A doença de Chagas, descrita em 1909 pelo médico sanitarista brasileiro Dr. Carlos Chagas, é causada pelo parasito Trypanosoma cruzi. É uma doença tropical negligenciada que afeta aproximadamente entre 12 e 14 milhões de indivíduos em América latina. No ano de 2008 foi responsável pela morte de cerca de 10 mil pessoas no mundo, sendo que a terapia atual consiste no uso dos fármacos benzonidazol e nifurtimox que são eficazes apenas no estágio inicial da doença (fase aguda) e ainda possuem efeitos colaterais severos. Esse quadro justifica a necessidade da busca por substâncias mais eficientes para o tratamento dessa doença. Entre os candidatos em fase pré-clínica, o K777 mostrou-se eficaz em eliminar efetivamente a infeção pelo T. cruzi em modelos animais por meio da inibição irreversível da Enzíma cruzaína, uma cisteíno protease expressada durante todo o ciclo de vida do parasito. Novas técnicas em planejamento computacional de fármacos tem possibilitado a rápida identificação de compostos bioativos com atividade contra essa Enzíma. A abordagem baseada em fragmentos moleculares foi utilizada para identificação de pequenas substâncias bioativas. Aqui, uma junção molecular foi realizada entre fragmentos ativos, obtidos em estudos prévios, com a finalidade de explorar o sítio ativo da cruzaína. Os compostos foram sintetizados por meio de reações de acoplamento, com a finalidade de investigar a relação estrutura atividade (SAR), visando potencializar as interações responsáveis pela inibição no alvo. Os análogos obtidos foram testados in vitro, utilizando-se a espectrometria de fluorescência para a confirmação da inibição da atividade enzimática. / Chagas disease, described in 1909 by the Brazilian physician Carlos Chagas, is caused by the parasite Trypanosoma cruzi, which is a neglected tropical disease that affects approximately 10 million individuals. In 2008, Chagas disease was responsible for the death of about 10 thousand people, and the current therapy consists of the use of benznidazole and nifurtimox drugs that are only effective in the early stage of the disease (acute phase) and still have severe side effects. This scenario justifies the need to search for more efficient substances for the treatment of Chagas disease. Among candidates in pre-clinical phases, the K777 was effective in eliminating the T. cruzi infection in animal models by irreversibly inhibiting the enzyme cruzain, which is a cysteine protease expressed throughout the parasite lifecycle. New techniques in computational drug design have enabled the rapid identification of bioactive compounds with activity against this cruzain. A molecular approach based on fragments was used to identify small bioactive substances of the class. The dipeptidil nitriles were synthesized via coupling reactions, in order to investigate the structure activity relationship (SAR) aimed at enhancing the interactions responsible for inhibition of the target cruzain enzyme. The analogs have been assayed in vitro using fluorescence spectrometry to confirm inhibition of cruzain activity that inhibit cruzain in low-micro molar range.

Made available in DSpace on 2016-08-10T10:55:15Z (GMT). No. of bitstreams: 1 SANDRA ARANTES DE MATTOS CASTRO.pdf: 5216172 bytes, checksum: 0c82fa0e4740cdf88f9a7275f33c4e4b (MD5) Previous issue date: 2006-08-18 / A preliminary study of the wild fauna host of T. cruzi was carried out within the area of influence of the reservoir of the Corumbá IV hydroelectric power plant where through the faunal rescue of vertebrates specimens of possums, armadillos, rodents, monkeys, foxes and anteaters where collected. Blood samples where collected from a total of 23 wild mammals and used to detect T. cruzi using three parasitological diagnostic methods including thin and thick blood scrubs, hemoculture and the polymerase chain reaction (PCR), and an immunonological method represented by indirect fluorescence antibody test (IFAT).The reactions were carried out to evaluate the efficiency of the methods in the diagnostic of the infection in wild reservoirs and the real incidence of T. cruzi in wild mammal. The data obtained were compared with the data of the occurrence of the disease in the region valuated in relation of the environmental impact on the wild fauna. / Um estudo preliminar da fauna silvestre hospedeira de T. cruzi foi realizado na região do entorno de Brasília, na área de influência do reservatório da Usina Hidrelétrica (UHE) Corumbá IV onde, através do resgate da fauna de vertebrados, foram capturados espécimes de gambás, tatus, roedores, macacos, raposas e tamanduás. Amostras de sangue foram coletadas de um total de 23 mamíferos silvestres e submetidas à pesquisa de T. cruzi através de três métodos de diagnóstico parasitológico, incluindo o esfregaço sanguíneo delgado e em gota espessa, a hemocultura e a reação em cadeia da polimerase (PCR), e um método imunológico representado pela imunofluorescência indireta (IFI). As reações foram realizadas com o propósito de avaliar a eficiência dos métodos no diagnóstico da infecção em reservatórios silvestres e a real incidência de T. cruzi em mamíferos silvestres. Os dados obtidos foram posteriormente comparados com os dados de ocorrência da doença na região, e também, avaliados em relação ao impacto ambiental sobre a fauna silvestre.

A doença de Chagas afeta cerca de 6 a 7 millhões de pessoas no mundo, principalmente América Latina. A busca de alternativas terapêuticas para esta enfermidade tem grande relevância para a sociedade, já que as opções atuais são limitadas, sendo disponível apenas o benznidazol (BZD) e nifurtimox. Os derivados nitroheterocíclicos são considerados compostos bioativos com número crescente de estudos na comunidade científica contra seu agente etiológico, o Trypanosoma cruzi. Neste sentido, o presente trabalho tem por objetivo a identificação de derivados do 5-nitrofurano com atividade frente a diferentes cepas do T. cruzi, assim como estudar possíveis modo de ação desta classe de compostos. Esta investigação envolve estudos computacionais com o propósito de construir modelos quantitativos de relações estrutura-atividade (QSAR multivariado) que possam auxiliar na previsão de novas estruturas com perfil farmacológico otimizado. No presente trabalho foram realizadas as etapas de planejamento, síntese e identificação de 36 compostos com resultados satisfatórios quanto à identificação estrutural, pureza e rendimento, que foi da ordem de 70%. A determinação da atividade anti-T. cruzi in vitro dos compostos obtidos foi realizada frente às cepas Silvio X10 cl1, Y, Bug 2149 cl10 e Colombiana na forma epimastigota do parasito. A maioria dos compostos analisados apresentou maior capacidade de inibição de crescimento do parasito, comparado ao BZD: Silvio X10 cl1 - IC50 = 29,16 ±2,90 µM, Y - IC50 = 40,40 ±3,37µM, Bug 2149 cl10 - IC50 = 30,63 ±3,21 µM, Colombiana - IC50 = 47,91 ±4,96 µM. O composto mais ativo (BSF-35) apresentou os seguintes valores: Silvio X10 cl1 - IC50 = 3,17 ±0,32 µM, Y - IC50 = 1,17 ±0,12 µM, Bug 2149 cl10 - IC50 = 1,81 ±0,18 µM e Colombiana - IC50 = 3,06 ±0,23 µM. Foram realizados cálculos de propriedades moleculares das estruturas tridimensionais dos compostos, seguido pela análise exploratória de dados por análise de agrupamentos hierárquicos (HCA) e análise de componentes principais (PCA), possibilitando o reconhecimento de padrões do conjunto. Considerando esta análise prévia, foram obtidos modelos QSAR com abordagem multivariada, aplicando algorítmo OPS e método de regressão por quadrados mínimos parciais, PLS. Os melhores modelos gerados foram obtidos considerando os compostos benzenos substituídos para as quatro cepas estudadas. Os descritores que mais influenciaram na análise foram o ClogP (coeficiente de partição) e cargas CHELPG. Considerando as informações obtidas, foram planejados e sintetizados quatro novos compostos com objetivo de obter compostos mais ativos e validar os modelos QSAR. Estes compostos apresentaram alta atividade frente a forma epimastigota das quatro cepas estudadas. Os compostos mais ativos foram avaliados quanto a citotoxicidade frente células LLC-MK2 e apresentaram seletividade até 25 vezes superior ao BZD. Estudos in vitro frente a forma amastigota da cepa Y em células U2OS foram realizados com metodologia fenotípica de análise de alto conteúdo (HCA\') e os compostos apresentaram atividade até 64 vezes superior ao BZD e com seletividade de até 50 vezes superior a este fármaco. Quanto à determinação da atividade dos compostos frente às enzimas tripanotiona redutase (TcTR) e glutationa redutase (GR), os compostos analisados não apresentaram atividade relevante, indicando não ser este o mecanismo desta classe de compostos. Com finalidade de explorar outro possível mecanismo de ação dos compostos 5-nitrofurânicos, foi realizada a análise de potencial de redução da membrana mitocondrial, porém a morte parasitária não foi atribuída à despolarização da membrana em estudos simultâneos com iodeto de propídio. / Chagas disease affects approximately 6-7 millions people worldwide, especially Latin America. The search for therapeutic alternatives for this disease is of great relevance to society, as current options are limited and there are only two available drugs: benznidazole (BZD) and nifurtimox. The nitroheterocyclic derivatives are considered bioactive compounds with increasing number of studies in the scientific community against its etiologic agent, Trypanosoma cruzi. In this sense, this work aims to identify derivatives of 5-nitrofuran with activity against different strains of T. cruzi, and to study possible mode of action of this compounds. This research involves computational studies to obtain models of quantitative structure-activity relationships (QSAR multivariate) that can help predict new structures with optimized pharmacological profile. In this work were carried out the design, synthesis and identification of 36 compounds with satisfactory results regarding the structural identification, purity and yield (approximately 70%). The determination of anti-T. cruzi activity in vitro of the compounds obtained was carried out with Silvio X10 cl1, Y, Bug 2149 CL10 and Colombiana strains of epimastigote form of the parasite. Most of the compounds examined showed greater capacity of growth inhibition of the parasite compared to the BZD (Silvio X10 CL1 - IC 50 = 29.16 ± 2.90 µM, Y - IC50 = 40.40 ± 3,37µM, 2149 CL10 Bug - IC 50 = 30.63 ± 3.21 µM, Colombiana - IC 50 = 47.91 ± 4.96 µM). The most active compound (BSF-35) showed the following values: Silvio X10 cl1 - IC 50 = 3.17 ± 0.32 uM, Y - IC 50 = 1.17 ± 0.12 µM, Bug 2149 CL10 - IC50 = 1, 81 ± 0.18 µM and Colombiana - IC 50 = 3.06 ± 0.23 µM. Calculations were performed for the molecular properties of three-dimensional structures of the compounds, followed by exploratory data analysis by hierarchical cluster analysis (HCA) and principal component analysis (PCA), allowing the recognition of the set. Considering this preliminary analysis were obtained QSAR models with multivariate approach, using OPS algorithm and regression method of partial least squares, PLS. The best generated models were obtained considering the benzyl substituted compounds for the four strains. The descriptors that most influenced the analysis were ClogP (partition coefficient) and CHELPG charges. Considering the information obtained, four new compounds were designed and synthesized to obtain more active compounds and validate QSAR models. These compounds showed high activity against epimastigote form of the four strains studied. The most active compounds were evaluated for cytotoxicity against LLC-MK2 cells and the compounds selectivity values were up to 25 times higher than BZD. In vitro studies against amastigote form of the Y strain in U2OS cells were performed with phenotypic method of high content analysis (HCA\') and the compounds showed activity to 64 times higher than BZD and selectivity of up to 50 times. The activity of the compounds against trypanothione reductase enzymes (TcTR) and glutathione reductase (GR) showed no significant activity, indicating that this is not the mechanism of this class of compounds. In order to exploit another possible mechanism of action of 5-nitrofuran derivatives, analysis reduction of mitochondrial membrane potential was held, however the cell death was not attributed to membrane depolarization in simultaneous studies with propidium iodide.

Estudos anteriores dos alcalóides totais (AT) de Annona coriacea Mart. (Annonaceae) revelaram atividade antiprotozoária promissora. No presente trabalho, realizou-se o fracionamento biomonitorado dos AT de folha e selecionaram-se duas frações ativas (100% morte), frente às formas promastigotas de Leishmania (L.) chagasi in vitro, para a caracterização dos alcalóides, por CG-EM. Os AT bioativos de caule (100% morte) foram analisados sem fracionamento prévio. Em paralelo, efetuou-se amostragem de três exemplares de A. coriacea, analisados em conjunto, para o acompanhamento da variação do rendimento em AT e da atividade leishmanicida, por 12 meses. Nas frações bioativas de folha, foram caracterizados: estefarina (proaporfínico) e nornuciferina (noraporfínico) e nos AT de caule: pronuciferina (proaporfínico), asimilobina (noraporfínico) e boldina (aporfínico). A presença de boldina foi confirmada pela análise CG-EM do padrão, nas mesmas condições dos AT. Os resultados mostraram-se inéditos para a espécie e a ocorrência de pronuciferina e boldina constituiu o primeiro relato, no gênero Annona. Os dados referentes ao rendimento em AT (folha e caule) e à atividade antipromastigota in vitro indicaram comportamento, praticamente, constante dos parâmetros ao longo do ano. O óleo volátil de folha foi analisado, por CG-EM, tendo-se identificado 60 compostos, em mistura complexa de sesquiterpenos (76,7%) e monoterpenos (23,3%). O constituinte majoritário foi o sesquiterpeno biciclogermacreno (39,8%). O óleo volátil foi avaliado in vitro e apresentou atividade frente às formas promastigotas de quatro espécies de Leishmania e nas formas tripomastigotas de T. cruzi. A determinação e obtenção dos compostos bioativos motiva a continuidade da pesquisa. / Previous studies of total alkaloids (TA) from Annona coriacea Mart. (Annonaceae) have revealed potential antiprotozoal activity. In this study a bioguided fractionation of leaves TA was conducted and two fractions were active in vitro against Leishmania (L.) chagasi promastigotes (100% death) and selected in order to identify the alkaloid constituents, by GC-MS analysis. Stem bioactive TA (100% death) were also analyzed, without previous fractionation. Parallel to that, a sample of three combined specimens of A. coriacea (leaves and stem) was evaluated for the annual variation of TA production and the leishmanicide activity. Stefarine (proaporphine) and nornuciferine (noraporphine) were identified in the bioactive fractions of leaves while pronuciferine (proaporphine), asimilobine (noraporphine) and boldine (aporphine) were identified in stem TA. Boldine was confirmed by the GC-MS evaluation of the standard, under the same conditions of the TA. It was the first report of those alkaloids in this species and for pronuciferine and boldine occurrence in Annona genus. The TA yields (leaves and stem) and the in vitro antipromastigote activity remained almost unaltered throughout the year. The volatile oil of leaves was also analyzed by GC-MS. Sixty compounds were indentified in a complex mixture of sesquiterpenes (76.7%) and monoterpenes (23.3%). Byciclogermacrene was its major component (39.8%). The volatile oil was evaluated in vitro and was active against four species of Leishmania promastigotes and also against T. cruzi tripomastigotes. The identification of the bioactive constituents and their isolation are promising for further studies.

As células dendríticas (DCs) são críticas no processo de indução de imunidade e tolerância periférica. Estas células apresentam inúmeros receptores em sua superfície e podem ser classificadas em diferentes subpopulações de acordo com a expressão dos mesmos. Anticorpos monoclonais dirigidos contra diferentes receptores celulares vêm sendo utilizados com sucesso no tratamento de patologias como câncer. Nos últimos dez anos, demonstrou-se que é possível enviar antígenos diretamente para o receptor DEC205 presente na superfície das DCs. Quando isso acontece na ausência de estímulo inflamatório, o resultado é a indução de tolerância imunológica. Quando o antígeno é enviado a estas mesmas células na presença de um estímulo inflamatório, o resultado é a indução de uma forte resposta imunológica. Geramos um anticorpo <font face=\"Symbol\">aDEC205 em fusão com a proteína 2 de superfície dos amastigotas (ASP-2) de Trypanosoma cruzi e estudamos o efeito da administração deste anticorpo in vivo na presença de diferentes adjuvantes em duas linhagens distintas de camundongos. Observamos que ambas as linhagens de camundongos não foram capazes de gerar anticorpos, mas a resposta imune celular foi suficiente para reduzir a parasitemia quando desafiados com tripomastigotas cepa Y de Trypanosoma cruzi. Camundongos A/J foram capazes de mediar apresentação cruzada. Mapeamos um peptídeo que é reconhecido por camundongos BALB/c. Camundongos imunizados com Poly (I:C) como estímulo de maturação mostrou-se superior ao CpG. / As part of the innate immune system, dendritic cells (DCs) are critical in the process of induction of immunity and peripheral tolerance. These cells offer many receptors on their surface and can be classified in different subsets according to the expression there of. Monoclonal antibodies directed against different cellular receptors have been used successfully to treat diseases such as cancer. In the last ten years has been demonstrated that antigen can be sent directly to the receiver DEC205 present on the surface of DCs in vivo. When this happens in the absence of concomitant inflammatory stimulus, the result is the induction of immunological tolerance. Moreover, when the antigen is sent to the same cells in the presence of an inflammatory stimulus, the result is to induce a strong immune response. In this study we generated an antibody <font face=\"Symbol\">aDEC205 fusion protein with the amastigote surface protein 2 (ASP-2) from Trypanosoma cruzi and study the effect of administration of this antibody in vivo in the presence of different adjuvants in two distinct strains of mice. We observed that both strains of mice were unable to generate antibodies, but cellular immune response was sufficient to reduce the parasitemia when challenged with trypomastigotes Y strain of Trypanosoma cruzi. The mice A/J were able to mediate cross-presentation. In contrast, we mapped a peptide that is recognized by BALB/c mice. In counterpart mice immunized with Poly (I:C) as maturation stimuli was superior to CpG.

A doença de Chagas, zoonose causada pelo protozoário Trypanosoma cruzi, apresenta uma ampla distribuição na América Latina estendendo-se do Sul dos Estados Unidos até a Argentina. Estima-se existirem 10 milhões de pessoas infectadas e outras 25 milhões expostas ao risco. Apesar de descoberta há mais de um século, o mal de Chagas ainda é uma infecção grave que provoca grande impacto sócio-econômico, sem tratamento efetivo na fase crônica e que carece de conhecimentos científicos. O presente trabalho teve como objetivo a obtenção e o uso de linhagens consômicas de camundongos, na investigação da resistência. As linhagens consômicas foram produzidas por meio de acasalamentos programados e monitoração com marcadores polimórficos de DNA, onde um de seus cromossomos foi substituído pelo seu homólogo da outra linhagem. Como parentais foram utilizadas as linhagens isogênicas C57BL/6/J Unib, de fenótipo resistente (doadora) e A/JUnib, susceptível (receptora) empregadas na produção de cinco linhagens consômicas para os cromossomos 7 (CSs7), 11 (CSs11),14 (CSs14),17 (CSs17) e 19 (CSs19); descritos por Passos et al. (2003), como importantes no controle da infecção causada pela cepa Y do T.cruzi. Nos ensaios experimentais, os consômicos foram inoculados pela via i.p., com as doses de 101, 102, 103 e 104 empregando-se como controles animais de ambas as linhagens parentais. Em todos os consômicos, a resistência foi superior àquela observada no parental susceptível. Em um segundo protocolo, os consômicos foram acasalados com associações programadas e as progênies foram desafiadas empregando-se inóculos com doses crescentes de tripomastigotas. A resistência observada neste grupo foi também superior àquela observada no parental de fenótipo susceptível. Os resultados observados demonstram que o emprego das linhagens consômicas produzidas possibilitam avaliar a participação de cada cromossomo na resistência, bem como os efeitos da associação entre os cromossomos, que são uma estratégia eficiente no estudo de doenças multifatoriais de trato complexo, como a doença de Chagas. / Chagas disease, a zoonosis caused by the protozoan Trypanosoma cruzi, has a wide distribution in Latin America and extends from the southern part of the United States to Argentina. A number of 10 million of infected people is estimated and another 25 million exposed to the risk. Although discovered over a century, Chagas disease is still a serious infection that causes great socioeconomic impact, with no effective treatment at the chronic phase and in which, a lack of scientific knowledge can be observed. The main goal of this work was that obtaining and using consomic strain of mice, the resistance could be investigated. Consomic strains were produced by programmed mating, in which the animals were monitored with DNA polymorphic markers, and one of his chromosomes was replaced by his homologue from another strain. As parental, were used, the inbred strains C57BL/6/J Unib with resistant phenotype (donor) and as receiver, the A/JUnib strain, that has a susceptible phenotype. These models were used to produce five consomic strains: for the chromosomes 7 (CSs7), 11 (CSs11), 14 (CSs14), 17 (CSs17) and 19 (CSs19), described by Passos et al. (2003) as important in controlling infection caused by the Y strain of T. cruzi. In experimental testing, the consomics were inoculated intraperitoneally at doses of 101, 102, 103 and 104 using as control, animals from both parental lines. In all consomics, resistance was higher than that observed in the susceptible parental. In a second protocol, the consomics were mated with scheduled associations and the progenies were challenged with inocula employing increasing doses of trypomastigotes. The resistance observed in this group was also higher than that observed in the parental with susceptible phenotype. The observed results demonstrate that the use of the consomic strains that were produced order to assess the contribution of each chromosome in the resistance, as well as the effects of association between chromosomes are an effective strategy in the study of complex multifactorial diseases tract, such as Chagas disease.

A doença de Chagas é uma doença crônica causada pela infecção pelo protozoário Trypanosoma cruzi (T.cruzi). A sua principal consequência clínica é o desenvolvimento da cardiomiopatia chagásica crônica (CCC), que acomete 30% dos pacientes. Não foi determinado um indicador de evolução para a CCC ou permanência na forma indeterminada assintomática da doença de Chagas. Diversos trabalhos têm mostrado alterações no perfil de expressão gênica e proteômica ocorridas na fase aguda e crônica da doença de Chagas experimental e humana. Tais alterações advêm da regulação estabelecida em diversos estágios da expressão gênica e podem ser fatores relevantes no prognóstico da doença. Neste contexto, os microRNAs (miRs), podem exercer uma importante função reguladora. Sua ação se dá pela associação a um RNA mensageiro (RNAm) alvo, inibindo sua tradução ou degradando este transcrito. Assim, a hipótese deste trabalho é a de que a infecção aguda por T. cruzi modula a expressão de miRs no miocárdio de camundongos. Foi avaliado por qRT-PCR o perfil de expressão de miRs 15, 30 e 45 dias após a infecção. O perfil de expressão de miRs resultante foi suficiente para segregar os grupos de acordo com o tempo da infecção. O número de miRs diferencialmente expressos aumentou com a progressão da infecção. Além disso, seis miRs tiveram sua expressão correlacionada à piora na parasitemia e intervalo QTc dos animais: miR-142-3p miR-142-5p, miR-145, miR-146b, miR-149 e miR-21. Análises de correlação realizadas com todos os miRs avaliados ressaltaram este mesmo grupo de miRs entre os mais significativamente correlacionados, além de outros 73 correlacionados com a parasitemia, 67 com o intervalo QTc e 16 com ambos os parâmetros simultaneamente. Nas análises in silico, TNF-alfa e ciclina-D1 foram moléculas nodais recorrentes nas redes criadas com alvos dos miRs diferencialmente expressos em todos os tempos avaliados. Na única rede criada com os miRs correlacionados às alterações na parasitemia e intervalo QTc, TNF-alfa, TGF-beta, Rac1 e Src foram as moléculas nodais. Este trabalho apresenta de maneira inédita o envolvimento dos miRs durante a infecção aguda por T. cruzi, proporcionando novas perspectivas em relação a potenciais ferramentas terapêuticas e prognósticas / Chagas disease is a chronic illness caused by infection with the protozoan Trypanosoma cruzi (T. cruzi). Its main clinical outcome is the development of chronic Chagas cardiomyopathy (CCC), which affects 30% of the patients. The factors that define the progression to CCC or maintenance in the asymptomatic indeterminate form of the disease are still poorly understood. Several studies have presented changes occurred in the gene and proteomic expression profiles in both acute and chronic phases of experimental and human Chagas disease. Such changes result from regulation established at different stages of gene expression and may be relevant for the disease prognosis. In this context, microRNAs (miRs) may play an important regulatory function. miRs act by association to a target messenger RNA (mRNA), inhibiting translation or degrading the transcript. Thus, our hypothesis is that acute infection by T. cruzi modulates the expression of microRNAs in the myocardium of mice. The miR expression profile was evaluated by qRT-PCR 15, 30 or 45 days after the infection. This profile was sufficient to segregate the samples according to the time of infection. The number of differentially expressed miRs was higher as the infection progressed. Moreover, six miRs had their expression correlated with worsening of parasitaemia and QTc interval: miR-142-3p miR-142- 5p, miR-145, miR-146b, miR-149 and miR-21. Secondary unbiased correlation analyses showed this cluster of miRs among the most significant and other 73 miRs correlated with parasitaemia, 67 with QTc and 16 with both parameters simultaneously. In silico target prediction analyses showed TNF-alfa and cyclin-D1 as recurrent nodal molecules of the networks created with miRs targets from all time points. The network generated with miRs correlated to changes in parasitaemia and QTc interval showed TNF-alfa, TGF-beta, Rac1 and Src as nodal molecules. This work points out for the first time the involvement of miRs in the acute infection by T. cruzi, providing new insights about potential diagnostic and prognostic tools

trans-Sialidase de Trypanosoma cruzi (TcTS) pertence à família de glicoproteínas de superfície do parasita e constitui um dos poucos exemplos naturais de glicosiltransferases superficiais encontradas em eucariotes. T. cruzi é incapaz de sintetizar ácido siálico e utiliza esta enzima para retirar este monossacarídeo de glicoconjugados do hospedeiro para sialilar moléculas aceptoras, como mucina-GPI, presentes na sua membrana plasmática. Esta enzima é específica em catalisar, preferencialmente, a transferência de ácido siálico para moléculas de mucina, originando ligações -2,3 com moléculas de galactose aceptoras na superfície do parasita. As moléculas de mucina sialiladas estão envolvidas no processo de aderência e subseqüente penetração do parasita nas células do hospedeiro. Considerando a heterogeneidade das moléculas de mucina de T. cruzi, não existem compostos disponíveis que atuem como substratos glicopeptídicos sintéticos. Desta forma, este trabalho teve como objetivo o desenvolvimento de métodos químicos e químico-enzimáticos de síntese de glicopeptídeos de mucina de T.cruzi para investigação da natureza das interações moleculares críticas envolvidas no reconhecimento e processamento de glicosídeos contendo ácido siálico, na presença de trans-sialidase. O melhor entendimento destas interações conduziu ao planejamento racional de potenciais inibidores seletivos de trans-sialidase de T. cruzi. Alguns dos principais glicopeptídeos, obtidos por metodologias de síntese em fase sólida e síntese químico-enzimática com a enzima 1,4-galactosiltransferase (1,4-GalT) foram: NH2(Thr)2-(LacNAc)-(Thr)3-GlyOH 2, NH2(Thr)2-(LacNAc)-(Thr)3-GlyOH 4 e NH2(Thr)2-(LacNAc)-(Thr)3-(LacNAc)-(Thr)3-GlyOH 5. Como precursores destes glicopeptídeos os blocos de construção GlcNAc-FmocThrOH 24, GlcNAc-FmocThrOH 25, Gal-FmocThrOH 27 e LacNAc-FmocThrOH 75 foram sintetizados por meio de reações de glicosilação do aminoácido treonina 18, contendo os grupos protetores N-Fmoc e O-Bn, com os correspondentes açúcares GlcNAcCl 12, GalBr 13 e LacN3Cl 33, seguidas de reações de hidrogenólise (10% Pd-C/ H2) para desproteção do grupo O-Bn e posterior acoplamento em cadeia peptídica rica em seqüência de treonina. Os aminoácidos glicosilados GlcNAc-ThrOH 22 e GlcNAc-ThrOH 23, totalmente desprotegidos, foram empregados em reações enzimáticas com a enzima 1,4-GalT, sendo obtidos os dissacarídeos glicosídicos LacNAc-ThrOH 53 e LacNAc-ThrOH 41 (também sintetizado quimicamente). Os dissacarídeos glicosídicos 41 e 53, os glicopeptídeos 2 e 4 e o aminoácido glicosilado Gal- ThrOH 28 foram submetidos aos ensaios enzimáticos com a enzima TcTS, sendo verificada a sialilação de todos os aceptores testados em rendimentos elevados, o que confirmou que estes compostos podem atuar como potenciais substratos da enzima TcTS. / Trypanosoma cruzi trans-sialidase (TcTS) belongs to the family of glycoproteins expressed on the surface of the parasite and constitutes one of the few examples of natural surface glycosyltransferases found in eucariotes. T. cruzi can not synthesize sialic acid itself and uses a trans-sialidase enzyme to scavenge this monosaccharide from host glycoconjugates to sialylate acceptors molecules, such as GPI (glycosylphosphatidylinositol)-anchored mucins, that are present in parasite plasma membrane. This enzyme is specific to catalise, preferentially, the transference of sialic acid to mucin glycoproteins, originating -2,3- linkages with acceptor galactose molecules in the parasite surface. The sialylated mucin molecules are involved in the attachment and subsequent penetration of the parasite into host cells. Given the heterogeneity of T. cruzi mucin molecules, there are no suitable synthetic occurring sources of TcTS glycopeptide substrates. Thus, the objective of this work was the development of chemical and chemoenzymatic methods of synthesis of T. cruzi mucin glycopeptides in order to investigate the nature of the molecular interactions involved in recognition and processing of containing sialic acid glycosides, in the presence of trans-sialidase. A better understanding of these interactions led to drug design of selective potential inhibitors for T. cruzi trans-sialidase. Some of the main glycopeptides obtained by methods of solid phase and chemoenzymatic synthesis with 1,4-galactosyltransferase (1,4-GalT) enzyme were: NH2(Thr)2-(LacNAc)- (Thr)3-GlyOH 2, NH2(Thr)2-(LacNAc)-(Thr)3-GlyOH 4 and NH2(Thr)2-(LacNAc)-(Thr)3- (LacNAc)-(Thr)3-GlyOH 5. As precursors of these glycopeptides, the building blocks GlcNAc-FmocThrOH 24, GlcNAc-FmocThrOH 25, Gal-FmocThrOH 27 and LacNAc- FmocThrOH 75 were synthesized by glycosylation reactions of the threonine amino acid 18, containing the protecting groups N-Fmoc and O-Bn, with the correspondent sugars GlcNAcCl 12, GalBr 13 and LacN3Cl 33, followed by hydrogenolysis reactions (10% Pd- C/ H2) for deprotection of O-Bn group and later coupling into the peptide chain rich in threonine sequence. The glycosylated amino acids GlcNAc-ThrOH 22 and GlcNAc-ThrOH 23, totally deprotected, were employed in enzymatic reactions with 1,4-GalT, being obtained the disaccharide glycosides LacNAc-ThrOH 53 and LacNAc-ThrOH 41 (also chemically synthesized). The disaccharide glycosides 41 and 53, the glycopeptides 2 and 4 and the glycosylated amino acid Gal-ThrOH 28 were submitted to enzymatic assays with TcTS enzyme, being verified the sialylation of all tested acceptors in high yields, which confirmed that these compounds can act as potential acceptors substrates for TcTS enzyme.

O controle da infecção por Trypanosoma cruzi dependente da resposta de linfócitos T CD8+. Porém, o parasito faz a indução subótima destes linfócitos, que pode ser corrigida pela vacinação genética. Não se sabe como T. cruzi induz uma resposta ruim dos linfócitos T CD8+, nem como a vacinação reverte esta resposta. Estas questões foram objeto de estudo da presente tese. O envolvimento do imunoproteassomo foi investigado na indução de imunidade in vivo em animais triplamente deficientes das subunidades 1i, 2i e 5i (TKO), indicando que o imunoproteassomo é essencial para o processamento dos epítopos de T. cruzi relacionados à imunidade protetora de linfócitos T CD8+ gerados durante a infecção e na vacinação. Também foi observado que T. cruzi, mas não adenovírus, é capaz de tornar uma resposta ótima de linfócitos transgênicos induzidos in vivo em subótima. A interferência do parasito envolveu a supressão ativa do priming dos linfócitos T CD8+ mediada por linfócitos T CD4+ CD25- Foxp3+ de modo independente de IL-10, mas parcialmente dependente de TGF- e CTLA-4. / The control of infection by Trypanosoma cruzi relies on the response of CD8+ T cells. However, the parasite suboptimally induces these lymphocytes, which can be corrected by genetic vaccination. It is unknown how T. cruzi induces a poor response of CD8+ T cells and how vaccination reverts this. These questions were subject of study in this thesis. The involvement of the immunoproteasome was investigated in the in vivo induction of immunity in mice triply deficient of the subunits &beta;1i, &beta;2i e &beta;5i (TKO), indicating that the immunoproteasome is essential for the processing of T. cruzi epitopes related to the protective immunity of CD8+ T cells generated upon infection and vaccination. Also, it was observed that T. cruzi, and not adenovirus, is capable of turning an optimal response of in vivo-induced transgenic CD8+ T cells into suboptimal. The parasite interference involved the active suppression of CD8+ T cell priming mediated by CD4+ CD25- Foxp3+ lymphocytes, in an IL-10-independent, but TGF-&beta; and CTLA-4 partially dependent manner.

A doença de Chagas, uma infecção parasitária amplamente distribuída na América Latina, é um problema grave de saúde pública com consequências devastadoras em termos de morbidade e mortalidade humana. O arsenal terapêutico contra a doença é bastante limitado e insuficiente em todos os aspectos clínicos. Visando o desenvolvimento de novos agentes antichagásicos, várias proteínas do parasita têm sido exploradas como alvos terapêuticos. Neste contexto, a enzima cruzaína, uma cisteíno protease envolvida nos estágios de desenvolvimento e diferenciação do Trypanosoma cruzi, foi selecionada para os nossos estudos, visando a identificação de inibidores através do uso do método de planejamento de fármacos baseado na estrutura do receptor (SBDD, do inglês, structure-based drug design). Esta metodologia engloba uma diversidade de estratégias, empregando estruturas cristalográficas de proteínas alvo, disponíveis usualmente no Protein Data Bank (PDB). Entre as técnicas modernas utilizadas no SBDD, destaca-se a triagem virtual baseada na estrutura do receptor (SBVS, do inglês, structure-based virtual screening), que possibilita a seleção de novos candidatos a ligantes de proteínas alvo, a partir de grandes bases de dados de compostos. No presente trabalho de dissertação, a seleção de 19 estruturas da enzima cruzaína, em complexo com ligantes, permitiu a aplicação de métodos de SBDD. Um conjunto com cerca de 3,4 milhões de compostos, com característica líder-similar (do inglês, lead-like), e outro conjunto com aproximadamente 450.000 compostos, com característica fragmento-similar (do inglês, fragment-like), foram coletados da base de dados ZINC. O programa DOCK 3.5.54 foi empregado na triagem virtual das bases de dados utilizando-se a estrutura cristalográfica PDB ID: 3KKU. Um subconjunto com 35.000 moléculas foi selecionado para estudos posteriores com os programas GOLD e Surflex. As 500 melhores moléculas selecionadas por cada um dos programas foram analisadas visualmente considerando-se diversas características estruturais dos subsítios da enzima cruzaína e dos ligantes (e.g., complementaridade molecular, flexibilidade, lipofilia do subsítio S2, presença de doadores e aceptores de hidrogênio entre os subsítios S2 e S1). Desta forma, um conjunto final de 18 compostos foi priorizado para os ensaios bioquímicos frente a enzima cruzaína. Destes 18 compostos, 6 apresentaram atividade inibitória frente a cruzaína, com destaque para os 2 mais promissores, com valores de IC50 (concentração de inibidor necessária para reduzir em 50% a atividade enzimática) de 20 &micro;M e 580 nM. O inibidor mais potente da série foi selecionado da base fragmento-similar e apresentou um valor de eficiência do ligante (EL) de 0,53 kcal/mol/átomo, considerado significativo para otimização em química medicinal. A integração de técnicas computacionais e experimentais permitiu a descoberta de ligantes com inovação estrutural, abrindo novas perspectivas para o planejamento de inibidores mais potentes e seletivos da enzima cruzaína de T. cruzi. / Chagas disease, a parasitic infection widely distributed in Latin America, is a serious public health problem with devastating consequences in terms of human morbidity and mortality. The therapeutic arsenal against the disease is very limited and insufficient in all clinical aspects. This has led to a new paradigm for the discovery of new agents that act on specific enzymes or metabolic pathways. The enzyme cruzain, a cysteine protease essential for the survival of the parasite Trypanosoma cruzi, has been selected in this work as an attractive target for the development of new inhibitors through the use of structure-based drug design (SBDD). This approach brings together a diversity of strategies, which employs crystal structures of target proteins, usually available in the Protein Data Bank (PDB). Structure-based virtual screening (SBVS), one of the most important techniques used in SBDD, allows the selection of new ligands of target proteins from large libraries of compounds. In this work, 19 crystal structures of the cruzain enzyme, in complex with ligands, allowed the application of SBDD methods. A data set of about 3.4 million compounds, with lead-like characteristics, and a second data set, with approximately 450,000 compounds, with fragment-like characteristics, were collected from the ZINC data base. The docking program DOCK 3.5.54 was employed in the virtual screening of the data sets using the crystal structure PDB ID: 3KKU. A subset of 35,000 compounds was selected for further studies with the programs GOLD and Surflex. The 500 top ranked molecules for each of the programs were visually inspected considering a number of structural characteristics of the subsites of the cruzain enzyme, as well as of the ligands (e.g., molecular complementarity, flexibility, the hydrophobic S2 subsite, and the presence of hydrogen donors and acceptors between the subsites S2 and S1). Thus, a final subset of 18 compounds was prioritized for the biochemical assays against the cruzain enzyme. Six out of 18 compounds exhibited enzyme inhibition, with the most two promising inhibitors having IC50 values (IC50 refers to the concentration of compound required for 50% inhibition of cruzain) of 20 &micro;M e 580 nM. The most potent inhibitor of the series was selected from the fragment-like data set and showed a ligand efficiency of 0,53 kcal/mol/atom, which is considered significant in drug design. The integration of computational and experimental approaches allowed the discovery of compounds with innovative structures, providing new perspectives for the design of inhibitors of T.cruzi cruzain having increased potency and selectivity.