Submitted by Andrea Hartke (andreamh@fiocruz.br) on 2014-11-24T17:22:58Z No. of bitstreams: 1 Tese Doutorado Saloê Bispo.pdf: 7313913 bytes, checksum: 084107e9ced08be104473d461e3b1102 (MD5) / Approved for entry into archive by Andrea Hartke (andreamh@fiocruz.br) on 2014-11-24T17:25:15Z (GMT) No. of bitstreams: 1 Tese Doutorado Saloê Bispo.pdf: 7313913 bytes, checksum: 084107e9ced08be104473d461e3b1102 (MD5) / Made available in DSpace on 2014-11-24T17:25:15Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Tese Doutorado Saloê Bispo.pdf: 7313913 bytes, checksum: 084107e9ced08be104473d461e3b1102 (MD5) Previous issue date: 2014 / Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Carlos Chagas. Pós-Graduação em Biociências e Biotecnologia. Curitiba, PR, Brasil. / O Trypanosoma cruzi é o agente etiológico da Doença de Chagas. O controle da expressão de genes é fundamental para gerar as mudanças morfológicas durante o ciclo de vida do parasita. Entretanto, os tripanosomatídeos possuem peculiaridades quanto a sua biologia molecular, como por exemplo, a transcrição policistrônica e a ausência de promotores definidos para a RNA polimerase II. Acredita-se, portanto, que grande parte da regulação da expressão gênica nestes parasitas ocorra em nível pós-transcricional por mecanismos que envolvem mudanças na estabilidade e no acesso dos mRNAs aos polissomos. Estudos prévios do nosso grupo mostraram que alguns mRNAs que codificam proteínas do complexo proceossomo (SSU) em T. cruzi são mais abundantes em tripomastigotas metacíclicos que em epimastigotas. No entanto, apesar da grande quantidade de mRNAs da proteína TcSof1 nas formas infectantes, o mRNA de TcSof1, esta imobilizado dentro dos polissomos e não é traduzido. O sequestro de mRNA dentro polissomos é uma maneira de bloquear a tradução, sugerindo um mecanismo de regulação negativa da tradução, provavelmente nas etapas de elongação e terminação. O objetivo do nosso trabalho foi caracterizar os mecanismos de regulação da expressão gênica envolvidos na expressão negativa do gene de TcSof1 na forma tripomastigota metacíclica de T. cruzi. Primeiramente isolamos e analisamos mais de 500 RNAs pequenos na forma metaciclica que pudessem estar regulando negativamente a tradução de TcSof1. Embora, nenhum RNA regulador tenha sido identificado, uma grande população de fragmentos de tRNAs foi encontrada. Sua participação na maquinaria de tradução ativa foi excluída, uma vez que os mesmos não foram detectados associados aos polissomos ou ribossomos. Padronizamos e empregamos a técnica de Ribossome Footprinting para a análise da eficiência de tradução em T. cruzi, avaliando a população de mRNA total e os mRNA que estavam associados aos ribossomos, provenientes da forma metacíclica. Os resultados mostraram que de aproximadamente 9.000 genes presentes nesta etapa do ciclo de vida, apenas 4.241 estavam associados aos ribossomos nas amostras do footprinting, ao contrário do que foi visto na forma epimastigota, onde dos 9.000 genes presentes 7. 419 genes estavam associados aos polissomos. Este resultado indica que quase a metade dos genes transcritos nas formas tripomastigotas estão sendo regulados negativamente, provavelmente em nível de tradução. Confirmamos com esta técnica a presença do mRNA de TcSof1 associado aos polissomos na forma metacíclica mesmo sem haver expressão da proteína nesta forma, e outros genes que apresentam o mesmo padrão de expressão também foram analisados. Através do tratamento dos parasitas com a droga harringtonina, um inibidor da tradução, seguido das análises por Ribosome Footprinting, foi possível evidenciar um acúmulo de ribossomos nos locais de inicio da tradução da maioria dos mRNAs mostrando que a droga bloqueia os ribossomos no sitio de inicio da tradução. Pelo contrario, o mRNA de TcSof1 apresentou marcas de ribossomo ao longo de toda a região codificante do gene nas formas metacíclicas, sugerindo que os ribossomos estão parados na etapa de elongação da tradução. Este resultado confirmou que a ausência de expressão desta proteína nesta etapa do ciclo de vida do parasita, é controlada em nível de tradução por um mecanismo de parada dos ribossomos nos polissomos. / Trypanosoma cruzi is the etiologic agent of Chagas disease. The parasite alternates between different morphological and functional forms during its life cycle. Control of gene expression is key to generate the morphological changes during the life cycle of the parasite. However, trypanosomatids display very peculiar cellular processes, as polycistronic transcription and the lack of canonical RNA II polymerase promoters. Therefore, gene expression regulation occurs mainly at the posttranscriptional level by mechanisms that involve changes in the stability of mRNAs and their access to polysomes. Previous studies from our group have shown that some mRNAs, which encode proteins of the proceossome complex (SSU) in T. cruzi, are more abundant in metacyclic trypomastigote than in epimastigote stages. However, even though a greater amount of TcSof1 mRNA is observed in the infective forms and is associated with the polysomes it is not translated. Trapping the mRNA in polysomes is a way to block translation, suggesting a mechanism of translation down-regulation, probably during the elongation and termination stages. The aim of our study was to characterize the mechanisms of gene expression regulation involved in the negative expression of TcSof1 gene in the metacyclic stage of T. cruzi. First, we isolated and analyzed more than 500 small RNAs in the metacyclic form that could be negatively regulating the translation of TcSof1 gene. Although no regulatory RNA was identified, a large population of tRNAs fragments was found. Their association to the active translation machinery was excluded, since they were not detected in association with polysomes or ribosomes. After that, we standardized and applied the Ribosome Footprinting technique to analyze translation efficiency in T. cruzi, and to assess which mRNAs were protected by ribosomes in the metacyclic form. Our results showed that from some 9,000 genes present in this life cycle stage, only 4,241 were associated with ribosomes. On the other hand, in epimastigote forms from 9,000 genes present, 7,419 genes were associated with polysomes. This indicates that almost half of the transcribed genes in metacyclic trypomastigotes are being negatively regulated, probably at translation level. Through the ribosome profiling technique we confirmed ours previous results and showed that TcSof1 mRNA is associated to metacyclic polisomes though the protein is not expressed in this form. Similarly, other genes that have the same TcSof1 expression pattern were also analyzed. By treating parasites with harringtonine, an inhibitor of translation, followed by Ribosome Footprinting analysis, it was possible to show an accumulation of ribosomes at the initiation translation sites of most mRNAs. We could observe the presence of ribosome footprints along the coding region of TcSof1 gene in metacyclic forms, suggesting that ribosomes are stalled onto the mRNA. This result confirms that the absence of protein expression at this stage is controlled at the translation level by a mechanism that stalls the ribosomes on the mRNA.

Submitted by Renata Fontoura (comunicaicc@fiocruz.br) on 2014-11-26T15:13:12Z No. of bitstreams: 2 Dissertação Claudia Maria do Nascimento Moreira - 01.pdf: 4994656 bytes, checksum: c9acb588dbfcaa318394a1f54b594a32 (MD5) Dissertação Claudia Maria do Nascimento Moreira - 01.pdf: 4994656 bytes, checksum: c9acb588dbfcaa318394a1f54b594a32 (MD5) / Made available in DSpace on 2014-11-26T15:15:37Z (GMT). No. of bitstreams: 2 Dissertação Claudia Maria do Nascimento Moreira - 01.pdf: 4994656 bytes, checksum: c9acb588dbfcaa318394a1f54b594a32 (MD5) Dissertação Claudia Maria do Nascimento Moreira - 01.pdf: 4994656 bytes, checksum: c9acb588dbfcaa318394a1f54b594a32 (MD5) Previous issue date: 2013 / Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Carlos Chagas. Curitiba, PR, Brasil / O complexo adaptador 1 (AP-1) atua na formação do revestimento de vesículas com clatrina na rede trans-Golgi em células eucariontes. O conhecimento sobre o complexo AP-1 em tripanosomatídeos é escasso, mas já foi demonstrada sua importância na infectividade de Leishmania mexicana em macrófagos, assim como na viabilidade de Trypanosoma brucei. O Trypanosoma cruzi é um protozoário flagelado pertencente à família Trypanosomatidae, sendo o agente etiológico da doença de Chagas, a qual afeta milhões de pessoas no mundo. Neste contexto, esta dissertação teve como objetivo identificar os genes que codificam as quatro subunidades do complexo AP-1 no genoma de T. cruzi, analisar sua expressão e localização subcelular nesse parasita. Busca em banco de dados genômicos permitiu identificar as sequências codificantes para todas as subunidades do complexo AP-1, sendo obtidos os seguintes números de acesso gênicos: AP1-γ: XP_818958.1; AP1-β: XP_820334.1; AP1-µ:XP_818899.1; AP1-σ: XP_804127.1. Foram produzidos anticorpos em camundongos contra as proteínas recombinantes de todas as subunidades do complexo AP-1. Análise da especificidade dos anticorpos foi realizada por western blot e a localização subcelular das proteínas foi feita por imunofluorescência em microscopia de epifluorescência e microscopia confocal a laser. Resultados negativos foram obtidos com o antisoro contra a subunidade AP1-σ. Anticorpos obtidos contra as subunidades AP1-µ (policlonal) e AP1-β (monoclonal) reconheceram polipetídeos de tamanho compatível ao peso molecular da proteína endógena em extratos de formas epimastigotas, porém não reconheceram as proteínas por imunofluorescência. O antisoro policlonal obtido contra a subunidade AP1-γ reconheceu em extratos de diferentes formas evolutivas de T. cruzi (epimastigotas, tripomastigotas e amastigotas) um polipeptídeo de peso molecular compatível com o predito em banco de dados (~90 kDa). Imunolocalização demonstrou reação positiva pontual em região compatível com a do complexo de Golgi deste protozoário: entre núcleo e cinetoplasto de formas tripomastigotas e entre cinetoplasto e bolsa flagelar de epimastigotas e amastigotas. Colocalização da AP1-γ com a GTPase Rab7 (marcador de complexo de Golgi em T. cruzi) confirmou a localização desta subunidade no complexo de Golgi desse parasita. Nossos resultados demonstram que as subunidades do complexo AP-1 são conservadas e expressas em T. cruzi e que pelo menos a subunidade AP1-γ possui localização celular em complexo de Golgi, similar ao que é descrito em outras células eucariontes. / The adaptor complex 1 (AP-1) acts in the formation of clathrin-coated vesicles at the transGolgi network of eukaryotic cells. Knowledge about the AP-1 complex in trypanosomatids is scarce, but it has been already demonstrated its importance in the infectivity of Leishmania mexicana in macrophages, as well as the viability of Trypanosoma brucei. Trypanosoma cruzi is a protozoan flagellate that belongs to the family Trypanosomatidae, being the etiologic agent of Chagas disease, which affects millions of people worldwide. In this context, this study aimed to identify the genes encoding the four subunits of the AP-1 complex in the genome of T. cruzi and analyze their expression and subcellular localization in this parasite. Search in genomic database identified gene sequences coding for all subunits of the AP-1 complex, the following accession numbers being obtained: AP1-γ: XP_818958.1; AP1-β: XP_820334.1; AP1-µ: XP_818899 .1; AP1-σ: XP_804127.1. Antibodies were produced in mice against recombinant proteins of all subunits of the AP-1 complex. Analysis of the specificity of the antibodies was performed by western blot and subcellular localization of the proteins by immunofluorescence was done by epifluorescence microscopy and confocal laser microscopy. Negative results were obtained with the antiserum against subunit AP1-σ. Antibodies raised against the AP1-µ (polyclonal) and AP1-β (monoclonal) subunits recognized polypeptides with size compatible to the molecular weight of the endogenous protein in extracts from epimastigotes, but no proteins could be localized by fluorescence microscopy. The antiserum polyclonal obtained against the AP1-γ subunit recognized a polypeptide in extracts of different evolutionary forms of T. cruzi (epimastigotes, trypomastigotes and amastigotes) of molecular weight consistent with that predicted in database (~90 kDa). Immunolocalization showed punctual positive reaction in the region compatible with the Golgi complex of this protozoan: between nucleus and kinetoplast of trypomastigotes and between kinetoplast and flagellar pocket of epimastigotes and amastigotes. Colocalization of AP1-γ with the GTPase Rab7 (a marker of the Golgi complex in T. cruzi) confirmed the location of this subunit in the Golgi apparatus of this parasite. Our results demonstrate that the subunits of the AP-1 complex are conserved and expressed in T. cruzi and that at least the AP1-γ subunit has cellular localization in the Golgi apparatus, similar to that described in other eukaryotic cells.

Made available in DSpace on 2015-05-19T13:30:31Z (GMT). No. of bitstreams: 2 185.pdf: 4365385 bytes, checksum: 6c364e4e8e6f1c7012d8d4bc56993d0c (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2013 / Fundação Oswaldo Cruz. Centro de Pesquisas Aggeu Magalhães. Recife, PE, Brasil / A doença de Chagas, causada pelo protozoário hemoflagelado Trypanosoma cruzi, consiste em um grave problema de saúde pública na América Latina, com cerca de 7 a 8 milhões de pessoas infectadas. O benznidazol é atualmente o único fármaco disponível para o tratamento, apresentando boa atividade na fase aguda, mas com eficácia questionada na fase crônica, além de apresentar severos efeitos colaterais e longo período de tratamento. Tendo em vista a sua fácil síntese e baixo custo, adutos aromáticos oriundos da reação Morita-Baylis-Hillman têm sido considerados promissores como quimioterápicos. Neste sentido, foi avaliada a atividade tripanocida e citotóxica de seis adutos Morita-Baylis-Hillman. Para analisar possíveis efeitos dos adutos sobre estruturas específicas do protozoário foi utilizado a microscopia confocal a laser, através da marcação com Rodamina 123, MitoSOXT, Laranja de Acridina e Kit Live/Dead(R). As alterações morfológicas em parasitas submetidos ao tratamento foram acompanhadas por microscopia eletrônica de transmissão. Nossos resultados mostraram que todos os compostos foram capazes de inibir o crescimento de formas epimastigotas e causaram uma diminuição da viabilidade em formas tripomastigotas, apresentando uma moderada citotoxicidade para células de mamíferos. Os adutos MBH1, MBH2, MBH5 e MBH7 também foram efetivos em inibir a infecção de macrófagos e diminuir a viabilidade das formas amastigotas. Os compostos não foram capazes de alterar os níveis de produção do óxido nítrico em macrófagos. Análises pela microscopia confocal e microscopia eletrônica de transmissão (MET) apontam a mitocôndria como principal alvo intracelular destes compostos. Alterações compatíveis com a perda da viabilidade e morte celular por necrose e autofagia foram observadas por MET. Os resultados obtidos neste trabalho colocam os adutos Morita -Baylis-Hillman em evidência como agentes promissores para o tratamento da tripanossomíase americana

Submitted by Ana Maria Fiscina Sampaio (fiscina@bahia.fiocruz.br) on 2015-07-23T17:05:59Z No. of bitstreams: 1 Carlos Gustavo Silva dos Santos Caracterização molecular....pdf: 1743940 bytes, checksum: 3a0047fb24b0ac8cad48dfd0a4088b8f (MD5) / Approved for entry into archive by Ana Maria Fiscina Sampaio (fiscina@bahia.fiocruz.br) on 2015-07-23T17:06:11Z (GMT) No. of bitstreams: 1 Carlos Gustavo Silva dos Santos Caracterização molecular....pdf: 1743940 bytes, checksum: 3a0047fb24b0ac8cad48dfd0a4088b8f (MD5) / Made available in DSpace on 2015-07-23T17:06:11Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Carlos Gustavo Silva dos Santos Caracterização molecular....pdf: 1743940 bytes, checksum: 3a0047fb24b0ac8cad48dfd0a4088b8f (MD5) Previous issue date: 2014 / Fundação Oswaldo Cruz. Centro de Pesquisas Gonçalo Moniz. Salvador, BA, Brasil / A Doença de Chagas é uma infecção parasitária causada pelo protozoário flagelado Trypanosoma cruzi. As cepas de T. cruzi se constituem de uma população heterogênea, apresentando várias subpopulações. Essas populações circulam entre animais vertebrados domésticos, silvestres e humanos, além de insetos vetores. Devido a essas múltiplas relações, o T. cruzi demostra uma grande variedade biológica, genética, bioquímica e imunológica. A caracterização das cepas de T. cruzi pode utilizar várias metodologias que pode ter foco biológico, bioquímico, isoenzimático e molecular. Dentre essas, a molecular vem ganhando destaque devido a rapidez, sensibilidade e precisão do método. Deste modo, com a presente pesquisa o objetivo foi caracterizar molecularmente as cepas de Tripanosoma cruzi (Chagas 1909) isoladas em vetores e reservatórios na zona urbana de Salvador. Foram incluídas neste estudo amostras de T. cruzi isoladas de triatomíneos e reservatórios provenientes de diversas localidades da cidade de Salvador, capturados entre Julho de 2007 e Junho de 2011, perfazendo um total de 4 anos de amostragem. Adotamos a técnica de tipagem molecular do T. cruzi sugerida por Zingales et al. (2009) em sistema de eletroforese capilar. Das 930 amostras de triatomíneos avaliados, 99,35% da espécie Triatoma tibiamaculata, 482 amostras (52%) não estavam em condições de análise. Das 448 amostras passíveis de análises foram randomizadas 192 amostras (43%) para avaliação das linhagens de T. cruzi. Dentre as amostras analisadas, 20 (10,4%) não apresentaram sinal satisfatório na eletroforese capilar e foram excluídas, restando 172 amostras. Foi detectado T. cruzi em 21,5% das amostras de triatomíneos (n=37). A tipagem revelou o seguinte perfil nas amostras positivas: T. cruzi 1 (32,4%), T. cruzi 2 (59,4%), T. cruzi 3 (2,7%). Foi detectado também triatomíneos com múltipla infecção com linhagens diferentes de T. cruzi 1 & 2 (5,4%). Adicionalmente, foram avaliados 78 marsupiais, Didelphis spp. A taxa de infecção nos marsupiais foi de 29,4%, e nas amostras positivas foi observado o seguinte perfil molecular de tipagem pelo T. cruzi: T. cruzi 1 (30,4%), T. cruzi 2 (60,8%), T. cruzi 1 e 2 (8,6%). A alta taxa de infecção dos vetores e reservatórios avaliados pode ser efeito da fragmentação florestal, causada pela expansão urbana. O Triatoma tibiamaculata já foi associado à transmissão oral do T. cruzi por alimentos infectados no Brasil e a ocorrência de exemplares infectados desta espécie no ambiente intradomicíliar na cidade de Salvador é fator de risco para a transmissão da doença de Chagas para a população local. Os dados obtidos na tipagem molecular das cepas isoladas em Salvador demonstrou maior prevalência do T. cruzi 2 em seguida do T. cruzi 1 nos vetores e reservatórios avaliados. A presença de triatomíneos e marsupiais infectados, co-habitando e albergando diversas linhagens do T. cruzi em áreas de ocupação urbana é razão de alerta para os órgãos de vigilância em saúde locais. / Chagas disease is a parasitic infection caused by the flagellate protozoan Trypanosoma cruzi. The T. cruzi strains constitute a heterogeneous population, with several subpopulations. These populations move between domestic vertebrate animals, wildlife and humans, and insect vectors. Because of these multiple relationships, T. cruzi demonstrates great biological diversity, genetic, biochemical and immunological. The characterization of T. cruzi strains can use various methodologies that may have biological, biochemical, and molecular isoenzyme focus. Among these, the molecular been gaining attention due to speed, sensitivity and precision of the method. Thus, the present study the objective was to characterize molecularly strains of Trypanosoma cruzi (Chagas 1909) isolated in vectors and reservoirs in the urban area of Salvador. Were included in this study T. cruzi samples of insects and shells from different localities of the city of Salvador, captured between July 2007 and June 2011, a total of four years of sampling. We adopt molecular typing technique of T. cruzi suggested by Zingales et al. (2009) in a capillary electrophoresis system. Of the 930 samples evaluated triatomine 99.35% of Triatoma tibiamaculata, 482 samples (52%) were not in analytical conditions. Of the 448 samples amenable to analysis 192 samples were randomized (43%) for evaluation of T. cruzi strain. Among the samples analyzed, 20 (10.4%) had no satisfactory signal in capillary electrophoresis and were excluded, leaving 172 samples. T. cruzi was detected in 21.5% of samples of insects (n = 37). The typing revealed the following profile in positive samples: T. cruzi 1 (32.4%) T. cruzi 2 (59.4%) T. cruzi 3 (2.7%). Triatominae was also detected with multiple infections with different strains of T. cruzi 1 & 2 (5.4%). Additionally, we evaluated 78 marsupials, Didelphis spp. The infection rate in marsupials was 29.4%, and the positive samples was observed the following molecular profile of typing T. cruzi: T. cruzi 1 (30.4%), T. cruzi 2 (60.8% ), T. cruzi 1 and 2 (8.6%). The high rate of infection vectors and reservoirs can be evaluated effect of forest fragmentation caused by urban sprawl. Triatoma tibiamaculata has been associated with oral transmission of T. cruzi by infected food in Brazil and the occurrence of infected specimens of this species within domestic environments in the city of Salvador is a risk factor for the transmission of Chagas disease to the local population. The data obtained in the molecular typing of strains isolated from Salvador showed a greater prevalence of T. cruzi 2 then 1 of T. cruzi in vectors and reservoirs evaluated. The presence of infected bugs and marsupials, co-habiting and harboring various strains of T. cruzi in urban areas of occupation is warning reason for the oversight bodies in local health

Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / A transsialidase é uma glicoproteína de membrana pertencente a uma família de genes de cópia múltipla, envolvida no processo de invasão celular do Trypanosoma cruzi no hospedeiro vertebrado. Esta dissertação foi concebida com um amplo componente analítico que dependia de dados publicamente disponíveis, ou seja, as sequências oriundas do projeto genoma de T. cruzi e cDNAs de trans-sialidase depositadas no Genbank-dbEST. Este componente analítico necessitou ser complementado e ampliado com a obtenção experimental de novas sequências, a partir da metodologia baseada na transcrição reversa acoplada a PCR. Os fragmentos obtidos de cepas de T. cruzi Dm28c (T. cruzi I), Y (T. cruzi II), CL-Brener (T. cruzi II, cepa híbrida), INPA4167 (zimodema III), 3663 (zimodema III) e Colombiana (zimodema III) foram clonados, sequenciados e analisados composicionalmente. Essas sequências foram editadas e alinhadas usando-se o software CLUSTAL X. Em uma seção específica do Genbank, denominada dbEST, buscamos os cDNAs homólogos a trans-sialidase. Esta busca por similaridade foi realizada individualmente com os números de acesso referentes às seqüências supracitadas contra o dbEST utilizando o BLAST a fim de obtermos informações funcionais e evolutivas. Em seguida, desenvolvemos metodologias experimentais que nos permitiu avaliar segmentos da 5 UTR, tais como os sítios de trans-splicing adicionais ou múltiplos em TS e seus respectivos sinais (região rica em polipirimidina), variação composicional e tamanho da região das sequências entre diferentes linhagens de T. cruzi. O resultado dessa averiguação também nos mostrou a quantidade de cDNAs relacionados com a transsialidase no dbEST bem como a relação desses cDNAs com o mini-exon. As cepas do zimodema III apresentaram tamanho médio dos fragmentos de 312 bases, enquanto T. cruzi I e T. cruzi II apresentaram, respectivamente 209 e 218. Trans splicing adicional ou duplicações gênicas com mutações no sítio primário de trans splicing não parece ser um fenômeno exclusivo de algum grupo populacional, embora seja mais evidente em T. cruzi zimodema III.

O Trypanosoma cruzi, agente etiológico da doença de Chagas, possui um ciclo de vida complexo, deve lidar com diversas condições do ambiente e depende dos hospedeiros para suprir suas necessidades nutricionais. Uma delas é a necessidade de captar a molécula de heme (Fe-protoporfirina IX) que será utilizada como fator de crescimento. Os mecanismos envolvendo o metabolismo de heme são cruciais para a sobrevivência do T. cruzi pois o parasito não possui várias enzimas de biossíntese dessa porfirina e o heme livre pode apresentar citotoxicidade para célula. Na tentativa de perseguir o destino final do heme no parasito, nós estudamos essa via inexplorada no T. cruzi. Nessa tese, nós demonstramos que epimastigotas cultivados com heme, produziram os compostos, α-meso hidroxiheme, verdoheme e biliverdina (identificados por HPLC acoplado á espectrofotômetria). Além disso, nós observamos através de análise dos extratos de epimastigotas no espectrômetro de massas (LQT Orbitrap), espécies iônicas de m/z 583,4 e m/z 619,3. A fragmentação subsequente desses íons originaram espécies filhas típicas das moléculas de biliverdina e verdoheme, respectivamente. Nós observamos também, espécies iônicas de m/z 1397,4 e m/z 1135,4. A fragmentação dessas espécies produziram íons, sendo um deles com a mesma massa molecular de heme (m/z 616,3). Essa espécie iônica por sua vez, gerou fragmentos iônicos idênticos a uma molécula de heme, confirmando que esses intermediários são produtos da modificação da porfirina. Baseado nesses resultados, nós propomos um modelo onde o catabolismo de heme em T. cruzi, envolveria a conjugação da bis(glutationil)spermina, um derivado da tripanotiona presente em tripanossomatídeos, à porfirina (m/z 1137,4), seguido da remoção de dois resíduos de ácidos glutâmicos (m/z 1135,4). Embora o significado bioquímico e fisiológico da adição desse resíduo tiol na molécula de heme ainda é pouco compreendido, alguns trabalhos demonstram a abilidade desses compostos em ligar na porfirina, sem contar também, que esse heme conjugado poderia resultar em uma forma efetiva de prevenção de danos à membrana e a célula ocasionados pelo acúmulo de heme livre. Em conjunto, esses resultados fornecem novas abordagens do metabolismo de heme em T. cruzi, revelando possíveis alvos de intervenção quimioterápica futuros. Nossa proposta está direcionada para uma via ativa de catabolismo de heme que inclui a adição de grupos tiol (derivado da tripanotiona) à heme e a clivagem do anel porfirínico originando a molécula de biliverdina. / Trypanosoma cruzi, the causal agent of Chagas disease, has a complex life cycle and they must cope with diverse environmental conditions and depends on hosts for its nutritional needs. One of the nutritional characteristic is that they need a heme compound (Fe-protoporphyrin IX) as a growth factor. The mechanisms involved in these processes are crucial for their survival mainly because of trypanosomatids lack of the complete heme biosynthetic pathway and the cytotoxic activity of free heme. Following the fate of this porphyrin in the parasite we studied this missing pathway in T. cruzi. Here, we show that epimastigotes cultivated with heme yielded the compounds, α-meso hydroxyheme, verdoheme and biliverdin (as determined by HPLC with diode array detector). Furthermore, we observed ion species of m/z 583.4 and m/z 619.3 from epimastigotes extracts detected by direct infusion on LQT Orbitrap platform. A tipical biliverdin and verdoheme doughter-ion species were generated by m/z 583.4 and m/z 619.3 fragmentations, respectively. We also observed an ion species at m/z 1397.4 and m/z 1135. The subsequent fragmentation of this species produced a daughter-ions whose one with the same molecular mass as heme (m/z 616.4). This species, in turn, generated daughter species identical to an authentic heme, confirming that these intermediates were modified heme products. Based on these findings, we propose that heme catabolism in T. cruzi involves a additions of Bis(glutathionyl)spermine, a low molecular mass thiols occurring in trypanosomatids, to heme (m/z 1397.4), followed by removal of the glutamic residues (m/z 1135). Although the biochemical and physiological significance of the addition of thiol residues to heme molecule is underexplored, some works, already demonstrated their ability to bind heme and also this modified heme may resulting in the effective prevention of membrane damage and cytotoxicity by the heme accumulation. Taken together, these results offer new insights into heme metabolism in T. cruzi, revealing potential future therapeutic targets. We propose an active heme catabolism pathway that includes a trypanotione derivate additions and cleavage of the heme porphyring ring to biliverdin.

Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado do Rio de Janeiro / As formas epimastigotas de Trypanosoma cruzi proliferam e se diferenciam no interior de diferentes compartimentos do trato digestivo dos triatomíneos. Esses ambientes antagônicos, no que diz respeito à concentração de nutrientes, pH e status redox, constituem um desafio para o protozoário por conterem moléculas e fatores capazes de deflagrar diferentes sinalizações e respostas no parasito. Por isso, testamos a influência de produtos abundantes do metabolismo do vetor e de status redox distintos, frente aos processos de proliferação e diferenciação in vivo e in vitro. Como exemplo temos o heme e a hemozoína, subprodutos da digestão da hemoglobina, e o urato, rico na urina dos insetos. O heme é uma importante molécula em todos os seres vivos. Nosso grupo mostrou seu papel na proliferação in vitro de T. cruzi e que esse sinal é governado pela enzima redox-sensível CaMKII (Lara et al., 2007; Souza et al., 2009). Esse efeito parece depender de uma sinalização redox, onde o heme e não seus análigos induz a formação de EROs, modulando a atividade da CaMKII (Nogueira et al, 2011). Apesar de gerar espécies reativas de oxigênio (EROs) em formas epimastigotas, o heme não alterou a ultraestrutura desses parasitos mostrando uma adaptação a ambientes oxidantes. Além disso, a adição de FCCP inibiu a formação de EROs mitocondrial, diminuindo a proliferação dos parasitos. Em contrapartida, a AA aumentou drasticamente a produção de EROs mitocondrial levando à morte dos epimastigotas. Estes resultados confirmam a hipótese de regulação redox do crescimento de epimastigotas. A formação de β- hematina (hemozoína) constitui uma elegante estratégia para minimizar o efeito tóxico do heme nos insetos hematófagos. Contudo, a β-hematina não influenciou a proliferação ou a metaciclogênese in vitro. Já o urato, e outros antioxidantes clássicos como o GSH e o NAC prejudicaram a proliferação in vitro de epimastigotas. Estes efeitos foram parcialmente revertidos quando os antioxidantes foram incubados juntamente com o heme. Durante a metaciclogênese in vitro, o NAC e o urato induziram um aumento significativo das formas tripomastigotas e levaram a diminuição da porcentagem de formas epimastigotas. Em contrapartida, o heme e a β-hematina apresentaram o efeito oposto, diminuindo a porcentagem de formas tripomastigotas e aumentando a de epimastigotas. No intuito de confirmar a influencia do status redox na biologia do parasito in vivo, nós quantificamos a carga parasitária nas porções anterior e posterior e no reto do triatomíneo alimentado na presença ou na ausência de NAC e urato por qPCR. O tratamento com os antioxidantes aumentou a carga parasitária em todas as partes do intestino analisadas. Posteriormente, para diferenciar as formas evolutivas responsáveis pelo incremento da carga parasitária, foram realizadas contagens diferenciais nas mesmas porções do intestino do inseto vetor. Cinco dias após a infecção foi observado aumento significativo de formas tripomastigotas e diminuição de formas epimastigotas in vivo. Em conjunto, estes dados sugerem que, assim como a concentração de nutrientes e o pH, o status redox também pode influenciar a biologia do T. cruzi no interior do inseto vetor. Neste cenário, moléculas oxidantes agiriam a favor da proliferação, e em contraste, antioxidantes parecem favorecer a metaciclogênese. / Trypanosoma cruzi epimastigotes proliferate and differentiate inside different compartments of the triatomines gut. These environments are antagonic in terms of nutrient content, pH and redox status. All these factors represent a challenge to the protozoan due to the presence of molecules and factors which are able to induce different signals to the parasite. Thus, we tested the influence of abundant metabolism products of the vector, with distinct redox status, in the proliferation and metacyclogenesis in vitro and in vivo. These molecules are heme and hemozoin, both byproducts of hemoglobin digestion, and urate, present in the urine of insects. Heme is a ubiquitous molecule present in all living organisms. Our group studied its role in T. cruzi growth in vitro, showing that this signal is governed by the redox-sensitive enzyme CaMKII (Lara et al., 2007; Souza et al., 2009). Indeed, it seems to rely on a redox signaling pathway in which heme, but not its analogs, induces ROS formation, thus modulating CaMKII activity (Nogueira et al., 2011). Although it induces ROS in epimastigotes, the heme molecule had no deleterious effect upon the parasites ultrastructure, suggesting an adaptation to oxidative environments. In addition, FCCP inhibited mitochondrial ROS formation, then decreasing the parasite proliferation. On the other hand, AA drastically increased mitochondrial ROS production leading to cell death. These results corroborate the hypothesis of redox regulation of epimastigotes proliferation. Hemozoin (β- hematin) formation is an elegant strategy to minimize the toxic effect of heme in hematophagous insects. However, β-hematin had no influence upon the proliferation or metacyclogenesis in vitro. Also, urate, GSH and NAC impaired epimastigote proliferation. These effects were partially reversed when the antioxidants were incubated along with heme. During metacyclogenesis in vitro, NAC and urate induced a significant increment of trypomastigotes and decreased the percentage of epimastigotes. Heme and β-hematin presented the opposite effect diminishing the percentage of trypomastigotes and increasing the percentage of epimastigotes. To confirm the influence of the redox status in the parasite biology in vivo, we quantified the parasite loads in the anterior and posterior midguts and in the rectum of the triatomine vector fed with or without NAC and urate by qPCR. The treatment with the antioxidants increased the parasite loads in all midgut sections analyzed. Afterwards, in order to distinguish the evolutive forms responsible for the increment of parasite loads, we performed differential counting of the midgut sections. Five days post infection we observed an increment of trypomastigotes and a decrease of epimastigote forms in vivo. Taken together, these data suggests that, as well as nutrient content and pH, the redox status may also influence T. cruzi biology in the vector. In this scenario, oxidants act to turn on proliferation and in contrast, antioxidants seem to switch the cycle towards metacyclogenesis.

Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado do Rio de Janeiro / O Trypanosoma cruzi é o agente etiológico da doença de Chagas, transmitida através de insetos vetores triatomíneos durante a alimentação no hospedeiro vertebrado. Os triatomíneos ingerem numa única alimentação cerca de 10 mM de heme ligado à hemoglobina. O heme é uma importante molécula no metabolismo dos organismos. Um mecanismo intracelular importante no controle de sua homeostase é a degradação enzimática pela Heme Oxigenase (HO) formando biliverdina (Bv), monóxido de carbono e ferro. Como esta enzima não está presente no genoma de T. cruzi, esse trabalho tem por objetivo identificar uma atividade funcional de HO neste parasito, uma vez que dados do nosso laboratório mostram a presença de biliverdina nas incubações dessas células com heme. No presente trabalho testamos o efeito do SnPPIX (inibidor da HO-1), CoPPIX (indutor da HO-1) e Bv sobre a proliferação da forma epimastigota do parasito. A adição de SnPPIX diminuiu a proliferação do parasito na tanto na ausência quanto na presença de heme. Quando a Bv foi adicionada à cultura esse efeito foi revertido; a Bv aumenta a proliferação celular na presença de heme. Por outro lado, a adição de CoPPIX não interferiu na proliferação. Posteriormente, mostramos através da técnica de immunoblotting, utilizando anticorpo monoclonal contra a HO-1, um aumento da expressão de uma proteína em resposta ao heme. Diferentemente das HO-1 já descritas que possuem massa molecular de 32 kDa, a única banda reconhecida pelo anticorpo apresenta 45 kDa. Analisamos também a expressão da HO-1 na presença de CoPPIX, SnPPIX e biliverdina, e somente o CoPPIX foi capaz de modular os níveis de expressão da HO-1. A análise estrutural através da técnica de imunocitoquímica mostrou uma maior expressão da enzima na presença de heme, e que a HO-1 de T. cruzi pode ter mais de uma localização, apresentando marcação citoplasmática e glicossomal. A fim de investigar a sequência da HO-1 de T. cruzi, o DNA genômico foi extraído para amplificação por PCR do gene da HO-1 utilizando oligonucleotídeos desenhados no genoma de T. cruzi. Os dois pares de oligonucleotídeos utilizados nao foram capazes de amplificar uma sequência equivalente a uma HO. Em seguida, utilizamos a técnica de imunoprecipitação, seguida de immunoblotting, com anticorpo anti-HO-1, com objetivo de concentrar a proteína alvo, e observamos um aumento significativo do imunocomplexo nas células tratadas com heme 300 mM, cerca de 2 vezes em relação ao controle. Dando seguimento à tentativa de identificação da HO-1 de T. cruzi, utilizamos a técnica de espectrometria de massa a partir de eletroforese unidimensional, que mostrou uma grande alteração do perfil protéico na presença de heme, mas futuros experimentos são necessários, como eletroforese 2D, para a identificação da proteína alvo / Trypanosoma cruzi, the ethiologic agent of Chagas disease, is transmitted through triatomine vectors during their blood-meal on vertebrate host. These hematophagous insects ingest blood about 6 to 12 times its original weight, reaching in a single meal about 10 mM heme bound to hemoglobin. Heme (iron protoporphyrin IX) is an important molecule in metabolism of all living organisms. One important intracellular mechanism to control heme homeostasis is its enzymatic degradation by heme oxygenase (HO). HO catalyzes the degradation of heme to biliverdin (Bv), carbon monoxide and iron. HO is absent in T. cruzi genome, thus we have been investigating the presence of a functional HO in this parasite, since our previous results showed a presence of biliverdin in heme-treated epimastigotes. In the present work, we evaluated the effect of SnPPIX, a HO-1 inhibitor, CoPPIX, a HO inducer, and Bv upon T. cruzi epimastigotes proliferation. The addition of SnPPIX decreased the parasite proliferation in the absence or in the presence of heme. When Bv was added to the culture this effect was reversed; Bv increases the parasite proliferation in the presence of heme. On the other hand, CoPPIX did not interfered on proliferation. Furthermore, we showed through immunoblotting, using an anti-HO-1 monoclonal antibody, an increase in the protein expression in heme-treated epimastigotes. Differently of described HO-1 that has a mass molecular of a 32 kDa, we showed a 45 kDa protein, the only band recognize by the HO-1 antibody. HO-1 expression analysis in the presence of CoPPIX, SnPPIX and biliverdin, showed that only CoPPIX was able to modulate its expression level. Ultrastructural immunocytochemistry analysis suggests a higher expression of the enzyme in heme-treated epimastigotes, and that T. cruzi HO-1 might have a dual distribution, since the anti-HO-1 antibody labeled both cytosol and glycosomes. In order to investigate the T. cruzi HO-1 gene sequence, we isolated genomic DNA from T. cruzi for PCR amplification using primers designed as from the parasite genome. Unfortunately, the two pairs of the designed oligonucleotides tested were unable to amplify a sequence equivalent to a HO-1. In order to isolate the target protein, immunoprecipitation was performed and subsequently immunoblotted with anti-HO-1 antibody. The immunocomplex level was two-fold higher in heme-treated cells. Following the attempt to identify a HO-1 in T. cruzi, we used mass spectrometry from unidimensional electrophoresis. We showed a significant protein profile modification in heme-treated epimastigotes, but further experiments will be necessary, such as mass spectrometry from bidimensional electrophoresis, for identification of the target protein

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Medicina, Programa de Pós-Graduação em Patologia Molecular, 2016. / Submitted by Fernanda Percia França (fernandafranca@bce.unb.br) on 2016-06-28T16:26:07Z No. of bitstreams: 1 2016_AlineSilvaMoraes.pdf: 1493539 bytes, checksum: 3d4a2d5c7ca444ed6c0872b841d411bb (MD5) / Approved for entry into archive by Raquel Viana(raquelviana@bce.unb.br) on 2016-07-15T12:05:08Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2016_AlineSilvaMoraes.pdf: 1493539 bytes, checksum: 3d4a2d5c7ca444ed6c0872b841d411bb (MD5) / Made available in DSpace on 2016-07-15T12:05:08Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2016_AlineSilvaMoraes.pdf: 1493539 bytes, checksum: 3d4a2d5c7ca444ed6c0872b841d411bb (MD5) / A doença de Chagas é considerada uma das principais endemias da América Latina, existindo cerca de oito milhões de pessoas infectadas com o Trypanosoma cruzi em todo o mundo, principalmente na América Latina. A associação entre a transferência gênica lateral de minicírculos de kDNA do T. cruzi para o genoma hospedeiro e o surgimento de manifestações clínicas da doença de Chagas está descrita na literatura. Entretanto os mecanismos que levariam ao desenvolvimento das reações autoimunes ainda precisam ser elucidados. No presente estudo, desenvolveu-se um protocolo de PCR quantitativa (qPCR) que permitiu a quantificação das integrações de minicírculos de kDNA de T. cruzi no genoma do hospedeiro, confirmando, dessa forma, a transferência dos minicírculos ao genoma de célula hospedeira. Verificou-se que há um acúmulo das integrações ao longo do tempo em células J774.A1. À medida que ocorre a inserção dos minicírculos de kDNA no genoma hospedeiro, observa-se alteração da temperatura de dissociação das amostras, indicando mudança na composição ou no tamanho dos fragmentos integrados. De fato, a clonagem e o sequenciamento dos amplicons demonstrou o truncamento da região variável do kDNA. O Benznidazol é capaz de eliminar a infecção, porém não previne a integração e o acúmulo das sequências de kDNA. Já o AZT, droga inibidora de retrotransposição, mostra-se efetivo no controle dos eventos de integração. Os experimentos in vivo corroboraram os achados in vitro, demonstrando uma maior quantidade de integrações em animais que se encontravam na fase crônica da doença de Chagas. Outros estudos são necessários para determinar o papel do acúmulo de integrações de kDNA e a severidade das manifestações clínicas. Entretanto, o real significado de tais mutações não fica restrito à doença de Chagas, mas, sim, estende-se ao longo do processo da evolução, em que a aquisição de DNA exógeno ajudaria a impulsionar um fluxo genético introdutor de complexidade crescente às espécies. / Chagas' disease is considered a major endemic disease in Latin America, and there are approximately eight million people infected with Trypanosoma cruzi worldwide, especially in Latin America. The association between lateral gene transfer of T. cruzi kDNA minicircle into host genome and the onset of clinical manifestations of Chagas disease is described in the literature. However, the mechanisms that lead to autoimmune reactions are to need to be elucidated. In the present study, we have developed a protocol quantitative PCR (qPCR), which permitted quantitation of kDNA minicircle integrations T. cruzi into the host genome, confirming thus the transfer of the minicircle into the genome of the host J774.A1 cells. It was found that there is an accumulation of integrations over time J774.A1 cells. As kDNA insertions occur, there is change in melting curve, indicating change in composition or size of the integrated fragments. In fact, cloning and sequencing of amplicons showed loss of nucleotides in kDNA variable region. Benznidazole is able to eliminate the infection, but does not prevent the integration and accumulation of kDNA sequences. AZT, an inhibitory drug for retro transposition, shows to be effective in controlling integration events. In vivo experiments confirmed in vitro findings, showing a greater amount of integrations in animals that were in the chronic phase of Chagas disease. Further studies are needed to determine the role of kDNA accumulation in severity of clinical manifestations. However, the real significance of such date is not restricted to Chagas disease, but rather extends throughout the evolutionary process, where the acquisition of exogenous DNA would help boost a genetic flow introducing higher complexity to species.

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:23:01Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2005-02-24Bitstream added on 2014-06-13T20:29:39Z : No. of bitstreams: 1 ambrosio_dl_me_arafcf.pdf: 2442154 bytes, checksum: cc3386b51bef3a73071ee6043f88fc0e (MD5) / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / Universidade Estadual Paulista (UNESP) / Alguns fatores importantes no funcionamento das células eucarióticas correspondem à pequenos complexos de RNA e proteínas; essas partículas de ribonucleoproteínas (UsnRNPs) têm um papel essencial no processamento do pré-mRNA, principalmente durante o splicing (corte de íntrons e união de éxons). Embora as snRNPs estejam definidas em mamíferos, ainda não estão bem caracterizadas em certos tripanosomatídeos como o Trypanosoma cruzi. Assim, este trabalho propôs a caracterização molecular dos snRNAs (U2, U4, U5 e U6), por PCR e RT-PCR de formas epimastigotas de T. cruzi (cepa Y). Essas seqüências amplificadas foram clonadas, seqüenciadas e comparadas entre os tripanosomatídeos e o alinhamento múltiplo apresentou mais de 70% de identidade, exceto da U5 snRNA, que se mostrou menos conservada. Árvores filogenéticas mostraram a proximidade evolutiva dos snRNAs analisados em Trypanosoma brucei e Trypanosoma cruzi. As respectivas estruturas secundárias foram preditas, confirmando-se também as semelhanças com aquelas de T. brucei. O alinhamento das snRNAs de T. cruzi com as seqüências de Homo sapiens mostrou regiões únicas em U2, U4 e U5 snRNAs, nessa espécie, enquanto U6 mostrou-se fortemente conservada. Até o momento, ainda não foi possível a obtenção da seqüência completa de U1 snRNA de T. cruzi. / Some important factors in functioning of the eucariotic cells are the small complexes of RNA and proteins; these particles of ribonucleoproteins (UsnRNPs) have an essential role in the pre-mRNA processing, mainly during splicing (cut of introns and union of exons). Even though they are well defined in mammals, snRNPs are still not characterized in certain Trypanosomatids, as well, Trypanosoma cruzi. So, this work proposed the molecular characterization of the snRNAs (U2, U4, U5 and U6), by PCR and RT-PCR with T. cruzi epimastigote forms (Y strain). These amplified sequences were cloned, sequenced and compared among the Trypanosomatids and the multiple alignment presented more than 70% of identity, except for U5 snRNA, which showed less conserved. Phylogenetic trees showed the evolutionary proximity between the Trypanosoma brucei and Trypanosoma cruzi snRNAs analysed. The respective secondary structures were predicted and also confirmed similarity with T. brucei. The alignment of T. cruzi snRNAs with Homo sapiens sequences showed unique regions in U2, U4 and U5 snRNAs in this species, while U6 was strongly conserved. Until this moment, it was not still possible to obtain U1 snRNA of T. cruzi complete sequence.