Les ganglions de la base (GB) sont un ensemble de noyaux sous-corticaux impliqués dans les fonctions motrices, mnésiques et cognitives. Le globus pallidus externe (GPe) est un noyau GABAergique, qui tient la place de structure relais entre le striatum et le noyau sous-thalamique au sein du réseau des GB. Les changements de mode et de fréquence de décharge des neurones du GPe sont connus pour être les signatures électro-physiologiques des maladies de Parkinson (MP) et de Huntington (MH). Dans la MP, où les concentrations de GABA extracellulaires sont anormalement élevées dans le GPe, il est admis que la voie striato-pallidale (STR-GPe) est hyperactive, ce qui contribue à l’hypoactivité des neurones pallidaux. A l’inverse dans la MH, il est admis que l’hyperactivité des neurones du GPe est due à la dégénérescence de la voie STR-GPe levant la principale influence inhibitrice du GPe. Cependant, les mécanismes moléculaires impliqués dans ces changements d’activité pallidale sont encore peu connus. Nous avons donc entrepris des expériences de biologie moléculaire, d’immunohistochimie et d’électrophysiologie sur tranches, afin de mieux caractériser l’origine des modifications de transmission GABAergique conduisant aux changements d’activité électro-physiologique des neurones du GPe dans ces deux pathologies à l’aide de modèles animaux. Mes principaux résultats montrent l’apparition d’une inhibition tonique dans les neurones du GPe due à un déficit de recapture du GABA dans la MP et une réduction précoce de la transmission synaptique GABAergique dans la MH. Ces résultats suggèrent que les altérations de la transmission GABAergique contribuent à la physiopathologie de la MP et la MH. / The basal ganglia (BG) are a group of sub-cortical nuclei involved in motor, memory and cognitive functions. In the BG, the GABAergic external globus pallidus (GPe) holds a position of relay nucleus between the striatum (STR) and the sub thalamic nucleus within the indirect pathway of the BG. Modifications of rate and pattern of activity of this nucleus are known to be the electrophysiological signatures of Parkinson’s (PD) and Huntington’s diseases (HD). In PD, hyperactivity of the striato-pallidal (STR-GPe) pathway is thought to be responsible for the increase of the extracellular GABAergic concentrations in the GPe and participate to the hypoactivity of pallidal neurons observed in experimental Parkinsonism. In contrast, during HD, it is recognized that the hyperactivity of GPe neurons is due to the degeneration of striato-pallidal neurons and thus to the reduction of the main source of pallidal GABAergic inhibition. However, the molecular mechanisms involved in these modifications of pallidal activity are not well characterized. Therefore, using PD and HD animal models, the 6-OHDA rodents and the R6-1 transgenic mice respectively, we have performed molecular biology, immunohistochemistry and electrophysiological in vitro experiments in order to better understand the origin of GABAergic transmission alterations leading to changes in electrophysiological activity of GPe neurons into these two pathologies. My main results show the apparition of a tonic GABAergic inhibition due to a deficit of GABA uptake in PD and a early stage reduction of GABAergic synaptic transmission in HD. Altogether, these results suggest that alterations of GABAergic transmission contribute to the pathophysiology of PD and HD.

Le testicule assure la production des spermatozoïdes et la sécrétion de la testostérone. Chaque fonction est assumée par un compartiment cellulaire distinct: l’épithélium séminifère et le tissu interstitiel. Le cholestérol, présent dans les deux compartiments, est un composé indispensable aux membranes cellulaires et un précurseur essentiel de la testostérone. Dans le compartiment interstitiel, environ 40 % du cholestérol utilisé pour la production hormonale est importé du sang à partir des lipoprotéines HDL et/ou LDL. Dans l’épithélium séminifère, la cellule de Sertoli assure le contrôle et le maintien de la spermatogenèse. Elle a la capacité de synthétiser du cholestérol à partir de l’acétate in vitro, néanmoins, il n’y a pas d’évidence qu’elle le fait in vivo. De plus il existe, au niveau des tubules séminifères, une barrière hémato-testiculaire qui empêche le libre passage de plusieurs composés sanguins, y compris le cholestérol. Nous avons testé l’hypothèse qu’il existe des moyens d’importation du cholestérol sanguin, mais aussi l’exportation du cholestérol intra-tissulaire, qui contourneraient cette barrière et qui contribueraient au maintien du taux intratubulaire du cholestérol compatible avec le bon déroulement de la spermatogenèse. Nous avons comparé les taux de variation de l’expression de l’ARNm et de la protéine des transporteurs sélectifs de cholestérol SR-BI, SR-BII, CD36 et ABCA1 aux taux de variation du cholestérol libre et estérifié au cours de la spermatogenèse chez les souris normales durant le développement postnatal. Afin de mieux apprécier le niveau d’implication de chacun de ces récepteurs, nous avons examiné comment la suppression du gène d’une enzyme comme la lypase hormono-sensible (HSL) ou de celui d’un transporteur de cholestérol comme SR-BI, CD36 ou NPC1 était compensée et comment cette suppression affectait le taux de cholestérol libre et estérifié dans chacun des deux compartiments cellulaires du testicule. Nous avons dans un premier temps mis au point une nouvelle technique d’isolation des testicules en fraction enrichie en tissu interstitiel (ITf) et en tubules séminifères (STf) qui a l’avantage de mieux préserver l’intégrité des formes phosphorylées et glycosylées des protéines comparée aux techniques préexistantes. Les résultats de nos analyses ont montré que l’expression de SR-BI et CD36 étaient maximales dans les ITf au moment où les souris ont complété leur maturité sexuelle et où le niveau de synthèse de la testostérone était maximal. Dans les tubules séminifères, l’expression maximale de SR-BI et le taux le plus élevé de cholestérol estérifié étaient mesurés de façon concomitante à 35 jours après la naissance, au moment où la première vague de l’activité spermatogénétique était complétée. L’expression de l’ABCA1 était maximale au moment où le taux de cholestérol était élevé et minimale au moment où le taux de cholestérol était le plus bas, alors que le niveau d’expression de CD36 était maximal chez l’adulte au moment où le taux de spermiation était le plus élevé. L’expression de SR-BII variait peu dans les deux compartiments cellulaires durant le développement. La suppression génétique de la HSL et de NPC1, qui cause une infertilité chez les souris mâles, était accompagnée d’une accumulation de cholestérol libre et estérifié dans les tubules séminifères. Par contre, la suppression génétique de SR-BI et CD36, qui ne causent pas d’infertilité chez les souris mâles était sans impact significatif sur le taux de cholestérol intratubulaire. Nous avons montré que l’invalidation génétique d’un transporteur sélectif ou d’une enzyme du métabolisme du cholestérol était accompagnée d’un ensemble de mécanismes de compensation visant à maintenir le taux de cholestérol libre aux niveaux semblables à ceux mesurés dans les fractions tissulaires de souris normales. Ensemble, nos résultats ont montré que l’expression des transporteurs sélectifs de cholestérol SR-BI, SR-BII, CD36 et ABCA1 variait en fonction de la spermatogenèse et du taux intratesticulaire du cholestérol suggérant leur contribution au maintien de l’homéostasie du cholestérol intratesticulaire. / The testis is made up of loops of convoluted seminiferous tubules surrounded by interstitial tissue composed of loose connective tissue containing Leydig cells that secrete testosterone into the bloodstream. The seminiferous tubules are lined with a stratified epithelium containing germ cells at various stages of development and the supporting Sertoli cells. Cholesterol is present in both compartments and is crucial for the development of germ cells, the fertility of spermatozoa as well as for testosterone production. In the interstitial compartment, approximately 40 % of the cholesterol used for the hormonal production is imported from blood lipoproteins HDL and LDL. In the seminiferous epithelium, Sertoli cells plays key role in the development and maintenance of spermatogenesis. Sertoli cells have the capacity to synthesize cholesterol from acetate in vitro, however, there is no evidence that they do so in vivo. In addition, there is a blood-testis barrier within the seminiferous tubules that prevents the free passage of several blood compounds including cholesterol. We tested the hypothesis that there are ways of blood cholesterol uptake, but also the intratubular cholesterol efflux that by-pass this barrier and contribute to the cholesterol homeostasis within the tubules. We compared expression patterns of the mRNA and proteins for selective cholesterol transporters SR-BI, SR-BII, CD36 and ABCA1 with those of free and esterified cholesterol during the spermatogenesis in normal mice during the postnatal development. To better appreciate the level of involvement of each receptor, we examined the effect of the deletion of the genes for an enzyme (HSL) or for cholesterol transporters (SR-BI, CD36 or NPC1) on the rate of free and esterified cholesterol in both compartments of the testis. At first, we worked out a new technique to separate the testes into interstitial tissue- (ITf) and seminiferous tubule-enriched fractions (STf) that has the advantage of allowing a more faithful detection of the phosphorylated and glycosylated forms of the proteins compared to existing techniques. Our results showed that the expression of SR-BI and CD36 was maximum in the ITf when mice completed their sexual maturity and reached the peak level of testosterone synthesis. In the seminiferous tubule-enriched fractions, the maximum level of SR-BI expression coincided with the highest level of esterified cholesterol during the development at 35 days, as the first wave of the spermatogenetic activity was completed. ABCA1 reached the highest expression level when cholesterol was high and reached the lowest when cholesterol was at its minimum, while the level of CD36 expression was maximal in the adult tubules as the rate of spermiation was the highest. The knockout of the HSL and NPC1, which renders the male mice infertile, was accompanied by the accumulation of free and esterified cholesterol in the seminiferous tubules. On the other hand, the knockout of SR-BI and CD36, linkes to infertility, did not affect the rate of intratubular cholesterol. Here we showed that genetic withdrawal of a cholesterol transporter or of an enzyme involved in cholesterol metabolism was compensated by other transporters or enzymes in order to maintain the level of free cholesterol similar to those measured in the tissue-enriched fractions of wild-type mice. Together, our results showed that the expression of the selective cholesterol transporters SR-BI, SR-BII, CD36 and ABCA1 varied according to the spermatogenesis and intratesticular cholesterol rate, thus suggesting their contribution to the preservation of the intratesticular cholesterol homeostasis.

Les sécrétines peptidiques de l’hormone de croissance (GHRPs) constituent une classe de peptides synthétiques capables de stimuler la sécrétion de l’hormone de croissance (GH). Cette activité est médiée par leur liaison à un récepteur couplé aux protéines G : le récepteur des sécrétines de l’hormone de croissance (GHS-R1a), identifié subséquemment comme le récepteur de la ghréline. La ghréline est un peptide de 28 acides aminés sécrété principalement par les cellules de la muqueuse de l’estomac, qui exerce de nombreux effets périphériques indépendamment de la sécrétion de l’hormone de croissance. Les effets indépendants de la sécrétion de GH incluent, entre autres, des actions sur le contrôle de la prise de nourriture, le métabolisme énergétique, la fonction cardiaque, le système immunitaire et la prolifération cellulaire. L’étude de la distribution périphérique des sites de liaison des GHRPs nous a permis d’identifier un second site, le CD36, un récepteur scavenger exprimé dans plusieurs tissus dont le myocarde, l’endothélium de la microvasculature et les monocytes/macrophages. Le CD36 exprimé à la surface du macrophage joue un rôle clé dans l’initiation du développement de l’athérosclérose par la liaison et l’internalisation des lipoprotéines de faible densité oxydées (LDLox) dans l’espace sous-endothélial de l’artère. L’hexaréline, un analogue GHRP, a été développé comme agent thérapeutique pour stimuler la sécrétion de l’hormone de croissance par l’hypophyse. Sa propriété de liaison aux récepteurs GHS-R1a et CD36 situés en périphérie et particulièrement sa capacité d’interférer avec la liaison des LDLox par le CD36 nous ont incité à évaluer la capacité de l’hexaréline à moduler le métabolisme lipidique du macrophage. L’objectif principal de ce projet a été de déterminer les effets de l’activation des récepteurs CD36 et GHS-R1a, par l’hexaréline et la ghréline, le ligand endogène du GHS-R1a, sur la physiologie du macrophage et de déterminer son potentiel anti-athérosclérotique. Les résultats montrent premièrement que l’hexaréline et la ghréline augmentent l’expression des transporteurs ABCA1 et ABCG1, impliqués dans le transport inverse du cholestérol, via un mécanisme contrôlé par le récepteur nucléaire PPARγ. La régulation de l’activité transcriptionnelle de PPARγ par l’activation des récepteurs CD36 et GHS-R1a se fait indépendamment de la présence du domaine de liaison du ligand (LBD) de PPARγ et est conséquente de changements dans l’état de phosphorylation de PPARγ. Une étude plus approfondie de la signalisation résultant de la liaison de la ghréline sur le GHS-R1a révèle que PPARγ est activé par un mécanisme de concertation entre les voies de signalisation Gαq/PI3-K/Akt et Fyn/Dok-1/ERK au niveau du macrophage. Le rôle de PPARγ dans la régulation du métabolisme lipidique par l’hexaréline a été démontré par l’utilisation de macrophages de souris hétérozygotes pour le gène de Ppar gamma, qui présentent une forte diminution de l’activation des gènes de la cascade métabolique PPARγ-LXRα-transporteurs ABC en réponse à l’hexaréline. L’injection quotidienne d’hexaréline à un modèle de souris prédisposées au développement de l’athérosclérose, les souris déficientes en apoE sous une diète riche en cholestérol et en lipides, se traduit également en une diminution significative de la présence de lésions athérosclérotiques correspondant à une augmentation de l’expression des gènes cibles de PPARγ et LXRα dans les macrophages péritonéaux provenant des animaux traités à l’hexaréline. L’ensemble des résultats obtenus dans cette thèse identifie certains nouveaux mécanismes impliqués dans la régulation de PPARγ et du métabolisme du cholestérol dans le macrophage via les récepteurs CD36 et GHS-R1a. Ils pourraient servir de cibles thérapeutiques dans une perspective de traitement des maladies cardiovasculaires. / Growth hormone-releasing peptides (GHRPs) are a class of small synthetic peptides known to stimulate GH release through their binding to a G protein-coupled receptor identified as GHS-R1a, later recognized as the ghrelin receptor. Ghrelin is an acetylated 28 amino acid hormone initially identified from the stomach, which induces the release of growth hormone (GH) from the pituitary but also regulates food intake, energy homeostasis, cardiovascular function, immune system and cell proliferation. In documenting the peripheral distribution of GHRPs binding sites, we uncovered the presence of another binding site for GHRPs, identified as CD36, a class B scavenger receptor. CD36 is expressed among several tissues, including myocytes, endothelial cells of the microvasculature and monocytes/macrophages. The macrophage CD36 contributes to excessive lipid loading and atherogenic formation of foam cells through uptake of oxidized low-density lipoprotein (oxLDL) in the subendothelial space of the artery. The properties of hexarelin, a ligand for GHS-R1a and CD36, which features overlapping binding sites with that of oxLDL binding domain on CD36, and thus interfering with the binding of oxLDL on CD36, have prompted us to evaluate the potential of hexarelin, as well as that of the endogenous ligand ghrelin in the modulation of macrophage cholesterol metabolism. We demonstrate here the ability of hexarelin and ghrelin to enhance the expression of ATP-binding cassette A1 and G1 transporters through a PPARγ-dependent mechanism. The hormone binding domain of PPARγ is not required to mediate PPARγ transcriptional activation by CD36 and GHS-R1a. Both hexarelin and ghrelin promotes phosphorylation of PPARγ in THP-1 macrophages. A more detailed study of GHS-R1a-initiated signaling revealed an intricate and complex signalling interplay triggered by ghrelin that involves modulation of Src-dependent Dok-1/ERK1/2 and Src-independent Gαq/PI3-K/Akt pathways, leading to PPARγ-dependent transcriptional competence in the macrophages. The central role of PPARγ on cholesterol metabolism in the macrophages has been demonstrated using peritoneal macrophages from PPARγ heterozygote mice whose response to hexarelin on PPARγ-LXRα-ABC transporters pathway was strongly impaired. Treatment of apolipoprotein E-null mice fed on a lipid-rich diet with hexarelin resulted in a significant reduction in atherosclerotic lesions, concomitant with an enhanced expression of PPARγ and LXRα target genes in peritoneal macrophages. The results presented in this thesis feature novel mechanisms by which the beneficial regulation of PPARγ and cholesterol metabolism in macrophages could be regulated by both CD36 and ghrelin receptor. The downstream effects following the activation of these receptors might be potential targets in the treatment of human coronary artery disease.

En lien avec l’augmentation constante de l’obésité, de plus en plus de personnes sont atteintes de résistance à l’insuline ou de diabète de type 2. Ce projet doctoral s’est surtout intéressé à l’une des conséquences majeures des pathologies cardiométaboliques, soit la dyslipidémie diabétique. À cet égard, les gens présentant une résistance à l’insuline ou un diabète de type 2 sont plus à risque de développer des perturbations lipidiques caractérisées essentiellement par des taux élevés de triglycérides et de LDL-cholestérol ainsi que de concentrations restreintes en HDL-cholestérol dans la circulation. Les risques de maladies cardiovasculaires sont ainsi plus élevés chez ces patients. Classiquement, trois organes sont connus pour développer l’insulino-résistance : le muscle, le tissu adipeux et le foie. Néanmoins, certaines évidences scientifiques commencent également à pointer du doigt l’intestin, un organe critique dans la régulation du métabolisme des lipides postprandiaux, et qui pourrait, conséquemment, avoir un impact important dans l’apparition de la dyslipidémie diabétique. De façon très intéressante, des peptides produits par l’intestin, notamment le GLP-1 (glucagon-like peptide-1), ont déjà démontré leur potentiel thérapeutique quant à l’amélioration du statut diabétique et leur rôle dans le métabolisme intestinal lipoprotéinique. Une autre évidence est apportée par la chirurgie bariatrique qui a un effet positif, durable et radical sur la perte pondérale, le contrôle métabolique et la réduction des comorbidités du diabète de type 2, suite à la dérivation bilio-intestinale. Les objectifs centraux du présent programme scientifique consistent donc à déterminer le rôle de l’intestin dans (i) l’homéostasie lipidique/lipoprotéinique en réponse à des concentrations élevées de glucose (à l’instar du diabète) et à des peptides gastro-intestinaux tels que le PYY (peptide YY); (ii) la coordination du métabolisme en disposant de l’AMPK (AMP-activated protein kinase) comme senseur incontournable permettant l’ajustement précis des besoins et disponibilités énergétiques cellulaires; et (iii) l’ajustement de sa capacité d’absorption des graisses alimentaires en fonction du gain ou de la perte de sa sensibilité à l’insuline démontrée dans les spécimens intestinaux humains prélevés durant la chirurgie bariatrique. Dans le but de confirmer le rôle de l’intestin dans la dyslipidémie diabétique, nous avons tout d’abord utilisé le modèle cellulaire intestinal Caco-2/15. Ces cellules ont permis de démontrer qu’en présence de hautes concentrations de glucose en basolatéral, telle qu’en condition diabétique, l’intestin absorbe davantage de cholestérol provenant de la lumière intestinale par l’intermédiaire du transporteur NPC1L1 (Niemann Pick C1-like 1). L’utilisation de l’ezetimibe, un inhibiteur du NPC1L1, a permis de contrecarrer cette augmentation de l’expression de NPC1L1 tout comme l’élévation de l’absorption du cholestérol, prouvant ainsi que le NPC1L1 est bel et bien responsable de cet effet. D’autre part, des travaux antérieurs avaient identifié certains indices quant à un rôle potentiel du peptide intestinal PYY au niveau du métabolisme des lipides intestinaux. Toutefois, aucune étude n’avait encore traité cet aspect systématiquement. Pour établir définitivement l’aptitude du PYY à moduler le transport et le métabolisme lipidique dans l’intestin, nous avons utilisé les cellules Caco-2/15. Notre étude a permis de constater que le PYY incubé du côté apical est capable de réduire significativement l’absorption du cholestérol et le transporteur NPC1L1. Puisque le rôle de l'AMPK dans l'intestin demeure inexploré, il est important non seulement de définir sa structure moléculaire, sa régulation et sa fonction dans le métabolisme des lipides, mais aussi d'examiner l'impact de l’insulino-résistance et du diabète de type 2 (DT2) sur son statut et son mode d’action gastro-intestinal. En employant les cellules Caco-2/15, nous avons été capables de montrer (i) la présence de toutes les sous-unités AMPK (α1/α2/β1/β2/γ1/γ2/γ3) avec une différence marquée dans leur abondance et une prédominance de l’AMPKα1 et la prévalence de l’hétérotrimère α1/β2/γ1; (ii) l’activation de l’AMPK par la metformine et l’AICAR, résultant ainsi en une phosphorylation accrue de l’enzyme acétylCoA carboxylase (ACC) et sans influence sur l'HMG-CoA réductase; (iii) la modulation négative de l’AMPK par le composé C et des concentrations de glucose élevées avec des répercussions sur la phosphorylation de l’ACC. D’autre part, l’administration de metformine au Psammomys obesus, un modèle animal de diabète et de syndrome métabolique, a conduit à (i) une régulation positive de l’AMPK intestinale (phosphorylation de l’AMPKα-Thr172); (ii) la réduction de l'activité ACC; (iii) l’augmentation de l’expression génique et protéique de CPT1, supportant une stimulation de la β-oxydation; (iv) une tendance à la hausse de la sensibilité à l'insuline représentée par l’induction de la phosphorylation d'Akt et l’inactivation de la phosphorylation de p38; et (v) l’abaissement de la formation des chylomicrons ce qui conduit à la diminution de la dyslipidémie diabétique. Ces données suggèrent que l'AMPK remplit des fonctions clés dans les processus métaboliques de l'intestin grêle. La preuve flagrante de l’implication de l’intestin dans les événements cardiométaboliques a été obtenue par l’examen des spécimens intestinaux obtenus de sujets obèses, suite à une chirurgie bariatrique. L’exploration intestinale nous a permis de constater chez ceux avec un indice HOMA élevé (marqueur d’insulinorésistance) (i) des défauts de signalisation de l'insuline comme en témoigne la phosphorylation réduite d'Akt et la phosphorylation élevée de p38 MAPK; (ii) la présence du stress oxydatif et de marqueurs de l'inflammation; (iii) la stimulation de la lipogenèse et de la production des lipoprotéines riches en triglycérides avec l’implication des protéines clés FABP, MTP et apo B-48. En conclusion, l'intestin grêle peut être classé comme un tissu insulino-sensible et répondant à plusieurs stimuli nutritionnels et hormonaux. Son dérèglement peut être déclenché par le stress oxydatif et l'inflammation, ce qui conduit à l'amplification de la lipogenèse et la synthèse des lipoprotéines, contribuant ainsi à la dyslipidémie athérogène chez les patients atteints du syndrome métabolique et de diabète de type 2. / In relation with the constant increase in obesity, more and more people suffer from insulin resistance and type 2 diabetes (DT2). This doctoral research program especially emphasizes lipid disorders, one of the major consequences of cardiometabolic diseases. In this respect, people with insulin resistance or DT2 are at higher risk of developing lipid disturbances characterized mainly by high levels of triglycerides and LDL-cholesterol concentrations and HDL cholesterol in the blood circulation. The risks of cardiovascular disease are higher in these patients. Classically, three organs are known to develop insulin resistance: muscle, adipose tissue and liver. Nevertheless, important studies begin to point out the small intestine as a major organ in the regulation of postprandial lipids, which may have a significant impact on the development of diabetic dyslipidemia. In addition, the intestine produces peptides, including GLP-1 (glucagon-like peptide-1), that have already demonstrated their therapeutic potential with regard to diabetic status and intestinal lipoprotein metabolism. Further evidence is also is provided by the advent of bariatric surgery that has a positive effect on radical and sustainable weight loss, metabolic control and reduction of comorbidities of DT2, following biliopancreatic diversion. The central objectives of this scientific program are therefore to determine the role of the intestine in (i) lipid/ lipoprotein homeostasis in response to high concentrations of glucose (mimicking diabetes) and to gastrointestinal peptides such as PYY; (ii) the coordination of metabolism by involving AMPK (AMP-activated protein kinase) as an essential sensor for fine tuning of cellular energy needs; and (iii) adjusting absorption capacity of dietary fat in the gain or loss of insulin sensitivity demonstrated in intestinal specimens collected during bariatric surgery. In order to confirm the role of the intestine in diabetic dyslipidemia, we first used the intestinal Caco-2/15 cell model. The use of this epithelial cell line has shown a marked stimulation of cholesterol uptake via the transporter NPC1L1 (Niemann-Pick C1-like 1) in the presence of high glucose concentrations (as is the case in diabetic conditions) in basolateral compartment (compared to apical). The use of ezetimibe, an inhibitor of NPC1L1, helped to counteract this elevation of cholesterol absorption, thus proving that NPC1L1 is indeed behind this effect. If previous reports have identified some clues as to the potential role of intestinal PYY (peptide YY) in lipid metabolism disorders, no study has yet addressed this issue systematically. To definitively establish the ability of PYY to modulate lipid transport and metabolism in the intestine, we have used Caco-2/15 cells. Our recent investigation has shown that PYY (administered in the apical compartment) is able to significantly reduce cholesterol absorption via NPC1L1 transporter. Since the role of AMPK in the intestine remains unexplored, it is important to define not only its molecular structure, regulation and function in lipid metabolism, but also its impact on insulin resistance and T2D on its status and mode of action in the gastrointestinal tract. Using Caco-2/15 cells, we have been able to show (i) the presence of all AMPK subunits (α1/α2/β1/β2/γ1/γ2/γ3) with a marked difference in their abundance, but with a predominance of AMPKα1 and the prevalence of α1/β2/γ1 heterotrimer; (ii) the activation of AMPK by metformin and AICAR, resulting in increased phosphorylation of the downstream target acetylCoA carboxylases (ACC) without no influence on HMG-CoA reductase; (iii) the negative modulation of AMPK by compound C and glucose concentrations with high impact on ACC phosphorylation. On the other hand, administration of metformin to Psammomys obesus with insulin resistance and T2D led to (a) an upregulation of intestinal AMPK signaling pathway essentially typified by ascending AMPKα-Thr172 phosphorylation; (b) a reduction in ACC activity; (c) an elevation in the gene and protein expression of CPT1, supporting a stimulation of β-oxidation; (d) a trend of increase in insulin sensitivity portrayed by augmentation of Akt and GSK3β phosphorylation; (e) an inactivation of the stress-responsive p38-MAPK and /ERK1/2 exemplified by their phosphorylation lessening; and (f) a decrease in diabetic dyslipidemia following lowering of intracellular events that govern lipoprotein assembly. Therefore these data suggest that AMPK fulfills key functions in metabolic processes in the small intestine. The clear evidence for the involvement of the gut in cardiometabolic events has been obtained through the scrutiny of intestinal specimens obtained from obese subjects after bariatric surgery. Intestine of insulin-resistant subjects shows defects in insulin signaling as demonstrated by reduced Akt phosphorylation but increased p38 MAPK phosphorylation. These defects were accompanied with increased oxidative stress and inflammation markers in intestine of insulin-resistant subjects. Enhanced de novo lipogenesis rate and apo B-48 biogenesis along with increased triglyceride-rich lipoprotein production was also observed in the intestine of insulin-resistant subjects. Concomitantly, fatty acid binding proteins (FABP) and microsomal transfer protein (MTP) expression was increased in the intestine of insulin-resistant subjects. In conclusion, the small intestine may be classified as an insulin-sensitive tissue. Its deregulation, possibly triggered by oxidative stress and inflammation, may lead to amplification of lipogenesis and lipoprotein synthesis and may therefore represent a key mechanism for atherogenic dyslipidemia in patients with metabolic syndrome and T2D.

L’excitotoxicité est un mécanisme physiopathologique majeur impliqué dans la pathogenèse de la déficience en thiamine (DT). Dans les régions cérébrales vulnérables à la DT, on observe une mort cellulaire induite par excitotoxicité dont l’origine semble être la conséquence d’une perturbation du métabolisme énergétique mitochondrial, d’une dépolarisation membranaire soutenue et d’une diminution de l’absorption du glutamate par les astrocytes suite à la diminution de l’expression des transporteurs EAAT1 et EAAT2. Il est clairement établi que le glutamate joue un rôle central dans l’excitotoxicité lors de la DT. Ainsi, la mise en évidence des mécanismes impliqués dans la diminution de l’expression des transporteurs du glutamate est essentielle à la compréhension de la physiopathologie de la DT. L’objectif de cette thèse consiste en l’étude de la régulation des transporteurs astrocytaires du glutamate et la mise au point de stratégies thérapeutiques ciblant la pathogenèse de l’excitotoxicité lors de l’encéphalopathie consécutive à la DT. Les principaux résultats de cette thèse démontrent des perturbations des transporteurs du glutamate à la fois dans des modèles animaux de DT et dans des astrocytes en culture soumis à une DT. La DT se caractérise par la perte du variant d’épissage GLT-1b codant pour un transporteur du glutamate dans le thalamus et le colliculus inférieur, les régions cérébrales affectées lors d’une DT, en l’absence de modification des niveaux d’ARNm. Ces résultats suggèrent une régulation post-transcriptionnelle de l’expression des transporteurs du glutamate en condition de DT. Les études basées sur l’utilisation d’inhibiteurs spécifiques des facteurs de transcription NFkB et de l’enzyme nucléaire poly(ADP)ribose polymérase-1 (PARP-1) démontrent que la régulation de l’expression du transporteur GLT-1 est sous le contrôle de voies de signalisation NFkB dépendantes de PARP-1. Cette étude démontre une augmentation de l’activation de PARP-1 et de NFkB dans les régions vulnérables chez le rat soumis à une DT et en culture d’astrocytes DT. L’inhibition pharmacologique du facteur de transcription NFkB par le PDTC induit une augmentation des niveaux d’expression de GLT-1, tandis que l’inhibition de PARP-1 par le DPQ conduit à l’inhibition de l’hyperactivation de NFkB observée lors de DT. L’ensemble de ces résultats met en évidence un nouveau mécanisme de régulation des transporteurs du glutamate par l’activation de PARP-1. L’accumulation de lactate est une caractéristique de la DT. Un traitement avec le milieu de culture d’astrocytes en condition de DT sur des cultures d’astrocytes naïfs induit une diminution de l’expression de GLT-1 ainsi qu’une inhibition de la capacité d’absorption du glutamate par les astrocytes naïfs. En revanche, l’administration de lactate exogène ne modifie pas le niveau d’expression protéique de GLT-1. Ainsi, des facteurs solubles autres que le lactate sont sécrétés par des astrocytes en condition de perturbation métabolique et peuvent potentiellement réguler l’activité des transporteurs du glutamate et contribuer à la pathogenèse du syncytium astroglial. En outre, la ceftriaxone, un antibiotique de la famille des β-lactamines, augmente de façon différentielle l’expression du variant-d’épissage GLT-1 dans le colliculus inférieur chez le rat DT et en culture d’astrocytes DT. Ces résultats suggèrent que la ceftriaxone peut constituer une avenue thérapeutique dans la régulation de l’activité des transporteurs du glutamate lors de DT. Pour conclure, la mort cellulaire d’origine excitotoxique lors de DT survient en conséquence d’une dysfonction mitochondriale associée à une perturbation du métabolisme énergétique cérébral. La modification de l’expression des transporteurs du gluatamate est sous le contrôle des voies de signalisation NFkB dépendantes du facteur PARP-1. De plus, l’inhibition métabolique et l’augmentation des sécrétions de lactate observées lors de DT peuvent également constituer un autre mécanisme physiopathologique expliquant la diminution d’expression des transporteurs de glutamate. Enfin, la ceftriaxone pourrait représenter une stratégie thérapeutique potentielle dans le traitement de la régulation de l’expression des transporteurs du glutamate et de la perte neuronale associés à l’excitotoxicité observée lors de DT. / Excitotoxicity has been implicated as a major pathophysiological mechanism in the pathogenesis of thiamine deficiency (TD). Excitotoxic-mediated cell death is localized in areas of focal vulnerability in TD and may occur as a consequence of impairment in mitochondrial energy metabolism, sustained cell membrane depolarization and decreased uptake of glutamate by astrocytes due to the loss of excitatory amino acid transporters, (EAAT1 and EAAT2). Over the years, a number of studies have identified glutamate as being a major contributor to excitotoxicity in the pathophysiology of TD. Thus, downregulation of astrocytic glutamate transporters resulting in excitotoxicity is a key feature of TD and understanding the regulation of these transporters is essential to understanding the pathophysiology of the disorder. The objective of the present thesis project was to examine the underlying basis of astrocytic glutamate transporter regulation during TD encephalopathy. Major findings of the studies presented in this thesis project provide evidence for glutamate transporter abnormalities in TD animal models and astrocyte cultures exposed to TD. TD results in the loss of the glutamate transporter splice variant-1b (GLT-1b) in vulnerable areas of brain, i.e. thalamus and inferior colliculus, with no significant alteration in the mRNA levels of the transporters, suggesting that glutamate transporter regulation under conditions of TD is a posttranscriptional event. Studies using a specific inhibitor of the transcription factor, Nuclear factor-kappa B (NF-κB) and a nuclear enzyme poly (ADP)ribose polymerase-1 (PARP-1) provided evidence for the regulation of GLT-1 by PARP-1 dependent NF-κB signalling pathways. The major findings of this study suggested an increase in the activation of PARP-1 and NF-κB molecule in the vulnerable areas of TD rat brain and TD astrocyte cultures. Pharmacological inhibition of NF-κB showed an increase in the levels of GLT-1, while inhibition of PARP-1 using a specific PARP-1 inhibitor, DPQ inhibited the increased activation of NF-κB that was observed during TD. Overall results of this finding provided evidence for a mechanism involving PARP-1 activation in the regulation of glutamate transporters. Given the increased lactate accumulation as a classical feature of TD, we studied the effect of soluble factors produced by astrocytes on glutamate transporter function. Treatment of naïve astrocyte cultures with TD conditioned media resulted in decreased levels of GLT-1 and inhibition of glutamate uptake capacity concomitant with a loss of mitochondrial membrane potential. Administration of exogenous lactic acid produced a similar reduction in glutamate uptake to that resulting from conditioned media. However, lactic acid treatment did not result in a change in GLT-1 protein levels. In addition, the pro-inflammatory cytokine TNF-α was shown to be increased in astrocytes treated with TD along with elevated levels of the phospho-IκB fragment, indicative of increased activation of NFκB. Inhibition of NFκB led to an amelioration of the decrease in GLT-1 that occurs in TD, along with recovery of glutamate uptake. Thus, soluble factors released from astrocytes under conditions of metabolic impairment such as lactate and TNF-α impairment appear to exert a regulatory influence on glutamate transporter function. Ceftriaxone, a β-lactam antibiotic, has the ability to differentially stimulate GLT-1b (splice-variant) expression in the inferior colliculus in TD rats and under in vitro conditions with TD astrocyte cultures. Thus, ceftriaxone may be a potential therapeutic strategy in the regulation of glutamate transporter function during TD. In summary, excitotoxic cell death in TD occurs as a consequence of mitochondrial dysfunction associated with cerebral energy impairment and abnormal glutamate transporter status. A major underlying mechanism for glutamate transporter abnormalities is mediated by PARP-1 dependent NF-κB signaling pathways. In addition, metabolic inhibition with substantial production of lactate and TNF-α may be perhaps another mechanism responsible for glutamate transporter downregulation in TD.

No description available.

No description available.

Le phosphate inorganique (Pi) est un minéral essentiel de notre organisme, qui intervient dans la composition des acides nucléiques et des phospholipides, dans la minéralisation des os et des dents, dans la production d’énergie, et dans la régulation des voies de signalisation. L’homéostasie du Pi est étroitement régulée par différents transporteurs, et des anomalies du transport de Pi peuvent avoir des conséquences cliniques sévères. Chez l’homme, ils existent 3 transporteurs de Pi distincts de type SLC (solute carrier) avec une distribution tissulaire large et initialement identifiés en tant que récepteurs de rétrovirus : PiT1/SLC20A1, PiT2/SLC20A2, et XPR1/SLC53A1.Des mutations dans PiT2 sont associées à une maladie rare, la calcification cérébrale primaire familiale (PFBC), caractérisée par des dépôts de phosphate de calcium dans les noyaux gris centraux et par l’expression de troubles neuropsychiatriques. Alors que PiT1 ne semble pas être impliqué dans cette maladie, nous avons découvert que des mutations dans XPR1 étaient présentes chez des patients PFBC, renforçant le lien entre la maladie PFBC et les désordres de l’homéostasie du phosphate.Dans ce travail, nous avons cherché à comprendre comment PiT2 et XPR1, deux transporteurs de Pi mais de flux opposés peuvent conduire à une même maladie. Pour cela, nous avons étudié le lien entre PiT2 et XPR1 dans la régulation du Pi ainsi que les domaines de XPR1 impliqués dans le transport. Nous avons d’abord identifié de nouveaux variants PFBC dans PiT2 et XPR1 et confirmé l'effet délétère de ces mutations sur l’import et l’export. Nous avons pu distinguer des mutations qui abolissaient l’expression en surface de XPR1, et donc indirectement l’export de Pi, alors que d’autres avaient un impact fonctionnel direct sur les transporteurs pourtant présents à la membrane plasmique.L’inactivation de XPR1 dans des cellules haploïdes humaines induit une altération profonde de l’export de Pi sans effet notable sur l’import. De manière surprenante, l’inactivation de PiT2 entraine un effet modéré sur l’import, probablement dû à l'activité complémentaire de PiT1, avec une chute de l’export dépendant de XPR1. Cet effet identifie une boucle de régulation que nous avons montrée être essentielle au maintien des niveaux de phosphate et d’ATP. Ces résultats révèlent que le défaut d’export de phosphate par inactivation de PiT2 et XPR1 est susceptible d’être l’étape-clé qui conduit à une maladie commune, la PFBC.Nous nous sommes concentrés sur cette étape d‘export régulée en étudiant le domaine SPX de XPR1 dans lequel la plupart des mutations PFBC ont été retrouvées. Nous avons identifié la tankyrase (TNK) comme interactant cellulaire, et localisé son site d’interaction à la bordure carboxyle de SPX. Nous avons observé que la délétion de SPX entrainait un défaut d’export de Pi, et que la perte d’interaction de TNK à XPR1 par mutagenèse ponctuelle avait le même effet, suggérant que TNK et SPX sont 2 composants essentiels à l’export de phosphate. Enfin, nous avons identifié de nouvelles mutations de XPR1 à l'extrémité C-terminale qui abolissaient l’export de Pi, et montré que la délétion de ce domaine entrainait un défaut d’expression de XPR1 à la membrane plasmique. Nos résultats indiquent donc que les domaines N- et C-terminaux jouent un rôle clé dans l’export, et donc dans l’homéostasie du phosphate, avec le domaine C-terminal jouant plutôt un rôle dans le trafic en surface de XPR1.L’ensemble de ce travail a permis de documenter de nouvelles mutations PFBC dans les gènes PiT2 et XPR1, de démontrer que ces transporteurs étaient impliqués dans l’homéostasie intracellulaire du phosphate, en dévoilant que l’export de phosphate est vraisemblablement l’étape clé de la PFBC, ouvrant ainsi de nouvelles pistes dans la compréhension de cette maladie. Nous avons également identifié des domaines de XPR1 et un partenaire cellulaire, essentiels à l’export de Pi et/ou au trafic membranaire. / Phosphate (Pi) is a key mineral that participates directly in the synthesis of nucleic acids and membranes, bone and tooth mineralization, energy production, and signal transduction. Pi homeostasis is tightly regulated by transporter-mediated fluxes that adjust Pi concentration in real time, and defect in Pi transport has been associated with several pathologies. In humans, three Pi transporters, which belong to the solute carrier (SLC) superfamily, are widely expressed: PiT1/SLC20A1, PiT2/SLC20A2, and XPR1/SLC53A1. Interestingly, all three were initially identified as receptors for mammalian gammaretroviruses.Mutations in PiT2/SLC20A2 are responsible for a rare neurodegenerative disorder, the primary familial brain calcification (PFBC), characterized by deposits of calcium Pi in the basal ganglia and other regions of the brain, and associated with diverse neuropsychiatric clinical manifestations. While PiT1/SLC20A1 has not been involved in PFBC, we recently identified mutations in XPR1/SLC53A1 as causative for PFBC, thus linking further the disease with cellular Pi homeostasis dysfunction.In this work, we aimed to understand how defects of opposite Pi transport functions lead to PFBC, investigated the relationship between PiT2 and XPR1 in cellular Pi regulation, and studied XPR1 domains in Pi transport. We first identified several PFBC mutations in PiT2/SLC20A2 and XPR1/SLC53A1, and confirmed their impact on Pi import or export, respectively. Some of the mutations altered transporter cell surface expression, resulting in Pi transport impairment, while others did neither alter cell surface expression, nor retroviral receptor functions, confirming that Pi transport function and viral envelope glycoprotein binding can be structurally distinguished.Using single gene knock-out human haploid cells, we showed that depletion of XPR1/SLC53A1 resulted in a dramatic Pi export alteration, with no detectable effect on Pi import, in agreement with Pi exporter function of XPR1. Interestingly, depletion of PiT2/SLC20A2 had little impact on Pi uptake, most likely due to compensatory function of PiT1/SLC20A1, with, however, a surprising impact on Pi export mediated by XPR1. This effect is reminiscent to a regulation loop that we found to maintain both Pi and ATP constant. This results unveil for the first time that Pi export alteration, and not Pi import, is likely to be the common pathophysiological impact of mutations in both PiT2 and XPR1. This would explain the synonymous pathological effects of two transporters that have opposite transport activity.We further explored this regulated phosphate export by characterizing the SPX N-terminal cytoplasmic domain of XPR1, which harbors most of the PFBC mutations. We identified a cellular tankyrase (TNK) as a binding partner and mapped the TNK-binding site to the carboxyl border of SPX; furthermore, we found that mutations that abolished TNK binding resulted in loss of Pi export. Full deletion of SPX domain maintained cell surface expression but altered export, suggesting that both TNK and SPX are essential components for Pi export. Finally, during this work, we identified mutations in the XPR1 C-terminal domain as responsible for PFBC that also impaired Pi export, and showed that deletion of this domain prevented XPR1 cell surface expression. Our results therefore indicate that N- and C-terminal domains of XPR1 play a key role in phosphate homeostasis, the latter domain appearing to exert a more prominent role in XPR1 membrane trafficking and/or folding.

La Fédération internationale des travailleurs des transports figure parmi les syndicats internationaux les plus anciens et les plus puissants. Aussi, lors des étapes de la reconstruction de l'Europe, elle envisage d'y prendre part activement afin de s'imposer comme un interlocuteur incontournable dans l'Europe à venir. Toutefois, les inflexions géopolitiques, le développement d'une Europe sociale de plus en plus institutionnalisée et la mises en place d'organisations d'experts dans le domaine des transports la contraint à repenser ses plans ainsi que son rapport à l'Europe. Par ailleurs, tiraillée entre son appartenance au mouvement syndical international et le développement de l'Eurosyndicalisme, elle doit articuler l'échelle internationale et l'échelle européenne sans oublier qu'elle reste avant tout l'émanation de l'ensemble des volontés nationales. <p>Sur une période longue de soixante-dix années, nous avons étudié les relations entre représentations sociales et répertoires d'actions syndicaux, en les insérant dans une trame historique reprenant les grandes évolutions de l'histoire des relations internationales. Ce travail met en avant l'articulation de deux échelons syndicaux, international et européen, encore très faiblement étudié, dans une perspective historique se réclamant de l'histoire sociale et politique. Il permets de comprendre le rôle singulier des transports dans le mouvement syndical international et de rendre compte des nouvelles stratégies de celui-ci à l'oeuvre aujourd'hui / Doctorat en Sciences politiques et sociales / info:eu-repo/semantics/nonPublished

Les glioblastomes (GBM) sont les formes les plus agressives de tumeurs gliales avec une survie médiane des patients traités n’excédant pas 2 ans. Ce mauvais pronostic est dû, entre autres, à l’hétérogénéité de ces tumeurs avec la présence de cellules souches cancéreuses (CSCs) en prolifération ou quiescentes, particulièrement résistantes aux traitements conventionnels. Cibler ces cellules au sein du microenvironment tumoral hypoxique et acides fait donc partie des thérapies d’avenir des GBMs. Le laxatif bisacodyl a été identifié par criblage de la chimiothèque Prestwick comme un composé induisant la mort par nécrose des CSCs de glioblastome (GSCs en prolifération et en quiescence), uniquement dans des conditions de faible acidité retrouvées également au sein des tumeurs. Une activité antitumorale in vivo a également été démontrée pour ce composé. Cette thèse présente l’identification du mode d’action du bisacodyl dans les GSCs. Celui-ci implique la serine/thréonine kinase WNK1 et ses partenaires, les kinases Akt et SGK1 et des co-transporteurs Na+/HCO3- NBC. Nos résultats ont également révélé un rôle de WNK1 dans la physiopathologie des GSCs. / Glioblastoma (GBM), the most aggressive glial tumor, is currently incurable with a very short-term patient survival (< 2 years). The heterogeneity of GBM and the presence of highly resistant proliferating and quiescent cancer stem-like cells (CSCs), is largely responsible for poor prognosis in this disease. Thus, new approaches targeting glioblastoma CSCs (GSCs), within the acidic/hypoxic tumor microenvironment, are promising strategies for treating GBM. The laxative bisacodyl was identified in a high throughput screening of the Prestwick chemical library as a compound inducing necrotic cell death in proliferating and quiescent GSCs only in acidic microenvironments similar to those found in tumors. Bisacodyl was further shown to induce tumor shrinking and to increase survival in in vivo GBM models. In this thesis work, we identify bisacodyl’s mechanism of action in GSCs. This mechanism involves the serine/threonine kinase WNK1 and its signaling partners including protein kinases Akt and SGK1 and NBC Na+/HCO3- cotransporters. Our data also highlight a previously unknown role of WNK1 in GSC physiopathology.