoxidase (GI-GPx) wird als Barriere gegen eine Hydroperoxidabsorption im Gastrointestinaltrakt definiert. Neuen Erkenntnissen zufolge wird die GI-GPx aber auch in verschiedenen Tumoren verstärkt exprimiert, was weitere, bis dato unbekannte, Funktionen dieses Enzymes wahrscheinlich macht.<br> Um mögliche neue Funktionen der GI-GPx, vor allem während der Cancerogenese, abzuleiten, wurde hier die transkriptionale Regulation der GI-GPx detaillierter untersucht. Die Sequenzanalyse des humanen GI-GPx-Promotors ergab das Vorhandensein von zwei möglichen "antioxidant response elements" (ARE), bei welchen es sich um Erkennungssequenzen des Transkriptionsfaktors Nrf2 handelt. Die meisten der bekannten Nrf2-Zielgene gehören in die Gruppe der Phase-II-Enzyme und verfügen über antioxidative und/oder detoxifizierende Eigenschaften. Sowohl auf Promotorebene als auch auf mRNA- und Proteinebene konnte die Expression der GI-GPx durch typische, in der Nahrung enthaltene, Nrf2-Aktivatoren wie z.B. Sulforaphan oder Curcumin induziert werden. Eine direkte Beteiligung von Nrf2 wurde durch Cotransfektion von Nrf2 selbst bzw. von Keap1, das Nrf2 im Cytoplasma festhält, demonstriert. Somit konnte die GI-GPx eindeutig als Nrf2-Zielgen identifiziert werden. Ob sich die GI-GPx in die Gruppe der antiinflammatorischen und anticancerogenen Phase-II-Enzyme einordnen lässt, bleibt noch zu untersuchen. <br><br> Die Phospholipidhydroperoxid Glutathionperoxidase (PHGPx) nimmt aufgrund ihres breiten Substratspektrums, ihrer hohen Lipophilie und ihrer Fähigkeit, Thiole zu modifizieren, eine Sonderstellung innerhalb der Familie der Glutathionperoxidasen ein. Mit Hilfe eines PHGPx-überexprimierenden Zellmodells wurden deshalb Beeinflussungen des zellulären Redoxstatus und daraus resultierende Veränderungen in der Aktivität redoxsensitiver Transkriptionsfaktorsysteme und in der Expression atheroskleroserelevanter Adhäsionsmoleküle untersucht. Als Transkriptionsfaktoren wurden NF-kB und Nrf2 ausgewählt. Die Bindung von NF-kB an sein entsprechendes responsives Element in der DNA erfordert das Vorhandensein freier Thiole, wohingegen Nrf2 durch Thiolmodifikation von Keap1 freigesetzt wird und in den Kern transloziert. Eine erhöhte Aktivität der PHGPx resultierte in einer Erhöhung des Verhältnisses von GSH zu GSSG, andererseits aber in einer verminderten Markierbarkeit freier Proteinthiole. PHGPx-Überexpression reduzierte die IL-1-induzierte NF-kB-Aktivität, die sich in einer verminderten NF-kB-DNA-Bindefähigkeit und Transaktivierungsaktivität ausdrückte. Auch war die Proliferationsrate der Zellen vermindert. Die Expression des NF-kB-regulierten vaskulären Zelladhäsionsmoleküls, VCAM-1, war ebenfalls deutlich verringert. Umgekehrt war in PHGPx-überexprimierenden Zellen eine erhöhte Nrf2-Aktivität und Expression der Nrf2-abhängigen Hämoxygenase-1 zu verzeichnen. Letzte kann für die meisten der beobachteten Effekte verantwortlich gemacht werden.<br><br> Die hier dargestellten Ergebnisse verdeutlichen, dass eine Modifizierung von Proteinthiolen als wichtige Determinante für die Regulation der Expression und Funktion von Glutathionperoxidasen angesehen werden kann. Entgegen früheren Vermutungen, welche oxidative Vorgänge generell mit pathologischen Veränderungen assoziierten, scheint ein moderater oxidativer Stress, bedingt durch eine transiente Thiolmodifikation, durchaus günstige Auswirkungen zu haben, da, wie hier dargelegt, verschiedene, miteinander interagierende, cytoprotektive Mechanismen ausgelöst werden. Hieran wird deutlich, dass sich "antioxidative Wirkung" oder "oxidativer Stress" keineswegs nur auf "gute" oder "schlechte" Vorgänge beschränken lassen, sondern im Zusammenhang mit den beeinflussten (patho)physiologischen Prozessen und dem Ausmaß der "Störung" des physiologischen Redoxgleichgewichtes betrachtet werden müssen. / Selenium was discovered in 1817 by the Swedish chemist Berzelius and was for a long time considered as being toxic and even procarcinogenic. In 1957, however, Schwarz and Foltz realized that selenium is an essential trace element which elicits its biological functions in mammals as a structural component of selenoproteins among which the family of glutathione peroxidases plays a dominant role. Glutathione peroxidases reduce hydroperoxides to the corresponding alcohols and contribute to the antioxidative capacity of a cell. However, other functions of glutathione peroxidases and the according molecular mechanisms have hardly been described.>br><br> The gastrointestinal glutathione peroxidase (GI-GPx) is believed to build a barrier against the absorption of foodborne hydroperoxides. In addition, GI-GPx expression is increased in different tumors. This indicates further, still unknown, functions of this enzyme.<br> In order to elucidate new possible functions of GI-GPx, especially during carcinogenesis, the transcriptional regulation of GI-GPx was analyzed in more detail. An analysis of the GI-GPx promoter sequence revealed the presence of two putative "antioxidant response elements" (ARE) which are recognition sites for the transcription factor Nrf2. Most of the known Nrf2 target genes either belong to the group of phase-II detoxification enzymes or possess antioxidative and/or detoxifying properties. On promoter level as well as on mRNA- and protein level the expression of GI-GPx was induced by typical Nrf2-activating compounds such as sulforaphane or curcumin that are contained in the diet. A direct involvement of Nrf2 was demonstrated by cotransfection of Nrf2 itself or by cotransfection of Keap1 which retains Nrf2 in the cytosol. Thus, the GI-GPx gene was unequivocally identified as a new target for Nrf2. Whether GI-GPx also belongs in the category of antiinflammatory and anticarcinogenic enzymes remains to be elucidated.<br><br> The phospholipid hydroperoxide glutathione peroxidase (PHGPx) is exceptional among the glutathione peroxidases because of its broad range of substrates, its high lipophilicity, and its ability to modify protein thiols. With PHGPx-overexpressing cells, the influence of PHGPx on the cellular redox state and on resulting changes in the activity of redox-sensitive transcription factors and on the expression of proatherogenic adhesion molecules was analyzed. For this, the redox-sensitive transcription factors NF-kB and Nrf2 were chosen. NF-kB requires free thiols for being able to bind to its responsive element within the DNA, whereas Nrf2 is released from Keap1 and translocates to the nucleus upon a modification of protein thiols. PHGPx-overexpression resulted in an increase in the ratio of GSH to GSSG, in a reduced amount of intracellular protein thiols, and in a diminished proliferation rate. Furthermore, PHGPx-overexpressing cells displayed a reduced IL-1-dependent NF-kB activity as was assessed by a reduced NF-kB DNA-binding ability and activity of a NF-kB-driven reporter gene. In addition, the expression of the NF-kB-dependent vascular cell adhesion molecule (VCAM-1) was also inhibited by overexpression of PHGPx. On the other hand, PHGPx-overexpressing cells displayed an increased activity of Nrf2 that was accompanied by an increased expression of the Nrf2-dependent heme oxygenase-1. Heme oxygenase-1 most likely is responsible for most of the aforementioned effects.<br><br> The data presented here show that a modification of protein thiols can be regarded as an important determinant for the regulation and for the functions of glutathione peroxidases. In contrast to the previous assumption that oxidative processes are always linked to pathologic changes, a moderate oxidative stress seems to have beneficial effects, because it triggers different cytoprotective mechanisms. It can be concluded that the terms "antioxidative effect" or "oxidative stress" cannot simply be restricted to "good" or "bad" processes, but need to be seen in context with the modulated (patho)physiological processes and the degree of "disturbance" of the physiologic redox balance.

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In Tabak interagieren das Ankyrin-repeat Protein NtANK1 und der basische Leucin Zipper (bZIP)-Transkriptionsfaktor NtBZI-1. Diese Proteine sind in Auxin-vermittelter Genaktivierung und in Pathogenabwehr involviert. Ziel dieser Arbeit war es, die Funktion der homologen Ankyrin-repeat Proteine AKR2A und AKR2B aus Arabidopsis thaliana zu untersuchen. Dazu wurde die Interaktion zwischen AKR2A/B, und den homologen bZIP-Transkriptionsfaktoren der Gruppe C getestet. Mit verschiedenen Methoden, wie Hefe- und Protoplasten-two-hybrid und BiFC ( bimolecular fluorescence complementation ) konnte eine Interaktion der Arabidopsis Proteine nicht bestätigt werden. Lokalisationsstudien von YFP-AKR2A/B-Fusionsproteinen bestätigten, dass die Proteine im Cytoplasma lokalisiert sind. Sie besitzen ein funktionsfähiges Kernexportsignal und akkumulieren nach Inhibierung des Kernexports im Kern. Zur Funktionsaufklärung wurden AKR2-RNAi Pflanzen erzeugt, die sich phänotypisch vom Wildtyp unterscheiden: sie zeigen ein verringertes Wachstum und einen reduzierten Chlorophyllgehalt, abhängig von der Ausprägung des RNAi-Effektes. In elektronenmikroskopischen Untersuchungen ist zu erkennen, dass sich die Blattchloroplasten der AKR2-RNAi Pflanzen von denen des Wildtyps morphologisch unterscheiden und in ihrer Entwicklung unspezifisch beeinträchtigt sind. Eine Transkriptomanalyse der AKR2-RNAi Pflanzen zeigte, dass Gene des Endomembransystems herunterreguliert sind und viele Stress-induzierte Gene hochreguliert sind. Deshalb wurden die Pflanzen verschiedenen Stressbedingungen unterzogen und übereinstimmend stellte sich heraus, dass sie anfälliger gegenüber oxidativem Stress, Infektion mit dem biotrophen Bakterium Pseudomonas syringae und Infektion mit dem nekrotrophen Pilz Botrytis cinerea waren. Diese erhöhte Anfälligkeit kann als sekundärer Effekt aufgrund der beeinträchtigten Chloroplasten-Biogenese oder als spezifische Reaktion auf die reduzierte AKR2A/B-Proteinmenge interpretiert werden. Da AKR2A/B bereits als Importver mittler für chloroplastidäre Membranproteine beschrieben wurden (Bae et al., 2008), werden zusammenfassend mit den hier erhaltenen Daten multiple Funktionen für AKR2A und AKR2B diskutiert: Transport von Proteinen zu verschiedenen Endomembransystemen, eine Funktion im Signalaustausch zwischen Chloroplast und Kern, und eine Regulation der Transkriptionskontrolle im Kern.