A doença de Chagas, parasitose causada pelo Trypanosoma cruzi, é doença prevalente na América Latina. Estima-se que cerca de 10 milhões de pessoas estão sob o risco de infecção e, em 2008, registraram-se mais de 10 mil óbitos devido à doença. Os únicos dois fármacos disponíveis na terapêutica, nifurtimox e benznidazol, são mais eficazes no tratamento da doença no início da fase aguda. Entretanto, a fase crônica da doença não possui tratamento. O nitrofural (NF), fármaco antimicrobiano, destaca-se por possuir atividade contra o T. cruzi, porém, apresenta toxicidade. Seu derivado hidroximetilado, o hidroximetilnitrofural (NFOH), por sua vez, mostrou maior atividade antichagásica e menor toxicidade. Ante a necessidade de novos fármacos antichagásicos, a existência de alvos terapêuticos promissores como a 14α-esterol desmetilase (CYP51) e a cruzaína e mediante utilização do bioisosterismo como ferramenta de modificação molecular, realizou-se a triagem virtual de 144 ligantes análogos do NFOH pelo método de docking com o programa GOLD para a CYP51 de T. cruzi. Adicionalmente, realizou-se estudo qualitativo dos campos de interação moleculares (MIFs) com o programa GRID para a enzima humana e do parasita, homólogas entre si, estudo que revelou 9 resíduos de aminoácidos no sítio ativo da enzima parasitária que podem ser explorados no planejamento de inibidores seletivos. Neste trabalho, obtiveram-se 5 compostos inéditos, caracterizados por determinação da faixa de fusão, análise elementar, técnicas de espectroscopia no infravermelho, espectroscopia de ressonância magnética nuclear de 1H,13C, HSQC, HMBC, HETCOR e NOESY, e a atribuição dos sinais foi realizada com o auxílio de técnicas de modelagem molecular. Testaram-se 4 compostos contra a forma amastigota de T. cruzi em células da linhagem U2OS. Todos os compostos apresentaram atividade da ordem de micromolar e índices de seletividade satisfatórios. O composto LAPEN-2901 teve sua estrutura elucidada por cristalografia de raios X, apresentou toxicidade duas vezes menor que o NFOH e potência semelhante à do composto de referência benznidazol, porém menor eficácia. Os resultados obtidos ressaltam a importância de grupos nitro, 1,2,4-triazólicos e tiossemicarbazônicos para o planejamento de derivados eficazes no tratamento da fase crônica da doença de Chagas. / Chagas disease, parasitosis caused by Trypanosoma cruzi, is a disease that predominates in Latin America. It is estimated that 10 million people are under the risk of infection and, in 2008, more than 10 thousand deaths were registered. The only two drugs available in the therapeutics, nifurtimox and benznidazole, showed to be more effective in the acute phase of the disease. However, there is no choice for the chronic phase. Nitrofurazone (NF), an antimicrobial drug, has activity against T. cruzi, although being toxic. Its hydroxymethyl derivative, the hydroxymethylnitrofurazone (NFOH), showed to be more active and less toxic than the prototype. Considering the need for new antichagasic drugs, the existence of promising new therapeutic targets, as 14α-esterol demethylase and cruzain, and by employing the bioisosterism approach, a virtual screening using T. cruzi CYP51 was performed for 144 NFOH analogues. Additionaly, a qualitative molecular interaction field study was performed, revealing 9 aminoacids in the parasitic enzyme relevant for selectivity. Five novel compounds were synthesized, characterized by melting range, elemental analysis, IR spectroscopy, 1H and 13C NMR as well as HSQC, HMBC, HETCOR and NOESY experiments, in which the signal assigning were aided using molecular modeling techniques Four compounds were tested against T. cruzi amastigotes in infected U2OS cells. All compounds were sufficiently selective towards T. cruzi and showed trypanomicidal activity in low micromolar range. The compound LAPEN-2901 had its structure determined using X-ray crystallography and showed lower toxicity than NFOH and potency similar to benznidazole, but lower efficacy. These results highlight the importance of the 1,2,4-triazolic, thiosemicarbazonic and nitro group moieties for designing new efficient compounds for the chronic phase of Chagas disease.

Made available in DSpace on 2017-07-24T19:37:52Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Robson Rodrigo Miranda.pdf: 3117830 bytes, checksum: 06e1c7195d09d214dbcc6eeb5412efe4 (MD5) Previous issue date: 2015-03-10 / Chagas disease is one of the seventeen neglected tropical diseases according to the World Health Organization. In the recent decades, new parasite metabolic pathways were identified, what brings perspectives for the development of more specific and less toxic drugs, towards crucial target pathways. Once the therapeutic target is identified, a structural and biochemical characterization of the enzymes involved becomes necessary. It may be speculated that one possible therapeutic target to combat Chagas disease is the Histidine Ammonia-Lyase enzyme, which participates in the catabolic pathway of histidine. Therefore, in order to contribute to the structural and biochemical understanding of this enzyme, their heterologous production in E. coli was performed. The product protein was purified by affinity chromatography and used in various techniques for initial characterization. The activity was determined by kinect assay, the thermal stability and secondary structure content were investigated by Circular Dichroism (CD) and the oligomerization stated in solution was analyzed by Dynamic Light Scattering (DLS). The X ray diffraction technique was used to elucidate the three dimensional structure. TcHAL was expressed and purified satisfactorily. The activity proved adequate protein folding and the Circular Dichroism indicated a predominance of α-helix secondary structure and the start of the thermal denaturation at 68°C. TcHAL was crystallized and provided suitable diffraction patterns for the 3D structure elucidation. These biochemical and structural studies advanced the understanding of this enzyme and of the inhibition potentialities. / A Doença de Chagas é uma das dezessete doenças tropicais negligenciadas de acordo com a Organização Mundial da Saúde. Nas últimas décadas foram descritas novas vias metabólicas deste parasita, o que abre perspectivas para o desenvolvimento de medicamentos mais específicos e menos tóxicos, para vias cruciais como alvo. Uma vez identificado o alvo terapêutico, passa a ser necessária a caracterização estrutural e bioquímica das enzimas envolvidas. Especula-se como alvo terapêutico para combater a Doença de Chagas a enzima Histidina Amônio Liase, que participa da via catabólica da histidina. Sendo assim, visando contribuir com o entendimento estrutural e bioquímico desta, foi realizada a sua produção heteróloga em E. coli. Esta foi purificada por cromatografia de afinidade e utilizada em diversas técnicas para caracterização inicial. A atividade foi determinada em ensaio cinético, a estabilidade térmica e as estruturas secundárias foram investigadas por Dicroísmo Circular (CD) e o estado de oligomerização em solução foi analisado por Espalhamento Dinâmico de Luz (DLS). A técnica de difração de raios X foi empregada para elucidação da estrutura tridimensional. A TcHAL foi expressa e purificada de maneira satisfatória. A atividade revelou um adequado enovelamento protéico e o Dicroísmo Circular indicou predominância de estruturas secundárias hélices-α e início da desnaturação térmica próximo a 68 °C. A TcHAL foi cristalizada e forneceu padrões de difração suficientes para elucidação da estrutura 3D. Os estudos bioquímicos e estruturais avançaram o entendimento desta enzima e das possibilidades de sua inibição.

Made available in DSpace on 2017-07-24T19:38:13Z (GMT). No. of bitstreams: 1 SHEILA BOREIKO.pdf: 2469578 bytes, checksum: d94618ec9a9eb25acc74ab5a7a6ca5d3 (MD5) Previous issue date: 2014-03-26 / Fundação Araucária de Apoio ao Desenvolvimento Científico e Tecnológico do Paraná / Chagas' disease, caused by the protozoan Trypanosoma cruzi, is one of the seventeen neglected diseases according to World Health Organization. In the last two decades, this parasite specific metabolic pathways have been evaluated as therapeutic targets, making the prospect for the development of more specific and less toxic drugs. To achieve this goal, there is the need for studies to get knowledge on the pathway protein three dimensional structures.Protein structures can be studied experimentally by the X ray diffraction technique and computationally by homology modeling, however, other structural information can also be obtained by spectroscopic techniques. Thus, in this work, structural studies of the enzyme Urocanate Hydratase from Trypanosoma cruzi (TcUH), which participates in the histidine metabolic pathway, were carried out. The enzyme was expressed functionally in E. coli and,by affinity chromatography, effectively purified and crystallized, however, no minimum quality for X-ray diffraction was observed. Thus, we carried out the structural study by circular dichroism (CD), small angle X-ray scattering (SAXS) and homology modeling. The TcUH is mainly composed of α-helices and its denaturation process by temperature starts near 50 ° C, being irreversible after completed. The SAXS study indicated that the protein in solution was not monomeric. With the homology produced model, docking studies indicated that some promising molecules to be carefully studied for possible inhibition tests. / A doença de Chagas, causada pelo protozoário Trypanosoma cruzi, é uma das dezessete doenças negligenciadas de acordo com a Organização Mundial de Saúde. Nas últimas duas décadas, vias metabólicas específicas deste parasita têm sido avaliadas como alvos terapêuticos, o que abre perspectivas para o desenvolvimento de medicamentos mais específicos e menos tóxicos. Para alcançar este objetivo, há a necessidade de estudos para conhecimento da estrutura tridimensional de proteínas que fazem parte destas vias. As estruturas das proteínas podem ser estudadas experimentalmente pela técnica de difração de raios X e computacionalmente pela modelagem por homologia, porém, outras informações estruturais também podem ser obtidas por técnicas espectroscópicas. Sendo assim, realizaramse, neste trabalho, estudos estruturais com a enzima Urocanato Hidratase de Trypanosoma cruzi (TcUH), que participa da via metabólica da histina. A enzima foi expressa em E. coli de forma funcional e, por meio de cromatografia de afinidade, purificada efetivamente e cristalizada, porém, não apresentou qualidade mínima para análise por difração de raios X. Assim, realizou-se o estudo estrutural por meio de dicroísmo circular (CD), espalhamento de raios X a baixo ângulo (SAXS) e modelagem por homologia. A TcUH é constituída majoritariamente por hélices-α e seu processo de desnaturação térmica inicia-se próximo a 50 °C, sendo irreversível após completa. O estudo de SAXS indicou que em solução a enzima não se apresenta monomérica. Com o modelo produzido por homologia, que apresentou razoáveis índices de qualidade, os estudos de docagem indicaram algumas moléculas promissoras que deverão ser estudadas criteriosamente para possíveis testes de inibição.

A doença de Chagas é considerada a terceira doença parasitária tropical de maior incidência no mundo, só superada pela malária e esquistossomose, e seu agente causador é o protozoário flagelado Trypanosoma cruzi. O parasita expressa uma enzima de superfície denominada trans-sialidase de Trypanosoma cruzi (TcTS), responsável pela transferência do ácidos siálicos de células do hospedeiro para moléculas de ?-galactose terminais presentes em glicoproteínas de sua superfície. As moléculas de glicoproteína sialiladas estão envolvidas na adesão e subsequente penetração do parasita em células hospedeiras. O papel fundamental da TcTS no reconhecimento e na invasão de células hospedeiras, bem como sua ausência em seres humanos, torna esta enzima um alvo potencial a ser estudado. A TcTS é específica em catalisar, preferencialmente, a transferência de ácido siálico para moléculas de mucina, originando ligações ?-2,3 com unidades de ?-galactose aceptoras na superfície do parasita. Considerando a importância da unidade de galactose e da função carboxila do ácido siálico para interações no sítio ativo de TcTS, priorizamos na síntese de derivados galactosil-triazolo-benzenossulfonamidas com diferentes substituintes, visto que o grupo sulfonamida é bioisóstero do ácido carboxílico, na busca de potenciais inibidores de TcTS. Os derivados galactosiltriazolo- benzenossulfonamidas 45-51 foram preparados via estratégia de click chemistry, por reação de ciclo-adição azido-alcino catalisada por Cu(I) (CuAAC), a partir do intermediário de galactose contento função amino terminal 30 e os derivados aril azidas 38-44. Após etapa de desacetilação, os produtos obtidos 52-58 foram testado em TcTS por ensaio fluorimétrico in vitro para avaliação de sua atividade inibitória. Os resultados obtidos são interessantes e bastante promissores, principalmente com os obtidos com o produto 58 (contendo o grupo galactosiltriazólico ligado a sulfapiridina), que apresentou atividade inibitória promissora (81%) na concentração de 1,0 mM, abrindo perspectivas para a síntese de um maior número de derivados galactosil-triazolo-benzenossulfonamidas com diferentes substituintes em R, para o estabelecimento de estudos de relação estruturaatividade. Adicionalmente, os compostos 53-55 foram testados em ensaios in vitro para avaliação de sua atividade tripanocida e citotóxica, e apresentaram atividade tripanocida máxima de 50%, normalmente nas concentrações de 500 a 250 ?M, com destaque para o derivado 55, contendo o grupo galactosil-triazólico ligado a sulfamerazina, que apresentou atividade moderada, mas superior ao benznidazol nas concentrações mais baixas (15,0 - 1,9 ?mol.L-1). Por outro lado, de acordo com os resultados do ensaio de citotoxicidade, a atividade citotóxica foi observada apenas nas concentrações mais elevadas, similar ao benznidazol. / Chagas disease is considered the third most common tropical parasitic disease worldwide, after malaria and schistosomiasis, and its causer is the flagellate protozoan, Trypanosoma cruzi. The parasite expresses a surface enzyme known as Trypanosoma cruzi trans-sialidase (TcTS), responsible for the transference of sialic acid from host cell to ?-galactose terminal molecules present in surface glycoproteins. Sialylated glycoproteins molecules are involved in adhesion and further penetration of parasite in host cell. Due to TcTS primordial role in recognizing and invasion of host cells, as well as its absence in humans, this enzyme becomes a potential target to be investigated. TcTS is specific on catalyzing, specially, transference of sialic acid to mucin molecule giving ?-2,3 bond with ?-galactose moiety in parasite surface. Considering the importance of the galactose moiety and the function of carboxylic in sialic acid for interactions in TcTS enzyme, we prioritized the synthesis of galactosyl-triazol-benzenesulfonamides derivatives with different substituents since sulfonamide group is bioisoster of carboxylic acid, in attempt to produce potential inhibitors of TcTS. The galactosyl-triazol-benzenesulfonamides derivatives 45-51 were prepared via click chemistry reaction (Copper(I)-catalyzed azide-alkyne cycloaddition (CuAAC)) from galactose intermediate with terminal amino group 30 and aril azides derivatives 38-44. After removing acetyl group, the inhibiting activity of products 52-58 were evaluated in TcTS fluorimetric in vitro assay. We found very promising results, specially with 58 (containing galactosyl-triazolic group bonded to sulfapyridine), wich showed 81% of inhibitory activity in 1,0mM solution, bringing expectations for synthesis of greater number of galactosyl-triazolbenzenesulfonamides derivatives with different substituents in R, to establish studies of structure relationship activity. Additionally, trypanocidal and cytotoxic activity of compounds 53-55 were tested and showed maximum activity of 50%, commonly in concentrations of 500 to 250 ?M, specially compound 55, containing galactosyltriazolic group bonded to sulfamerazine, with showed moderate activity, but higher then benznidazol in lower concentrations (15,0 - 1,9 ?mol.L-1). On the other hand, according to cytotoxicity results, activity were observed only in higher concentrations, as for benznidazol.

O número de pessoas infectadas por protozoários dos gêneros Leishmania e Trypanosoma cruzi, no mundo, permanece preocupante, havendo cerca de 12 milhões de casos de leishmaniose e 7 a 8 milhões referentes à doença de Chagas. Face ao grave quadro destas doenças e às limitações da terapêutica atual, a busca de novos fármacos é urgente. Considerada uma das principais estratégias disponíveis, a pesquisa a partir de espécies vegetais contendo constituintes bioativos é promissora fonte de moléculas potencialmente ativas. Neste contexto, espécies do gênero Lavandula mostraram atividade anti-Leishmania in vitro, tendo motivado a seleção de L. angustifolia (Lamiaceae). Embora tenham sido comprovadas diversas atividades farmacológicas desta espécie, a atividade antiprotozoária frente aos agentes avaliados ainda não havia sido estudada. Além disto, a produção em larga escala e o seu uso bastante difundido no mundo, sobretudo nas indústrias cosméticas, de perfumes e de domissanitários, despertou interesse. O presente trabalho visou à análise da composição do óleo volátil de uma variedade de L. angustifolia aclimatada ao Brasil e à avaliação de sua atividade antiprotozoária in vitro, frente a cepas de Leishmania infantum, L. amazonensis e de Trypanosoma cruzi. A análise do óleo volátil das inflorescências e das folhas, por CG-EM, indicou a predominância de monoterpenos, tendo-se estabelecido análise comparativa entre estes órgãos. De forma geral, o óleo foi inativo frente às espécies de Leishmania, tendo apresentado promissora atividade anti-Trypanosoma. / The number of people infected by Leishmania and Trypanosoma cruzi protozoa around the world has increased and raised concerns that approximately 12 million cases of leishmaniasis and 7 to 8 million cases of Chagas disease have been reported. The alarming statistics involving these diseases and limitations of therapeutics currently in use point to an urgent need for new drugs. Considered one of the main strategies available, research on plants containing bioactive constituents is a promising source of potentially active molecules. Species of Lavandula genus have shown in vitro anti-Leishmania activity and this encouraged the present study on L. angustifolia (Lamiaceae) species. Although several pharmacological activities have been identified, the antiprotozoal activity against these specific agents has not yet been approached. Moreover, the possibility of a large-scale production and its quite comprehensive use worldwide, especially for the manufacturing of cosmetics, perfumes and household sanitizing products have attracted our interest. This study aimed at the analysis of the volatile oil compounds of the L. angustifolia species acclimatized in Brazil as well as the evaluation of the in vitro antiprotozoal activity against the strains of Leishmania (L.) infantum, L. (L.) amazonensis and Trypanosoma cruzi. The CG-EM analysis of the volatile oil from the inflorescences and leaves has shown monoterpenes as majority constituents also allowing a comparative analysis between these organs. Overall, the oil was not active against the Leishmania species but presented promising anti-Trypanosoma activity.

Na fase crônica da doença de Chagas, 70% dos pacientes são assintomáticos, 20-30% apresentam a forma cardíaca e 8% a digestiva. A influência da heterogeneidade genética das cepas de Trypanosoma cruzi na evolução da forma clínica foi cogitada. Neste trabalho, utilizamos PCRs para genes do maxicírculo de T. cruzi para caracterizar parasitas isolados de 75 pacientes com a forma assintomática ou cardíaca. Verificamos que os genes que codificam as subunidades 7 (ND7) e 4 (ND4) da NADH desidrogenase (complexo I mitocondrial) apresentam deleções em algumas cepas. No entanto, não observamos correlação entre as deleções nos genes e as formas clínicas. Investigamos alguns parâmetros do funcionamento da mitocôndria em cepas controle e com mutações. Verificamos que as deleções em ND7 ou ND4 não afetam a velocidade de consumo de oxigênio em epimastigotas permeabilizados com digitonina, concluindo que o complexo I mitocondrial não é funcional neste estágio. Observamos que os níveis de produção de H2O2 pela mitocôndria não guardam relação com a presença das mutações. / In the chronic phase of Chagas disease, 70% of the patients are asymptomatic, 20-30% develop the cardiac form and 8% the digestive form. The influence of the genetic heterogeneity of Trypanosoma cruzi strains in the outcome of the clinical presentation has been considered. In this study, we employed PCR assays targeted to T. cruzi maxicircle genes to genotype parasite isolates from 75 patients with the asymptomatic or cardiac forms. We verified that the genes that code for subunits 7 (ND7) and 4 (ND4) of the NADH dehydrogenase (mitochondrial complex I) show deletions in some strains. Nevertheless, we found no correlation between the presence of the deletions and the clinical presentations. We investigated some mitochondrial functional parameters in control and mutant strains. We observed that deletions in ND7 or ND4 do not affect the rate of oxygen consumption in epimastigotes permeabilized with digitonin. We conclude that complex I is non-functional in this stage. We observed no correlation between mitochondrial production of H2O2 and the gene deletions.

En Guyane comme dans l'ensemble de la région amazonienne, le risque de maladie de Chagas pour l'homme a longtemps été sous estimé du fait de l'absence de vecteur domestique et de l'existence d'un réservoir animal exclusivement sauvage. Le travail présenté répond aux besoins de compléter et d'actualiser les connaissances épidémiologiques disponibles sur la maladie de Chagas dans ce département , en précisant les modalités de circulation de Trypanosoma cruzi et les facteurs impliqués dans le cycle à l'origine des cas humains. Les données cumilées entre 2001 et 2023 représentent 971 spécimens de triatomes. Nous avons choisi de différencier les triatomes provenant des zones non habitées (forêts primaire ou secondaire) de ceux provenant de zones habitées, collectées dans les maisons à la faveur d'intrusion. Une espère, Panstrongylus geniculatus, s'est distinguée par son abondance (61,1%) et son omniprésence dans les différents types de milieux explorés. Au total, neuf espèces ont été retrouvées. En zone non habitée, avec une prédominance de P. geniculatus, P. lignarius, Rhodnius pictipes et R. robustus. L'infection des triatomes par T. cruzi a été étudiée, avec une mise en évidence d'un taux d'infection plus élevé chez les triatomes collectés à l'intérieur des habitations (53.9%) que chez ceux provenant des zones non habitées (46%). L'étude sur les mammifères sauvages a montré des taux d'infection élevés pour T. cruzi chez deux espèces : didelphis marsupialis (62.5%) et Philander opossum (35%). Cette étude a été complétée par l'analyse de la variabilité génétique de T. cruzi identifié par des techniques de génotypage réalisées sur du matériel obtenu à partir de triatomes, de mammifères sauvages et domestiques et des hommes. En zone non habitée trois groupes, TcI, TcII-TcV-TcVI et TcIII-TcIV, ont été caractérisés, avec une prédominance de TcI. Parmi les acteurs du cycle parasite, les chiens et P. geniculatus hébergent le groupe TcIII-TcIV à la différence du genre Rhodnius et des marsupiaux qui hébergent le groupe TcI. Nos résultats ont permis d'émettre un certain nombre d'hypothèses sur la circulation des génotypes de T. cruzi en Guyane / In French Guiana, as in the whole of Amazon region, the risk of Chagas disease to humans has long been underestimated due to the presence of non-domiciled triatomines and wild animal reservoir. Overall, this thesis aims at reactualizing and improving epidemiological knowledge about Chagas disease in French Guiana, by specific modalities of circulation of Trypanosoma cruzi and the factorsinvolved in the transmission cycle of the origin of human cases. Accumulated data, between 2001 and 2013, represent 971 triatomine specimens collected. We chose to differentiate triatomine collected in uninhabited areas (primary or secondary forests) and those frominhabited areas, collected in homes by intrusion. One species, Panstrongylus geniculatus, was distinguished by its abundance (61.1%) and its presence in different types of habitats investigated. A total of nine species were found in uninhabited area, with the predominance of four species: P. geniculatus, P. lignarius, Rhodnius pictipes and Eratyrus mucronatus. In inhabited area, five species of triatomine were collected, with the predominance of P. geniculatus, R. pictipes and R. robustus. The triatomine infection rate with T. cruzi has been studied, with a highlighting of higher rate of infection in triatomine collected inside houses (53.9%) than those from uninhabited area (46%). The study on wild mammals showed high T. cruzi infection rates for two species: Didelphis marsupialis (62.5%) and Philander opossum (35%).This study was completed by the analysis of the genetic variability of T. cruzi identified by genotyping techniques performed on material obtained from triatomine, wild and domestic mammals and humans. In uninhabited area, three groups$ TcI, TcII-TcV-TcVI and TcIII-TcIV have been characterized, with a predominance of TcIII-TcIV group. In inhabited area, only two groups were characterized (TcI andTcIII-TcIV), with a predominance of TcI. Among the actor’s transmission cycle of parasite, dogs and P. geniculatus were characterized by TcIII-TcIV group. Contrary to Rhodnius genus and marsupials were characterized by the TcI group. Our results have allowed issuing a number of assumptions about the circulation of T. cruzi genotypes in French Guiana

Produzida por macrófagos e células dendríticas, a IL-27 é uma citocina heterodimérica capaz de induzir células Tr1 produtoras de IL-10 e consequentemente regular linfócitos Th1, Th2 e Th17, dependendo da doença envolvida. Partindo-se do pressuposto de que a infecção causada por Trypanosoma cruzi normalmente induz miocardite refletida pela migração intensa de linfócitos Th1 para o tecido cardíaco, nós analisamos o papel regulador da IL-27 nesta condição inflamatória. Nós inicialmente verificamos que a IL-27 foi prontamente induzida in vitro em células infectadas com T. cruzi. Para gerar miocardite intensa coordenada por linfócitos Th1, nós polarizamos linfócitos T naïves para o padrão Th1 na ausência de moléculas relacionadas ao perfil Th17 (camundongos IL-17R-/-, IL-23-/- e IL-6-/-). Como esperado, a inflamação cardíaca intensa e o dano tecidual foram observados na ausência das moléculas do padrão Th17, o que contribuiu para a morte prematura dos animais IL-17R-/-, IL-23-/- e IL-6-/-, precisa e notoriamente pela indução da migração excessiva de linfócitos Th1 para o tecido cardíaco via CXCL-9 e CXCL-10. Para explorar os mecanismos pelos quais a IL-27 controla a miocardite induzida pelo T. cruzi, nós encontramos um recrutamento substancial de macrófagos produtores de IL-27 para o tecido cardíaco, o qual foi mediado pelas quimiocinas CCL3 e CCL4 na ausência de moléculas do padrão Th17. Para determinar quais os receptores necessários para a produção de IL-27, nós observamos que macrófagos derivados da medula óssea de camundongos deficientes de TLR4-/-, TLR9-/- e NLRP3-/- aboliram completamente a produção desta citocina após a infecção in vitro com T. cruzi, enquanto o receptor TLR2 foi dispensável. Nós também verificamos que macrófagos produtores de IL-27 suprimiram linfócitos Th1 através da indução de células Tr1 produtoras de IL-10 após a infecção com T. cruzi. Em seguida, nós avaliamos se a IL-27 foi correlacionada com a proteção cardíaca durante a doença de Chagas. Nós observamos níveis séricos elevados de IL-27 tanto em pacientes com a forma clínica indeterminada ou cardíaca leve, enquanto pacientes com cardiomiopatia moderada ou grave produziram níveis reduzidos de IL-27. Neste estudo, nós descrevemos um novo mecanismo regulador desempenhado por macrófagos produtores de IL-27 no controle da miocardite induzida por T. cruzi. Macrófagos produtores de IL-27 podem suprimir processos inflamatórios desencadeados por linfócitos Th1, os principais vilões na doença de Chagas. / IL-27 is a heterodimeric cytokine produced by macrophages and dendritic cells known to induce IL-10-producing Tr1 cells and to regulate Th1, Th2, and Th17 lymphocytes, depending on the underlying disease. Because the infection caused by Trypanosoma cruzi normally induces myocarditis mirrored by an outstanding migration of Th1 cells to the heart tissue, we analyzed the regulatory role of IL-27 in this inflammatory condition. We firstly verified that IL-27 was promptly induced by in vitro T. cruzi-infected spleen cells. To generate a robust myocarditis coordinated by Th1 lymphocytes, we polarized lymphocytes to a Th1 pattern by infecting mice in the absence of Th17-related molecules (IL-17R-/-, IL-23-/-, and IL-6-/- mice). As expected, an impressive cardiac inflammation and damage was observed in the absence of Th17-related molecules, leading IL-17R-/-, IL-23-/-, and IL-6-/- mice to the premature death, precisely and notably by inducing an exuberant Th1 migration to the heart tissue via CXCL9 and CXCL10 chemokines. To explore the mechanisms by which IL-27 controls T. cruzi-induced myocarditis, we found a striking recruitment of IL-27-producing macrophages to the heart tissue mediated by increased levels of CCL3 and CCL4 chemokines in the absence of Th17-associated molecules. To gain further insights into the receptors required to IL-27 production, we observed that bone marrow-derived macrophages from TLR4-/-, TLR9-/-, and NLRP3-/- mice completely abolished IL-27 production after in vitro T. cruzi infection, while TLR2 was dispensable. We also verified that IL-27-producing macrophages supressed Th1 lymphocytes by inducing IL-10-producing Tr1 cells after T. cruzi infection. We next assessed whether IL-27 was correlated to cardiac protection during Chagas Disease. We observed augmented serum levels of IL-27 in either patients with indeterminate (asymptomatic) form or mild cardiac form, whereas patients with moderate or severe cardiomyopathy were poor producers of IL-27. Here, we described a novel regulatory mechanism developed by IL-27-producing macrophages in the control of T. cruzi-induced myocarditis. IL-27-producing macrophages can suppress inflammatory processes caused by Th1 lymphocytes, the bona fide culprits of Chagas Disease.

\'Trypanosoma cruzi\' é o agente etiológico da doença de Chagas, esta considerada um problema de saúde pública na América Latina. Cerca de 10 a 14 milhões de pessoas estão infectadas com o \'Trypanosoma cruzi\' e 40120 milhões de pessoas correm o risco de contrair a doença. Diidroorotato desidrogenase (DHODH) é uma flavoenzima que catalisa a oxidação de L-diidroorotato em orotato, a quarta e única reação redox na biossíntese de novo de nucleotídeos de pirimidinas. Atualmente, existe um grande interesse em inibidores da DHODH como agentes terapêuticos para o tratamento de câncer, artrite reumatóide e doenças parasitarias. Em particular, estudos genéticos têm mostrado que DHODH é essencial para a sobrevivência do \'T. cruzi\', validando a idéia de que DHODH pode ser considerada um alvo atraente para o desenvolvimento de drogas antichagásicas. Neste trabalho, reportamos a estrutura cristalográfica da enzima DHODH de \'Trypanosoma cruzi\' cepa Y (TcDHODH), uma cepa parcialmente resistente a drogas e altamente virulenta. O gene de TcDHODH que codifica um polipeptídeo consistindo de 314 aminoácidos foi clonado em pET-28a entre os sítios de restrição BamHI e NotI. A enzima TcDHODH foi expressa como uma proteína solúvel em E. coli BL21 (DE3) através da indução com 1 mM IPTG por 5 h a 25 °C e purificada utilizando cromatografia por afinidade em resina Ni-NTA. A cristalização de TcDHODH foi realizada utilizando o método de difusão de vapor em gotas suspensa e pendurada contra o reservatório contendo 1,5 M sulfato de amônio, 5% 2-propanol em 0,1 M acetato de sódio pH 5 adicionado de 2 mM ditiotreitol (DTT). A coleta de dados foi realizada na linha de luz D03B-MX1 do Laboratório Nacional de Luz Síncrotron (LNLS) com radiação a 1,427 Å. Cristais de TcDHODH difratam à resolução de 2.2 Å e crescem no grupo espacial P212121 com parâmetros de cela a = 82.39, b = 123.92 e c = 128.89 Å. A estrutura foi resolvida por técnicas de substituição molecular e refinada a 2.2 Å de resolução. Uma análise detalhada da enzima TcDHODH cepa Y tem nos permitido identificar características estruturais que podem ser melhor exploradas para o desenho de inibidores altamente específicos através da tecnologia de desenho de drogas baseado em estrutura, como uma importante ferramenta no combate a doença de Chagas. / \'Trypanosoma cruzi\' is the etiological agent of Chagasdisease, considered a public health problem in Latin America. Ten to 14 million people are infected by \'Trypanosoma cruzi\' and 40120 million people are at risk of infection. Dihydroorotate dehydrogenase (DHODH) is a flavin mononucleotide containing enzyme, which catalyses the oxidation of L-dihydroorotate to orotate, the fourth step and only redox reaction in the de novo biosynthesis of pyrimidine nucleotides. At present, there is a great interest in inhibitors of DHODH as therapeutic agents for the treatment of cancer, rheumatoid arthrits and parasitic diasease. In particular, genetic studies have shown that DHODH is essential for \'T. cruzi\' survival, validating the idea that DHODH can be considered an attractive target for the development of antichagasic drugs. Here, we report the crystal structure of \'Trypanosoma cruzi\' DHODH from Y strain (TcDHODH), a partially drug-resistant and highly virulent strain. The TcDHODH gene that encodes a polypeptide consisting of 314 amino acid residues was cloned into BamHI and NotI restriction sites of pET-28a. The TcDHODH was functionally expressed as a soluble protein in E. coli BL21 (DE3), through induction with 1 mM IPTG for 5 h at a temperature of 25 °C and purified to homogeneity using affinity chromatography on Ni-NTA resin. The crystallization of TcDHODH was performed using vapor diffusion method in sitting and hanging drops against a reservoir solution containing 1.5 M ammonium sulfate, 5% 2-propanol in 0.1 M sodium acetate pH 5 plus the addition of 2 mM dithiothreitol (DTT). Data collection was performed at the D03B-MX1 beam line of the Brazilian Synchrotron Light Laboratory (LNLS) using 1.427 Å radiation. TcDHODH crystals diffract up to 2.2 Å resolution and belong to space group P212121 with unit cell dimensions a = 82.39, b = 123.92 and c = 128.89 Å. The structure has been solved by molecular replacement techniques and refined up to 2.2 Å resolution. A detailed analysis of TcDHODH strain Y has allowed us to identify structural characteristics that can be further exploited for design of highly specific inhibitors through the technology of structure-based drug design as an important tool to fight against Chagasdisease.

Made available in DSpace on 2014-07-29T15:26:21Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Tese Alejandro Luquetti Ostermayer.pdf: 346489 bytes, checksum: c2559928ce370a8044e13975ad38a042 (MD5) Previous issue date: 2011-07-18 / The main papers published on the last five years on the area of human Chagas disease, mainly on parasitological, serological and therapeutic aspects, reflecting areas of recent involvment of the author, were selected. As a baseline, briefly comments on publications on the last 40 years were included. Parasitemia profile measured by hemoculture during the chronic infection was the subject of the first two. The first (published in 2006) included six hemocultures from each of 27 patients, the last three after specific treatment. Results were compared with those of 13 non treated, infected patients. The supressive effect of benznidazole was demonstrated in 89% of the patients and treatment failure was registered in three cases (11%) during the two year follow-up. In the second paper (2011) a single hemoculture was performed in 152 infected women, 101 pregnant. Parasitemic pregnant women doubled the number of non-pregnant, mainly during the first months of pregnancy. A new ELISA test was developed (2010) by employing two recombinant proteins and two synthetic peptides. Sensitivity was 99.3% on 165 positive sera, and specificity of 100% (216 negatives). A multicentric study was done (2009) with participation of laboratories of North America (Mexico), Central America (Honduras) and South America (Brazil) with 98 serum samples from patients of Mexico employing reagents made from Tc1 and Tc2 strains. Results showed good agreement among laboratories demonstrating the feasibility of using reagents prepared from both types of T. cruzi. In another multicentric study (Bolivia, Argentina and Brazil) xenodiagnosis performed in 17 patients after a 60 days course of allopurinol treatment, remained positive, showing the lack of effect of this drug in the chronic phase. A national serological survey in children born after insecticide spraying (below five years old) with filter paper, involved 104,954 samples, tested with ELISA and indirect immuofluorescence. Only 11 samples (0.01%) were identified as by vector transmission (negative mothers) mainly from the northeast of the country, areas without Triatoma infestans. These findings (2011) confirm the effectivity of house spraying for the control of the disease. As a sub-product of this investigation, an unusual number of cases of congenital transmission (n = 12) was found only in the State of Rio Grande do Sul, where TcV-TcVI circulates. When compared with other states (n=8) the proportion was 10 times higher. This is the first report on geographical differences related to congenital transmission in Brazil. We considered that all these findings contributed significantly to a better knowledge on different aspects of Chagas disease. / Foram selecionados os principais trabalhos publicados nos últimos cinco anos na área de doença de Chagas no homem, com ênfase em aspectos parasitológicos, de diagnóstico sorológico e de tratamento, os quais refletem o foco das investigações do autor neste período. Como embasamento desses estudos foram brevemente comentados artigos publicados nos últimos quarenta anos. O perfil parasitêmico no indivíduo infectado crônico, por meio de hemocultura, foi objeto de dois artigos. No primeiro (publicado em 2006), foi determinada a parasitemia em 27 pacientes, por meio de três hemoculturas seriadas antes do tratamento específico e três após. Os resultados foram comparados com os de 13 pacientes não tratados. O efeito terapêutico do benznidazol no sentido de supressão da parasitemia foi detectado em 89%, enquanto que a falha terapêutica foi comprovada em três casos (11%) nos primeiros dois anos. No segundo (2011), foi realizada hemocultura em 101 gestantes e 51 mulheres não grávidas, todas infectadas. A parasitemia foi o dobro nas gestantes (60,4%), em relação às não grávidas, em particular nos primeiros meses da gestação. Um ensaio imunoenzimático (ELISA) (2010) foi desenvolvido com dois antígenos recombinantes e dois peptídios sintéticos, com sensibilidade de 99,3% (em 165 soros reagentes) e especificidade de 100% (em 216 negativos). Em estudo multicêntrico, com a participação de laboratórios da América do Norte (México), Central (Honduras) e do Sul (Brasil), em 98 amostras de soro de pacientes do México (2009), foi encontrada excelente concordância entre os laboratórios, empregando-se testes sorológicos de diferentes origens (TcI e II), demonstrando que antígenos de diferentes cepas de Trypanosoma cruzi apresentam desempenho similar. Em estudo multicêntrico (Bolívia, Argentina e Brasil) foi demonstrado, por xenodiagnóstico, que o allopurinol não teve efeito parasiticida em 17 pacientes, em comparação com dez não tratados (estudo do Brasil), pela persistência do exame parasitológico positivo em todos os tratados (2007). Em inquérito nacional sorológico em crianças que nasceram após as medidas de controle (abaixo de cinco anos) de toda a área rural do Brasil (n = 104.954) foram encontradas 104 (0,1%) amostras positivas em papel-filtro (ELISA e imunofluorescência indireta), sendo confirmadas com soro apenas 11 de transmissão vetorial (0,01%), todas em municípios sem Triatoma infestans. Este trabalho confirma a efetividade da borrifação com inseticidas no Brasil (2011). Como sub-produto desse trabalho, verificou-se que a transmissão congênita foi 10 vezes superior no estado do Rio Grande do Sul (TcV-VI) com 12 casos, em comparação com outros oito no restante do país, demonstrando pela primeira vez diferenças geográficas no tocante à transmissão vertical no Brasil. Consideramos que os trabalhos apresentados contribuíram efetivamente ao conhecimento de diferentes aspectos da doença de Chagas.