Diss. (sammanfattning) Stockholm : Karolinska institutet, 2007. / Härtill 5 uppsatser.

Thesis (M.S.)--Baylor University, 2007. / Includes bibliographical references (p. 1-6 [second group]).

Made available in DSpace on 2015-12-06T22:54:33Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2009 / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / Ministerio de Planificación de Chile (MIDEPLAN) / Em nosso laboratório foi isolado um clone recombinante de T. cruzi, denominado H49, que codifica repetições de 68 aminoácidos (aa) dispostas em tandem. Estas repetições são encontradas em um antígeno imunodominante de aproximadamente 240 kDa que está envolvido na ligação do flagelo ao corpo do parasita, conhecida como zona FAZ. Este trabalho relata a caracterização da estrutura do gene e da proteína H49. Buscas no banco de dados de T. cruzi utilizando o algoritmo BLAST revelaram que as repetições de 68 aa são encontradas em uma região central de oito calpaínas-like cisteínas peptidases. Em duas dessas, as repetições H49 são altamente conservadas e organizadas em tandem. Nas outras seis calpaínas-like encontradas, as repetições eram degeneradas e podem ser separadas por pequenas seqüências não repetitivas. Essas proteínas apresentaram domínios característicos de cisteínas proteinases cálciodependente, como Cys-Pc e Calpain_III. A associação entre as seqüências H49 e calpaína foi confirmada por amplificação por PCR e análises de clones de YAC utilizando oligonucleotídeos específicos para amplificar regiões especificas de calpaína e repetições H49. O locus H49 foi mapeado no clone CL Brener utilizando uma sobreposição de clones de YAC. A associação da repetição H49 e calpaínas nos YACs foi demonstrada por PCR e por análise de restrição. Corroborando com dados obtidos, a análise por “chromoblot” revelou que as sondas H49 e calpaína hibridizam com as mesmas bandas cromossômicas. Nossos dados indicam que as repetições H49 fazem parte de um subgrupo de genes da calpaína e, portanto, denominados H49/calpaína. Recentemente uma nova família de proteínas associadas ao citoesqueleto foi descrita em Trypanosoma brucei e Leishmania. Estas proteínas são caracterizadas por sua similaridade com a região catalítica da calpaína, assim como pela presença de seqüências de aminoácidos repetidas em tandem que apresentam similaridade de 30-40% com a repetição H49. Esses resultados sugerem que a aquisição da calpaína, contendo repetições pelos tripanossomatídeos (talvez por fusão de genes) foi um evento tardio na evolução dessa família de proteínas. Para avaliar a ocorrência e a distribuição subcelular da proteína H49/calpaína em epimastigotas, diferentes domínios da calpaína e da repetição de 68 aa foram expressas em bactérias, as proteínas foram purificadas e utilizadas na imunização de coelhos e camundongos. Os anticorpos policlonais purificados foram utilizados para estudar a organização e distribuição subcelular das repetiçãos de 68 aa e calpaína em T. cruzi. Em “immunoblotting”, anticorpos contra o domínio calpaína e contra as repetições de 68 aa reagiram com uma proteína de 240 kDa presente no extrato total de epimastigotas. Anticorpos anti-calpaína reagiram com bandas adicionais de aproximadamente 170, 60 e 56 kDa que correspondem a calpaínas sem as repetições de 68 aa. Análise de imunofluorescência revelou que a proteína H49/calpaína está localizada apenas na região de adesão entre o corpo celular e o flagelo. A calpaína, além de ser encontrada no flagelo, também é encontrada no citoplasma. Além disso, a H49/calpaína associada ao citoesqueleto colocalizou com marcadores da zona de adesão flagelar (FAZ). Domínios repetitivos da H49/calpaína contem alfa hélices (“helix-turn-helix”) que poderiam estar organizadas em uma estrutura enovelada em uma estrutura “coiled-coil”. Sugerimos que as proteínas H49/calpaína formariam um homodímero que poderia ligar a membrana do flagelo à membrana do corpo celular na zona de adesão flagelar. / We have previously isolated a T. cruzi recombinant clone, termed H49, that encodes tandemly arranged repeats of 68-amino acids (aa). The repeats are found in an immunodominant antigen (~240 kDa) which is involved in the attachment of the flagellum to the cell body in the FAZ region of the parasite. Here we present further characterization of the structure of H49 gene and protein. Blast search of T. cruzi databases showed that the 68-aa repeats can be found in the central domain of 8 calpain-like cysteine peptidases. In two of them, the H49 repeats are highly conserved and arranged in tandem arrays, whereas in other calpains the repeats are degenerated and can be separated by short nonrepeat sequences. These proteins show the domains Cys-Pc and calpain_III, characteristics of calcium-dependent cysteine proteinases. The association between H49 and calpain sequences was further confirmed by PCR amplification and analysis of YAC clones using primers designed to amplify specific regions of calpain and H49 repeat. We mapped the H49 locus in clone CL Brener using YAC overlapping clones. The association of H49 and calpain in these YACs was demonstrated by PCR and restriction analysis. Consistent with this, chromoblot analysis revealed that H49 and calpain probes hybridized with the same chromosomal bands. Our data indicate that the H49 repeats are part of a subset of calpain genes, and they were termed H49/calpains. Recently, a novel family of cytoskeleton-associated proteins was described in Trypanosoma brucei and Leishmania. These proteins are characterized by their similarity to the catalytic region of calpain, and also by the presence of tandemly arranged amino acid repeats that share 30-40% similarity with H49. These results suggest that the acquisition by trypanosomatids of calpain containing repeats (maybe by gene fusion) was a relatively late event in the evolution of this family of proteins. To study the occurrence and subcellular distribution of H49/calpain protein in epimastigotes, we have expressed different domains of the calpain and the 68-aa repeats in bacteria, purified the proteins, and employed them to immunize rabbits and mice. The affinity purified polyclonal antibodies were used as probes to study the organization and subcellular distribution of 68-aa repeats and calpain in T. cruzi. Antibodies raised against the calpain domains and 68-aa repeats reacted, by immunoblot analysis, with a ~240 kDa protein in the whole epimastigote extracts. Anti-calpain antibodies reacted with additional bands of ~170, 60 and ~56 kDa which correspond to the calpain proteins without 68-aa repeats. Immunofluorescence analysis showed that H49/calpain-like protein is only localized in the region of adhesion between the cell body and flagellum. Calpain was present not only in the flagella, but it was also localized in the cytoplasm. Further, the cytoskeleton-associated H49/calpain was colocalized with markers of the flagellar attachment zone (FAZ). Repetitive domain of H49/calpains contain alpha-helices (helix-turn-helix) that could be arranged in a coiled-coil rope-like structure. We suggest that H49/calpain proteins form a homodimer that could link the flagellar membrane to the cell body membrane at the flagellar attachment zone. / BV UNIFESP: Teses e dissertações

Orientador: João Aristeu da Rosa / Banca: Maria Tercilia Vilela de azeredo Oliveira / Banca: Carlos Eduardo de Almeida / Banca: Marcos Takashi Obara / Banca: Sergio de Albuquerque / Resumo: A doença de Chagas apresenta como agente etiológico o protozoário Trypanosoma cruzi, cujos vetores pertencem à subfamília Triatominae. Triatomíneos são insetos sugadores de sangue (ordem Hemiptera e família Reduviidae), distribuídos, principalmente, na região Neotropical e, epidemiologicamente, se destacam espécies dos gêneros Panstrongylus, Rhodnius e Triatoma. O gênero Rhodnius apresenta alta semelhança morfológica entre suas espécies e o gênero Triatoma é o mais diversificado, porém ambos foram agrupados em complexos de espécies, com base em semelhanças morfológicas, distribuição geográfica, abordagens genéticas, entre outros. Para alguns complexos de espécies os caracteres morfológicos não são suficientes para a identificação específica correta. Portanto, as ferramentas moleculares são apresentadas como uma alternativa útil para a identificação de espécies relacionadas. Este estudo visou contribuir para a identificação de três grupos de espécies de triatomíneos, por meio do desenho de novos primers diagnósticos para compor uma multiplex-PCR: o primeiro grupo é composto por quatro espécies de Rhodnius: R. neglectus, R. robustus, R. prolixus e R. pictipes; os segundo e terceiro grupos apresentam espécies do gênero Triatoma: T. maculata e T. pseudomaculata; e T. tibiamaculata, T. melanocephala e T. vitticeps. Além disso, avaliaram-se as relações filogenéticas com as sequências resultantes. Após extração do DNA mitocondrial (16S, Cytb e COI) e DNA nuclear (ITS1 e ITS2) genes foram amplificados e sequenciados. Para diagnosticar as espécies do gênero Rhodnius, os primers referentes ao Cytb foram eficientes para compor uma multiplex-PCR, que se separou R. prolixus, R. neglectus, R. pictipes e R. robustus. Da mesma forma, os primers desenhados para o fragmento 16S distinguiram T. tibiamaculata, T. melanocephala... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Chagas disease presents as etiologic agent the protozoan Trypanosoma cruzi, whose vectors belong to the Triatominae subfamily. Triatomine bugs are bloodsucking insects (belonging to the Hemiptera order and Reduviidae family), which are distributed predominantly at the Neotropical region and epidemiologically stand the species belong Panstrongylus, Rhodnius and Triatoma genera. The Rhodnius genus shows high morphological similarity among their species, as the Triatoma genus is the most numerous, however both were grouped into species complexes, according to morphological similarities and geographical distribution, genetic approaches, and others. For some species complexes morphological characters are not enough to make the correct specific identification. Therefore, molecular tools are presented as an useful alternative to identify closely related species. This study aimed to contribute to the identification of three groups of Triatominae species by the design of new diagnose primers for multiplex-PCR: the first group consists of four species of Rhodnius genus: R. neglectus, R. robustus, R. prolixus and R. pictipes; the second and third groups comprise Triatoma species: T. maculata, and T. pseudomaculata; and T. tibiamaculata, T. melanocephala and T. vitticeps. Additionally, we evaluated the phylogenetic relationships with the resulting sequences. After DNA extraction, mitochondrial (16S, Cytb and COI) and nuclear DNA (ITS1 and ITS2) genes were amplified and sequenced. To diagnose Rhodnius species the primers for the fragment of Cytb were efficient, by using a multiplex-PCR that separated R. prolixus, R. neglectus, R. robustus and R. pictipes. Similarly, the primers designed for the 16S fragment distinguished T. tibiamaculata, T. melanocephala and T. vitticeps. For T. maculata and T. pseudomaculata no one of the tested candidate primers showed satisfactory results... (Complete abstract click electronic access below) / Doutor

Memoria para optar al Título Profesional de Médico Veterinario / Calreticulina (CRT) es una proteína ubicua, altamente conservada, que se localiza principalmente en el retículo endoplásmico (RE), donde es elemental para el correcto plegamiento y transporte de proteínas. Se han descrito diversas funciones extracelulares para esta proteína, entre ellas, inducir la fagocitosis de células apoptóticas, y promover la migración concentración-dependiente de queratinocitos, fibroblastos, macrófagos y monocitos, estimulando la re-epitelización a través de la proliferación celular de queratinocitos y fibroblastos, procesos fundamentales para la cicatrización de heridas cutáneas. Es así como, se evaluaron diversos efectos de CRT recombinante humana (rHuCRT) y parasitaria proveniente del protozoo Trypanosoma cruzi (rTcCRT) administrada subcutáneamente en distintas concentraciones, en el proceso de cicatrización de heridas en la piel de ratas. Se comparó la efectividad de ambas proteínas en el porcentaje de re-epitelización, proliferación celular (medido como N° de células/cm2) y profundidad dérmica, tanto a los 5 como 10 días post-intervención. Los mejores resultados en la cicatrización de heridas de piel en ratas fueron obtenidos al administrar rTcCRT en menor concentración (2.500 veces menos concentrada que la dosis alta) y rHuCRT a mayor concentración. / Calreticulin (CRT) is a ubiquitous protein highly conserved mainly localized in the endoplasmic reticulum (ER), which is elementary for the proper folding and protein transport. Have been described various extracellular functions for this protein, including induction of phagocytosis of apoptotic cells and promote migration concentration-dependent keratinocytes, fibroblasts, macrophages and monocytes, stimulate re-epithelialization through cell proliferation of keratinocytes and fibroblasts, processes essential for cutaneous wound healing. Thus, we evaluated various effects of recombinant human (rHuCRT) and protozoan parasite Trypanosoma cruzi (rTcCRT) CRT administered subcutaneously at different concentrations, in the process of wound healing in the skin of rat. We compared effectiveness of both proteins in the percentage of re-epithelialization, cell proliferation (measured as numbers of cells), and dermal depth, both at 5 and 10 days post-intervention. The best results in healing of skin wounds in rats were obtained by administering rTcCRT in lower concentrations (2,500 times less concentrated than the high dose) and rHuCRT of higher concentration. / Financiamiento: Proyecto Fondecyt 3100021

Resumo não disponível.

Submitted by Nuzia Santos (nuzia@cpqrr.fiocruz.br) on 2013-08-07T14:09:58Z No. of bitstreams: 1 Tese_RafaelleCGomesFaresGusmão.pdf: 2582678 bytes, checksum: c69c8890c0878586f273089f5214d41f (MD5) / Made available in DSpace on 2013-08-07T14:09:58Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Tese_RafaelleCGomesFaresGusmão.pdf: 2582678 bytes, checksum: c69c8890c0878586f273089f5214d41f (MD5) Previous issue date: 2013 / A cardiomiopatia dilatada crônica decorrente da infecção pelo T. cruzi está associada com o remodelamento do miocárdio e com a fibrose intersticial, o que resulta em mudanças significativas da matriz extracelular (MEC). O remodelamento da MEC é regulado por enzimas proteolíticas como as metaloproteinases de matriz (MMPs). Nesse estudo, avaliamos pela primeira vez o envolvimento das MMPs 2 e 9 e seus inibidores (TIMPs) em pacientes portadores das formas clínicas indeterminada (IND) e cardíaca (CARD) da doença de Chagas. Nossos resultados mostraram que os níveis séricos da MMP-9 estão associados com a gravidade do acometimento cardíaco e que a MMP-9 possui maior potencial de atividade proteolítica no soro de pacientes CARD. Os níveis séricos de TIMP-1 não apresentaram diferenças estatísticas entre os grupos estudados. Por outro lado, os níveis séricos de TIMP-2 foram maiores no grupo CARD. A partir da análise de correlação, foi possível observar uma possível especificidade do TIMP-1 pela MMP-9. A análise da produção de MMPs por linfócitos T e monócitos mostrou que essas células do sistema imune são capazes de produzir MMP-2 e MMP-9 e, ainda que linfócitos T CD8+ são as principais células mononucleares produtoras de MMP-2 e MMP-9. A partir da cultura tridimensional de cardiomiócitos de camundongos, observamos que existem componentes no soro dos pacientes com doença de Chagas capazes de induzir a expressão de componentes da matriz extracelular no microtecido cardíaco. Além disso, MMP-2 apresentou correlação negativa com proteínas de matriz (laminina e fibronectina) e com citocinas inflamatórias (TNF-IL-6 e IL-1), enquanto que a MMP-9 apresentou correlação positiva com proteínas de matriz (laminina e fibronectina) e com a citocina inflamatória IL-1. A partir da análise da ocorrência de polimorfismos de nucleotídeo único, não foi possível observar influência da genética do hospedeiro sobre os níveis séricos das MMPs 2 e 9 e seus inibidores, bem como sobre a morbidade da doença de Chagas. Nossos resultados sugerem que MMP-2 e MMP-9 participam de maneira diferente na patogênese da doença de Chagas, sendo que a MMP-9 parece estar mais envolvida no processo inflamatório e no remodelamento cardíaco. Em resumo, nossos resultados mostram, pela primeira vez, o envolvimento da MMP-9, mas não da MMP-2, na cardiomiopatia chagásica. Esses dados são inovadores e representam um avanço no conhecimento dos mecanismos envolvidos no estabelecimento e manutenção da patologia do acometimento cardíaco na doença de Chagas. / Dilated chronic cardiomyopathy (DCC) in Chagas disease is associated with myocardial remodeling and interstitial fibrosis, resulting in significant extracellular matrix (ECM) modifications. ECM remodeling is regulatedby proteolytic enzymes such as matrix metalloproteinases (MMPs). In this study, we evaluated, for the first time, the serum MMPs 2 and 9 levels, as well as their main cell sources in the peripheral blood from patients presenting the indeterminate (IND) or cardiac (CARD) clinical forms of Chagas disease. Our results showed that MMP-9 serum levels are associated with the severity of Chagas disease. The serum levels of TIMP-1 were not different between the studied groups; however the serum levels of TIMP-2 were higher in CARD group.The correlation analysis showed a possible specificity of TIMP-1 for MMP-9. The analysis of MMPs production by T lymphocytes showed that CD8+ T cells are the main source of both MMP-2 and MMP-9 molecules. Using a new 3-dimensional model of fibrosis we also observed that serum from patients with Chagas disease induced an increase in the extracellular matrix components in cardiac spheroids obtained from mice cardiomyocytes. Furthermore, MMP-2 and MMP-9 have showed different profile of correlation with matrixproteins (laminin and fibronectin) and inflammatory cytokines (TNF-and IL-1) in patients with Chagas disease. Our results suggest that MMP-2 and MMP-9 show distinct activities in Chagas disease pathogenesis. While MMP-9 seems to be involved with the inflammation and cardiac remodeling of Chagas disease, MMP-2 does not show any correlation with inflammatory molecules. There are many factors involved in the determination of the severity and progression of Chagas disease, and host genetics is certainly a contributing factor for the development of the disease. Therefore, we evaluated whether there were significant polymorphisms in MMPs and TIMPs genes. Our results did not show any association between polymorphisms occurrence and morbidity of the disease. In conclusion, our datastress the involvement of MMP-9, and not of MMP-2, in heart disease and, for the first time, its participation in chagasic cardiomyopathy. These data are innovative and represent an advance in the knowledge of the mechanisms involved in the establishment/maintenance of the Chagas heart disease pathology.

Submitted by Alessandra Portugal (alessandradf@ioc.fiocruz.br) on 2013-09-16T23:26:21Z No. of bitstreams: 1 Tese de Doutorado Andre Luis Souza.pdf: 3755617 bytes, checksum: e99b71eb0533b935acc75e908e5504a3 (MD5) / Made available in DSpace on 2013-09-16T23:26:21Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Tese de Doutorado Andre Luis Souza.pdf: 3755617 bytes, checksum: e99b71eb0533b935acc75e908e5504a3 (MD5) Previous issue date: 2012 / Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Oswaldo Cruz. Rio de Janeiro, RJ, Brasil. / Os peptídeos antimicrobianos têm se mostrado uma boa alternativa para as terapias antiparasitárias. Neste trabalho descrevemos a estrutura e a atividade biológica da temporizina (FLPLWLWLWLWLWKLK) e sua ação contra formas epimastigotas do Trypanosoma cruzi. A temporizina é um peptídeo híbrido, sintetizado a partir de outros três peptídeos antimicrobianos: a temporina A (FLPLIGRVLSGIL-NH2), a sapecina B (KLKLLLLLKLK-NH2) e a gramicidina A (HCO-VGALAVVVWLWLWLW-NHCH2). Os efeitos da temporizina sobre o Trypanosoma cruzi e sua toxicidade para células de mamíferos foram analisados utilizando as metodologias de citometria de fluxo, microscopia de fluorescência e liberação da lactato desidrogenase (LDH). O valor concentração efetiva de temporizina para lisar 50% das formas epimastigotas de Trypanosoma cruzi (EC50), foi determinado em um ensaio de viabilidade celular através do método de metabolização do brometo azul de tetrazólio (MTT). Para determinar a liberação de hemoglobina e quantificar a porcentagem de hemólise causada pela temporizina em doses letais para o Trypanosoma cruz. Utilizamos o método colorimétrico. Os dados sobre a EC50 e a capacidade hemolítica da temporizina foram então utilizados para a determinação do índice terapêutico do peptídeo. O mapeamento da estrutura da temporizina e a determinação de suas características foram obtidos através da metodologia de dicroísmo circular em um ambiente hidrofóbico que mimetizou as bicamadas das biomembranas. Submetemos a sequência da temporizina à plataforma Itasser para modelagem de proteínas e softwares, com o objetivo de realizar predições teóricas sobre a sua estrutura e características conformacionais. Para avaliar os efeitos da temporizina sobre a eletrofisiologia de membranas, foi usada a técnica de Patch-Clamp em célula inteira ou célula ligada. Essa técnica associada com experimentos envolvendo captação de corantes com diferentes valores de massa molecular permitiu determinar o limite de exclusão dos poros formados pelo peptídeo. Tendo em vista, as características estruturais e a atividade tripanocida da temporizina, concluímos que este peptídeo é uma alternativa viável para o desenho racional de um novo fármaco para o controle da doença de Chagas. / The antimicrobial peptides have been shown to a good alternative for the therapy antiparasites. At this work, we describe the structure and the biological activity of temporizin (FLPLWLWLWLWLWKLK) and its action against epimastigotes of Trypanosoma cruzi. The temporizin is a hybrid peptide, synthesized from three other antimicrobial peptides: the temporin A (FLPLIGRVLSGIL-NH2), the sapecin B (KLKLLLLLKLK-NH2) and gramicidin A (HCO-VGALAVVVWLWLWLW-NHCH2). The effects of temporizin over T. cruzi and its toxicity for the mammalian cells were analyzed using flow cytometry, fluorescence microscopy and release of lactate dehydrogenase (LDH). The value of the effective concentration of temporizin to lyse 50% of epimastigotes forms of T. cruzi (EC50) was determined in a cell viability assay using the method of metabolism of tetrazolium blue thiazol methyl bromide (MTT). To determine the release of hemoglobin and to quantify the percentage hemolysis caused by lethal doses temporizin T. cruzi, we used the method colorimetric. The data about the EC50 and the hemolytic capacity of temporizin were then used to determine the peptide’s therapeutic index. The mapping of the structure of temporizin and the determining the characteristics were obtained through the method of circular dicroism (CD) in a hydrophobic environment that mimicked the bilayers of membranes. We submitted the sequence of the platform itasser and software for modeling proteins, with the purpose to make of theoretical predictions about the structure and conformational characteristics. To evaluate the effect of temporizin over membrane electrophysiology, was used the technique of patch-clamp in a whole cell or attached cell form. This technique associated with experiments involving uptake of dyes with different molecular mass values, allowed to determine the exclusion limit of the pores formed by the peptide. Given the structural characteristics and trypanocidal activity of temporizin, we concluded that this peptide is a viable alternative to the rational design of a new drug for the control of Chagas disease.

Submitted by Alessandra Portugal (alessandradf@ioc.fiocruz.br) on 2013-09-17T14:37:08Z No. of bitstreams: 1 TESE RITA DE CASSIA PONTELLO RAMPAZZO.pdf: 4806860 bytes, checksum: 8062bd9dd8843e24004e4dfeb47291c3 (MD5) / Made available in DSpace on 2013-09-17T14:37:08Z (GMT). No. of bitstreams: 1 TESE RITA DE CASSIA PONTELLO RAMPAZZO.pdf: 4806860 bytes, checksum: 8062bd9dd8843e24004e4dfeb47291c3 (MD5) Previous issue date: 2011 / Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Oswaldo Cruz. Rio de Janeiro, RJ, Brasil / A doença de Chagas, causada pelo protozoário Trypanosoma cruzi, acomete entre 7 e 8 milhões de pessoas especialmente na América Latina e Caribe, apresentando manifestações em órgãos associados ao sistema digestivo e cardíaco. A principal manifestação na fase crônica determinada é a cardiopatia chagásica e pode acometer entre 10 e 30% dos indivíduos infectados. Diante da ineficiência do tratamento, estudos com ênfase na biologia de interação parasita-hospedeiro têm sido desenvolvidos na busca de moléculas inovadoras que possam ser usadas para a prevenção, tratamento e/ou diagnóstico. A aplicação da genômic a funcional na interação T. cruzi-célula hospedeira tem como desafio desvendar a regulação de genes na célula alvo, buscando estratégias que enfoquem mecanismos de sobrevivência e replicação do parasita. A abordagem cinética utilizada neste trabalho (1, 2, 3, 4, 5, 6 e 24 horas de infecção) para analisar a expressão gênica global através da metodologia inovadora de RNA-Seq proporcionou um melhor entendimento dos eventos que culminam na ativação coordenada e temporal de moléculas durante a interação T. cruzi-cardiomiócito. Identificamos 572 genes modulados, sendo que 371 apresentavam expressão gênica induzida e 201 reprimidos. Nossos resultados revelam que o T. cruzi induz uma modulação gênica dinâmica com 18 genes alterados após uma hora de interação. No estágio inicial da infecção (1 a 4 horas), os genes modulados encontram-se relacionados com a estratégia de invasão do parasita e, principalmente, com a resposta de cardiomiócitos induzindo genes relacionados à resposta imune e atividade tripanocida. Neste contexto, evidenciamos a ativação de genes envolvidos com a resposta pró-inflamatória, estresse oxidativo e metabolismo de radicais livres indicativos da tentativa da célula cardíaca de conter a disseminação do parasita. Com o avanço da infecção, constatamos a modulação de genes integrados com o remodelamento do citoesqueleto e rigidez celular, provavelmente associado com a acomodação do parasita intracelular, e ainda repressão de genes relacionados com junções celulares e manutenção da arquitetura celular. Distúrbios na expressão de genes envolvidos em vias metabólicas mitocondriais apontam para uma deficiência energética e disfunção mitocondrial induzida pelo T. cruzi. Destacamos ainda alterações em genes associados à hipertrofia, principalmente relacionados à IL1 e IL6, receptor toll-like 2 e GSK3B, desde os tempos iniciais de infecção (1 a 4 horas). O remodelamento associado à matriz extracelular apresentou genes com padrão diminuído principalmente no ponto de 24 horas quando a taxa de infecção ultrapassa 75%, sendo as alterações relacionadas aos genes de colágeno e fibronectina. Genes associados à apoptose com perfil pró- e anti-apoptótico foram diferencialmente modulados nas diferentes fases da infecção, sugerindo que a indução ou repressão da apoptose pode estar diretamente relacionada a dispersão do parasita, controle da carga parasitária no hospedeiro e/ou escape da resposta imune Dessa forma, a identificação de genes importantes para adaptação do T. cruzi no microambiente da célula cardíaca aliada à modulação de genes envolvidos na resposta desta célula alvo contribuirá para aplicação de novas estratégias de controle deste parasita, possibilitando a seleção de potenciais alvos vacinais e/ou terapêuticos. / Chagas` disease, caused by Trypanosoma cruzi, affects between 7 and 8 million people especially in Latin America and Caribbean, presenting manifestations in organs associated with the digestive system and heart. The main clinical manifestation on symptomatic chronic phase is chagasic cardiophaty and may affect about 10 to 30% of infected individuals. Given the ineffectiveness of the treatment, studies with emphasis on biology of host-pathogen interaction have been carried out to search innovative molecules that can be used to prevention, treatment and/or diagnosis. The application of functional genomics in the T. cruzi-host cell interaction has as its goal to display the regulation of genes in the target cell, seeking strategies that focus on mechanisms of survival and replication of the parasite. The kinetic approach used on this research (1, 2, 3, 4, 5, 6 and 24 hours of infection) to analyse the global gene expression by RNA-Seq, an innovative methodology, provide a better understanding of events that culminate in coordinated and temporal activation of molecules during T. cruzi-cardiomyocyte interaction. We identified 572 modulated genes, where 371 were induced and 201 repressed. Our results indicate that T. cruzi induces a dynamic gene modulation with 18 genes altered after one hour of interaction. On early stage of infection (1 to 4 hours), the modulated genes are related to immune response and trypanocydal activity. In this context, we observed the activation of genes involved in pro-inflammatory response, oxidative stress and free radical metabolism indicating that the cardiac cell attempts to control the dissemination of the parasite. With the progression of the infection, it was evident the modulation of genes involved in cytoskeleton remodeling and cell stiffness, probably associated with intracellular parasite accommodation and repression of cell junctions genes as well as cell architecture maintenance genes. Alterations in expression of genes involved in metabolic pathways point to a mitochondrial dysfunction and energy deficiency induced by T. cruzi. We also point out changes in genes associated with hypertrophy, mainly related to IL1, IL6, toll like receptor 2 and GSK3B from early times of infection (1 to 4 hours). Remodeling associated to extracellular matrix showed genes with decreased expression mainly at 24 hours when the infection exceeds 75%, specially collagen- and fibronectin-related genes. In addition, genes associated to apoptosis with pro- and anti- apoptotic activity were differentially modulated in different stages of infection, suggesting that induction or repression of apoptosis may be directly related to parasite spread, the parasite load control in the host and/or escape of immune response. Thus, the identification of genes important to adaptation of T. cruzi on the microenviroment of the cardiac cell combined with modulation of genes involved in the response of the target cell will contribute to implementation of new strategies to control this parasite, allowing the selection of potential vaccine and/or therapeutic targets.

Made available in DSpace on 2014-03-18T17:17:54Z (GMT). No. of bitstreams: 2 samanta_xavier_ioc_dout_2013.pdf: 10283235 bytes, checksum: 159d2a0096921c251fd5eff48ab974d1 (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2013-11-21 / Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Oswaldo Cruz. Rio de Janeiro, RJ, Brasil / Atualmente, os casos de doença de Chagas aguda (DCA) vêm sendo devidos à ingestão de alimento contaminado por formas infectivas do vetor, as formas metacíclicas, e/ou devido à invasão de domicílios por triatomíneos silvestres infectados atraídos pela luz. O novo perfil epidemiológico que a doença de Chagas vem adquirindo, exige um novo olhar e o delineamento de novas ferramentas na definição de medidas de vigilância e controle. O carater recorrente dos surtos de DCA demonstra que ainda não se encontrou medidas de controle efetivas dentro deste novo perfil epidemiológico. Trypanosoma cruzi é um táxon extremamente heterogêneo, inclui 6 genótipos que infectam centenas de espécies de mamíferos e vetores em ciclos de transmissão complexos com características e particularidades locais e temporais. Nosso objetivo foi avaliar a aplicação da análise geoespacial por Lógica Fuzzy, como ferramenta a ser utilizada para reconhecer áreas de risco e fornecer elementos para definição de ações sustentáveis de vigilância epidemiológica na região Amazônica. Para tanto, inicialmente geramos dados referentes à distribuição das DTUs TcIII e TcIV, descritas como típicas da Amazônia, nos biomas brasileiros Observamos que estas DTUs não estão restritas à Amazônia e sim estão amplamente dispersas na natureza tendo sido encontradas infectando seis ordens de mamíferos e distribuidas por cinco biomas. Em seguida geramos dados sobre as variáveis envolvidas no ciclo enzóotico de T. cruzi em três localidades de Abaetetuba/Pará, onde são registrados casos recorrentes de DCA. Este estudo mostrou distintos perfis enzóoticos em cada localidade sendo a infecção de cães por T. cruzi a única característica comum às áreas e sinalizadora da existência de um ciclo silvestre de transmissão em áreas de atividade humana. Esses dados nos levaram a avaliar e validar o uso de cães como sentinela de áreas de risco e a sua detecção como medida de vigilância epidemiológica. Assim, concluímos como ponto de corte para definir uma área de risco epidemiológico e a implementação de programas de sensibilização e educação a soroprevalência de cães deve ser >=30%. O conjunto destes resultados nos permitiu concluir que o ciclo enzóotico de transmissão de T. cruzi é dinâmico, sazonal, multifatorial e modifica-se conforme as condições ambientais naturais e conseqüentemente com a utilização da paisagem pelo homem Com o conjunto de variáveis gerados por nós e obtidos referentes as variáveis entomológicas, ambientais, meteorológicos (CEPETEC) e dados de casos de doença de Chagas (SINAN e SESPA). Após iniciou-se a construção de mapas protótipos de áreas de risco como forma de consolidar critérios de definição de áreas estratégicas de ação e assim prevenir novos casos de DCA. Foi testada a abordagem geoespacial por interpolação e álgebra de mapas como uma ferramenta do diagnóstico ambiental das variáveis reguladoras da transmissão de T. cruzi na natureza. O conjunto das variáveis primárias e secundárias foi tratado pelo método fuzzy de inferência espacial na construção de um modelo de integração. O modelo demonstrou a possibilidade de usar essa nova abordagem na identificação de áreas com diferentes graus de risco, permitindo uma representação contínua e integrada das variáveis envolvidas na transmissão de T. cruzi na natureza / Currently, cases of Acute Chagas Disease (ACD) have occurred due to the ingestion of food contaminated with infective forms of the vector, me tacyclic forms, and or due to the household invasion by infected triatomines attracte d by artificial light. This new Chagas disease epidemiological profile, requires a new loo k and the design of new tools for the definition of surveillance and control strategies. The character recurrent ACD outbreaks demonstrate that we still haven ́t found effective c ontrol measures for this new epidemiological profile. Trypanosoma cruzi is an extremely heterogeneous taxon that includes 6 genotypes, which infect hundreds of mamm als and vectors species within complex transmission cycles with local and temporal peculiarities.. Our objective was to evaluate the application of geospatial analysis by Fuzzy Logic as a tool to be used to recognize risk areas and provide elements for defin ing sustainable epidemiological surveillance in the Amazon region. Therefore, we in itially generated data regarding the distribution of DTUs TcIII and TcIV, described as t ypical of the Amazon, throughout other Brazilian biomes. We observed that these DTUs are n ot restricted to the Amazon but they are widely dispersed in nature as they were found i nfecting six mammalian orders and were distributed in five biomes. Then, we generated data on the variables involved in the T. cruzi enzootic cycles in three different localities of th e municipality of Abaetetuba, Pará State, where recurrent cases of ACD are registered. This s tudy revealed distinct enzootic profiles in each location. Dogs’ infection by T. cruzi was the only common feature among those areas, thus they signaling the existence of a sylvatic tra nsmission cycle in areas of human activity. These results led us to evaluate and validate the u se of dogs as sentinel of risk areas and its use as a surveillance tool. We defined that dogs’ s eroprevalence of ≥ 30% is the cut off to define an area of epidemiological risk and thus can didate to the implementation of surveillance and education programs. Altogether, th ese results allowed us to conclude that the T. cruzi enzootic transmission cycle is dynamic, seasonal, multifunctional and modifies itself according to the environmental conditions an d, consequently, with the human landscape modification. Putting together the set of variables generated by us, the assembled entomological, environmental and meteorological (CE PETEC) variables, and the data on Chagas disease cases (SINAN and SESPA), we began to build prototypes of risk maps as an approach to consolidate criteria for the demarca tion of strategic areas for the implementation of actions to prevent further ACD ca ses. We tested the geospatial interpolation and map algebra approach as a diagnos tic tool of the environmental variables which regulate the T. cruzi transmission in nature. The set of primary and sec ondary variables were treated by the fuzzy method of spati al inference in order to build an integrated model. This model demonstrated the possibility to u se this novel approach in order to identify areas with different degrees of risk, thus allowing a continuous and integrated representation of the variables involved in the T. cruzi transmission in nature