Dissertação apresentada para obtenção parcial do grau de Mestre em Engenharia Electrotécnica e de Computadores (Área de Especialização de Informática Industrial), na Faculdade de Engenharia da Universidade do Porto, sob a orientação Prof. Doutor José A. Soeiro Ferreira

The protein-energy malnutrition is one of the most serious nutritional problems that occur in developing countries. The energy and nutritional deficiency in early life can cause significant changes in different stages of development of central nervous system, since the cases of hyperplasia, hypertrophy and myelinization occur in more intense. The brain uses glucose as its main energy substrate. However, under certain physiological conditions, as during the weaning or during prolonged fasting, the cells may use other substrates in order to meet their metabolic needs. The transport of glucose to the nerve cells requires the presence of specific transporter proteins called GLUT s (Glucose Transporters) to perform the transport of glucose by facilitated diffusion. Besides the transporters of glucose, transporter proteins of monocarboxilatos (MCTs) are responsible for neuronal influx of lactate, MCT1 being the main responsible for providing energy to neurons during maturation of nervous tissue. The acetylcholine is a major neurotransmitter of the nervous system and is associated with the maintenance processes of attention, learning and memory. In the synaptic cleft acetylcholine is degraded by the enzyme cholinesterase, the acetylcholinesterase (AChE) and the butyrilcholinesterase (BuChE). Increased activity of fractions of AChE has been associated with states of dementia in elderly patients and the loss of cognitive function in patients with Alzheimer's Disease. This work is proposed to study the expression of neuronal glucose transporter GLUT3 and activity of the enzyme acetylcholinesterase (AChE) in brain of young adult rats (84 days of life) who were breastfed in litters formed by 6 (control group) or 12 pups (undernourished group). The results showed that the weight of the brains of malnourished rats was significantly lower (P <0001, Student s t test) compared to controls. The blood glucose levels and the expression of GLUT3 in total cortical membranes was also reduced by malnutrition (P <0001, Student s t test). The activity of AChE in different brain homogenate showed a significant interaction (P = 0019, two-way ANOVA, Tukey s test) between nutritional status and the type of fraction of the homogenate, with a significant reduction (p< 0,05) in activity this enzyme in the brain homogenate in control group. These results show for the first time that malnutrition during the period of weaning reduces the expression of GLUT3 and vi that the increased activity of acetylcholinesterase associated with decreased in the expression of the main glucose transporter in the brain could contribute to cognitive deficits and changes in brain metabolic activity. / A desnutrição energético-protéica consiste em um dos problemas nutricionais mais graves que ocorrem em países em desenvolvimento. A deficiência energética e nutricional no início da vida pode ocasionar importantes alterações nas diferentes fases de desenvolvimento do sistema nervoso central, uma vez que os processos de hiperplasia, hipertrofia e mielinização ocorrem de forma mais intensa. O cérebro utiliza a glicose como seu principal substrato energético. No entanto, em certas condições fisiológicas, como durante a fase de amamentação ou durante o jejum prolongado, as células podem utilizar outros substratos a fim de suprir suas necessidades metabólicas. O transporte de glicose para as células nervosas requer a presença de proteínas transportadoras específicas denominadas GLUTs (glucose transporters) que efetuam o transporte de glicose através de difusão facilitada. Além dos transportadores de glicose, proteínas transportadoras de monocarboxilatos (MCTs) são responsáveis pelo influxo neuronal de lactato, sendo o MCT1 o principal responsável pelo fornecimento energético aos neurônios durante o processo de maturação do tecido nervoso. A acetilcolina é um dos principais neurotransmissores do sistema nervoso, sendo associada com a manutenção de processos de atenção, aprendizagem e memória. Na fenda sináptica a acetilcolina é degradada por enzimas colinesterásicas, a acetilcolinesterase (AChE) e a Butirilcolinesterase (BuChE). O aumento da atividade de frações da AChE vem sendo associada com estados de demência em pacientes idosos e com a perda da função cognitiva em pacientes com Doença de Alzheimer. O presente trabalho se propôs a estudar a expressão do transportador neuronal de glicose GLUT3 e a atividade da AChE no cérebro de ratos adultos jovens (84 dias de vida) que foram amamentados em ninhadas formadas por 6 (grupo controle) ou 12 filhotes (grupo desnutrido). Os resultados demonstraram que o peso dos cérebros dos ratos desnutridos foi significativamente menor (P<0,001, teste t de Student) comparado ao grupo controle. Os níveis glicêmicos e a expressão do GLUT3 nas membranas corticais totais foram também diminuídos pela desnutrição (P<0,001, teste t de Student). A atividade da AChE nos diferentes homogenados do cérebro mostrou uma interação significativa (P = 0,019, ANOVA two-way, Tukey teste) entre o estado iv nutricional e o tipo de fração do homogenado, apresentando uma redução significativa ( p< 0,05) na atividade desta enzima do homogenado de células em animais controle . Esses resultados mostram pela primeira vez que a desnutrição durante o período de amamentação diminui a expressão do GLUT3 e que o aumento da atividade da acetilcolinesterase associado com a diminuição da expressão do principal trnasportador de glicose para o cérebro poderia contribuir para déficits cognitivos e alterações da atividade metabólica cerebral.

PONTE, J.S. Análise imuno-histoquímica do transportador de glicose-1 em hiperplasia fibrosa inflamatória e carcinoma epidermóide oral. 2013. 77 f. Dissertação. (MESTRADO EM BIOTECNOLOGIA) - Campus de Sobral, Universidade Federal do Ceará, Sobral, 2013. / Submitted by Djeanne Costa (djeannecosta@gmail.com) on 2017-08-23T13:33:56Z No. of bitstreams: 1 2013_dis_jsponte.pdf: 1853429 bytes, checksum: c2551c1c3d35636d7fc7eb9f4366f186 (MD5) / Approved for entry into archive by Djeanne Costa (djeannecosta@gmail.com) on 2017-09-27T12:08:02Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2013_dis_jsponte.pdf: 1853429 bytes, checksum: c2551c1c3d35636d7fc7eb9f4366f186 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-09-27T12:08:02Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2013_dis_jsponte.pdf: 1853429 bytes, checksum: c2551c1c3d35636d7fc7eb9f4366f186 (MD5) Previous issue date: 2013 / Cancer is still a big target of scientific studies and research, to be an important cause of morbidity and mortality worldwide. Oral squamous cell carcinoma (CEO) is the most prevalent form of cancer in the mouth, and despite the great advances and discoveries, the prognosis of this cancer is still poor, mainly discovered in advanced stages. Oral carcinogenesis is a complex and multiple genes can be altered in this process. Several proteins are altered in these tumors, highlighting more recently, proteins of cellular metabolism, especially glucose transporters (GLUT). The objective of this research was to evaluate the immunohistochemical expression of GLUT-1 in comparison with CEO inflammatory fibrous hyperplasia (HFI), a non-neoplastic proliferative lesion. The sample consisted of 30 cases of oral lesions, 15 cases of HFI CEO and 15. We used immunohistochemical technique Estreptoavitina-Biotin with GLUT-1 antibody (Genetex, dilution 1:300, 60 minutes, antigen retrieval with citrate pH 6), analyzing 05 fields in each case 100X, telling the percentage of positive cells. As a result it was found that the mean percentage of epithelial cells positive for GLUT-1 in inflammatory fibrous hyperplasia group was 85.6 ± 0.9% (median = 85.6% = 81.0% minimum, maximum = 90.1%). The mean percentage of epithelial cells positive for GLUT-1 in the group of squamous cell carcinoma was 89.6 ± 2.7% (median = 92.2% = 72.2% minimum, maximum = 98.0%). Could observe a statistically significant difference between the two study groups (p = 0.033, Mann-Whitney test). The percentage of immune cells marked as to the location where the CEO shows a higher percentage of 93.4% in the alveolar ridge compared to the tongue (64.7%). Based on the results of this research, it was observed that there is an increased expression of GLUT-1 in lesions in carcinomas than in hyperplastic, and this may probably reflect the involvement of GLUT in some oncogenic mechanism. However, more studies are needed to further elucidate the involvement of this protein in oral carcinogenesis. / O câncer continua sendo grande alvo de estudos e investigações científicas, por ser importante causa de morbidade e mortalidade em todo mundo. O carcinoma epidermoide oral (CEO) é a forma mais prevalente de câncer em boca, e apesar dos grandes avanços e descobertas, o prognóstico desse tipo de câncer ainda é pobre, principalmente se descoberto em estágios avançados. A carcinogênese oral é um processo complexo e vários genes podem estar alterados neste processo. Várias proteínas estão alteradas nesses tumores, destacando-se mais recentemente, as proteínas do metabolismo celular, especialmente os Transportadores de Glicose (GLUT). O objetivo da presente pesquisa foi avaliar a expressão imuno-histoquímica de GLUT-1 em CEO comparando com Hiperplasia Fibrosa Inflamatória (HFI), uma lesão proliferativa não-neoplásica. A amostra foi constituída por 30 casos de lesões orais, sendo 15 casos de CEO e 15 HFI. Utilizou-se a técnica imuno-histoquímica da Estreptoavitina-Biotina com o anticorpo GLUT-1 (marca Genetex, diluição 1:300, 60 minutos, recuperação antigênica com citrato pH6), analisando 05 campos de cada caso no aumento de 100X, contando-se o percentual de células positivas. Como resultado obteve-se que a média do percentual de células epiteliais positivas para GLUT-1 no grupo de HFI foi 85.6±0.9% (mediana = 85.6%, mínima = 81.0%, máxima = 90.1%). A média do percentual de células epiteliais positivas para GLUT-1 no grupo de CEO foi 89.6±2.7% (mediana = 92.2%, mínima = 72.2%, máxima = 98.0%). Pôde-se observar diferença estatisticamente significante entre os dois grupos de estudo (p=0.033, teste Mann-Whitney). O percentual de células imunomarcadas quanto à localização nos casos de CEO mostra um percentual maior de 93,4% no rebordo alveolar quando comparado com a língua (64.7%). Com base nos resultados desta pesquisa, observou-se que há uma maior expressão da GLUT-1 nas lesões nos carcinomas do que nas hiperplasias, e isso, pode provavelmente refletir a participação da GLUT em algum mecanismo oncogênico. Contudo, mais estudos são necessários para elucidar melhor a participação desta proteína na carcinogênese oral.

Submitted by FERNANDA CAMPOS MASTROTTI PEREIRA null (fernandamastrotti@hotmail.com) on 2016-07-11T23:14:22Z No. of bitstreams: 1 Tese - FCMP.pdf: 2610085 bytes, checksum: a49f98240dcd399f279d429f0e4ef5ec (MD5) / Rejected by Ana Paula Grisoto (grisotoana@reitoria.unesp.br), reason: Solicitamos que realize uma nova submissão seguindo a orientação abaixo: O arquivo submetido está sem a ficha catalográfica. A versão submetida por você é considerada a versão final da dissertação/tese, portanto não poderá ocorrer qualquer alteração em seu conteúdo após a aprovação. Corrija esta informação e realize uma nova submissão contendo o arquivo correto. Agradecemos a compreensão. on 2016-07-12T19:10:51Z (GMT) / Submitted by FERNANDA CAMPOS MASTROTTI PEREIRA null (fernandamastrotti@hotmail.com) on 2016-07-16T13:53:50Z No. of bitstreams: 1 Tese - FCMP - repositório.pdf: 2652760 bytes, checksum: fe30a505f009d928b1772bbb1ba24ca9 (MD5) / Approved for entry into archive by Felipe Augusto Arakaki (arakaki@reitoria.unesp.br) on 2016-07-18T16:26:44Z (GMT) No. of bitstreams: 1 pereira_fcm_dr_jabo.pdf: 2652760 bytes, checksum: fe30a505f009d928b1772bbb1ba24ca9 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-07-18T16:26:44Z (GMT). No. of bitstreams: 1 pereira_fcm_dr_jabo.pdf: 2652760 bytes, checksum: fe30a505f009d928b1772bbb1ba24ca9 (MD5) Previous issue date: 2016-06-10 / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / A cultura do eucalipto apresenta uma grande importância no cenário econômico nacional e mundial, oferecendo uma vasta gama de produtos florestais. No entanto, a disponibilidade de fósforo nos solos raramente é adequada para o crescimento, desenvolvimento e produtividade das plantas de eucalipto, bem como para diversas outras culturas. A presença de plantas daninhas em eucaliptais é outro fator limitante, e para o manejo da comunidade infestante, glyphosate é o herbicida mais utilizado. As plantas de eucalipto, quando cultivadas em diferentes concentrações de fósforo, podem alterar a expressão gênica de transportadores de fosfato. Em algumas condições, a síntese de transportadores de fosfato de alta afinidade pode ser incrementada. Esses transportadores podem ter afinidade pelo grupo fosfonato do glyphosate, transportando esse herbicida via membrana plasmática. Assim, podem ocorrer alterações no comportamento do glyphosate em função das concentrações de fósforo. Estudos do efeito diferencial de glyphosate em função de concentrações de fósforo e do transporte de glyphosate mediado por transportadores de fosfato ainda são escassos, principalmente em uma espécie perene, como o eucalipto. Com essa pesquisa objetivou-se (1) avaliar, em clones de Eucalyptus urophylla (GG100 e I144) a cinética de absorção de fósforo, as eficiências nutricionais de macronutrientes e seus reflexos no crescimento das plantas; (2) verificar as alterações fotossintéticas, metabólicas e nutricionais de clones de E. urophylla (GG100 e I144) cultivados em concentrações de fósforo e submetidos à aplicação de glyphosate; e (3) estudar, em E. grandis, a coordenação da expressão gênica de transportadores de fosfato, a absorção e a translocação de 14C-glyphosate, e o transporte de 14C-glyphosate através da membrana plasmática em protoplastos. Os experimentos com E. urophylla foram realizados na Universidade Estadual Paulista, Câmpus de Jaboticabal, SP, enquanto aqueles com E. grandis foram desenvolvidos na University of Maryland, Maryland, EUA. Após a avaliação dos parâmetros cinéticos de absorção de fósforo, o clone I144 foi superior, apresentando menores Cmín e Km (concentração limite abaixo da qual a planta é incapaz de absorver um elemento na solução e concentração do nutriente na solução onde foi atingida metade da Vmáx, respectivamente) e maior Vmáx (velocidade máxima de absorção). As eficiências de absorção, translocação e utilização de macronutrientes também foram maiores no clone I144, com exceção da eficiência de utilização de potássio, superior no clone GG100. Não houve diferenças na eficiência nutricional dos clones em relação ao boro. Para a avaliação das alterações fotossintéticas, metabólicas e nutricionais ocasionadas por glyphosate em função de concentrações de fósforo, experimentos foram conduzidos em casa de vegetação utilizando areia como substrato (pulverização foliar de glyphosate) e em câmara de crescimento utilizando sistema hidropônico (aplicação radicular de glyphosate). Para ambos os experimentos, os nutrientes foram oferecidos por meio da solução nutritiva, que foi ajustada para as doses de fósforo 0,5X; 1X e 1,5X de fósforo (em que X correspondeu à concentração de fósforo recomendada para o preparo da solução nutritiva). Interações entre as concentrações de fósforo e as doses de glyphosate ocorreram nas características que avaliaram o processo fotossintético (teores de clorofila e eficiência quântica do fotossistema II), nos teores de glyphosate, AMPA e ácido chiquímico, nos teores nutricionais e massas secas. Essas características ou teores foram menores ou mais intensamente reduzidos, após glyphosate, nas plantas cultivadas com menores concentrações de fósforo (0,5X e, em alguns casos, 1X). Por fim, experimentos foram conduzidos em E. grandis, e a expressão gênica dos transportadores de fosfato (mensurada por meio de RT-qPCR) nas folhas e nas raízes dessas plantas foram alteradas em resposta a deficiência de fosfato. A expressão de transportadores de alta afinidade foi incrementada pela deficiência de fosfato. A absorção de 14C-glyphosate aplicado via foliar ou radicular foi maior nas plantas submetidas à deficiência de fosfato, e a translocação deste herbicida também foi mais rápida nessas plantas. Nos protoplastos, o transporte de 14C-glyphosate via membrana plasmática ocorreu rapidamente na ausência de fosfato, e de modo mais lento quando NaH2PO4 foi adicionado ao meio. Possivelmente, o transporte de fosfato através da membrana plasmática foi realizado em um primeiro momento, e com a redução do fosfato disponível no meio, o transporte de glyphosate foi iniciado, provavelmente, por transportadores de fosfato de alta afinidade. / Eucalypt plantation have great importance in the national and global economic environment, offering a wide range of forest products. However, the phosphorus availability in soils is rarely appropriate for growth, development and yield of eucalypt plants, as well as several other crops. The presence of weeds in eucalypt plantations is another limiting factor, and for weed management glyphosate is the most used herbicide. Eucalypt plants grown under different phosphorus concentrations can change phosphate transporters gene expression. Under specific conditions, high-affinity phosphate transporter synthesis can be increased. Such transporters can have affinity for glyphosate phosphonate group, transporting this herbicide through plasma membrane. So, changes may occur in glyphosate behavior depending on phosphorus concentrations. Studies of glyphosate effect as a function of phosphorus concentrations and glyphosate transport mediated by phosphate transporters are still scarce, especially in a perennial species, such as eucalypt. This study aimed (1) to evaluate, in Eucalyptus urophylla clones (GG100 and I144), the phosphorus absorption kinetics, the nutritional efficiency of macronutrients and their effects on plant growth; (2) verify the photosynthetic, nutritional and metabolic changes in E. urophylla clones (GG100 and I144) grown under phosphorus concentrations and submitted to glyphosate application; and (3) study in E. grandis the phosphate transporters gene expression coordination, the 14C-glyphosate uptake and translocation, and the 14C-glyphosate transport through the plasma membrane in protoplasts. The experiments with E. urophylla were carried out at São Paulo State University, Campus of Jaboticabal, SP, while the experiment with E. grandis were developed at University of Maryland, Maryland, USA. After the evaluation of phosphorus absorption kinetic parameters, I144 clone was considered superior, presenting lower Cmin and Km (respectively, the limiting concentration for absorbing an element in solution and the nutrient concentration in solution which was reached half of Vmax,) and higher Vmax (maximum rate of absorption). The efficiency of absorption, translocation and utilization of macronutrients were also higher in I144 clone, with the exception of potassium utilization efficiency, higher in GG100 clone. No differences in boron nutritional efficiency were found. For the evaluation of photosynthetic, nutritional and metabolic changes caused by glyphosate according phosphorus concentrations, experiments were performed in a greenhouse using sand (glyphosate sprayed in leaves) and in a growth chamber using hydroponic system (glyphosate applied in roots). For both experiments, nutrients were provided by nutrient solution, which was adjusted to phosphorus levels 0.5X, 1X and 1.5X (where X corresponded to the phosphorus concentration recommended for nutrient solution preparation). Interactions between phosphorus concentration and glyphosate doses occurred in the characteristics that evaluated the photosynthetic process (chlorophyll content and quantum efficiency of photosystem II), in the glyphosate, AMPA and shikimic acid content, and in the nutritional content and dry mass. These characteristics or contents were smaller or more strongly reduced after glyphosate in plants grown with lower phosphorus concentration (0.5X, and in some cases, 1X). Finally, experiments were conducted in E. grandis, and the gene expression of phosphate transporters (measured by RT-qPCR) in leaves and roots of these plants have been modified as a phosphate deficiency response. High-affinity transporters expression was increased by phosphate deficiency. The absorption of 14C-glyphosate applied in leaves or roots was higher in plants subjected to phosphate deficiency, and glyphosate translocation was also faster in these plants. In protoplasts, 14Cglyphosate transport via plasma membrane was fast in phosphate absence and slower when NaH2PO4 was added to the medium. Possibly, the phosphate transport through the plasma membrane was performed initially, and with the phosphate reduction in the medium, the glyphosate transport was started probably for highaffinity phosphate transporters. / CNPq: 156323/2012-5 / CAPES: BEX-9553/14-2 / FAPESP: 2011/201705-3

Submitted by MARIANA MAURO null (mamaurofarm@gmail.com) on 2016-08-19T18:10:28Z No. of bitstreams: 1 MARIANA Dissertação.pdf: 2027586 bytes, checksum: c109c012716ad7eba88d5828ee7295a5 (MD5) / Rejected by Juliano Benedito Ferreira (julianoferreira@reitoria.unesp.br), reason: Solicitamos que realize uma nova submissão seguindo a orientação abaixo: O arquivo submetido está sem a ficha catalográfica e sem a folha de aprovação. A versão submetida por você é considerada a versão final da dissertação/tese, portanto não poderá ocorrer qualquer alteração em seu conteúdo após a aprovação. Corrija esta informação e realize uma nova submissão contendo o arquivo correto. Agradecemos a compreensão. on 2016-08-23T18:18:39Z (GMT) / Submitted by MARIANA MAURO null (mamaurofarm@gmail.com) on 2016-08-23T21:13:02Z No. of bitstreams: 1 DISSERTAÇÃO FINAL.pdf: 2164316 bytes, checksum: 594c78c0b6e6709fd92f1b941f2b7d32 (MD5) / Approved for entry into archive by Ana Paula Grisoto (grisotoana@reitoria.unesp.br) on 2016-08-24T15:04:03Z (GMT) No. of bitstreams: 1 mauro_m_me_arafcf.pdf: 2164316 bytes, checksum: 594c78c0b6e6709fd92f1b941f2b7d32 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-08-24T15:04:03Z (GMT). No. of bitstreams: 1 mauro_m_me_arafcf.pdf: 2164316 bytes, checksum: 594c78c0b6e6709fd92f1b941f2b7d32 (MD5) Previous issue date: 2016-07-20 / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / A exposição ocupacional a agentes químicos é potencialmente capaz de modificar a disposição cinética ou o metabolismo de fármacos, principalmente em função da indução ou inibição de enzimas do sistema citocromo P450. Entretanto, estudos que mostram o efeito da exposição ocupacional a agentes químicos na atividade de transportadores de fármacos são escassos. O tolueno está presente no ambiente de trabalho principalmente na forma de vapor. Neste ambiente, o solvente é absorvido principalmente por inalação. O objetivo do estudo é avaliar a influência da exposição inalatória ao tolueno na atividade in vivo do polipeptídeo transportador de ânions orgânicos da família Oatp em ratos, empregando como fármaco marcador a pravastatina. Ratos machos Wistar (n=6 por tempo de coleta, por grupo) foram expostos ao tolueno (85 mg/m3) por inalação ou ao ar em câmara de exposição apenas pelo nariz por 6 horas/dia, 5 dias/semana, 4 semanas. Ao final do período de exposição, os animais receberam dose única de pravastatina (20 mg/kg) por via oral. Amostras seriadas de sangue foram coletadas até 8 horas após a administração de pravastatina. As concentrações plasmáticas do fármaco foram avaliadas por cromatografia líquida de alta eficiência com detecção por espectrometria de massas (LC-MS). O método de análise da pravastatina por LC-MS mostrou detectabilidade, precisão e exatidão compatíveis com a aplicação em estudos de disposição cinética após dose única em ratos. As áreas sob as curvas de concentração plasmática versus tempo (ASC) foram calculadas do tempo zero a infinito com base na Quadratura de Gauss-Laguerre. As concentrações de pravastatina correspondentes aos tempos avaliadas foram estimadas por interpolação polinomial. O clearance total aparente (CL/F) foi calculado a partir da equação: CL/F = dose/ASC0-∞. Na avaliação da disposição cinética da pravastatina, os animais não expostos ao tolueno apresentaram ASC0-∞ de 726 ng h/mL e Cl/F de 49,1 L/h kg. Não houve diferença estatística na ASC0-∞ ao comparar os animais expostos (ASC0-∞: 681,8 ng h/mL) e não expostos ao tolueno. Os resultados do estudo permitem concluir que a atividade de transportadores Oatp, avaliada pelo uso da pravastatina como fármaco marcador, não foi alterada após a exposição ao tolueno por inalação a 85 mg/m3, 6 horas/dia, 5 dias/semana, 4 semanas em ratos. / Occupational exposure to chemical agents is potentially able to modify the kinetic disposition of drug metabolism, mainly due to the induction or inibition of cytochrome P450 enzymes. However, studies investigating the influence of occupational exposure to chemicals on the variability in drug response are rare. Toluene is present in the working environment particularly in vapor form. In this environment, the toluene is mainly absorbed by inhalation. Considering that, the aim of this study was evaluate the influence of inhalation to toluene in the in vivo activity of the polypeptide transporter organic anion (Oatp) family transporters in rats, using pravastatin as a probe drug. Male Wistar rats (n=6, for each sampling time) were exposed to toluene (85 mg / m3) by inhalation or air in a nose only exposure system for 6 hours/day, 5 days/week, during 4 weeks. After 4 weeks of exposure, animals received a single dose of pravastatin (20 mg/kg) orally. Serial blood samples were collected up to 8 hours after administration of pravastatin. Plasma concentrations of pravastatin were measured by high-performance liquid chromatography with detection by mass spectrometry (LC-MS). The analysis method of pravastatin by LC-MS showed detectability, precision and accuracy compatible with the application in kinetic disposition studies after single doses in rats. The areas under the plasma concentration versus time (AUC) were calculated by zero to the infinity by the Gauss-Laguerre Quadrature. The concentrations corresponding to the times were estimated by polynomial interpolation. The total clearance apparent (CL/F) was calculated from the equation: CL/F = dose/AUC0-∞. In assessing the kinetics of pravastatin disposition, animals not exposed to toluene showed AUC0-∞ of 726 ng h/mL and CL/F of 49.1 L/h kg. There was no statistical difference in AUC0-∞ to compare the exposed animals (AUC0-∞: 681.8 ng h/mL) and not exposed to toluene. The results of this study showed that Oatp family transporters activity, assessed by the use of pravastatin as a marker drug, was not altered after exposure to toluene by inhalation at 85 mg/m3 6 hours/day, 5 days/week and for 4 weeks in rats. / CNPq: 448803/2014-3

Submitted by INAÊ CRISTINA REGATIERI null (iregatieri@hotmail.com) on 2016-10-25T11:32:21Z No. of bitstreams: 1 Tese_Inae_Cristina_Regatieri.pdf: 1026482 bytes, checksum: 93ce299c664eb44473c4cdf6c6496fb4 (MD5) / Approved for entry into archive by Juliano Benedito Ferreira (julianoferreira@reitoria.unesp.br) on 2016-10-31T17:37:43Z (GMT) No. of bitstreams: 1 regatieri_ic_dr_jabo.pdf: 1026482 bytes, checksum: 93ce299c664eb44473c4cdf6c6496fb4 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-10-31T17:37:43Z (GMT). No. of bitstreams: 1 regatieri_ic_dr_jabo.pdf: 1026482 bytes, checksum: 93ce299c664eb44473c4cdf6c6496fb4 (MD5) Previous issue date: 2016-10-19 / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / O transportador de monocarboxilato isoforma 1 (MCT1), presente na membrana das hemácias, e sua proteína auxiliar CD147 têm como função transportar H+ e lactato do plasma para dentro das hemácias, mantendo assim, a homeostase ácido-base e retardando a acidose sistêmica e fadiga muscular. Dessa forma, o objetivo desse estudo foi comparar as quantidades das proteínas MCT1 e CD147 em hemácias de cavalos Árabes e Quartos de Milha com diferentes níveis de desempenho atlético. Além disso, objetivou-se buscar por polimorfismos para os genes MCT1, CD147, DMRT3 e PDK4, a fim de checar associações entre os polimorfismos e o desempenho nas raças. Cavalos Árabes e Quartos de Milha foram divididos em dois grupos de acordo com o desempenho em provas de enduro e provas de corridas, respectivamente. A quantidade de MCT1 e CD147 na membrana plasmática das hemácias foi determinada por western blotting com unidades arbitrárias de densidade óptica (OD) e anticorpos reagentes à espécie humana anti-MCT1 e anti-CD147. Os dados para as quantidades de proteínas foram analisados pelo PROC MIXED do SAS. O modelo incluiu a idade como covariável e os efeitos fixos de sexo, raça e grupo de desempenho dentro de raça. As correlações foram analisadas pelo teste de Pearson pelo procedimento PROC CORR. P-valores <0,01 foram considerados estatisticamente significantes. Os polimorfismos dos genes foram analisados por sequenciamento (MCT1 e CD147), PCR-RFLP (DMRT3) e ARMS-PCR (PDK4). Os pacotes estatísticos Genetics, Lattice e GenABEL foram utilizados para comparar as frequências dos grupos de desempenho no software R, com o teste exato de Fisher a 5% de significância. As proteínas MCT1 e CD147 foram encontradas nas hemácias de todos os animais. A quantidade de MCT1 foi significativamente (p<0,0001) maior em Quartos de Milha (2,99 ± 0,35 OD) do que em Árabes (1,04 ± 0,08 OD). Quartos de Milha (3,23 ± 0,38 OD) também apresentaram maior conteúdo de CD147 do que Árabes (0,88 ± 0,06 OD). Não houve diferença estatística nas quantidades de proteínas para os grupos de desempenho de ambas as raças. Correlação positiva foi encontrada entre as quantidades de MCT1 e CD147 (r=0,95; p<0,0001). O Alelo A dos polimorfismos Lys457Gln:1573A>C do gene MCT1 e Ile51Val:168A>G do gene CD147 estavam fixados em ambas as raças. Um novo polimorfismo (AY457175.1:c1498G>A) foi encontrado na sequência do gene MCT1. Para o DMRT3, todos os animais apresentaram o alelo C fixado para o polimorfismo. Árabes mostraram maior frequência para o alelo G do que Quartos de Milha (p<0,01) para o polimorfismo no gene PDK4. Entretanto, não houve diferença entre os grupos de desempenho para as duas raças. Dessa forma, conclui-se que Quartos de Milha têm maiores quantidades de MCT1 e CD147 do que Árabes. Não foi possível determinar a influência dos polimorfismos nos genes MCT1, CD147 e DMRT3 no desempenho atlético das duas raças visto que seus alelos estavam fixados. Além disso, houve diferença significativa nas frequências do polimorfismo no gene PDK4 entre Árabes e Quartos de Milha, mas não houve diferença entre os grupos de desempenho. / Monocarboxylate transporter isoform 1 (MCT1), present in the red blood cell membranes and its ancillary protein CD147 have as function transport H+ and lactate ions from the plasma into the red blood cells, thereby maintaining acid/base homeostasis and retarding systemic acidosis and muscular fatigue. Thereby, the aim of this study was to compare the amount of MCT1 and CD147 proteins in the red blood cells of Arabian and Quarter Horses with different levels of athletic ability. Furthermore, we investigated polymorphisms for MCT1, CD147, DMRT3, and PDK4 genes in Arabian and Quarter Horses in order to check associations between the polymorphisms and the performance in these breeds. Arabian horses were divided into two groups according to their performance in endurance competition and Quarter Horses were separated by its performance in races, determined by Speed Index. The amount of MCT1 and CD147 proteins in the plasma membrane of red blood cells was determined by western blotting analysis with arbitrary optical density units (OD), using a human specific anti-MCT1 and anti- CD147 antibody. Data for the amounts of proteins were analyzed using the PROC MIXED procedure of SAS software. The model for the analysis included the effects of sex, breed and performance group within breed as fixed effect and age as covariate. The correlations were analyzed by Pearson correlation test using the PROC CORR procedure of SAS software. P values <0.01 were considered statistically significant. Polymorphisms of the genes were analyzed by sequencing (MCT1 and CD147), PCR-RFLP (DMRT3) and ARMS-PCR (PDK4) techniques. The statistical packages Genetics, Lattice and GenABEL were used to compare the frequencies of the groups using the software R, with the Fisher's exact test being performed with significance level of 5%. MCT1 and CD147 proteins were found in the red blood cell membranes of all studied animals. The amount of MCT1 was significantly (p<0.0001) higher in Quarter Horses (2.99 ± 0.35 OD) than in Arabians (1.04 ± 0.08 OD). Quarter Horses (3.23 ± 0.38 OD) also showed bigger contents of CD147 than Arabians (0.88 ± 0.06 OD). There was not statistical difference in the amounts of MCT1 and CD147 between the performance groups of both breeds. Positive correlation was found between the amounts of MCT1 and CD147 (r=0.95; p<0.0001). The A allele from the polymorphisms Lys457Gln:1573A>C of MCT1 and Ile51Val:168A>G of CD147 gene, were fixed in both breeds. A new polymorphism (AY457175.1:c1498G>A) was found in the MCT1 gene sequence. For DMRT3 mutation, all the animals shown to have the C allele fixed for the polymorphism. Arabians showed significant greater frequency of the G allele than Quarter Horses (p<0.01) for the PDK4 polymorphism. However, there was not difference between the groups of performance for both breeds. In summary, it follows that the Quarter Horses have greater amount of MCT1 and CD147 proteins than Arabian. It was not possible to determine the influence of polymorphisms in MCT1, CD147 and DMRT3 genes in the athletic performance of these breeds since they had alleles fixed. There was a significant difference in the frequencies of the PDK4 polymorphism between Arabians and Quarter Horses, but there was not difference between the performance groups. / FAPESP: 2012/24193-0 / FAPESP: 2012/20697-9

Linfomas pertencem a um grupo de neoplasias em que há proliferação monoclonal de linfócitos malignos, sendo uma das neoplasias mais frequentemente diagnosticadas em cães. Podem ser classificados quanto à forma anatômica em multicêntrico, mediastinal, digestório e extranodal. Dentre os extranodais, os linfomas cutâneos são classificados histologicamente como epiteliotrópicos e não epiteliotrópicos e são predominantemente de imunfenótipo T, com raros casos do tipo B. A principal característica histopatológica do linfoma epiteliotrópico em cães é o tropismo das células neoplásicas pela epiderme, mucosa ou estruturas anexas, enquanto o linfoma não epiteliotrópico é caracterizado pela infiltração dérmica e subcutânea sem invasão das estruturas anexas. Os linfomas cutâneos caninos têm progressão rápida, são considerados bastante agressivos e com mau prognóstico, com baixa taxa de resposta à quimioterapia. Um dos fatores que podem contribuir para isso é a resistência das células a múltiplas drogas e entre esses mecanismos de resistência estão o efluxo de drogas do meio intracelular para o extracelular por meio dos transportadores da família ABC, como a glicoproteína-P, MRP (multiple resistance protein) e BCRP (breast câncer resistance protein) e da LRP (lung resistance protein), uma proteína vault responsável pelo transporte nucleocitoplasmático. O objetivo deste estudo foi caracterizar imunofenotipicamente os linfomas cutâneos, a proliferação celular por meio do marcador Ki67, a expressão das proteínas de resistência glicoproteína-P, MRP, BCRP e LRP e avaliar a relação dessas proteínas com a sobrevida dos animais. Foi realizado um estudo retrospectivo com 21 casos de cães linfomas cutâneos com diagnóstico histopatológico. A técnica de imunoistoquímica foi utilizada para determinar a imunofenotipagem dos linfomas pelos marcadores CD3 e CD20, a proliferação celular por Ki67 e a expressão de glicoproteína-P, MRP, BCRP e LRP. Dos 21 animais, 38% tiveram diagnóstico histopatológico de linfoma epiteliotrópico, 52% eram linfomas não epiteliotrópicos, 5% dos casos de linfoma não tiveram epiteliotropismo definido e 5% foram classificados como neoplasia de células redondas. O imunofenótipo predominante foi CD3+CD20- (76%), 15% dos casos eram CD3-CD20+ e 9% eram CD3+CD20+. A mediana de células marcadas para Ki67 foi de 31%. Com relação aos marcadores de resistência a múltiplas drogas, a mediana da marcação de glicoproteína-P foi de 40%, a de LRP foi de 65% enquanto para MRP e BCRP, 19% e 23%, respectivamente. Os linfomas cutâneos não epiteliotrópicos foram mais frequentes que os epiteliotrópicos e o imunfenótipo predominante foi o T. A ocorrência de linfócitos CD3-CD20+ e CD3+CD20+ indica a necessidade de mais estudos e um painel mais amplo de anticorpos para subtipagem desses linfomas. A glicoproteína-P teve maior expressão nos linfomas não epiteliotrópicos do que nos epiteliotrópicos e não houve correlação entre as proteínas de resistência e o tempo de sobrevida dos animais, sugerindo que, além da biologia da neoplasia, outros mecanismos de resistência a múltiplas drogas diferente dos estudados possam ter um papel relevante na baixa resposta do linfoma cutâneo à quimioterapia. / Lymphoma is a group of blood cell tumors that develop from monoclonal proliferation of malignant lymphocytes. Lymphoma is the most frequent neoplasia in dogs and can be anatomically classified in multicentric, mediastinal, digestive and extranodal. Cutaneous lymphomas an extranodal type of lymphoma are classified histologically in epitheliotropic and non-epitheliotropic and are predominantly of T-cell immunophenotype, and rare cases of B cell phenotype. The main histopathological characteristic of epitheliotropic lymphoma in dogs is the tropism of neoplastic cells by the epidermis, mucosa or adjacent structures, while non-epitheliotropic lymphoma is characterized by dermal and subcutaneous infiltration without invasion of adjacent structures. Canine cutaneous lymphomas have rapid progression, are considered very aggressive and have poor prognosis. These dogs, usually have a low rate of response to chemotherapy which can be associated to an antineoplastic resistance. Among mechanisms of resistance are efflux of drugs from intracellular to extracellular through ABC family transporters such as P-glycoprotein, MRP (multple resistance protein) and BCRP (breast cancer resistance protein) and LRP (lung resistance protein), a vault protein responsible for nucleocytoplasmic transport. The aim of this study was to characterize immunophenotypically cutaneous lymphomas, measure cell proliferation using the Ki67 marker, the expression of resistance proteins P-glycoprotein, MRP, BCRP and LRP and to evaluate the relationship of these proteins with the survival of the animals. A retrospective study was performed with 21 cases of dogs with cutaneous lymphoma with histopathological diagnosis. Immunohistochemical was used to immunophenotyping of lymphomas by CD3 and CD20 markers, Ki67 cell proliferation, and P-glycoprotein, MRP, BCRP and LRP expression. Of the 21 animals, 38% had histopathological diagnosis of epitheliotropic lymphoma, 52% were non-epitheliotropic lymphomas, 5% of lymphoma cases had no definition and 5% were classified as round cell neoplasia. The predominant immunophenotype was CD3+CD20- (76%), 15% of the cases were CD3-CD20 + and 9% were CD3 + CD20 +. The median of cells labeled for Ki67 was 31%. Regarding the markers of resistance to multiple drugs, the median of the P-glycoprotein label was 40%, which 65% of LRP while for MRP and BCRP, 19% and 23%, respectively. Non-epitheliotropic cutaneous lymphomas were more frequent than epitheliotropic lymphomas and the predominant immunophenotype was T. The occurrence of CD3-CD20+ and CD3+CD20+ lymphocytes indicates the need for further studies and a wider panel of antibodies for subtyping these lymphomas. P-glycoprotein had higher expression in non-epitheliotropic lymphomas than in epitheliotropic lymphomas and there was no correlation between resistance proteins and survival time of the animals, suggesting that in addition to the biology of neoplasia other mechanisms of resistance to multiple drugs different from those studied may play a relevant role in the low response of cutaneous lymphoma to chemotherapy.

FundaÃÃo Cearense de Apoio ao Desenvolvimento Cientifico e TecnolÃgico / Cancer is still a big target of scientific studies and research, to be an important cause of morbidity and mortality worldwide. Oral squamous cell carcinoma (CEO) is the most prevalent form of cancer in the mouth, and despite the great advances and discoveries, the prognosis of this cancer is still poor, mainly discovered in advanced stages. Oral carcinogenesis is a complex and multiple genes can be altered in this process. Several proteins are altered in these tumors, highlighting more recently, proteins of cellular metabolism, especially glucose transporters (GLUT). The objective of this research was to evaluate the immunohistochemical expression of GLUT-1 in comparison with CEO inflammatory fibrous hyperplasia (HFI), a non-neoplastic proliferative lesion. The sample consisted of 30 cases of oral lesions, 15 cases of HFI CEO and 15. We used immunohistochemical technique Estreptoavitina-Biotin with GLUT-1 antibody (Genetex, dilution 1:300, 60 minutes, antigen retrieval with citrate pH 6), analyzing 05 fields in each case 100X, telling the percentage of positive cells. As a result it was found that the mean percentage of epithelial cells positive for GLUT-1 in inflammatory fibrous hyperplasia group was 85.6  0.9% (median = 85.6% = 81.0% minimum, maximum = 90.1%). The mean percentage of epithelial cells positive for GLUT-1 in the group of squamous cell carcinoma was 89.6  2.7% (median = 92.2% = 72.2% minimum, maximum = 98.0%). Could observe a statistically significant difference between the two study groups (p = 0.033, Mann-Whitney test). The percentage of immune cells marked as to the location where the CEO shows a higher percentage of 93.4% in the alveolar ridge compared to the tongue (64.7%). Based on the results of this research, it was observed that there is an increased expression of GLUT-1 in lesions in carcinomas than in hyperplastic, and this may probably reflect the involvement of GLUT in some oncogenic mechanism. However, more studies are needed to further elucidate the involvement of this protein in oral carcinogenesis. / O cÃncer continua sendo grande alvo de estudos e investigaÃÃes cientÃficas, por ser importante causa de morbidade e mortalidade em todo mundo. O carcinoma epidermoide oral (CEO) à a forma mais prevalente de cÃncer em boca, e apesar dos grandes avanÃos e descobertas, o prognÃstico desse tipo de cÃncer ainda à pobre, principalmente se descoberto em estÃgios avanÃados. A carcinogÃnese oral à um processo complexo e vÃrios genes podem estar alterados neste processo. VÃrias proteÃnas estÃo alteradas nesses tumores, destacando-se mais recentemente, as proteÃnas do metabolismo celular, especialmente os Transportadores de Glicose (GLUT). O objetivo da presente pesquisa foi avaliar a expressÃo imuno-histoquÃmica de GLUT-1 em CEO comparando com Hiperplasia Fibrosa InflamatÃria (HFI), uma lesÃo proliferativa nÃo-neoplÃsica. A amostra foi constituÃda por 30 casos de lesÃes orais, sendo 15 casos de CEO e 15 HFI. Utilizou-se a tÃcnica imuno-histoquÃmica da Estreptoavitina-Biotina com o anticorpo GLUT-1 (marca Genetex, diluiÃÃo 1:300, 60 minutos, recuperaÃÃo antigÃnica com citrato pH6), analisando 05 campos de cada caso no aumento de 100X, contando-se o percentual de cÃlulas positivas. Como resultado obteve-se que a mÃdia do percentual de cÃlulas epiteliais positivas para GLUT-1 no grupo de HFI foi 85.6Â0.9% (mediana = 85.6%, mÃnima = 81.0%, mÃxima = 90.1%). A mÃdia do percentual de cÃlulas epiteliais positivas para GLUT-1 no grupo de CEO foi 89.6Â2.7% (mediana = 92.2%, mÃnima = 72.2%, mÃxima = 98.0%). PÃde-se observar diferenÃa estatisticamente significante entre os dois grupos de estudo (p=0.033, teste Mann-Whitney). O percentual de cÃlulas imunomarcadas quanto à localizaÃÃo nos casos de CEO mostra um percentual maior de 93,4% no rebordo alveolar quando comparado com a lÃngua (64.7%). Com base nos resultados desta pesquisa, observou-se que hà uma maior expressÃo da GLUT-1 nas lesÃes nos carcinomas do que nas hiperplasias, e isso, pode provavelmente refletir a participaÃÃo da GLUT em algum mecanismo oncogÃnico. Contudo, mais estudos sÃo necessÃrios para elucidar melhor a participaÃÃo desta proteÃna na carcinogÃnese oral.

Orientador: Paulo Mazzafera / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Insituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-12T18:35:16Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Andreazza_NathaliaLuiza_M.pdf: 3988387 bytes, checksum: 14f12a095b5cbb5989b090f57b961f01 (MD5) Previous issue date: 2009 / Resumo: A pilocarpina é um alcalóide imidazólico, que possui como única fonte natural spécies do gênero Pilocarpus. Este alcalóide é utilizado no tratamento de glaucoma e xerostomia. O elevado custo de folhas de Pilocarpus microphyllus no mercado internacional e conseqüente extrativismo predatório resultaram na sua inclusão na lista de espécies em extinção do IBAMA. Na busca de fontes alternativas do alcalóide conseguiu-se demonstrar que suspensões celulares desta espécie podem ser um modelo para produção e estudo da biossíntese e do transporte de pilocarpina, uma vez que produz os mesmos alcalóides encontrados nas folhas. A extração de pilocarpina a partir do meio de cultura poderá minimizar a quantidade de solventes altamente poluentes utilizados na extração deste alcalóide a partir das células, assim como, reduzir a contaminação por outros constituintes celulares. Neste contexto o presente trabalho teve como objetivo inicial determinar o local e limite de acúmulo intracelular de pilocarpina e verificar se o fornecimento externo de altas doses do alcalóide causaria toxidez às células produtoras e não produtoras de pilocarpina. Em seguida, caracterizar a absorção do alcalóide pelas células submetidas a diferentes valores de pH do meio de cultura e também identificar o mecanismo de transporte do alcalóide nas suspensões procurando definir qual é a proteína de membrana responsável pelo transporte de pilocarpina entre células e meio de cultura através do uso de inibidores de transportadores da família das ATPases e ATP-binding cassete proteins (ABC). Os testes histoquímicos e o ensaio de fracionamento celular, apesar de não conclusivos, indicaram o acúmulo de pilocarpina no vacúolo, ainda que a fração correspondente a essa organela venha misturada com o conteúdo do citoplasma. As informações sobre a localização subcelular em adição aos dados de toxicidade mostraram que pilocarpina apresenta forte citotoxicidade a cultura de plantas que não apresentam sua via de biossíntese. Culturas de P. microphyllus produtoras de pilocarpina apresentaram uma clara tolerância às altas doses do alcalóide (crescimento semelhante ao controle), mesmo que não produzindo o alcalóide em altas quantidades. Isto sugere a existência de um mecanismo de detoxificação espécifico-específico nas células aqui estudadas, que evitam a toxicidade de seus alcalóides (pilocarpina e pilosina) armazenando-os no vacúolo. Nos ensaios de absorção do alcalóide em diferentes valores de pH, observou-se que quanto maior o pH, menor a absorção do alcalóide. Nos ensaios com os inibidores de proteínas transportadoras de membrana verificou-se que as menores taxas de inibição na absorção e liberação provocadas por inibidores específicos de ATPases, a bafilomicina e pelo NH4Cl, não descartam a participação destas proteínas, mas podem indicam uma menor participação, visto que a inibição provocada pela azida sódica, também um inibidor de ATPases, foi muito intensa. Contudo, os resultados de absorção e liberação de pilocarpina mostraram intensa inibição na presença dos inibidores de ABCs o que aponta para um transporte de pilocarpina mediado por esta família de proteínas, tanto para fora como para dentro da célula. Por fim, os ensaios de cinética apontam para uma inibição do tipo competitiva gerada pelos dois inibidores utilizados, sendo que os menores valores da Constante de Inibição (Ki), encontrados para a nifedipina indicam que este composto possue uma ação inibitória mais intensa que o vanadato de sódio. / Abstract: Leaves of species from Pilocarpus genus are the only known source of pilocarpine, an imidazole alkaloid, which has been used for the treatment of glaucoma and xerostomy. Because the leaves of jaborandi are collected from plants living in the wild and the high price of pilocarpine in the international market, jaborandi was included in the endangered species list of IBAMA. Looking for alternative sources of this alkaloid, it has been shown that cell suspension cultures of Pilocarpus microphyllus can be a model to study the production of pilocarpine as well as a model to study its biosynthesis and metabolism, as it produces the same alkaloids that are found in leaves. Previous studies showed that high concentrations of nitrogen and the medium pH resulted in higher production and release of pilocarpine to the medium culture. Therefore, the objective of this study was to define the cell intracellular accumulation of pilocarpine and verify if exogenous by supplied pilocarpine to jaborandi cell suspensions is toxic to the cells. Moreover, the absorption of pilocarpine by cells treated with exogenous by supplied pilocarpine at different medium pH, as well as, the alkaloid transport mechanism through the cell membrane, using inhibitors of the protein families ATPases and ATP-Binding Cassette, were studied. The histochemical tests and the cell fractionation assays showed the accumulation of pilocarpine in the vacuole. This, together with the results of experiments that showed that pilocarpine was not toxic to jaborandi cells, suggests that vacuolar transport may be one of the mechanisms for the detoxification of pilocarpine in this species. In the absorption assays with different medium pH, the higher the pH, the lower absorption of pilocarpine by the cells. Bafilomicin and NH4Cl, which are ATPase inhibitors, were the least effective inhibitors among all the inhibitors tested for absorption and release of pilocarpine. This result does not discard the participation of these proteins in the process but indicate that they are less important, in view of the fact that inhibition by sodium azide which affects both ABC and ATPases, was very effective. The results on absorption and release of pilocarpine by the jaborandi cells showed strong inhibition by specific ABC inhibitors, which indicates an important participation of this protein family in the transport of the alkaloid through the cell membranes. Kinetics assays showed that inhibition was a reversible competitive type in the presence of nifedipine and sodium vanadate. The lowest Inhibition Constant (Ki) was observed for nifepidine. / Mestrado / Mestre em Biologia Vegetal

O desenvolvimento humano pode ser influenciado pelo ambiente. Estímulos recebidos ao longo da vida determinam seu progresso e sucesso. Estímulos positivos levam ao desenvolvimento de habilidades, melhorando funções cognitivas e da memória, enquanto estímulos negativos podem predispor a patologias como o estresse. Eventos estressantes durante a infância aumentam a predisposição para o desenvolvimento de transtornos psiquiátricos ao longo da vida. A separação materna, modelo animal de estresse pós-natal, promove diversas alterações comportamentais e encefálicas. Animais submetidos à separação materna apresentam comportamentos que mimetizam doenças psiquiátricas humanas. Por outro lado, diversos trabalhos sugerem que o enriquecimento ambiental pode ter efeito benéfico na reversão ou atenuação de modificações comportamentais e encefálicas promovidas por modelos animais de depressão, esquizofrenia, ansiedade e hiperatividade. Esses aspectos motivaram-nos a estudar se as alterações causadas por estresse podem ser revertidas ou atenuadas pelo enriquecimento do ambiente. Há evidências que sugerem um importante envolvimento de células gliais e de transportadores de glutamato presentes nessas células em modelos animais de transtornos psiquiátricos. Sendo assim, investigamos a expressão de mRNA e proteínas de dois transportadores de glutamato gliais e um neuronal, do receptor de glutamato AMPA, de marcadores gliais GFAP, S100?, glutamina sintase (GS) e do marcador de neurônios maduros NeuN na camada molecular e granular do giro denteado do hipocampo de ratos de 60 dias. Observamos que a separação materna diminui a expressão das proteínas GLAST, GLT-1, GS e NeuN, reduz a expressão dos genes Gria1 (AMPA) e S100?, e aumenta a expressão da proteína EAAC1 no giro denteado. Nossos dados sugerem uma reversão das alterações causadas pela separação materna em relação ao gene Gria1/AMPA e às proteínas GLAST, GLT-1 e EAAC1 após o enriquecimento ambiental. Portanto, o enriquecimento ambiental pode reverter as modificações causadas pela separação materna nas vias glutamatérgicas. Esses efeitos benéficos podem ser investigados para auxiliar no tratamento de transtornos psiquiátricos relacionados à separação materna. / Human development can be influenced by the environment. Stimuli received throughout life determine its progress and success. Positive stimuli lead to development of skills, improving cognitive and memory functions, while negative stimuli may predispose to pathologies such as stress. Stressful events during childhood increase the predisposition to psychiatric disorders throughout life. Maternal separation, an animal model of postnatal stress, promotes several behavioral and encephalic changes. Animals submitted to maternal separation stage behaviors associated with psychiatric diseases in humans. On the other hand, some researches have suggested that environmental enrichment may have some beneficial effects on the reversal or attenuation of behavioral and encephalic modifications promoted by animal models of depression, schizophrenia, anxiety and hyperactivity, which motivates us to study if these changes, stirred by this kind of stress, can be reversed or mitigated by environmental enrichment. There are evidences suggesting the involvement of glial cells and glutamate transporters existent in these cells in psychiatric disorders and animal models of these disorders. Therefore, we investigated mRNA and protein expression of two glial and one neuronal glutamate transporters, AMPA glutamate receptor, glial markers GFAP, S100?, glutamine synthase (GS), and the NeuN neuronal marker in the molecular and granular layer of the hippocampal gyrus in sixty-days-old rats. We observed that maternal separation decreases expression of GLAST, GLT-1, GS and NeuN proteins, reduces Gria1 (AMPA) and S100? gene expression, and increases EAAC1 protein expression in the dentate gyrus. After environmental enrichment, our data suggests a reversal of the maternal separation changes in the Gria1/AMPA gene and the GLAST, GLT-1 and EAAC1 proteins. Therefore, environmental enrichment may reverse the maternal separation changes in the glutamatergic pathways. These beneficial effects may be investigated to aid in the treatment of psychiatric disorders related to maternal separation.