A importância de aminoácidos em tripanossomatídeos vai além da síntese de aminoácidos, envolvendo processos tais como a diferenciação, osmorregulação e metabolismo energético. A disponibilidade dos aminoácidos envolvidos nestas funções depende, entre outras coisas, de seu transporte na célula. Aqui, caracterizamos o transporte de glutamato e GABA do parasita protozoário humano Trypanosoma cruzi. No transporte de glutamato dados cinéticos amostram um único sistema saturável com uma Km de 0.30 mM e uma velocidade máxima de 98.34 pmoles min-1 per 2 x 107 células para epimastigotas é 20 pmoles min-1 per 2 x 107 células para trypomastigotas, e uma Vmax de 84.45 pmoles/min/20x106 células com uma Km de 0.4 mM para o sistema de transporte de GABA. O transporte não apresentou alterações em condições de jejum de até 3 horas. Aspartato, alanina, glutamina, asparagina, metionina, oxaloacetato é alfa-cetoglutarato competiram com o substrato em concentrações dez vezes em excesso na incorporação de glutamato. Interessantemente, o transporte de glutamato aumentou fortemente na presença de GABA. O transporte de glutamato foi fortemente dependente do pH, mas não de concentrações de Na+ e K+ no meio extracelular, e o transporte de GABA foi fortemente dependente de K+. Estes dados foram consistentes com uma sensibilidade do sistema de transporte a um ionóforo (FCCP), sugerindo que o transporte é levado por um gradiente de concentração de H+ na membrana plasmática nos dois sistemas de transporte. O transporte de glutamato e GABA aumentou linearmente com a temperatura na faixa de 15 a 40o C. / The role of amino acids in trypanosomatids goes beyond protein synthesis, involving processes such as differentiation, osmoregulation and energy metabolism. The availability of the amino acids involved in those functions depends, among other things, on their transport into the cell. Here we characterize a glutamate transporter and GABA transport from the human protozoan parasite Trypanosoma cruzi. In the glutamate transport, data kinetics show a single saturable system with a Km of 0.30 mM and a maximum velocity of 98.34 pmoles min-1 per 2 x 107 cells for epimastigotes and 20 pmoles min-1 per 2 x 107 cells for trypomastigotes, and, a Vmax de 84.45 pmoles/min/20x106 cells and a Km of 0.4 mM for GABA transport system. Transport was not affected by parasite nutrient starvation for up to 3h in the two transport system. Aspartate, alanine, glutamine, asparagine, methionine, oxaloacetate and alpha-ketoglutarate competed with the substrate in 10-fold excess concentrations in the glutamate incorporation. Interestingly, the glutamate transport was strongly increased in the presence of GABA. Glutamate uptake was strongly dependent on pH, but not on Na+ or K+ concentrations in the extracellular medium, and the GABA transport was strongly dependent of K+. These data were consistent with the sensitivity of the system to the H+ ionophore carbonyl cyanide p-trifluoromethoxyphenylhydrazone, suggesting that transport is driven by H+ concentration gradient across the cytoplasm membrane in two transport systems. The glutamate and GABA transport increased linearly with temperature in a range from 15 to 40 degrees C.

As doenças negligenciadas são conseqüências marcantes do subdesenvolvimento que atinge diversas regiões do planeta. Dentre estas, destaca-se a Doença de Chagas, causada pelo parasita Trypanosoma cruzi, a qual afeta aproximadamente um quarto da população da América Latina e para qual os fármacos utilizados apresentam baixa eficácia, toxidez e sérios efeitos colaterais. Este quadro é agravado pela emergência de cepas resistentes, o que indica a grande necessidade de desenvolvimento de novos agentes quimioterápicos contra esta doença. A enzima gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase (GAPDH) da via glicolítica do T. cruzi é um alvo macromolecular interessante devido ao seu papel essencial no metabolismo de tripanossomatídeos. Constitui o objetivo desta tese o desenvolvimento, a padronização e a validação de ensaios enzimáticos para a realização de extensivas triagens bioquímicas de modo a contribuir para a identificação de novos inibidores da GAPDH pertencentes a diversas classes químicas. Os compostos estudados são provenientes de síntese orgânica e de complexos inorgânicos de Rutênio, bem como de origem natural. Paralelamente, a realização do ensaio virtual em larga escala a partir de uma base de dados dirigida e da estrutura da GAPDH de T. cruzi resultou na identificação de um inibidor inédito da proteína alvo. Estudos do mecanismo de ação enzimático levaram à elucidação da modalidade de alguns inibidores identificados nesse estudo. / Parasitic diseases are a major global cause of illness, long-term disability, and death, with severe socio-economic consequences for millions of people worldwide. In Latin America, nearly one fourth of the population is infected by Trypanosoma cruzi, the causative agent of Chagas disease. The limited existing drug therapies suffer from a combination of drawbacks including poor efficacy, resistance and serious side effects. Therefore, there is an urgent need for new drugs that can overcome resistance and are safe and effective for use in human. The crucial dependence on glycolysis as a source of energy makes the glycolytic parasite enzymes promising targets for drug design. In this context, the enzyme glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (GAPDH) was identified as an attractive target for drug design. The development of standard enzymatic assays combined with extensive biological screening was the aim of this work and it has been contributing for the identification of novel GAPDH inhibitors. These compounds belong to several chemical classes from different sources, including organic synthesis, inorganic complexes and natural products. In addition, a virtual screening approach was applied in a focused database, previously filtered by drug-like properties, in order to identify new hits. This strategy resulted in the discovery of a novel scaffold with significant inhibitory activity against T. cruzi GAPDH. Kinetic and inhibition assays were conducted to shed light on the mechanism of action of the promising inhibitors.

A doença de Chagas é causada pelo protozoário flagelado Trypanosoma cruzi e foi descoberta em 1909 por Carlos Chagas. A doença atinge cerca de 18 milhões de indivíduos na região das Américas, causando 50.000 mortes ao ano e deixando mais de 100 mil pessoas sob risco de infecção. Os tratamentos disponíveis foram desenvolvidos ainda na década de 70 apresentando baixa eficácia e fortes efeitos colaterais. Assim, é extremamente importante o desenvolvimento de novos fármacos mais seguros e eficazes para o tratamento da doença de Chagas. Uma importante estratégia que pode ser utilizada para o planejamento de novas moléculas bioativas é o planejamento baseado em um receptor-alvo. Nessa tese o alvo em estudo é a enzima gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase (GAPDH) que faz parte da via glicolítica do protozoário T. cruzi. Este trabalho compreendeu os estudos estruturais e mecanísticos de quatro complexos cristalográficos da GAPDH na presença de ligantes diferentes. As estruturas obtidas subsidiaram estudos que forneceram informações importantes no planejamento de novos inibidores. Foi elucidado o modo pelo qual os compostos alquilantes iodoacetamida e iodoacetato atuam causando a inativação enzimática e as diferenças existentes nesse processo foram esclarecidas, mostrando que é necessária a expulsão do NAD+ do sítio ativo para que a inativação ocorra por parte do iodoacetamida. Além disso, o mecanismo de nitrosilação por complexos de rutênio foi investigado fornecendo informações que contribuem para o entendimento do mecanismo de inibição enzimática por parte dessa classe compostos. Além disso, a partir de um dos complexos estruturais obtidos, foi possível identificar a localização de um novo sítio alostérico que se forma na superfície da proteína. Essa informação é extremamente importante, pois abre novas perspectivas para o planejamento de novos inibidores mais potentes e seletivos da enzima GAPDH de T. cruzi. / Chagas disease, caused by Trypanosoma cruzi protozoan, was discovered in 1909 by Carlos Chagas. The disease affects about 18 million people in the American region, causing 50,000 deaths per year, leaving more than 100 thousand people at risk of infection. Available treatments developed in the 70 decade present low efficiency and strong side effects. Thus, it is extremely important the development of new drugs that safer and more effective. An important strategy used for the design of new bioactive molecules is based on a macromolecular target. The goal of this thesis is to study the glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (GAPDH), an enzyme that participates of the glycolytic pathway of the parasite T. cruzi. This work comprised structural and mechanistic studies of four complex crystallographic GAPDH in the presence of different ligands. The structures obtained subsidized structural and mechanistic studies that provided important information for the design of new inhibitors. It was clarified the way in which the alkylating agents iodoacetamide and iodoacetate acts causing enzyme inactivation and the differences in this process were resolved, showing that it is necessary the NAD+ is excluded of the active site wherefore the inactivation occurs by the iodoacetamide. Moreover, the mechanism of enzyme nitrosylation by ruthenium complexes was investigated, providing information that contributed to the understanding of the mechanism of enzyme inhibition by this class of compounds. Moreover, from the structural complexes obtained, it was possible to identify the location of a new allosteric site formed at the surface of the protein. This information is extremely important, because it opens new perspectives for the design of new inhibitors that are more potent and selective for the enzyme GAPDH of T. cruzi.

Orientador: Silmara Marques Allegretti / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-23T21:11:56Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Teodoro_AnnaKarollinaMenezes_M.pdf: 4367892 bytes, checksum: ee9aded885185f6f74b60fa635f80ecc (MD5) Previous issue date: 2013 / Resumo: Os gambás do gênero Didelphis (Marsupialia, Didelphimorphia), são animais sinantrópicos, cuja dieta generalista os predispõe a infecções por endoparasitas. Tal fato, agravado pela presença cada vez mais frequente dos mesmos em área urbana e periurbana os torna potenciais hospedeiros e veiculadores de protozoários e helmintos. O gênero já foi descrito albergando diferentes tipos de parasitos, incluindo espécies potencialmente zoonóticas, sendo necessários novos estudos para uma melhor compreensão do mesmo e suas relações com os ciclos de vida dos parasitos. Para isso, a presente pesquisa teve por objetivo estudar os parasitos intestinais e sanguíneos em Didelphis spp. capturados em área urbana pelo Serviço de Controle de Zoonoses, de janeiro de 2010 a janeiro de 2013, e em fragmentos de mata ciliar associados à Bacia do Rio Capivari, no município de Monte Mor, São Paulo (22o56'48" latitude sul, 47o18'57" longitude oeste), de junho de 2011 a maio de 2012. Os espécimes capturados foram medidos, pesados, marcados, fotografados, avaliados clinicamente, registrados e identificados para verificar a duplicidade de capturas. Foram coletadas amostras de sangue e fezes para pesquisa de parasitos intestinais e sanguíneos, bem como fragmentos teciduais para avaliação biomolecular. Foram capturados pelo Serviço de Controle de Zoonoses de Monte Mor, 46 animais da espécie D. albiventris, dos quais 17 foram necropsiados. Neste período 02 animas foram recapturados, sendo 01 deles por 02 vezes, gerando assim um total de 49 capturas realizadas pelo serviço durante o estudo. Em coletas com armadilha, foram obtidos 02 animais da espécie D. aurita e 08 D. albiventris, sendo 01 deles recapturado uma vez, totalizando 11 capturas em área de mata. Em análise do conteúdo fecal, constatou-se que 77,6% das amostras foram positivas para parasitos do filo Nematoda, das quais Cruzia tentaculata foi o ovo mais comumente encontrado, 34,5% para parasitos da classe Trematoda e 32,7% para protozoários, não sendo encontrados parasitos da classe Cestoda. Dos animais necropsiados, 08 albergavam parasitos no sistema gastrintestinal, destaque para estômago e intestino, 08 não albergavam nenhum tipo de parasito e 01 não se pode determinar parasitismo devido ausência de algumas vísceras, decorrente de ataque por cão. Os helmintos adultos identificados foram Cruzia tentaculata, Rhopalias coronatus, Viannaia sp., Travassostrongylus sp., Turgida turgida e Aspidodera raillieti. Dois animais da espécie D. aurita foram encontrados naturalmente infectados por Trypanosoma cruzi, sendo as formas tripomastigotas visualizadas nos esfregaços sanguíneos e a positividade confirmada por meio de PCR dos fragmentos teciduais. Em análise molecular, um animal D. albiventris capturado em área de mata também foi identificado como positivo para DNA de Leishmania spp., demonstrando a necessidade de novos estudos no município / Abstract: Opossums of the genus Didelphis (Marsupialia, Didelphimorphia) are synanthropic animals, whose generalist diet predisposes to infections with endoparasites. This fact, exasperated by the even higher frequency in urban and periurban areas, makes them potential host and carriers of protozoans and helminths. The genus has been described harboring differents parasite, including potentially zoonotic species, and more studies are necessary for a better understanding of it and its relationship to the parasites life cycles. The present research aimed to study the intestinal and blood's parasites in Didelphis spp. captured in an urban area by the Zoonosis Municipal Control Service, January 2010 to January 2013, and fragments of riparian associated to the Capivari river basin, in the municipality of Monte Mor, São Paulo (22º56'48"south latitude, 47º18'57" west longitude), from June 2011 to May 2012. Captured specimens were measured, weighed, tagged, photographed, clinically evaluated, recorded and identified to verify duplicity catching. Blood and stool samples were collected for research of parasites and blood and tissue samples for biomolecular evaluation. Forty six animals of the species D. albiventris were captured by the Zoonoses Control Service of Monte Mor, which 17 were necropsied. Two animals were recaptured, and one of them twice, generating a total of 49 catches for the service during the study. Samples collected with trapping resulted in 02 animals of D. aurita and 08 species of D. albiventris, one of them being recaptured once, totaling 11 catches in the forest area. In fecal analysis, 77.6% of samples were positive for parasites of the phylum Nematoda, which Cruzia tentaculata was the most common egg found, 34.5% for the class Trematoda parasites and 32.7 % for protozoans, no parasites of the class Cestoda has been found. The necropsy results, 08 harbored parasites in the gastrointestinal system, especially stomach and intestine, 08 weren't harboring any sort of parasite and 01 could not be determined because of lack of some organs due to the attack by dogs. Helminths adults were identified as Cruzia tentaculata, Rhopalias coronatus, Viannaia sp., Travassostrongylus sp., Turgida turgida and Aspidodera raillieti. Two animals of the species D. aurita were found naturally infected by Trypanosoma cruzi, with trypomastigotes visualized in blood smears and confirmed positive by PCR technique from tissue samples. Molecular analysis in an animal D. albiventris captured in the forest area, was also identified positive for DNA of Leishmania spp., demonstrating the need for further studies in the municipality / Mestrado / Parasitologia / Mestra em Parasitologia

Orientador: Fernanda Ramos Gadelha / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-20T03:23:03Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Peloso_EduardodeFigueiredo_D.pdf: 2969065 bytes, checksum: 6920a8df71d5ab432dce07d0beb2e5eb (MD5) Previous issue date: 2012 / Resumo: O Trypanosoma cruzi é o agente etiológico da doença de Chagas para a qual não há vacina e os tratamentos disponíveis têm eficácia limitada, sendo agravada pela heterogeneidade das cepas do parasita. Na busca por novos alvos terapêuticos, destaca-se o sistema antioxidante do parasita. As proteínas desse sistema como as triparedoxinas peroxidases citosólica e mitocondrial e as superóxido dismutases A e B (TcCPx, TcMPx, SODA e SODB, respectivamente) são fundamentais para a sobrevivência do parasita. Neste sentido, analisou-se o envolvimento da TcCPx e TcMPx na bioenergética mitocondrial de T. cruzi que superexpressavam estas enzimas (CPx e MPx, respectivamente) e também em células controle (pTEX), bem como a expressão dessas enzimas e das SODA e SODB, a liberação de H2O2 e a produção de O2 .- ao longo da curva de proliferação nas cepas Tulahuen 2 e Y. Paralelamente, foi verificado o nível de expressão da TcCPx e TcMPx na forma tripomastigota de cultura sob incubação com H2O2, tanto intracelularmente quanto no meio de incubação e a expressão dessas enzimas comparada com a da forma epimastigota. Em relação à CPx e MPx, foi possível observar que na CPx há um aumento na expressão da TcMPx, e a mesma correlação para a MPx foi observada. Diferenças na liberação de H2O2 entre CPx e MPx foram detectadas apenas quando a cadeia respiratória mitocondrial foi inibida. A MPx teve maiores taxas de consumo de oxigênio do que a pTEX e CPx, entretanto em todas as células, o potencial de membrana mitocondrial e os níveis de ATP foram similares. Em relação às cepas Tulahuen 2 e Y, diferenças foram observadas em relação à liberação de H2O2 e produção de O2.- não somente entre as cepas, mas também ao longo da curva de proliferação. Todas as enzimas estudadas nessas cepas variaram sua expressão em função do tempo em cultura. Contudo, na cepa Y, o nível de expressão de todas as enzimas foi menor do que da Tulahuen 2, exceto para a SODA. Em relação à forma tripomastigota, tanto a TcCPx quanto a TcMPx tiveram padrões de expressão similares, com um aumento em baixas concentrações (10?M) seguido por uma redução até concentrações maiores de H2O2. No sobrenadante do meio de incubação a TcMPx não foi detectada, contudo a TcCPx foi e em níveis que aumentaram concomitantemente com a redução da sua expressão no compartimento intracellular. Adicionalmente, o nível de expressão de ambas peroxiredoxinas foi maior na forma tripomastigota em relação à epimastigota. Devido a um leve desacoplamento observado nas MPx, a presença ou indução de um transportador na membrana mitocondrial é sugerido quando a TcMPx é expressa em maiores níveis. Além disso, houve uma modulação das enzimas antioxidantes ao longo da curva de proliferação e entre as diferentes cepas, formas do parasita e tratamento com H2O2. Dada a importância das espécies reativas de oxigênio na sinalização redox do parasita, a expressão diferencial das enzimas antioxidantes nos diferentes parâmetros analisados sugere que as mesmas desempenham diversos papéis na sobrevivência, proliferação e diferenciação do parasita / Abstract: Trypanosoma cruzi is the etiologic agent of Chagas disease, which has no vaccine and the available treatments have limited efficacy that is aggravated by the heterogeneity of parasite strains. In the search for new therapeutic targets, the antioxidant system of the parasite has attracted attention. The proteins of this system such as the cytosolic and mitochondrial tryparedoxin peroxidases and superoxide dismutases A and B (TcCPx, TcMPx, SODA and SODB, respectively) are essential for parasite survival. In this sense, analysis of the involvement of TcCPx and TcMPx in the mitochondrial bioenergetics in T. cruzi overexpressing these enzymes (CPx and MPx, respectively) and also in control cells (pTEX) as well as the expression of these enzymes and SODA and SODB, H2O2 release and O2 .- production along the growth curve in two strains Tulahuen 2 and Y were performed. In parallel, the expression level of TcCPx and TcMPx was determined in tissue culture-derived trypomastigotes under incubation with H2O2, both intracellularly and in the incubation medium and the expression of these enzymes compared to the epimastigote form. Regarding CPx and MPx, it was observed that in CPx the expression of TcMPx was increased, and the same correlation was observed for MPx. Differences in H2O2 release between CPx and MPx were detected only when the mitochondrial respiratory chain was inhibited. MPx had higher oxygen consumption rates than pTEX and CPx, however in all cells, the mitochondrial membrane potential and ATP levels were similar. Regarding Tulahuen 2 and Y strains, differences were observed in relation to H2O2 release and O2.- production not only between strains but also along the growth curve. All the enzymes studied in these strains varied their expression in function of time in culture. However, in the Y strain, the expression level of all enzymes was lower than Tulahuen 2, except for SODA. Regarding trypomastigotes, not only TcCPx but also TcMPx had similar expression patterns, with an increasing in lower concentrations (10?M) followed by a reduction till higher H2O2 concentrations. In the supernatant of the incubation medium TcMPx was not detected, but TcCPx was detected and its levels increased concomitantly with the reduction in its expression in the intracellular compartment. Additionally, the level of expression of both peroxiredoxinas was higher in trypomastigote compared to epimastigote. Because of the mild uncoupling observed in MPx, the presence or induction of a carrier in the mitochondrial membrane is suggested when the TcMPx is expressed at higher levels. In addition, there was a modulation of the antioxidant enzymes along the growth curve and between different strains, forms of the parasite and treatment with H2O2. Given the importance of reactive oxygen species in parasite redox signaling, the differential expression of the antioxidant enzymes in the different parameters analyzed suggests that they play different roles in the survival, proliferation and differentiation of the parasite / Doutorado / Bioquimica / Doutor em Biologia Funcional e Molecular

Duas linhagens filogenéticas principais (LI e L2) foram definidas em Trypanosoma cruzi, com base em sequências de genes de rDNA e mini-exon e análise por RAPD (Souto et al. 1996). Neste trabalho investigamos a estrutura e atividade dos promotores do cistron ribossômico das duas linhagens de T. cruzi. O promotor da cepa Dm28 (L2) foi clonado e sua seqüência foi comparada com seqüências publicadas da região homóloga de CL (L1) e La Cruz (L2). A identidade entre os dois promotores de L2 foi de 98%, e entre estes e o de L1 foi de 82%. O ponto de início de transcrição foi mapeado, apresentando a mesma localização nas duas linhagens. A atividade dos promotores de L1 e L2 foi determinada em construções plasmidiais contendo o gene reporter da cloranfenicol acetil transferase (CAT). Experimentos de expressão transitória mostraram que o promotor de L1 foi funcional apenas em isolados de L1, enquanto que o promotor de L2 foi funcional em ambas as linhagens. A expressão do promotor de L2 em isolados de L1 foi maior do que a do promotor homólogo. Analisamos ainda a atividade dos dois promotores em um grupo de isolados que apresentam dois tipos de cistrons ribossômicos (grupo 1/2). Neste grupo de cepas observamos que ambos os promotores presentes nas construções são funcionais, embora o promotor de L2 induza maior expressão de CAT. Por outro lado, demonstramos que nestes isolados apenas o cistron ribossômico de tipo 2 é expresso in vivo. Neste trabalho analisamos ainda a eficiência de entrada das construções plasmidiais nas cepas de T. cruzi; caracterizamos a atividade de regiões do promotor de L2 e a eficiência do processo de \"trans-splicing\" para gerar mRNA de CAT contendo a seqüência de mini-exon na extremidade 5\'. / Two major phylogenetic lineages (L1 and L2) have been defined in Trypanosoma cruzi based on rDNA and mini-exon sequences and RAPD analysis (Souto et al., 1996). In the present work we have investigated the structure and activity of ribosomal RNA promoters from the two T. cruzi lineages. The promoter region of Dm28 strain (L2) was cloned and its sequence was compared with the homologous regions from the CL (L1) and La Cruz (L2) strains, whose sequences were previously published. The identity found between promoters of the two L2 strains was 98%, while the identity between L2 and L1 promoters was 82%. The transcription start point mapped in the two Lineages showed the same localization. The activity of L1 and L2 promoters was investigated through the use of plasmid constructs bearing bacterial chloramphenicol acetyl transferase (CAT) as reporter gene. Experiments of transient expression showed that the L1 promoter drove high CAT activity in L1 isolates, but essentially no activity in L2 strains. On the other hand, L2 promoter was functional in both Lineages. The expression driven by L2 promoter in L1 isolates was higher than that driven by the homologous promoter. We have also analysed the activity of both L1 and L2 promoters in a particular group of T. cruzi isolates (group 1/2) which contains two types of rRNA cistrons. It was observed that both promoters were functional in this group of strains, although L2 promoter drove higher CAT activity. This is an interesting result since we have shown that in group 1/2 isolates only the type 2 rRNA cistron is expressed in vivo. In the present study, we have also analysed the transfection efficiency of the plasmid constructs in T. cruzi strains; the activity of segments of the L2 promoter; and the efficiency of the \"trans-splicing\" process involved in the generation of mature CAT mRNA containing the mini-exon sequence at the 5\' end.

A doença de Chagas representa um importante problema para a Saúde Publica na América Latina, onde o tratamento é limitado principalmente na fase crônica. Mesmo controlando a replicação parasitária, a completa eliminação do parasita e a cura da doença não são observadas de forma consistente. A ativação do eixo adrenal-hipotálamo-hipófise possui um papel importante na supressão do sistema imune. Neste trabalho foram observados os efeitos do estresse repetitivo em ratos Wistar infectados com a cepa Y de Trypanosoma cruzi durante as fases aguda e crônica da doença experimental, através da exposição dos animais a vapores de éter por um minuto duas vezes ao dia. O estresse repetitivo provocou aumento do número de parasitas e a administração de DHEA reduziu significantemente a parasitemia durante a fase aguda. A resposta TH-1 foi mais vigorosa em animais submetidos à terapia com DHEA mesmo quando submetidos ao estresse repetitivo. Assim TNF-, IFN-, IL-2, NO e linfoproliferação mostraram concentrações mais elevadas quando comparadas aos animais não submetidos à terapia. A resposta TH-2 nos grupos sem suplementação com DHEA, IL-4 e IL-10 apresentaram valores reduzidos nos animais infectados e estressados submetidos à terapia com DHEA. A concentração de corticosterona mostrou-se elevada para animais estressados e infectados em relação aos animais submetidos a terapia com DHEA. A histopatologia apresentou redução no número de neurônios nas fases aguda e crônica para os animais estressados e infectados, os mesmos apresentaram desorganização tecidual cardíaca com aumento do número de ninhos de amastigotas e moderado processo inflamatório por células mononucleares. Estes resultados sugerem que o estresse repetitivo pode ser considerado como ii fator importante durante o desenvolvimento da doença de Chagas experimental, aumentando sua patogênese através de distúrbios do sistema imune do hospedeiro. / Chagas disease represents an important public health problem in Latin American, where the treatment is limited especially to chronic phase, besides the harmful side effects. Although controlling the parasite replication, the complete elimination of the etiologic agent still was not observed. Activation of the hypothalamuspituitaryadrenal axis plays a major role in the suppression of the immune system. We have investigated the effects of repetitive stress on Wistar rats infected with the Y strain of Trypanosoma cruzi during the acute and chronic phases of the experimental disease by the exposure to ether vapor for one minute twice a day. Repetitive stress resulted in an elevated number of circulating parasites and DHEA administration reduced significantly blood parasites during the acute phase. Several immunological parameters were evaluated. TH-1 response was more vigorous in animals submitted to DHEA therapy even those which underwent repetitive stress. So, TNF-, IFN-, IL-2, NO and lymphoproliferation displayed enhanced concentrations as compared to unsupplied animals. The TH-2 immune response in groups without DHEA supplementation, showed reduce values for IL-4 and IL-10 in groups infected and stressed submitted to DHEA therapy. Enhanced corticosterone concentration was a observed for infected and stressed animals. DHEA triggered reduced levels of corticosterone. The histopathology revealed that stressed animals showed a reduction in the number of neurons. Histological sections of heart smears from infected and stressed animals displayed deep tissue disorganization, increased parasite burdens and moderate diffused mononuclear inflammatory process. These results suggest that repetitive stress could be considered an iv important factor during development of experimental Chagas disease, enhancing pathogenesis through disturbance of the hosts immune system.

A galectina-1 (Gal-1) é uma proteína que reconhece ?-galactosídeos e participa de vários processos biológicos, incluindo a modulação da resposta imunológica. Vários relatos da literatura reportam o potencial uso terapêutico da Gal-1 para doenças auto-imunes, inflamatórias e infecciosas. Entretanto, são escassos os relatos sobre o envolvimento da Gal-1 na infecção causada por Tripanosoma cruzi. Neste trabalho foi avaliada a participação da Gal-1 endógena e a administração de Gal-1 exógena na evolução da infecção aguda induzida experimentalmente por T. cruzi. Foram realizados experimentos in vivo e/ou in vitro com o uso de Gal-1 recombinante humana, camundongos C57BL/6 deficientes do gene da Gal-1 (Gal-1 KO, knock-out) ou do gene Toll Like Receptor 4 (TLR-4 KO, knock-out) e selvagens (WT, wild type), além de seus macrófagos. A forma de T. cruzi utilizada foi a tripomastigota da cepa Y. Os parâmetros analisados na caracterização do processo de infecção foram: i) parasitemia e sobrevivência de animais; ii) histopatologia do tecido cardíaco; iii) imunofenotipagem de leucócitos; iv) dosagem de citocinas; v) determinação de taxas de invasão e liberação de parasitas a partir de células infectadas; vi) produção de óxido nítrico por macrófagos. A Gal-1 e/ou anticorpos anti-glicopeptídeos miméticos de mucina de T. cruzi ligam-se à glicanas da superfície deste parasita e impedem sua invasão em fibroblastos e sua captura por macrófagos. O tratamento de macrófagos infectados com Gal-1 reduz a liberação de parasitas e aumenta a produção de óxido nítrico (NO) por um mecanismo, aparentemente, independente da sinalização via TLR-4. Os camundongos KO Gal-1 e os WT tratados com Gal-1 exógena apresentaram as menores taxas de parasitemia, sendo que os primeiros são mais resistentes à infecção aguda por T. cruzi. A ausência da Gal-1 endógena nos animais infectados provocou vários efeitos como a redução no infiltrado inflamatório e carga parasitária no tecido cardíaco, níveis séricos elevados de citocinas (IL-2, IL-4, IL-6, IL-10 e IL-17A), menor porcentagem de linfócitos T CD4+ e maior de T CD8+ no coração dos animais, aumento do influxo de neutrófilos na cavidade peritoneal e no coração. Com base nesse conjunto de resultados sugerimos que a ausência de Gal-1 endógena ou o tratamento de animais com Gal- 1 exógena promoveram perfis imunológicos (resposta inata e adaptativa) favorecedores da resolução da infecção experimental aguda por T. cruzi / Galectin-1 (Gal-1) is a protein that recognizes ?-galactosides and participates in many biological processes, including the modulation of the immune response. Several reports in the literature show the potential therapeutic use of Gal-1 to autoimmune, inflammatory and infectious diseases. However, there are few reports on the involvement of Gal-1 on infection caused by Trypanosoma cruzi. Here, we evaluated the involvement of endogenous Gal-1 and Gal-1 administration of exogenous in the development of acute experimental infection by T. cruzi. Recombinant human Gal-1, C57BL/6 mice deficient for Gal-1 gene (Gal-1 KO, knockout) or for Toll like receptor 4 gene (TLR-4 KO, knock-out) or C57BL/6 wild type mice (WT), and macrophages from these animals were used in experiments in vivo and / or in vitro. The form of T. cruzi used in this work was trypomastigotes from Y strain. The analyzed parameters characterizing the process of infection were: i) parasitemia and survival of animals; ii) histopathology of cardiac tissue; iii) leucocyte immunophenotyping; iv) cytokine assay; v) determination of invasion and release rates of parasites from infected cells; vi) nitric oxide production by macrophages. The Gal-1 and / or antibodies anti- glycopeptides that mimics T. cruzi mucin bind to glycans on the surface of this parasite and prevent invasion of the parasite in fibroblasts and its capture by macrophages. Treatment of infected macrophages with Gal-1 promotes a lower release of parasites and increased production of nitric oxide (NO) by these phagocytes, and this production of NO is independent of TLR-4 signaling pathway. The Gal-1 KO mice and WT mice treated with exogenous Gal-1 had the lowest rates of parasitemia and the first group is more resistant to acute infection with T. cruzi. The absence of endogenous Gal-1 in infected animals caused various effects such as a reduction in the inflammatory infiltrate and the parasite load in the cardiac tissue, elevated serum levels of cytokines (IL-2, IL-4, IL-6, IL-10 and IL- 17A), a lower percentage of T CD4+ and increased T CD8+ the hearts of animals, increased influx of neutrophils into the peritoneal cavity and heart tissue. Based on this set of results we suggest that the absence of endogenous Gal-1 or treatment of animals with exogenous Gal-1 promoted immunological profiles (innate and adaptive response) favoring the resolution of acute experimental T. cruzi infection.

A doença de Chagas, também conhecida como tripanossomíase americana é causada pelo protozoário flagelado Trypanosoma cruzi e afeta aproximadamente 10 milhões de pessoas em áreas endêmicas do México, America central e do Sul. A quimioterapia disponível atualmente limita-se a dois compostos: Nifurtimox e o Benzonidazol. Ambos os fármacos reduzem os sintomas da doença e a mortalidade das pessoas infectadas, quando utilizadas na fase aguda, mas sua eficácia na fase crônica é controversa. Além do mais apresentam vários efeitos colaterais. O T. cruzi é capaz de utilizar carboidratos e aminoácidos como fonte de energia e carbono. O nosso grupo tem estudado o envolvimento do glutamato na resistência do parasita ao estresse térmico, oxidativo e metabólico como também a importância do aminoácido GABA no metabolismo do T. cruzi, visto que este também é transportado pelo parasita. Nesse contexto, o objetivo desse trabalho foi avaliar a interferência de fármacos, que atuam via receptores ou transportadores de GABA e glutamato, no ciclo de vida do T. cruzi. Os fármacos selecionados foram: Vigabatrina, Pregabalina, MK-801, MTEP e Memantina. Os resultados demonstram que apenas Memantina apresentou um melhor efeito tripanocida. Inibiu a proliferação de formas epimastigotas, interferiu na metaciclogênese, como também afetou o metabolismo energético do parasita com a diminuição dos níveis de ATP, além de desencadear mecanismos que levam a apoptose das formas epimastigotas. Memantina também interferiu no ciclo intracelular do parasita, mais especificamente no estágio amastigota. Interessantemente as fases do ciclo do parasita que são mais afetadas, são as fases que requerem mais energia: estágios replicativos (amastigota e epimastigota), como também os processos de diferenciação e invasão celular. Apesar de apresentar valores de IC50 que podem ser considerados altos em relação aos valores descritos para formas epimastigotas tratadas com Benzonidazol, esses resultados mostram perspectivas promissoras, visto que o Memantina poderá ser utilizado como composto líder para o desenho de derivados com atividade tripanocida otimizada. / Chagas disease, also known as American trypanosomiasis is caused by the flagellate protozoan Trypanosoma cruzi and affects approximately 10 million people in endemic areas of Mexico, Central America and South America, with about 25 million people living in areas at risk of infection. The currently available chemotherapy is limited to two compounds, which are: Nifurtimox and Benznidazole. Both drugs reduce symptoms of the disease and mortality of infected people when used in the acute phase, but its efficacy in chronic phase (phase in which the majority of cases are diagnosed) is still controversial. Moreover these drugs have several side effects. T. cruzi is able to utilize carbohydrate and amino acids as carbon and energy source. Our group has studied the involvement of glutamate in parasite resistance to thermal, oxidative and metabolic stress, as well as the importance of the amino acid GABA metabolism in T. cruzi. The aim of this study was to evaluate the interference of drugs, that act in GABA and glutamate transporters or receptors, in the life cycle of T. cruzi. The drugs selected were: vigabatrin, pregabalin, MK-801, memantine and MTEP. The results showed that only memantine has a better trypanocidal effect. Memantine inhibited the proliferation of epimastigotes, interfered in metacyclogenesis, and affected the energy metabolism of the parasite with decreased levels of ATP, and trigger mechanisms that lead to apoptosis of epimastigotes. Moreover interferes with intracellular cycle of the parasite, specifically in amastigote stage. Interesting that stages of the parasite that require more energy are more affected: replicative stages (epimastigote and amastigote) as well as the processes of differentiation and cell invasion. IC50 value is more than that described to epimastigotes treateds with Benznidazole, but Memantine could be used as leader compound for the design of drugs with optimized trypanocidal activity.

Benznidazol (BZ), fármaco utilizado para o tratamento da doença de Chagas, apresenta eficácia limitada na fase crônica da doença. Falhas terapêuticas foram atribuídas majoritariamente a diferenças na suscetibilidade a BZ entre as cepas do T. cruzi. Resultados prévios de nosso grupo indicam que o gene de um transportador ABC da subfamília G, TcABCG1, encontra-se super-expresso em cepas resistentes a BZ. Transportadores ABCG foram associados a resistência a drogas em vários organismos. O objetivo central do presente estudo foi caracterizar o gene TcABCG1 em cepas de diferentes linhagens e cuja suscetibilidade a BZ foi definida. A sequência do gene TcABCG1 (1.998 pb) de 14 cepas foi determinada. Observamos algumas variações de aminoácidos na proteína ABC entre as cepas. Análises genealógicas de TcABCG1 definiram quatro clados (TcI, TcII, TcIII e Tcbat). Os dois haplótipos das cepas híbridas TcV e TcVI agruparam com os clados TcII e TcIII. Dados de imunofluorescência indireta em epimastigotas indicam que TcABCG1 está localizado em vesículas intracelulares. / Benznidazole (BZ), drug employed for Chagas disease treatment, has limited efficacy in the chronic phase of the disease. Treatment failures have been attributed mostly to differences in BZ susceptibility among T. cruzi strains. Previous data from our group indicate that one ABC transporter gene of the G subfamily, named TcABCG1, is overexpressed in BZ-resistant strains. ABCG transporters have been associated to drug resistance in several organisms. The central goal of the present study was to characterize TcABCG1 gene in strains belonging to different lineages and of defined BZ susceptibility. TcABCG1 gene sequence (1,998 bp) of 14 strains was determined. Few amino acid substitutions were detected in the ABC transporter protein among the strains. Genealogic analyses of TcABCG1 showed four distinct clades (TcI, TcII, TcIII and Tcbat). The two haplotypes of TcV and TcVI hybrid strains clustered with TcII and TcIII clades. Indirect immunofluorescence analysis in epimastigote forms indicated that TcABCG1 is localized to intracellular vesicles.