A doença de Chagas é uma doença crônica causada pela infecção pelo protozoário Trypanosoma cruzi (T.cruzi). A sua principal consequência clínica é o desenvolvimento da cardiomiopatia chagásica crônica (CCC), que acomete 30% dos pacientes. Não foi determinado um indicador de evolução para a CCC ou permanência na forma indeterminada assintomática da doença de Chagas. Diversos trabalhos têm mostrado alterações no perfil de expressão gênica e proteômica ocorridas na fase aguda e crônica da doença de Chagas experimental e humana. Tais alterações advêm da regulação estabelecida em diversos estágios da expressão gênica e podem ser fatores relevantes no prognóstico da doença. Neste contexto, os microRNAs (miRs), podem exercer uma importante função reguladora. Sua ação se dá pela associação a um RNA mensageiro (RNAm) alvo, inibindo sua tradução ou degradando este transcrito. Assim, a hipótese deste trabalho é a de que a infecção aguda por T. cruzi modula a expressão de miRs no miocárdio de camundongos. Foi avaliado por qRT-PCR o perfil de expressão de miRs 15, 30 e 45 dias após a infecção. O perfil de expressão de miRs resultante foi suficiente para segregar os grupos de acordo com o tempo da infecção. O número de miRs diferencialmente expressos aumentou com a progressão da infecção. Além disso, seis miRs tiveram sua expressão correlacionada à piora na parasitemia e intervalo QTc dos animais: miR-142-3p miR-142-5p, miR-145, miR-146b, miR-149 e miR-21. Análises de correlação realizadas com todos os miRs avaliados ressaltaram este mesmo grupo de miRs entre os mais significativamente correlacionados, além de outros 73 correlacionados com a parasitemia, 67 com o intervalo QTc e 16 com ambos os parâmetros simultaneamente. Nas análises in silico, TNF-alfa e ciclina-D1 foram moléculas nodais recorrentes nas redes criadas com alvos dos miRs diferencialmente expressos em todos os tempos avaliados. Na única rede criada com os miRs correlacionados às alterações na parasitemia e intervalo QTc, TNF-alfa, TGF-beta, Rac1 e Src foram as moléculas nodais. Este trabalho apresenta de maneira inédita o envolvimento dos miRs durante a infecção aguda por T. cruzi, proporcionando novas perspectivas em relação a potenciais ferramentas terapêuticas e prognósticas / Chagas disease is a chronic illness caused by infection with the protozoan Trypanosoma cruzi (T. cruzi). Its main clinical outcome is the development of chronic Chagas cardiomyopathy (CCC), which affects 30% of the patients. The factors that define the progression to CCC or maintenance in the asymptomatic indeterminate form of the disease are still poorly understood. Several studies have presented changes occurred in the gene and proteomic expression profiles in both acute and chronic phases of experimental and human Chagas disease. Such changes result from regulation established at different stages of gene expression and may be relevant for the disease prognosis. In this context, microRNAs (miRs) may play an important regulatory function. miRs act by association to a target messenger RNA (mRNA), inhibiting translation or degrading the transcript. Thus, our hypothesis is that acute infection by T. cruzi modulates the expression of microRNAs in the myocardium of mice. The miR expression profile was evaluated by qRT-PCR 15, 30 or 45 days after the infection. This profile was sufficient to segregate the samples according to the time of infection. The number of differentially expressed miRs was higher as the infection progressed. Moreover, six miRs had their expression correlated with worsening of parasitaemia and QTc interval: miR-142-3p miR-142- 5p, miR-145, miR-146b, miR-149 and miR-21. Secondary unbiased correlation analyses showed this cluster of miRs among the most significant and other 73 miRs correlated with parasitaemia, 67 with QTc and 16 with both parameters simultaneously. In silico target prediction analyses showed TNF-alfa and cyclin-D1 as recurrent nodal molecules of the networks created with miRs targets from all time points. The network generated with miRs correlated to changes in parasitaemia and QTc interval showed TNF-alfa, TGF-beta, Rac1 and Src as nodal molecules. This work points out for the first time the involvement of miRs in the acute infection by T. cruzi, providing new insights about potential diagnostic and prognostic tools

Made available in DSpace on 2014-07-29T15:29:18Z (GMT). No. of bitstreams: 1 ELENI SOCORRO MARQUES SOUSA.pdf: 2411872 bytes, checksum: 588ba15c010ba33129eff5bfb3f25b33 (MD5) Previous issue date: 2009-05-25 / Introduction: The oral transmission of Chagas disease has been calling the attention in the last few years, especially because of the occurrence of outbreaks due to the ingestion of food such as sugar cane juice, with the possibility of contamination by sylvatic reservoirs of Trypanosoma cruzi, such as Didelphis sp. Objectives: a) Perform a systematic literature review on sugarcane (Saccharum spp) and/or Didelphis sp contamination by T. cruzi; b) Verify the transmission of T. cruzi strains collected from the secretion of the perianal glands of D. albiventris by direct contamination of sugarcane; c) Try to elucidate T. cruzi potential of penetration in sugarcane stalks; d) Assess possible penetration of T. cruzi through sugarcane roots by examining histological sections of stalks inoculated in vivo with this protozoan. Methodology: The study was carried out in two phases: 1) Systematic review of the literature using scientific articles that address the contamination of sugarcane and/or Didelphis sp by T. cruzi, searching for information in Cochrane Library, LILACS, MEDLINE and SciELO, using as descriptors T. cruzi, Didelphis sp, and Saccharum spp. We included in this review the articles published in the American continent from 1909 to October 2008 that presented at least two descriptors associated; 2) Experimental assessment of sugarcane contamination by T. cruzi, in which opossums were experimentally infected by intraperitoneal inoculation with a suspension containing this protozoan and assessed by microhaematocrit technique, culture in LIT (liver infusion tryptose) medium, and PCR. Fragments of sugarcane were contaminated by direct inoculation of T. cruzi suspension collected from the perianal glands of these marsupials. Sugarcane juice was extracted at different intervals, using a manual grinder, and assessed by direct examination and inoculation of mice. Also, histological sections of sugarcane contaminated in vitro and in vivo were performed and analyzed using an optical microscope. Results: After reading and discussing the articles selected, we confirmed the importance of opossums and sugarcane in the transmission of Chagas disease. Nevertheless, only one study approaches directly the object of this research since the others describe experimental contamination of Didelphis sp with different strains of T. cruzi. Given the Abstract xix methods employed herein, this study showed the contamination of sugarcane through the infection of mice up to 6 h after inoculation with strain Y of T. cruzi and up to 4 h with sylvatic P12. This showed plant contamination when inoculated in the tips but not on the surface. However, it was not possible to observe the potential of T. cruzi penetration in sugarcane or the contamination through its roots with the method used during this study, and no protozoan were visualized using an optical microscope. Conclusion: A systematic review of the literature showed the lack of studies on this theme. To the best of our knowledge, this is a pioneer relevant study and lead to the conclusion that the transmission of T. cruzi by sugarcane contaminated wit secretion of the perianal glands of opossums is possible. We suggest the use of other methods for evaluating T. cruzi penetration in sugarcane, and the contamination of this plant through the roots / Introdução: A transmissão oral da doença de Chagas destaca-se na atualidade pela ocorrência de surtos da doença por ingestão de alimentos como caldo de cana, não se descartando a possibilidade de contaminação através de reservatórios silvestres do Trypanosoma cruzi, como os gambás. Objetivos: a) Fazer uma revisão sistemática da literatura abordando a temática da contaminação da cana-de-açúcar (Saccharum spp) e/ou Didelphis sp por T. cruzi; b) Verificar a transmissão de cepas de T. cruzi provenientes das glândulas perianais de D. albiventris por contaminação direta da cana-de-açúcar; c) Buscar elucidar o potencial de penetração de T. cruzi nos tecidos do colmo da cana-de-açúcar; d) Avaliar a possível penetração de T. cruzi através das raízes da cana-de-açúcar inoculada in vivo com este protozoário. Metodologia: Estudo realizado em duas etapas: 1) Revisão sistemática da literatura utilizando artigos científicos que abordam a temática da contaminação da cana-deaçúcar e/ou Didelphis sp por T. cruzi, pesquisando nas bases de dados Biblioteca Cochrane, LILACS, MEDLINE e SciELO, utilizando como descritores T. cruzi, Didelphis sp e Saccharum spp. Participaram da revisão artigos publicados no continente americano no período de 1909 até outubro de 2008 que apresentaram ao menos dois descritores associados; 2) Avaliação experimental da contaminação da cana-de-açúcar por T. cruzi, em que gambás foram infectados experimentalmente por inoculação intraperitoneal de suspensão deste protozoário e avaliados por microhematócrito, cultura em meio LIT (liver infusion tryptose) e PCR. Fragmentos de cana-de-açúcar foram contaminados por inoculação direta de suspensão de T. cruzi proveniente das glândulas perianais desses marsupiais. O caldo de cana foi extraído em diferentes intervalos, com o uso de um moedor manual, e avaliado por exame direto e inoculação em camundongos. Também foram realizados cortes histológicos da cana-de-açúcar contaminada in vitro e in vivo e analisados por microscopia óptica. Resultados: Mediante leitura e discussão dos artigos, observou-se a importância dos gambás e da cana-de-açúcar na transmissão da doença de Chagas. Porém, ao final da análise constatou-se que apenas um estudo tinha maior relação com os objetivos da pesquisa. Nas condições metodológicas empregadas, o estudo mostrou a contaminação da cana-de-açúcar por meio da infecção de camundongos Resumo xvii em até 6 h após a inoculação da cepa Y de T. cruzi e em até 4 h com a cepa P12 silvestre. Isso mostrou que a planta se contaminou quando inoculada na extremidade, mas não quando inoculada na superfície. Entretanto, não foi possível observar o potencial de penetração do T. cruzi na cana-de-açúcar ou a contaminação por via radicular com o método utilizado, não tendo sido visualizados esses protozoários por microscopia óptica nas lâminas confeccionadas. Conclusão: A revisão sistemática da literatuta mostrou a carência de estudos a esse respeito. Os resultados do estudo experimental são inéditos e permitiram concluir que a transmissão de T. cruzi por cana-de-açúcar contaminada com secreção das glândulas perianais de gambás é possível. Sugere-se o emprego de outros métodos para avaliar a penetração de T. cruzi em cana-de-açúcar, bem como para a sua contaminação via radicular

A Doença de Chagas é causada pelo Trypanosoma cruzi, e possui duas fases clínicas, sendo o tratamento com o fármaco benznidazol eficaz somente na fase aguda, porém com diversos efeitos adversos ao longo do período do tratamento. Desta forma, consórcios vêm sendo estabelecidos entre \"governo - universidade - indústria\", com auxilio de capital nacional e estrangeiro para o desenvolvimento de novos fármacos. Apesar de diversas ferramentas disponíveis para o planejamento de novos compostos, a busca por produtos naturais ainda desperta interesse de muitos pesquisadores. Diversos trabalhos vêm descrevendo estudos de síntese e atividade tripanocida de lignanas, as quais merecem destaque, veraguensina (17) e grandisina (18). Devido à falta de tratamento e a alta toxicidade dos agentes disponíveis, este trabalho tem como objetivo sintetizar análogos dessas lignanas, relacionados a derivados de tetraidrofurânicos, furânicos, pirrólicos e de seus intermediários e testa-lasfrente à atividade tripanocida e citotóxica. O planejamento sintético envolveu a geração de derivados 1,4-diaril-2-butino-1,4-diol (28a-t) a partir da reação de condensação entre fenil carbinol (26) e aldeídos arílicos (27a-t) com diferentes padrões de substituiçõescom diversos grupos funcionais. Estes intermediários, obtidos em rendimentos moderados, foram convertidos aos correspondentes 1,4-diaril-1,4-diidroxílicos (30a-g), pela reação de redução em dióxido de platina e, posteriormente, oxidados a 1,4-diaril-1,4-dicetonas (29a-g). A partir da formação dos intermediários 29 e 30, os produtos de interesse, 2,5-diaril-furano (32a-g) e 2,5-diaril-tetraidrofurano (31a-g) foram preparados empregando reações de ciclização na presença de ácidos tríflico e trifluoroacético, respectivamente. Os intermediários e produtos obtidos em rendimentos de moderado a bom, totalizando 48 compostos, foram avaliados em ensaios de atividade tripanocida, envolvendo a cepa Tulahuen de T. cruzi, bem como ensaios de citotoxicidade. Considerando as cinco séries sintetizadas (28, 29, 30, 31 e 32), vale destacar que a maioria apresentou compostos com potente atividade tripanocida, a partir de 1,4 ?M, superior ao fármaco disponível benznidazol (7,9 ?M) e, adicionalmente, não apresentaram citotoxicidade em ensaios realizados por citometria de fluxo. / Chagas\' disease is caused by the Trypanosoma cruzi, whichhas two clinical stages. The treatment with the benznidazole is effective only in the acute stage, although with several side effects throughout the treatment period. Therefore, consortia are being established between \"government - university - industry\", with national and foreign financial support for drug discovery development. In spite of many available tools to design new compounds, the search for natural products still arouse interestfor a great number of researchers. Several papers have described studies of synthesis and trypanocidal activity of lignans, being veraguensin (17) and grandisin (18) worth to mention. Due to the lack of treatment and the high toxicity of the available drugs, this research has the aimto synthesize analogues from the above lignans, such astetrahydrofuran, furanic, pyrrolic derivatives and their intermediates,and test their trypanocidal activity and cytotoxicities. The synthetic strategy was based on the synthesis of 1,4-diarylacetylene-1,4-glycols (28a-t) via condensation reaction between phenyl carbinol (26) and substituted aryl aldehydes (27a-t) with several functional groups at different positionsof the aromatic ring. These intermediates, obtained in moderate yields, were converted to their corresponding 1,4-diaryl-1,4-dihydroxyl derivatives (30a-g) by the reduction reaction using platinum dioxide and, subsequently, oxidized to 1,4-diaryl-1,4-diketones (29a-g). From the synthesis of the intermediates 29 and 30, products of interest, 2,5-diaryl-furan (32a-g) and 2,5-diaryl-tetrahydrofuran (31a-g) were prepared from the cyclization reaction in the presence of the triflic and trifluoracetic acids, respectively. The intermediates and products, obtained in moderate to good yields, in a total of 48 compounds, were assessed in trypanocidal assays, using T. cruzi Tulahuen strain,as well as cytotoxicity assays. Considering the five synthesized series (28, 29, 30, 31 e 32), it is worth noting that the majority of the compounds showed potent trypanocidal activity from 1.4 ?M, higher than the available benznidazole (7,9 ?M) and, additionally, they were not cytotoxicin Flow Cytometry assays.

A doença de Chagas, uma infecção causada pelo protozoário Trypanosoma cruzi, é um grave problema de saúde pública. Atualmente, cerca de dez milhões de pessoas em todo o mundo estão infectadas, sendo que a situação é mais crítica na América Latina, onde a doença é endêmica. A necessidade de novas alternativas terapêuticas é grande, pois os fármacos disponíveis apresentam sérias limitações, como baixa eficácia e alta toxicidade. A enzima cruzaína, uma cisteíno-protease essencial à sobrevivência do parasita, é considerada um importante alvo para o desenvolvimento de novos agentes antichagásicos. Neste trabalho, o objetivo foi o desenvolvimento de novos inibidores da enzima cruzaína empregando como modelo um composto hit (1) com propriedades anti-T. cruzi. Este inibidor competitivo (um derivado imidazólico), que apresenta elevada potência e afinidade contra a enzima alvo (IC50 = 1 µM e Ki = 120 nM, respectivamente), foi identificado em trabalhos anteriores de nosso grupo por meio da integração de técnicas computacionais (triagem virtual) e experimentais (avaliação bioquímica in vitro). A presente proposta de planejamento molecular, empregando métodos de química medicinal, levou a investigação de padrões estruturais explorando a complementaridade entre as moléculas pequenas e os resíduos de aminoácidos dos subsítios da cruzaína. Um conjunto promissor de 38 compostos foi planejado, sintetizado e avaliado em ensaios in vitro frente à enzima cruzaína e posteriormente, contra o parasita. Entre os derivados do composto hit (1), que apresentaram valores de IC50 contra a enzima alvo na faixa nano- e micromolar, destaca-se o composto 14 (IC50 = 120 nM e Ki = 20 nM), um inibidor competitivo, potente e de alta afinidade contra a enzima alvo, que também apresentou atividade in vitro e in vivo contra o parasita. A integração de métodos experimentais e computacionais foi útil no processo de otimização de inibidores inéditos da cruzaína. As relações entre a estrutura e atividade obtidas são de grande relevância para o desenvolvimento de candidatos a novos fármacos para a terapia da doença de Chagas. / Chagas´ disease, an infection caused by Trypanosoma cruzi, is a serious public health problem. Currently, about ten million people are infected worldwide, and the situation is more critical in Latin America, where the disease is endemic. The need for new therapies is urgent, since the drugs available have serious limitations, such as low efficiency and high toxicity. The cruzain enzyme, an essential cysteine protease for the parasite survival is considered an important target for the development of new antichagasic agents. In this work, the goal was the development of new cruzain inhibitors based on modifications of a hit compound (1) with properties anti-T. cruzi. This competitive inhibitor (an imidazole derivative), shows high affinity and potency (IC50 = 1 µM and Ki = 120 nM, respectively), and was identified in a previous work in our group by integrating computational techniques (virtual screening) and experimental (in vitro biochemical evaluation). The proposed molecular design, employing methods of medicinal chemistry, aimed to investigate structural patterns exploiting the complementarity between small molecules and amino acid residues of the subsites of cruzain. A promising set of 38 compounds was designed, synthesized and evaluated in in vitro assays against the cruzain enzyme and subsequently against the parasite. Among the derivatives of the hit compound (1), which had IC50 values against the target enzyme in the nano- and micromolar range, the compound 14 (IC50 = 120 nM and Ki = 20 nM), a potent and high affinity competitive inhibitor against cruzain showed activity in vitro and in vivo against the parasite. This work illustrates the importance of the integration of experimental and computational methods in the optimization process of novel cruzain inhibitors. The structure-activity relationship studies revealed in this work are useful for the development of new drug candidates for the treatment of Chagas´ disease.

A doença de Chagas é uma infecção causada pelo protozoário intracelular Trypanosoma cruzi. Atualmente 7 a 8 milhões de pessoas encontram-se infectadas, e há 25 milhões de pessoas em áreas de risco de contaminação. A cada ano ocorrem 56.000 novos casos e, aproximadamente, 12.000 mortes por complicações oriundas da doença. É endêmica em 21 países da América do Sul, e pode ser encontrada, também, na América do Norte e Europa devido a processos migratórios. Somente dois fármacos estão disponíveis para o tratamento da doença de Chagas, o nifurtimox e o benznidazol, que são ativos somente na fase aguda e causam sérios efeitos adversos. Diante deste panorama, é eminente a necessidade de novos antichagásicos. A enzima cruzaína é a principal cisteíno-protease presente no T. cruzi, é importante para a sobrevivência, diferenciação e entrada do parasita no hospedeiro, se apresentando como um excelente alvo biológico na busca de novos quimioterápicos. Derivados de semicarbazona, tais como o nitrofural e o hidroximetilnitrofural demonstraram atividade inibitória da cruzaína, sendo considerados protótipos na busca de antichagásicos. Utilizando estratégias modernas de planejamento de fármacos por meio da integração entre técnicas computacionais, modelagem molecular e docking, e experimentais, síntese e ensaios biológicos, realizou-se neste trabalho o planejamento, síntese e avaliação biológica de bioisósteros do nitrofural como candidatos à antichagásicos. Aplicou-se estudos de modelagem molecular e docking para 10 compostos derivados de aminoguanidina, semi e tiossemicarbazona; observamos nesses estudos que os compostos contendo tiossemicarbazona apresentaram resultados mais favoráveis ao mecanismo de ação proposto, o qual sugere-se um ataque nucleofílico do resíduo de Cys25 presente no sítio catalítico da enzima cruzaína à tiocarbonila presente nesses compostos. Obtiveram-se através da síntese, 6 compostos caracterizados por RMN 1H e 13C. Tais compostos foram submetidos a ensaios de inibição da cruzaína, sendo que os derivados 6, 9 e 10, apresentaram um perfil de inibição favorável em dose de 100 µM, com valores entre 70 e 75% de inibição. Em ensaio de inibição de crescimento celular em formas epimastigotas do T. cruzi o composto 9 apresentou um IC50 de 19,8 µM, sendo o melhor protótipo para desenvolvimento de um novo agente antichagásico. De uma maneira geral os resultados obtidos nos ensaios biológicos corroboram com os dados apresentados na modelagem molecular, uma vez que os compostos contendo a cadeia lateral tiossemicarbazona mostraram melhores resultados em ambos os testes, demonstrando que a integração entre técnicas computacionais e experimentais se apresenta como uma excelente estratégia na busca de novos agentes antichagásicos. / Chagas disease is an infection caused by the intracellular protozoan Trypanosoma cruzi. Currently 7 million to 8 million people are infected, and there are 25 million people in areas at risk of contamination, with 56,000 new cases each year and roughly 12,000 deaths are related to Chagas complications. It is endemic in 21 countries in South America, and can also be found in North America and Europe due to migration processes. Only two drugs are available for treatment of Chagas disease, nifurtimox and benznidazole, which are active only in the acute phase and cause serious adverse effects. Against this background, it is imminent need for new antichagasic. The enzyme cruzain is the major cysteine protease present in the T. cruzi, is important for the survival, differentiation and entry of the parasite in the host, presenting itself as an excellent biological target in the search for new chemotherapeutic agents. Semicarbazone derivatives, such as nitrofurazone and hydroxymethylnitrofurazone showed inhibitory activity cruzain being considered prototypes in search antichagasic. Using modern drug design strategies through the integration of computational techniques, molecular modeling and docking, and experimental synthesis and biological assays. In this work were performed design, synthesis and biological evaluation of the bioisosters nitrofurazone as candidates for antichagasic. Were applied molecular modeling and docking studies for ten derivatives compounds of aminoguanidine, semi and thiosemicarbazone. In these studies thiosemicarbazone derivatives compounds showed more favorable for the mechanism of action proposed, that suggest a nucleophilic attack of the Cys25 residue present in the catalytic site of the enzyme cruzain in the thiocarbonyl group. Six compounds were synthesized and characterized by 1H and 13C NMR. These compounds were tested for inhibition of cruzain, and derivatives 6, 9 and 10 showed favorable enzyme inhibition at single dose of 100 µM, with values between 70 and 75%. In the inhibition assay of cell growth in epimastigotes forms of T. cruzi, the compound 9 showed an IC50 of 19.8 µM, the best prototype for the development of a new antichagasic agent. In general the results obtained by biological assay corroborate the data presented in molecular modeling, since compounds containing side chain thiosemicarbazone showed better results in both tests, showing that the integration of experimental and computational techniques is presented as a excellent strategy in the search for new agents antichagasic

trans-Sialidase de Trypanosoma cruzi (TcTS) pertence à família de glicoproteínas de superfície do parasita e constitui um dos poucos exemplos naturais de glicosiltransferases superficiais encontradas em eucariotes. T. cruzi é incapaz de sintetizar ácido siálico e utiliza esta enzima para retirar este monossacarídeo de glicoconjugados do hospedeiro para sialilar moléculas aceptoras, como mucina-GPI, presentes na sua membrana plasmática. Esta enzima é específica em catalisar, preferencialmente, a transferência de ácido siálico para moléculas de mucina, originando ligações -2,3 com moléculas de galactose aceptoras na superfície do parasita. As moléculas de mucina sialiladas estão envolvidas no processo de aderência e subseqüente penetração do parasita nas células do hospedeiro. Considerando a heterogeneidade das moléculas de mucina de T. cruzi, não existem compostos disponíveis que atuem como substratos glicopeptídicos sintéticos. Desta forma, este trabalho teve como objetivo o desenvolvimento de métodos químicos e químico-enzimáticos de síntese de glicopeptídeos de mucina de T.cruzi para investigação da natureza das interações moleculares críticas envolvidas no reconhecimento e processamento de glicosídeos contendo ácido siálico, na presença de trans-sialidase. O melhor entendimento destas interações conduziu ao planejamento racional de potenciais inibidores seletivos de trans-sialidase de T. cruzi. Alguns dos principais glicopeptídeos, obtidos por metodologias de síntese em fase sólida e síntese químico-enzimática com a enzima 1,4-galactosiltransferase (1,4-GalT) foram: NH2(Thr)2-(LacNAc)-(Thr)3-GlyOH 2, NH2(Thr)2-(LacNAc)-(Thr)3-GlyOH 4 e NH2(Thr)2-(LacNAc)-(Thr)3-(LacNAc)-(Thr)3-GlyOH 5. Como precursores destes glicopeptídeos os blocos de construção GlcNAc-FmocThrOH 24, GlcNAc-FmocThrOH 25, Gal-FmocThrOH 27 e LacNAc-FmocThrOH 75 foram sintetizados por meio de reações de glicosilação do aminoácido treonina 18, contendo os grupos protetores N-Fmoc e O-Bn, com os correspondentes açúcares GlcNAcCl 12, GalBr 13 e LacN3Cl 33, seguidas de reações de hidrogenólise (10% Pd-C/ H2) para desproteção do grupo O-Bn e posterior acoplamento em cadeia peptídica rica em seqüência de treonina. Os aminoácidos glicosilados GlcNAc-ThrOH 22 e GlcNAc-ThrOH 23, totalmente desprotegidos, foram empregados em reações enzimáticas com a enzima 1,4-GalT, sendo obtidos os dissacarídeos glicosídicos LacNAc-ThrOH 53 e LacNAc-ThrOH 41 (também sintetizado quimicamente). Os dissacarídeos glicosídicos 41 e 53, os glicopeptídeos 2 e 4 e o aminoácido glicosilado Gal- ThrOH 28 foram submetidos aos ensaios enzimáticos com a enzima TcTS, sendo verificada a sialilação de todos os aceptores testados em rendimentos elevados, o que confirmou que estes compostos podem atuar como potenciais substratos da enzima TcTS. / Trypanosoma cruzi trans-sialidase (TcTS) belongs to the family of glycoproteins expressed on the surface of the parasite and constitutes one of the few examples of natural surface glycosyltransferases found in eucariotes. T. cruzi can not synthesize sialic acid itself and uses a trans-sialidase enzyme to scavenge this monosaccharide from host glycoconjugates to sialylate acceptors molecules, such as GPI (glycosylphosphatidylinositol)-anchored mucins, that are present in parasite plasma membrane. This enzyme is specific to catalise, preferentially, the transference of sialic acid to mucin glycoproteins, originating -2,3- linkages with acceptor galactose molecules in the parasite surface. The sialylated mucin molecules are involved in the attachment and subsequent penetration of the parasite into host cells. Given the heterogeneity of T. cruzi mucin molecules, there are no suitable synthetic occurring sources of TcTS glycopeptide substrates. Thus, the objective of this work was the development of chemical and chemoenzymatic methods of synthesis of T. cruzi mucin glycopeptides in order to investigate the nature of the molecular interactions involved in recognition and processing of containing sialic acid glycosides, in the presence of trans-sialidase. A better understanding of these interactions led to drug design of selective potential inhibitors for T. cruzi trans-sialidase. Some of the main glycopeptides obtained by methods of solid phase and chemoenzymatic synthesis with 1,4-galactosyltransferase (1,4-GalT) enzyme were: NH2(Thr)2-(LacNAc)- (Thr)3-GlyOH 2, NH2(Thr)2-(LacNAc)-(Thr)3-GlyOH 4 and NH2(Thr)2-(LacNAc)-(Thr)3- (LacNAc)-(Thr)3-GlyOH 5. As precursors of these glycopeptides, the building blocks GlcNAc-FmocThrOH 24, GlcNAc-FmocThrOH 25, Gal-FmocThrOH 27 and LacNAc- FmocThrOH 75 were synthesized by glycosylation reactions of the threonine amino acid 18, containing the protecting groups N-Fmoc and O-Bn, with the correspondent sugars GlcNAcCl 12, GalBr 13 and LacN3Cl 33, followed by hydrogenolysis reactions (10% Pd- C/ H2) for deprotection of O-Bn group and later coupling into the peptide chain rich in threonine sequence. The glycosylated amino acids GlcNAc-ThrOH 22 and GlcNAc-ThrOH 23, totally deprotected, were employed in enzymatic reactions with 1,4-GalT, being obtained the disaccharide glycosides LacNAc-ThrOH 53 and LacNAc-ThrOH 41 (also chemically synthesized). The disaccharide glycosides 41 and 53, the glycopeptides 2 and 4 and the glycosylated amino acid Gal-ThrOH 28 were submitted to enzymatic assays with TcTS enzyme, being verified the sialylation of all tested acceptors in high yields, which confirmed that these compounds can act as potential acceptors substrates for TcTS enzyme.

Mucinas são glicoproteínas altamente O-glicosiladas cuja principal característica estrutural é a presença de -GalNAc ligado aos resíduos hidroxilados de serina e treonina. Em alterações celulares malignas, esse núcleo é exposto como um antígeno carboidrato associado a tumor (Tn) e sua alta expressão em células cancerosas faz dele um alvo para o desenvolvimento de abordagens contra o câncer. Mucinas de Trypanosoma cruzi, agente etiológico da Doença de Chagas, apresentam -GlcNAc ligado à apoproteína, envolvido no processo de sialilação catalisado pela enzima fundamental trans-sialidase (TcTS) mediadora da invasão celular. Sendo o componente glicosídico do antígeno Tn um análogo estrutural e funcional de -GlcNAc, pode influenciar na atividade de TcTS, alvo terapêutico para a Doença de Chagas. Neste contexto, foram sintetizados glicopeptídeos lineares e cíclicos derivados de GalNAc mimetizando sua ocorrência em mucinas tumorais e parasitárias. Doadores e aceptores glicosídicos convenientemente protegidos foram preparados e ligados entre si com -estereosseletividade por dois métodos de glicosilação: perclorato/carbonato de prata (promotor clássico de referência) e brometo de mercúrio (promotor pela primeira vez utilizado para doadores glicosídicos do tipo azidocloreto). Os blocos de glicoaminoácidos obtidos foram acoplados a um segundo resíduo, formando glicodipeptídeos lineares inéditos, que originaram glicodicetopiperazinas funcionalizadas com -GalNAc, igualmente inéditas a literatura, mediante a etapa de desproteção/ciclização. Glicoaminoácidos intermediários contendo -GalNAc foram desprotegidos e submetidos a ensaios de cinética enzimática em TcTS, apresentando expressiva inibição de 57% a 79% da atividade da enzima. Os mesmos blocos foram avaliados quanto à citotoxicidade em células tumorais, apresentando entre 73% e 79% de morte celular na linhagem Jurkat e cerca de 30% na linhagem B16F10. Os resultados ensaios biológicos sugerem que os compostos de interesse preparados podem atuar como inibidores da enzima TcTS e agentes de citotoxicidade seletiva em células tumorais. / Mucins are heavily O-glycosylated glycoproteins which major feature being the presence of -GalNAc bound to hydroxylated protein residues of serine and threonine. In malignant cell transformation this core is exposed as a tumor associated carbohydrate antigen (Tn), and its high-level expression in cancer cells turns it into a target for developing anticancer approaches. Mucins from Trypanosoma cruzi, aetiologic agent of Chagas Disease, display -GlcNAc linking glycans to the apoprotein, involved in the sialilation process catalized by tran-sialidase enzyme (TcTS), essential cell invasion by the parasite. Being Tn antigen an structural and functional analogue of -GlcNAc, it may interfere on TcTS, a therapeutic target Chagas Disease. In this context, linear and cyclic glycopeptides containing GalNAc were synthesized, mimicking their natural occurrence in tumoral and parasite mucins. Glycosidic donors and acceptors, conveniently protected were prepared and bound to each other with -stereoselectivity, though two glycosylation methods: silver perchlorate/carbonate (classical reference promoter) and mercuric bromide (first used as a promoter for azidochloride donors). Glycoaminoacids building blocks obtained were coupled to a second residue, furnishing novel linear glycopeptides, which generated glicodiketopiperazines functionalized with -GalNAc, equally unpublished, upon deprotection/cyclization step. Intermediate -GalNAc-containing glycoaminoacids were deprotected and subjected to kinetic enzymatic assay on TcTS, showing expressive enzyme activity inhibition from 57% to 79%. The same compounds were assessed for cytotoxicity on tumoral cells, showing from 73% to 79% of death for Jurkat cells and about 30% for B16F10 cells. Biological results sugest that the prepared compounds of interest may act as TcTS enzyme inhibitors and selective cytotoxic agents on tumoral cells.

A doença de Chagas, também conhecida como tripanossomíase americana, é uma das doenças tropicais mais devastadoras e é causada pelo protozoário Trypanosoma cruzi. O parasita expressa uma enzima de superfície, Trypanosoma cruzi trans-sialidase (TcTS), responsável pela transferência de ácidos siálicos de células do hospedeiro para moléculas de -galactose terminais presentes em glicoproteínas de sua superfície. As moléculas de glicoproteína sialiladas estão envolvidas na adesão e subsequente penetração do parasita em células hospedeiras. Logo, TcTS desempenha papel fundamental no reconhecimento e na invasão de células do hospedeiro. Além disso, a ausência de trans-sialidase em seres humanos faz de TcTS um alvo potencial a ser explorado, no entanto nenhum inibidor desta enzima (em concentração nanomolar) é conhecido até o momento. Considerando a importância da unidade de galactose e da função carboxila do ácido siálico para interações no sítio activo de TcTS, focamos na síntese de derivados de galactose com ácido succínico em diferentes posições do anel de açúcar e sua avaliação biológica em TcTS. Além disso, foi proposta uma busca por novos inibidores de TcTS através de técnicas de modelagem molecular, como triagem virtual baseada no sítio ativo da enzima. -D-galactose e -Dgalactopiranosídeo de metila, disponíveis comercialmente, foram tratados com reagentes adequados para fornecer alguns intermediários com apenas uma hidroxila livre em poucas etapas. O tratamento destes compostos com anidrido succínico em piridina levou à formação dos respectivos derivados com ácido succínico em todas as posições do anel galactosídico. Após etapa de desproteção foi obtido apenas o derivado com ácido succínico na posição 4 (85), que foi testado em TcTS por ensaio fluorimétrico in vitro para avaliação de sua atividade inibitória. Adicionalmente, 85 foi testado em ensaios in vitro para avaliação de sua atividade tripanocida e citotóxica. De acordo com os ensaios biológicos, o composto 85 apresentou atividade inibitória promissora (56%) na concentração de 1,0 mM. Esse resultado preliminar foi importante para mostrar que esse tipo de derivado pode atuar como inibidor de TcTS e para orientar a síntese de novos derivados de galactose. O valor da atividade tripanocida foi inferior a 40% (0,5 mM) e não foi observada citotoxicidade na concentração de 0,5 mM. Os estudos de triagem virtual realizados neste trabalho através de simulações de \"docking\" resultaram na seleção das 50 melhores moléculas, baseada na orientação de maior pontuação, dentre 50.000 encontradas na base de dados diverset. O próximo passo envolve novos estudos para filtrar as moléculas mais promissoras para serem testadas em TcTS. / Chagas\' disease, also known as American trypanosomiasis, is one of the most devastating tropical diseases and it is caused by the protozoan Trypanosoma cruzi. The parasite expresses a cell surface enzyme, Trypanosoma cruzi trans-sialidase (TcTS), responsible for the transference of sialic acids from host cells to terminal -galactose molecules present on its glycoprotein surface. The sialylated glycoprotein molecules are involved in the attachment and subsequent penetration of the parasite into host cells. As a result, TcTS plays a key role in the recognition and invasion of host cells. Moreover, the lack of trans-sialidase in humans makes TcTS a potential drug target to be explored, however no strong inhibitors (at nanomolar range) of this enzyme are known to date. Considering the importance of galactose unit and the carboxyl function in sialic acid for interactions in the active site of TcTS, we have focused on the synthesis of galactose derivatives containing succinic acid in different positions of the sugar ring and on their biological evaluation against TcTS. In addition, we have proposed the search for new TcTS inhibitors applying molecular modeling techniques, like virtual screening based on the enzyme´s active site. Commercially available ,-D-galactose and methyl--D-galactopyranoside were treated with suitable reagents to afford some intermediates with just one free hydroxyl group in few steps. Treatment of these compounds with succinic anhydride in pyridine afforded derivatives thereof with succinic acid in all galactosidic ring positions. After deprotection step it was only obtained the derivative containing succinic acid at position 4 (85), which was tested in in vitro TcTS fluorimetric assay for evaluation of its inhibitory activity. In Addition, 85 was tested in in vitro assays for assessment of their trypanocidal activity and cytotoxic. According to the biological assays, compound 85 showed promising inhibitory activity (56%) at 1.0 mM concentration. This preliminary result was important both to show that this type of derivative can act as an inhibitor of TcTS and to guide the synthesis of new derivatives of galactose. The trypanocidal activity value was lower than 40% (0.5 mM) and there was no cytotoxicity at 0.5 mM concentration. The virtual screening studies performed in this work through docking simulations resulted in the selection of the 50 top-ranked molecules, based in the highest score orientation, among 50.000 found at diverset data base. The next step involves new studies to filter the most promising molecules to be tested against TcTS.

A tripanossomíase sul-americana, também conhecida como Doença de Chagas é uma enfermidade endêmica da América Latina.A doença é causada pelo protozoário Trypanosoma cruzi, cuja transmissão em seres humanos e outros mamíferos ocorrem, principalmente, através das fezes do inseto \"barbeiro\" (triatoma infestans) infectado.Desde a descoberta já foram realizadas inúmeras tentativas de tratamento sem obter quimioterapia eficaz. Hoje o tratamento é realizado pelo uso do fármaco nitroheterocíclico benznidazol. Porém esse composto só é utilizado na fase aguda da doença e tem sua eficácia variada de acordo com a área geográfica, provavelmente como consequência de variação de cepas do parasita e apresenta graves efeitos colaterais. Uma ferramenta interessante em Química Medicinal é o uso do bioisosterismo para a síntese de moléculas análogas, que por possuírem propriedades biológicas relacionáveis geralmente atuam no mesmo alvo farmacológico como agonistas ou antagonistas. Por outro lado, as reações relacionadas às condensações de cicloadição 1,3 dipolar catalisadas por Cu(I), envolvendo estratégias de \"click chemistry\" tem como pontos positivos o fato de geralmente não formarem subprodutos, serem de fácil execução e apresentarem rendimentos elevados. Partindo de dois compostos comerciais (benzilamina e cloreto de cloro acetila) efetuou-se a síntese de uma biblioteca de vinte e três compostos análogos ao benznidazol através de uma rota sintética curta e de fácil execução. Foram realizados ensaios de atividade tripanocida envolvendo a cepa Tulahuen de T.cruzi, bem como ensaios de citotoxicidade. / The South American trypanosomiasis, also known as Chagas\' disease is an endemic disease in Latin America. The disease is caused by the protozoan Trypanosoma cruzi, whose transmission in humans and other mammals occur primarily through the faeces of the insect \"barbeiro\" (triatoma infestans) infection. Since the discovery already been carried out many attempts to obtain effective chemotherapy treatment. Today\'s treatment is accomplished through the use of the drug nitro-heterocyclic benznidazole. However this compound is only used in the acute phase of the disease and its effectiveness is varied in accordance with the geographical area, probably as a consequence of the variation of strains of the parasite and presents serious side effects. An interesting tool in medicinal chemistry is the use of bioisosterism for the synthesis of analogous molecules, which possess biological properties relatable generally act on the same target as pharmacological agonists or antagonists. Moreover, the reactions related to condensations of 1.3 dipolar cycloaddition catalyzed by Cu(I), involving strategies \"click chemistry\" has the strengths of the fact usually do not form byproducts, being easy to perform and present high yields. Starting from two commercial compounds benzylamine and chloro acetyl chloride) we performed the synthesis of a library of twenty-three analog compounds to benznidazole via a synthetic route short and easy to perform. Tests of trypanocidal activity involving Tulahuen strain of T. cruzi, and cytotoxicity assays.

O Trypanosoma cruzi expressa um grupo de glicoprotcinas de superfície, denominadas Tc-85, que pertencem à superfumília gêmca das gp85/traus-sialidases. Nosso laboratório clonou e caracterizou um membro da fumília Tc85 (Tc85-11), cuja região carboxila tenninal (clone Tc85-1) adere em laminina e em células de mamífero. Usando peptídeos sintéticos, correspondendo em seqüência à Tc85-1, caracterizou-se o motivo mais conservado da superfamilia gênica das gp85/trans-sialidases (VTVxNVFLYNR), o qual não adere em laminina. Esse motivo foi chamado peptídeo J. Por cromatografia de extratos de membrana de cardiomiócitos em coluna de afmidade contendo peptídeo J, foi isolada uma molécula de 30kDa identificada como sendo a subunidade β3 da Na+, K+ ATPase. A porção extracelular da subunidade β3 da Na+, K+ ATPase foi clonada e a interação in vitro desta proteína com peptídeo J foi observada. Deste modo, é sugerido aqui que a subunidade β3 da Na+, K+ ATPase pode ter um papel importante na interação do parasita com a célula hospedeira. / Abstract not available.