Les tumeurs solides sont souvent confrontées à un environnement déficient en oxygène, dit hypoxique. Hypoxia-Inducible Factor 1 (HIF1) est le facteur de transcription clé de l’adaptation cellulaire à l’hypoxie, régulant de nombreux gènes impliqués dans l’angiogenèse, le métabolisme cellulaire ou la régulation du pH. Ma thèse s’articule en trois axes autour de HIF1 et de la reprogrammation métabolique hypoxique. J’ai d’abord étudié Factor-Inhibiting HIF1 (FIH), l’un des deux senseurs d’oxygène régulant HIF1. Nous avons montré que FIH est essentiel dans le développement tumoral en inhibant à la fois l’activité transcriptionnelle de HIF1 et la voie p53-p21. J’ai ensuite étudié le « shift » du métabolisme cellulaire vers la glycolyse induit par HIF1, générant une addiction pour le glucose. Nos travaux ont montré que paradoxalement, les cellules hypoxiques synthétisent du glycogène via HIF1 constituant ainsi une réserve de glucose intracellulaire. Le glycogène confère alors une résistance accrue des cellules tumorales suite à une carence en glucose. Enfin, j’ai pu montrer que l’AMPK, « gardien de la balance énergétique », n’est pas nécessaire au maintien d’un niveau viable d’ATP suite à l’inhibition de la glycolyse, via le blocage de l’export de lactate, mais exerce, un effet protecteur en absence de glucose. Cependant, l’inhibition conjointe du transporteur de lactate, MCT4, et de l’AMPK réduit fortement le développement tumoral dans un modèle de xénogreffes chez la souris, suggérant un rôle crucial de ces deux acteurs dans ce contexte. L’ensemble de ces travaux a permis d’identifier plusieurs cibles potentielles impliquées dans la plasticité métabolique en hypoxie. / Cells of solid tumors are often exposed to an environment deficient in oxygen, i.e. hypoxic. The Hypoxia-Inducible Factor-1 (HIF-1) is the major transcription factor involved in cellular adaptation to hypoxia. HIF-1 regulates a wide array of genes involved in angiogenesis, cellular metabolism or pH regulation. My thesis is organized into three axes around HIF-1 and metabolic reprogramming in hypoxia. I first studied Factor-Inhibiting HIF-1 (FIH), one of two oxygen sensors regulating HIF-1. We showed that FIH is essential for tumor development through inhibition of the HIF-1 transcriptional activity as well as through the suppression of the p53-p21 axis. I then studied the HIF-1-induced « shift » in cellular metabolism toward glycolysis, which generates a type of “glucose addiction”. We showed that paradoxically, tumor cells store glycogen in hypoxia through a HIF-1 dependant mechanism. Glycogen served as a reservoir of intracellular glucose, which allows hypoxic cells to survive periods of glucose starvation. Finally, I studied AMPK «the guardian of energy », and showed that surprisingly, this kinase is not necessary in maintaining a viable level of ATP when glycolysis is inhibited (by blockade of lactate export). However, as expected, AMPK protected cells during glucose starvation. Moreover, combined inhibition of the lactate transporter MCT4 and of AMPK reduced dramatically tumor development in a xenograft model, suggesting a crucial role for these two actors in the context of growth of tumor cells in a hostile environment. Taken together these results identified several potential drug targets involved in the metabolic plasticity of hypoxic cells.

Les maladies du bois de la vigne, causées par des champignons nécrotrophes, ont un impact considérable sur l'économie viticole au niveau mondial. En effet, tous les cépages Vitis vinifera cultivés actuellement présentent une sensibilité plus ou moins forte à ces champignons.Dans le but d'établir un test rapide d'évaluation de la sensibilité de clones de vigne (nouvellement sélectionnés ou futures obtentions variétales) à Eutypa lata, le champignon responsable de l'Eutypiose, une recherche de marqueurs moléculaires de tolérance a été réalisée. Suite à l'infection in vivo et in vitro d'une douzaine de cépages de sensibilité différente par E. lata, plusieurs gènes candidats ont été identifiés comme marqueurs potentiels de la tolérance à la maladie à partir d'une étude transcriptomique.A l'aide d'un système innovant d'infection in vitro, le dialogue moléculaire sans contact physique entre des disques foliaires de V. vinifera et le mycélium d’E. lata a également été étudié chez les douze cépages. Cette étude a permis de mettre en évidence le rôle potentiel d'éliciteurs dans la mise en place des réponses de défenses. De plus, l'infection par E. lata régule différentiellement l'expression des gènes codant pour un transporteur d'hexoses et des invertases, ainsi que les activités invertasiques associées, chez les cépages de sensibilités variables.Les travaux de recherche présentées dans cette thèse ont ainsi permis l'identification des marqueurs de tolérance à l'Eutypiose et la mise au point d'un test d'infection in vitro efficace et fiable, permettant de diagnostiquer la sensibilité des futures créations variétales. De plus les résultats obtenus démontrent l'importance des éliciteurs dans la mise en place des défenses, de la régulation du transport et du métabolisme des sucres au cours de l'infection par E. lata. / Nowadays, grapevine wood decay diseases cause significant economic losses for the most sensitive varieties and represent a threat to the sustainability of the wine industry.This research focuses on the identification of molecular markers for sensitivity to Eutypa lata, responsible for Eutypiosis that could be used to diagnose the sensitivity of new grapevine clones or cultivars. Using an in vivo and in vitro infection assay, several potential markers genes for tolerance to Eutypiosis have been identified from a gene expression study on twelve different cultivars.Using an innovative in vitro infection system, the molecular dialogue (without physical contact) between Vitis vinfera foliars discs of and Eutypa lata was studied, leading to the identification of elicitors that could potentially play a role in the induction of defense responses in the cultivars. In addition, the expression of several sugar transport and invertase genes and their associated activities were demonstrated to be differentially regulated by the infection in tolerant and susceptible cultivars.Altogether, this research work led to the identification of several tolerance markers genes to Eutypiosis and to the development of a new, efficient and reliable in vitro infection system that could be used to diagnose new cultivar susceptibility. Furthermore, the results obtained demonstrated the importance of sugar transport and defense metabolism regulation during the infection of grapevine by Eutypa lata.

Chez les procaryotes, les systèmes ABC (ATP-binding cassette) canoniques permettent un import efficace et de haute affinité du nickel, en grande partie via l'action de la Ni-BP (nickel-binding protein) qui va jouer le rôle de récepteur extracytoplasmique du nickel avant son passage à travers la membrane interne. Dans ces travaux, nous avons cherché à mieux caractériser les stratégies d'import de nickel par les bactéries, notamment par l'étude cristallographique des Ni-BP. La résolution des structures de cinq de ces protéines, en interaction avec du nickel, nous a permis d'identifier les sites de fixation et ainsi de mettre en évidence les différents modes d'interaction de ce métal avec les Ni-BP. Nos résultats montrent notamment que la coordination du nickel requiert toujours la présence d'un métallophore exogène, appelé nickelophore. En parallèle, des études in vivo ont été conduites sur Escherichia coli, montrant que cette bactérie semble être capable de synthétiser son propre nickelophore. D'autre part, ces travaux ont permis la résolution de la structure de HypB de Helicobacter pylori en interaction avec du nickel. Celle-ci permet de mieux appréhender le rôle central de cette protéine au sein des voies de maturation des enzymes à nickel. / In prokaryotes, canonical ABC (ATP-binding cassette) importers allow an efficient uptake of nickel with high affinity through the inner membrane, largely via the action of the extracytoplasmic nickel-binding protein (Ni-BP). In this work, we intended to better understand the strategies developed by bacteria to scavenge nickel in the environment, especially through the structural studies of several Ni-BP. The resolution of the crystal structures of five Ni-BPs from diverse bacteria, in interaction with nickel, led us to identify their nickel-binding sites and shed light on the different binding modes. Our results show that the presence of an exogenous metallophore, called nickelophore, is always required. In vivo studies in Escherichia coli were also conducted, showing that this bacteria seems to be able to synthesize its own nickelophore. In addition, we have solved the crystal structure of Helicobacter pylori HypB in complex with nickel. This result provides insight into its cellular function in nickel enzyme maturation pathways.

Le passage sélectif de molécules à travers la membrane interne des mitochondries est essentiel aux processus métaboliques des cellules eucaryotes. Cette communication cellulaire est assurée par des protéines transmembranaires de la famille des transporteurs mitochondriaux (MCF). Le transporteur ADP/ATP (AAC) est le membre le plus connu et le mieux caractérisé de cette famille. Il est responsable de l'import d'ADP dans la matrice mitochondriale et de l'export d'ATP après synthèse vers le cytosol. La structure d'AAC est connue mais plusieurs questions restent ouvertes concernant le mécanisme du transport, la sélectivité et l'état oligomérique, controversé, de la protéine. Pendant plusieurs années des études biochimiques réalisées sur la protéine solubilisée en détergent étaient en faveur d'une organisation dimérique du transporteur, mais la structure d'AAC, monomérique a remis en cause ce dogme. Afin de caractériser l'organisation oligomérique d'AAC in vivo, nous avons combiné plusieurs approches. Nous avons réalisé des expériences de FRET (Fluorescence Resonance Energy Transfer) directement sur des cellules mammifères ou bactériennes (E. coli) surexprimant la protéine AAC fusionnée avec des sondes FRET. En parallèle, nous avons mis au point des tests fonctionnels afin de contrôler l'état des mitochondries et l'activité du transporteur dans ces cellules. Enfin nous avons étudié la stoechiométrie de liaison de l'inhibiteur carboxyatractyloside grâce à des mesures de respiration sur des mitochondries extraites de foie de rat et placées dans différents états métaboliques. L'ensemble des résultats présentés dans ce manuscrit ont permis de montrer que 1) l'unité fonctionnelle d'AAC est monomérique 2) l'organisation structurale d'AAC dans les membranes natives dépend de l'état métabolique des mitochondries et peut être associée à des phénomènes de régulation. / The transport of small molecules through the inner mitochondrial membrane is essential in eukaryotic metabolism and is selectively controlled by a family of integral membrane proteins, the Mitochondrial Carrier Family (MCF). The ADP/ATP carrier (AAC), which is responsible for the import of ADP to the matrix of mitochondria and the export of newly synthesized ATP toward the cytosol, is the best-known and characterized MCF member. Although its structure sheds light on several aspects of the carrier activity, additional investigations are still required to decipher the whole transport mechanism, to understand the specificity and to characterize the controversial oligomeric state of the protein. For many years, based on studies mainly carried on detergent solubilized AAC the general consensus has been in favor of a dimeric organization of the carrier. The AAC three-dimensional structure, monomeric, broke this dogma. In order to get a precise insight into the in vivo oligomeric organization of AAC we combined several approaches. Fluorescence resonance energy transfer (FRET) measurements were performed directly on mammalian and E.coli cells expressing AAC labeled with several types of FRET probes. In parallel, different functional assays were established to control the state of the mitochondria in these cells and the transport activity of these AAC fusions. Lastly, measurements of the respiration rate coupled to the titration of the inhibitory effect of carboxyatractyloside on isolated rat liver mitochondria were used to investigate the organization of AAC in native mitochondria within two regimes of oxidative phosphorylation. Taken together the results described herein revealed that 1) AAC can function mechanistically as a monomer, 2) the organization of AAC in native membranes might be related to the state of the mitochondria and be involved in regulation.

Les sucres, sont des signaux métaboliques, impliqués dans le développement des plantes et leurs réponses aux contraintes du milieu. Les transporteurs de sucres se révèlent à la fois acteurs de la répartition des sucres et cibles de leur signalisation. L'ASR (ABA, Stress and Ripening) de la Vigne, VvMSA, étant identifiée comme protéine régulatrice de l'expression génique du transporteur d’hexoses VvHT1, l'objectif de la thèse est d'appréhender ses rôles physiologiques dans une démarche de biologie intégrée.Le premier axe a été dédié à la mise en place des modèles biologiques, des cellules embryogènes et non embryogènes de Vigne, issues du même fond génétique mais cultivées sur deux sources de carbone différentes. La caractérisation des cinétiques de prolifération et l'analyse des métabolomes ont mis en évidence leur sensibilité/tolérance différentielle à la carence en sucres. Le deuxième axe a porté sur la régulation de VvHT1 dans les deux types cellulaires sauvages et leurs mutants de surexpression/répression de VvMSA. L'approche pharmacologique utilisant des analogues du glucose, l'analyse de l'expression génique, le transport du glucose et l'activité des enzymes de la glycolyse indiquent que VvMSA affecte l'expression de VvHT1 par la voie dépendante du métabolisme du glucose. Le troisième volet a été réalisé par une approche de protéomique quantitative et comparative des protéines nucléaires des cellules embryogènes sauvages et réprimées pour VvMSA. Les protéines à expression significativement affectée par l'absence de l'ASR, laissent entrevoir un nouveau rôle à l'interconnexion des réponses métaboliques aux stress et la régulation épigénétique de l'expression génique. / Sugars are metabolic signals involved in plant development and responses to environmental cues. Sugar transporters are both actors of sugar partitioning and targets of sugar signaling. As Grape ASR (ABA, Stress, Ripening), VvMSA, is identified as a regulatory protein controlling gene expression of the hexose transporter VvHT1, the aim of the PhD thesis is to assess its physiological functions by an integrative biology approach. The first part of the study consisted in the establishment of biological models, embryogenic and non embryogenic grape cells, sharing the same genetic background but growing on distinct carbon sources. The characterization of the proliferation kinetics and metabolomes of both cell types revealed differences in their sensitivity/tolerance to sugar starvation.The second objective was focused on VvHT1 expression regulation in both cell types and their mutants overexpressing or silenced for VvMSA. The pharmacological approach using glucose analogues, coupled to the analysis of gene expression, glucose transport and glycolytic enzymes activity, suggest that VvMSA affects VvHT1 expression through a glucose metabolism dependent pathway.The third research axis was carried out through a quantitative and comparative proteomic analysis of nuclear proteins in embryogenic wild type and VvMSA silenced cells. Proteins whose expression is affected by ASR repression suggest a new functional role of VvMSA at the interplay between metabolic responses to stress and epigenetic regulation of gene expression.

Au cours des interactions plante/agent pathogène, la disponibilité en sucres est un des enjeux majeurs pour les deux partenaires. Il s'établit donc une compétition vis-à-vis des ressources carbonées entre l'agent pathogène hétérotrophe pour le carbone et la plante consommant de l'énergie pour se défendre. Les transporteurs de sucres sont les acteurs moléculaires qui interviennent dans cette compétition et probablement dans le devenir de l'interaction. L'objectif de cette étude est de déterminer l'implication des transporteurs de sucres au cours de l'interaction entre la plante modèle Arabidopsis thaliana et le champignon nécrotrophe Botrytis cinerea.Parmi la famille des transporteurs d'hexoses (STPs) d'A. thaliana, l'expression du gène STP13 est régulée positivement durant l'infection par B. cinerea. Le rôle potentiel de STP13 au cours de cette interaction a donc été étudié à l'aide de plantes transgéniques (Knock-Out et surexpresseur). Le suivi du développement des symptômes et la mesure d'absorption du glucose ont permis de montrer des modifications phénotypiques entre les différents génotypes étudiés. Les résultats indiquent une corrélation entre le niveau d'expression de STP13, le transport de glucose et le développement du champignon, confortant ainsi le rôle de STP13 dans la tolérance face à B. cinerea.Les résultats préliminaires de l'étude du transport de glucose à l'échelle cellulaire montrent une inhibition dans des conditions mimant l'infection. Ces analyses ont été effectuées grâce à un modèle constitué d'une suspension cellulaire d'A. thaliana subissant un traitement éliciteur à partir d'un extrait protéique de B. cinerea.Nous nous sommes également intéressés au transport de saccharose à l'échelle de la plante infectée. Nos résultats suggèrent que l'inoculation par le champignon modifie les flux de saccharose classiquement observés créant ainsi une nouvelle force d'appel. Ainsi, la feuille infectée se comporte comme un nouveau puits. Ces travaux de recherche s'inscrivent dans la nécessité d'une meilleure compréhension des mécanismes de transport des sucres qui permettra à terme d'agir sur les capacités de résistance des plantes vis-à-vis d'agents pathogènes. / During plant/pathogen interactions, sugar availability is one of the major issues for both partners. There is a competition for the same carbohydrates necessary for carbon supply on the pathogen's side and to support the additional energy demand for plant's defense. Sugar transporters are the molecular actors in this competition which is determinant for the final outcome of the interaction. In this study, we characterized the implication of sugar transporters in the interaction between the model plant Arabidopsis thaliana and the necrotrophic fungus Botrytis cinerea.Among the A. thaliana hexose transporter family (STPs), STP13 is induced during B. cinerea infection. A potential role of STP13 in this interaction was investigated using transgenic plants (Knock-Out and over-expressor lines). Disease symptoms characterization and glucose uptake assays showed phenotypical variations between the different genotypes. It seems that STP13 expression, glucose uptake and fungus spreading are correlated pointing to a role of STP13 in tolerance to B. cinerea. Other preliminary results showed an inhibition of the cellular glucose uptake upon condition mimicking B. cinerea infection. These analyses were performed on a model composed of an A. thaliana cell suspension elicited with a proteinaceous extract from B. cinerea.We also studied sucrose fluxes in the whole infected plant. Our results suggest that fungus inoculation modifies the usual fluxes creating a new sink.This study may lead to a better understanding of sugar transport mechanisms to improve plant resistance capacity against pathogens in the future.

Francisella tularensis, agent étiologique de la tularémie, est un pathogène intracellulaire facultatif capable d’infecter de nombreuses cellules de mammifères. Pour se multiplier activement dans le cytoplasme des cellules hôtes, la bactérie doit être en mesure de capter dans cet environnement tous les composés nécessaires à son métabolisme, et notamment des acides aminés qui représentent ses principales sources de carbone et d’azote. Les pathogènes à multiplication intracellulaire ont mis en place un ensemble de mécanismes, visant i) la manipulation des voies métaboliques de l’hôte, pour accroître le pool de nutriments disponibles, et ii) l’expression de transporteurs dédiés, pour la captation optimale de ces nutriments. Cet ensemble de mécanismes est regroupé sous le terme de « virulence nutritionnelle ». Chez Legionella pneumophila, plusieurs membres d’une sous-famille de transporteurs actifs secondaires (désignés Pht, ou transporteurs phagosomaux), responsables de la captation des acides aminés lors de la phase intracellulaire de la bactérie, ont été caractérisés. Dans ce travail, nous avons établi le rôle de deux membres de la sous-famille des transporteurs Pht (désignés AnsP et IleP), dans le transport d’acides aminés et la virulence de Francisella. La protéine AnsP est un transporteur d’asparagine. La délétion du gène codant pour ce transporteur n’a pas d’effet sur la croissance de Francisella en milieu synthétique, mais entraîne une diminution drastique de sa multiplication intracellulaire dans tous les types cellulaires testés, ainsi qu’une atténuation importante de la virulence chez la souris. La perte de virulence du mutant asnP est réversible aussi bien in vivo qu’in vitro par ajout d’asparagine en excès. F. tularensis, qui est prototrophe pour l’asparagine en milieu minimum, devient donc auxotrophe dans le cadre de sa croissance intracellulaire, et nécessite un transport de cet acide aminé via AnsP. Ce changement de besoins en asparagine entre le milieu extérieur et le milieu intracellulaire illustre bien le phénomène d’adaptation nutritionnel que réalise la bactérie dans le cadre d’une infection. La délétion du second transporteur, IleP, entraine un défaut de croissance en milieu minimum, réversible par ajout de thréonine, un précurseur métabolique de l’isoleucine chez F. tularensis subsp. novicida. Des expériences d’incorporation d’isoleucine marquée ont permis de mettre en évidence la fonction de transporteur d’isoleucine de la protéine IleP. La délétion du gène codant pour IleP entraine également un défaut de multiplication in vitro, associé à un léger retard de sortie du phagosome ainsi qu’une atténuation importante de la virulence chez la souris. Ce transporteur assure donc la captation de l’isoleucine dans des conditions où l’utilisation de la thréonine, ne permet pas d’assouvir les besoins de la bactérie. De façon remarquable, la voie de biosynthèse de l’isoleucine via la thréonine est interrompue chez les sous-espèces tularensis et holarctica. La croissance de ces sous espèces, plus virulentes que novicida, dans la cellule infectée devient donc strictement dépendante du transport de l’isoleucine par IleP. Cet exemple constitue une parfaite illustration de la spécialisation des souches pathogènes aux conditions nutritionnelles de leur hôte. En conclusion, l’ensemble des travaux présentés dans cette thèse a permis de démontrer la participation de deux transporteurs d’acides aminés à la virulence nutritionnelle de la bactérie Francisella. / Francisella tularensis is the causative agent of tularemia. This facultative intracellular pathogen can infect a broad variety of mammalian cells. To multiply actively in the cytoplasm of host cells, the bacteria must be able to capture in this environment all necessary nutrients, including amino acids, that constitute its principal carbon and nitrogen sources. Intracellular pathogens have established a set of mechanisms aimed at: i) hijacking the metabolic pathways of the host, to increase the pool of nutrients available, and ii) expressing transporters dedicated to the optimal transport of these nutrients. These mechanisms are grouped under the term "nutritional virulence." In Legionella pneumophila, several members of a sub-family of secondary active transporters (designated Pht for phagosomal transporter), responsible for the uptake of amino acids in the intracellular phase of the bacteria, have been characterized. In this work, we have established the role of two Pht members (designated AnsP and IleP) in amino acid transport and virulence of Francisella. The AnsP protein is an asparagine transporter. Deletion of the gene encoding the transporter has no effect on the growth of Francisella in synthetic medium, but lead to a drastic decrease in intracellular multiplication in all cell types tested, and significant attenuation of virulence in mouse. The loss of virulence of the ansP mutant was reversible in vivo and in vitro by addition of excess asparagine. F. tularensis, which is prototrophic for asparagine in minimum medium, becomes auxotrophic under its intracellular growth and requires transport of the amino acid via AnsP. This change of asparagine requirement between an environmental and an intracellular lifestyle illustrates the nutritional adaptation achieved by bacteria during infection. The deletion of the second transporter, IleP, causes a growth defect in minimum medium, reversible by adding threonine, a metabolic precursor of isoleucine in F. tularensis subsp. novicida. Transport asays with radiolabelled isoleucine have highlighted the role of IleP protein in isoleucine uptake. Deletion of the ileP gene caused a severe defect in intracellular multiplication, combined with a slight delay exit the phagosome and a significant attenuation of virulence in mice. Notably, the biosynthesis pathway of isoleucine via the threonine is interrupted in holarctica and tularensis subspecies. The growth of these subspecies, more virulent than novicida, in the infected cell becomes strictly dependent on the transport of isoleucine by IleP. This example is a perfect illustration of the specialization of pathogenic strains to nutritional condition of their host. In conclusion, the work presented in this thesis has demonstrated the participation of two amino acid transporters to the nutritional virulence of the Francisella.

Les cellules dendritiques (DCs) sont des cellules spécialisées dans la présentation de l'antigène aux lymphocytes (CPAs), capables d'initier des réponses immunitaires adaptatives et ce sont également les acteurs majeurs de la présentation croisée des antigènes exogènes par le complexe majeur d’histocompatibilité de classe I (CMH-I). Les mécanismes moléculaires et cellulaires de la présentation croisée ont beaucoup été étudiés, mais des questions importantes restent à élucider. Notre laboratoire a précédemment montré que la pré-incubation à basse température des DCs déficientes pour TAP (transporter associated with antigen processing) normalise l’expression de molécules du CMH-I à la surface et la présentation croisée des antigènes phagocytés par une voie dépendante du protéasome, suggérant que les phagosomes pourraient être dotés d’un transporteur alternatif pour importer les peptides générés dans le cytosol par le protéasome. Comme la source de CMH-I chargés par cette voie reste incertaine, il est possible que le rôle de TAP dans la présentation croisée des antigènes phagocytés soit indirect et limité à fournir les molécules de CMH-I disponibles pour un chargement pendant leur recyclage. Ainsi, notre objectif était de déterminer le rôle exact de TAP dans le transport de peptides à l'intérieur du phagosome et d'évaluer le rôle de TAP-L (TAP-like), un transporteur lysosomal ATP-dépendant avec une fonction putative dans la présentation antigénique. Nous avons mis au point une technique de transport des peptides par cytométrie en flux (phagoFACS) et montré que TAP est présent dans les phagosomes des DCs et est capable de transporter des peptides ayant une forte affinité pour TAP d'une manière ATP-dépendante. Cette technique permet l'exclusion des phagosomes ayant un défaut d’intégrité membranaire, obtenus lors de la préparation des phagosomes, et apporte une preuve directe de l'accumulation du peptide à l'intérieur des phagosomes. Les paramètres affectant cette accumulation sont la maturation phagosomale et la présence de molécules CMH-I liant le peptide. De façon surprenante, en l'absence de TAP, le peptide SIINFEKL dérivé de l’ovalbumine ayant une affinité intermédiaire pour TAP est transporté de manière ATP-dépendante dans le phagosome. Ceci est cohérent avec l’hypothèse suggérant la présence d'un autre transporteur de peptide dans les phagosomes des DCs. Nous avons utilisé la même technique pour évaluer la fonction physiologique de TAP-L dans le transport de peptides et montré que TAP-L est présent dans les phagosomes et serait responsable de l’import de peptides dans ces vésicules. Nos résultats suggèrent aussi que TAP-L semble jouer un rôle dans la présentation croisée des antigènes phagocytés à basse température. Ceci a été observé dans des DCs déficientes pour TAP et TAP-L, indiquant que les deux transporteurs pourraient coopérer pour assurer l’import des peptides dans les phagosomes. Nous avons également pu démontrer un rôle de TAP-L dans la présentation de l’antigène par CMH-II. Ces résultats nous encouragent à explorer les mécanismes sous-jacents à ces fonctions pour comprendre la contribution relative de chaque transporteur de peptides dans la présentation antigénique. / Dendritic cells (DCs) are potent antigen-presenting cells, capable of activating resting T cells and of initiating primary and stimulating memory immune responses. DCs can efficiently use internalized antigens for presentation by major histocompatibility class I (MHC-I) molecules: a phenomenon referred to as “cross-presentation.” Cross-presentation is important in priming of CD8+ T-cell responses to a variety of pathogens and to tumors as well as in immune tolerance to self and in autoimmunity. The molecular and cell biological mechanisms underlying cross-presentation have been studied intensively but important issues remain unclear. Our laboratory has previously shown that the pre-incubation of TAP-deficient DCs at low temperature normalized surface MHC-I expression and cross-presentation of phagocytosed antigens in a proteasome-dependent pathway. This suggested that phagosomes might harbor an alternative peptide transporter to import peptides generated by cytosolic proteasome complexes. As the source of MHC-I loaded in this pathway remains unclear, it is possible that the principal or partial role of TAP in proteasome-dependent cross-presentation of phagocytosed antigens is to provide recycling cell surface class I molecules. Our aim was to assess the exact role of TAP in peptide transport into phagosomes and to examine the role of the transporter associated with antigen processing-like (TAP-L), a lysosomal transporter with a putative function in antigen presentation. We have developed an assay of peptide transport using flow cytometry (phagoFACS) and shown that TAP is present in DC phagosomes and capable of transporting at least peptides with high affinity to TAP in an ATP-dependant manner. Using this assay, which allowed for eliminating background due to leaky vesicles, we were able to provide direct evidence of peptide accumulation inside phagosomes. ATP-dependant peptide accumulation inside phagosomes was affected by phagosomal maturation and by the presence of a peptide-binding MHC class I-molecule. Surprisingly, in the absence of TAP, another peptide transporter may be able to transport a peptide with intermediate affinity to TAP, namely the ovalbumin peptide SIINFEKL, in an ATP-dependant manner. We used the same technique to assess the function of TAP-L in peptide transport and found that TAP-L may be involved in peptide import into phagosomes. Additional results suggest that TAP-L plays a role in MHC-II presentation and cross-presentation of phagocytosed antigens at low temperature. The latter was shown in DCs lacking both transporters, suggesting that TAP and TAP-L might cooperate to ensure peptide import into phagosomes. The mechanisms underlying these functions should be explored to understand the relative contribution of each peptide transporter to antigen presentation.

Les membranes cellulaires jouent un rôle important dans l’absorption des médicaments et la distribution de ceux-ci dans le corps humain. Elles contiennent différents transporteurs membranaires qui sont responsables des profils pharmacocinétiques, d’innocuité et d’efficacité des xénobiotiques. Lors du développement d’un médicament, il s’avère donc indispensable, de prédire l’interaction des nouveaux composés avec les transporteurs présents dans l’organisme. Le but du projet de recherche est de créer un nouvel outil pour étudier le comportement de la glycoprotéine-P (P-gp), un transporteur membranaire responsable du rejet de nombreux composés, sur différents médicaments. Pour cela, un modèle non cellulaire est développé en utilisant des protéoliposomes : des liposomes dans lesquels des transporteurs sont incorporés. La méthodologie consiste tout d’abord à produire, extraire et purifier la protéine d’intérêt à partir de deux systèmes d’expression : MDCK-MDR1 (cellules de chien transfectées avec le gène humain MDR1) et Pichia pastoris (levures) fin de déterminer les avantages et les limites de ces deux types cellulaires. Différentes méthodes de reconstitution dans des protéoliposomes ont ensuite été testées avec la P-gp obtenue. Puis, l’activité ATPasique de la P-gp reconstituée a été évaluée en présence de différents substrats. Les protocoles de culture cellulaire, d’extraction et de purification des deux systèmes d’expression ont été implémentés avec succès au sein du laboratoire. Les résultats montrent que les rendements obtenus sont supérieurs avec les levures qu’avec les cellules de mammifère. En outre, Pichia pastoris offre les avantages d’être facile et rapide à cultiver et peu couteux. Les premiers résultats d’activité ATPasique obtenus avec la P-gp reconstituée en protéoliposomes étaient prometteurs mais n’ont pas été reproduits en raison de la dégradation de la protéine membranaire. Les prochaines études du projet porteront sur un autre transporteur membranaire de la famille ABC, BCRP, une protéine de plus petite taille qui devrait montrer une plus grande stabilité pour mener à bien les tests. / Cellular membranes play an important role in the absorption and distribution of drugs in the human body. They contain different membrane transporters, which are responsible for the pharmacokinetic properties of drugs, as well as the safety and efficiency of their diffusion. When developing a new drug, it is thus of utmost importance to study the way that it will interact with the transporters present within the body. The aim of this study was to evaluate a new tool for measuring permeability in order to understand the function and mecanisms of P-glycoprotein (P-gp). P-gp is a transporter that is responsible for the rejection of many different compounds found in various drugs. This study thus seeks to use proteoliposomes to develop non-cellular models of membrane permeability including efflux and uptake transporters. This novel model of permeability will be utilized to study the underlying mechanisms of membrane permeability to xenobiotics. The human P-gp was produced, extracted and purified using two different expression systems: MDCK-MDR1 cells (Madin-Darby canine kidney cells transfected with the human MDR1 gene) and Pichia pastoris. Both expression systems were studied in order to compare the strengths and weaknesses of each system. We then tested different methods of reconstituting the P-gp into protéoliposomes. Finally, we measured the level of ATPase activity using different substrates. The protocols of cell culture, extraction and purification of both expression systems were accomplished in a laboratory during this study. These results demonstrated that expressing P-gp using yeast was more effective than that of mammalian cells. Furthermore, working with Pichia pastoris offers multiple advantages: expressing P-gp was easier, faster and cheaper than working with mammalian cells. The first measurements of ATPase activity using reconstituted P-gp proteoliposomes were promising, however they proved difficult to reproduce due to the possible degradation of the membrane protein.Further studies in this project will look to evaluate another ABC membrane transporter, BCRP. This smaller protein should prove to be more stable than P-gp, facilitating experimentation.

Notre projet vise à déterminer la structure 3D du transporteur BmrA de Bacillus subtilis. La protéine a été purifiée dans six détergents différents. L'utilisation de foscholine 12, a conduit à cristalliser OmpF, une porine de la membrane externe d'E. coli. Nous montrons que les conditions de cristallisation influencent directement l'empilement cristallin d'OmpF. Le protocole de purification de BmrA, optimisé en utilisant du triton X100 à l'extraction puis un mélange β-D-dodecyl maltoside-cholate pour les étapes chromatographiques nous a permis d'obtenir à 4°C des cristaux, pour lesquels nous avons vérifié qu'ils sont constitués de BmrA. Ces cristaux ont permis d'obtenir un jeu complet jusqu'à 7 Å. Ces données de diffraction constituent une avancée significative pour résoudre à court terme la structure 3D de BmrA. Nous avons développé une nouvelle méthode de dosage des détergents qui est basée sur la détermination par spectrométrie de masse de type MALDI du ratio d'isotopes deutérés/ protonés. La méthode a été validée avec la FC12, le DDM, le β-OG, le LMNG, le CHAPS, le cholate et des détergents calix[4]aréniques, en mesurant la concentration de ces détergents dans différentes conditions d'extraction/purification, de concentration, dialyse et gel filtration, de différentes protéines membranaires. Cette méthode nous a permis (i) d'estimer la taille de la ceinture de détergent associée à BmrA et d'autres protéines membranaires (ii) de moduler cette taille en fonction de mélange de détergents et (iii) d'apporter des informations sur le comportement des complexes protéine-détergent / Our project aims to determine the 3D structure of BmrA from Bacillus subtilis. The protein was purified in six different detergents. Using foscholine 12, led to crystallize OmpF, an outer membrane porin of E. coli. We show that the crystallization conditions directly influence the crystal packing of OmpF. The BmrA purification protocol optimized by using Triton X100 at the extraction and a mixture β-D-dodecyl-maltoside cholate for chromatographic steps allowed us to get to 4°C crystals, for which we verified they consist of BmrA. These crystals have yielded full data to 7 Å. These diffraction data are a significant advance in the short term to resolve the 3D structure of BmrA. We have developed a new detergents dosage assay which is based on the determination by MALDI-type mass ratio of deuterated isotopes / protonated. The method was validated with the FC12, the DDM, the β-OG, the LMNG, CHAPS, cholate detergents and calix [4] aréniques by measuring the concentration of these detergents in different conditions of extraction/ purification, concentration, dialysis and gel filtration, of different membrane proteins. This method allowed us (i) to estimate the size of the detergent belt associated to BmrA and other membrane proteins (ii) to modulate this size in terms of the detergent mixture and (iii) to provide information on the behavior of complex protein-detergent