Submitted by Ramon Santana (ramon.souza@ufpe.br) on 2015-03-05T13:58:04Z No. of bitstreams: 2 Dissertaçao Gevanio de Oliveira Filho.pdf: 3050082 bytes, checksum: f5a110f44cf40d78aceeea49163a6a10 (MD5) license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) / Made available in DSpace on 2015-03-05T13:58:04Z (GMT). No. of bitstreams: 2 Dissertaçao Gevanio de Oliveira Filho.pdf: 3050082 bytes, checksum: f5a110f44cf40d78aceeea49163a6a10 (MD5) license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) Previous issue date: 2013-02 / CNPq (Conselho Nacional de Desenvolvimento Cientifico e Tenológico) FACEPE (Fundação de Amparo à Ciência e Tecnologia de Pernambuco) / A doença de Chagas é uma infecção parasitária sistêmica causada pelo protozoário Trypanosoma cruzi, que afeta entre 8 a 10 milhões de pessoas em todo o mundo. O benznidazol é o único fármaco aprovado para o tratamento durante a fase aguda e crônica assintomática, contudo não é eficaz durante a fase crônica sintomática. Com isso, o desenvolvimento de novos fármacos úteis para o tratamento da doença de Chagas é necessário. Com o objetivo de identificar fármacos tripanocidas, o planejamento estrutural e a síntese de inéditas aril-4-tiazolinonas (23a–o) e seus análogos estruturais do tipo aril-1,3-tiazóis (24a–v) foi realizado. As aril-4-tiazolinonas (23a–o) foram planejadas com intuito de identificar compostos menos citotóxicos e mais potentes em inibir o parasito do que os compostos protótipos (tiossemicarbazonas Int-1-3). Almeja-se também compreender a relação estrutura-atividade anti-T. cruzi para essa classe de tiazolinonas e por isso, substituintes diversos foram inseridos nas posições N3 e C5 do anel heterociclo. Já o planejamento estrutural dos aril-1,3-tiazóis (24a–v) teve como objetivo comparar a atividade tripanocida entre 4-tiazolinonas e 1,3-tiazóis. A atividade tripanocida foi determinada em tripomastigostas da cepa Y, e a toxicidade foi estimada em macrófagos J774. Após a triagem das propriedades tripanocidas dos compostos (23a–v) e (24a–o), foi possível identificar os compostos (23d e 23l–m) como agentes tripanocidas com potência similar ao benznidazol e com baixa toxicidade para macrófagos. Os compostos (23l–m) possuem em comum uma fenila em N3, sugerindo que a presença desse substituinte é importante para atividade anti-T. cruzi. Da mesma maneira nós observamos que os tiazóis contendo uma fenila na posição C4 também apresentaram propriedades tripanocidas in vitro tao potentes quanto o benznidazol tais como (24a, 24f, 24q e 24t). Quando testados em macrófagos infectados, os compostos (23l–m) foram capazes de erradicar amastigotas intracelulares, enquanto que o benznidazol não curou a infecção. De uma maneira geral, demostramos que as tiazolinonas possuem atividade tripanocida superior a das tiossemicarbazonas (Int-1-3), sendo mais seletivas em relação a toxicidade para macrófagos, demonstrando assim que esses compostos são protótipos a fármacos anti-T. cruzi.

Submitted by Heitor Rapela Medeiros (heitor.rapela@ufpe.br) on 2015-03-05T19:13:43Z No. of bitstreams: 2 Marcos Cardoso - Tese catalogada.pdf: 10986714 bytes, checksum: 148a373469c1e6166da419a78de671e9 (MD5) license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) / Made available in DSpace on 2015-03-05T19:13:44Z (GMT). No. of bitstreams: 2 Marcos Cardoso - Tese catalogada.pdf: 10986714 bytes, checksum: 148a373469c1e6166da419a78de671e9 (MD5) license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) Previous issue date: 2012-12-06 / CAPES, CNPq / A doença de Chagas ainda é um problema concreto e impactante na América Latina, sob múltiplos aspectos vinculados às questões da iniquidade social e ao processo de globalização. Desde a descoberta da doença de Chagas, em 1909, a procura por uma terapia efetiva para os dois estágios da doença, fase aguda e fase crônica, é um desafio para muitos pesquisadores. Nos dias de hoje, somente um fármaco está em uso para o combate da doença de Chagas, o benznidazol. Esta terapia não é efetiva para a fase crônica da doença além de proporcionar vários efeitos adversos. Atualmente, vários trabalhos relatam que compostos que possuem a porção tiossemicarbazona apresentam uma potencial atividade antichagásica devido a uma possível inibição da enzima cruzaína do Trypanosoma cruzi (TCC). A cruzaína é uma enzima responsável pela replicação intracelular do T. cruzi e, devido a esta função, é um alvo explorado para o desenvolvimento de novas drogas potencialmente antichagásicas. Neste trabalho, objetivou-se a síntese, caracterização e avaliação de novas hidrazonas como protótipos a fármacos antichagásicos. No capítulo 1, foram sintetizados 22 compostos, análogos da tiossemicarbazona, e foram avaliados frente à atividade tripanocida e viabilidade celular. Dos 22 compostos avaliados, 11 apresentaram atividades semelhantes ou superiores ao do benznidazol, fármaco utilizado como referencial. Observaram-se interessantes relações estrutura-atividade acerca da funcionalização da tiocarbonila a tiazol, conferindo um maior potencial tripanocida e melhor viabilidade celular. Estes achados são de grande importância para o planejamento de novos fármacos antichagásicos, confirmando o tiazol como um núcleo promissor frente ao mal de Chagas. No capítulo 2 explorou-se a substituição do anel tiofenólico, utilizado no capítulo 1, pelo anel piridínico, devido a sua grande importância na química medicinal. Com os resultados obtidos foi possível classificar o anel piridina como um ótimo grupo antichagásico, devido a grande atividade tripanocida obtida nas séries TP e TAP. Foram sintetizados 24 compostos dos quais 14 apresentaram atividade tripanocida superior ao benznidazol. Interessantes relações de estrutura-atividade foram propostas para estas duas séries químicas. A substituição do tiofenol pelo anel piridina melhorou a atividade tripanocida, entretanto a viabilidade celular foi prejudicada. Neste trabalho também foi possível observar que a utilização do ultrassom como promotor principal dos protocolos propostos foi superior ao método clássico, por refluxo, devido à diminuição do tempo reacional, maior rendimento e menor formação de subprodutos

Memoria para optar al Título Profesional de Médico Veterinario. / La enfermedad de Chagas es una zoonosis de interés en salud pública que se encuentra distribuida ampliamente en América, causada por Trypanosoma cruzi, protozoo que es transmitido principalmente a través de las deyecciones de insectos hematófagos de la subfamilia Reduviidae. Los caninos, al ser mamíferos domésticos de gran cercanía con el ser humano, son un reservorio de esta enfermedad. El presente estudio tuvo como objetivo principal determinar la presencia de T. cruzi en caninos de la comuna de Til –Til, Región Metropolitana, a través del método de diagnóstico molecular PCR. Se estudiaron 90 caninos, 30 animales por cada localidad de la comuna en zona endémica (Huechún, Rungue, Til-Til). Se llevó a cabo una encuesta para cada dueño de los animales estudiados para determinar posibles factores de riesgos asociados. El análisis estadístico se realizó a través del test exacto de Fisher para determinar la frecuencia de infección entre localidades y una Regresión logística para analizar los factores de riesgo relacionados con los animales positivos. Se encontró prevalencia del 16,3% en la comuna, un total de 14 caninos analizados por la reacción en cadena de la polimerasa fueron positivos a T. cruzi, utilizando los primers 121 y 122. Rungue presentó una prevalencia de 10,7%, con 3 animales positivos, Huechún 21,4% con 6 animales positivos y Til-Til una prevalencia del 16,7% con 5 positivos a T. cruzi. No se encontraron diferencias significativas entre localidades (Fisher, p= 0,583). En la regresión múltiple no se encontró asociación significativa entre la condición de ser positivo a T. cruzi con ninguno de los factores de riesgos determinados en las encuestas realizadas. Este trabajo, sobre prevalencia de perros infectados con T. cruzi en Chile, revela la importancia epidemiológica de estos animales como reservorios del protozoo para los habitantes de la comuna de Til-Til y la diseminación del agente en los triatominos del sector. / Chagas disease is a zoonosis of interest in public health that is widely distributed in America. This disease it is caused by Trypanosoma cruzi, a protozoan that it is transmitted mainly through the dejections of hematophagous insect of the subfamily Reduviidae. The canines, being domestic mammals close to the human being, are a reservoir of this disease. This study had as main objective to determine the presence of T. cruzi in the canines of the Til –Til commune, Metropolitan Region, through the PCR molecular diagnostic method. A total of 90 canines, 30 animals for each locality of the commune, one area (Huechún, Rungue, Til-Til) were studied. A survey was conducted for each owner of the animals studied and identified the possible risk factors associated. Statistical analysis was performed using the Fisher exact test to determine the frequency of infection between sites and a logistic regression to analyze risk factors related to positive animals. A prevalence of 16.3% was found in the commune, a total of 14 canines analyzed by the polymerase chain reaction were positive to T. cruzi, using primers 121 and 122. Rungue presented a prevalence of 10.7% with 3 positive animals, Huechún 21.4% with 6 positive animals and Til-Til a prevalence of 16.7% with 5 positive to T. cruzi. No significant differences were founded between localities (Fisher, p = 0.583). In the multiple regressions there was no significant association between the conditions of being positive to T. cruzi with any of the risk factors determined in the surveys. This work about prevalence of dogs infected with T. cruzi in Chile reveals the epidemiological importance of these animals as reservoirs of the protozoan for the inhabitants of the commune of Til-Til and the dissemination of the agent in the triatomines of the sector. / Financiamiento: Proyecto Fondecyt No. 1140650.

Memoria para optar al Título Profesional de Médico Veterinario. / La enfermedad de Chagas es producida por el protozoo flagelado Trypanosoma cruzi. Esta enfermedad es endémica en Chile y tiene una compleja diversidad genética (enumeradas de TcI a TcVI) con distintas características clínicas y ecogeográficas. Se analizaron 164 muestras de sangre de 9 especies de micromamíferos silvestres (Abrocoma bennetti, Abrothrix longipilis, Abrothrix olivaceus, Octodon sp, Oligorizomys longicaudatus, Phyllotis darwini, Rattus norvegicus, Rattus rattus y Thylamys elegans) infectados por este protozoo, provenientes de 6 localidades de la zona centro-norte de Chile. Se utilizó la técnica de DNA blot con hibridación para la detección de la región hipervariable de los minicírculos del kDNA a través de sondas especificas marcadas para los linajes TcI, TcII, TcV y TcVI. Los resultados fueron sometidos a análisis estadístico. TcI resultó el linaje más predominante en todas las especies de micromamíferos y en todas las localidades, seguido de TcII, TcVI y TcV respectivamente. Octodon sp y P. darwini fueron las especies más abundantes en el estudio, con un 85% de muestras positivas a la hibridación. Por otro lado, Til-Til (Región Metropolitana) fue la localidad con mayor número de hibridaciones positivas y mayor cantidad de infecciones mixtas, lo cual fue confirmado estadísticamente con el test de Fisher. En último lugar, se obtuvieron casi cuatro veces más hibridaciones positivas e infecciones mixtas en muestras provenientes de la temporada de invierno, lo cual también fue estadísticamente significativo. Este estudio confirma la presencia de los linajes TcI, TcII, TcV y TcVI en la zona centro-norte de Chile, demostrando por primera vez una gran proporción de infecciones mixtas y únicas en la temporada de invierno, así como en las especies Octodon sp y P. darwini, y especialmente en la localidad de Til-Til, donde se analizan sus posibles causas y efectos / Chagas disease is caused by the flagellate protozoan Trypanosoma cruzi. The disease is endemic in Chile and has a complex genetic diversity (numbered from TcI to TcVI) with different clinical and eco-geographical features. One hundred sixty four blood samples were analyzed from 9 species of wild mammals (Abrocoma bennetti, Abrothrix longipilis, Abrothrix olivaceus, Octodon sp, Oligorizomys longicaudatus, Phyllotis darwini, Rattus norvegicus, Rattus rattus and Thylamys elegans) infected with this protozoan, from 6 locations of north-central Chile. DNA blot technique followed with hybridization was used to detect the hypervariable region of kDNA minicircle through labeled probes specific for lineages TcI, TcII, TcV and TcVI. Results were then submitted to statystical analysis. TcI was the most predominant lineage in all mammal species and in all localities, followed by TcII, TcVI and TcV in decreasing order. Octodon sp. and P.darwini were the most abundant species in the study, with 85% positive hybridization samples. On the other hand, Til-Til (Metropolitan Region) was the town with the highest number of positive hybridizations and mixed infections, which was confirmed statistically with Fisher's test. Finally, nearly four times more positive hybridizations and mixed infections in samples from the winter season were obtained, which was also statistically significant. This study confirms the presence of the TcI, TcII, TcV and TcVI lineages in the central-northern Chile, demonstrating for the first time a large proportion of mixed and single infections in the winter season as well in the species Octodon sp and P. darwini, and especially in the locality of Til-Til, where its possible causes and effects are analyzed / Financiamiento: Proyectos Fondecyt 1100339 y 1120122.

Doctor en Bioquímica / La angiogénesis es la formación de nuevos capilares a partir de vasos preexistentes. La utilización de agentes capaces de inhibir este proceso podría ofrecer opciones terapéuticas para patologías dependientes del abastecimiento de nutrientes a través de la sangre, como el cáncer, obesidad, o desórdenes inflamatorios. Calreticulina (CRT) es una proteína multifuncional, altamente conservada, expresada en todas las células nucleadas. Se ha reportado que calreticulina humana (HuCRT) y su dominio N-terminal, vasostatina, interfieren con la angiogénesis inhibiendo la proliferación de células endoteliales y la interacción de éstas con laminina, una proteína de la membrana basal. Previamente, hemos descrito que CRT de T. cruzi (TcCRT), es antiangiogénica en el ensayo in vivo de membrana corioalantoídea de pollo. Este efecto se correlaciona con propiedades antineoplásicas reportadas para la infección tripanosómica con varias cepas del parásito. El objetivo de la presente Tesis fue contribuir al conocimiento de los mecanismos celulares que median el efecto antitumoral de la infección chagásica, centrándose en el posible papel de TcCRT, en virtud de posibles efectos antiangiogénicos expresados en modelos in vitro y ex vivo. Para ello se propusieron tres Hipótesis: 1. TcCRT manifiesta efectos antiangiogénicos in vitro y ex vivo en modelos de vertebrados, 2. El efecto antiangiogénico de TcCRT se explica, al menos en parte, por su interacción directa con células endoteliales, inhibiendo su proliferación, y 3. La actividad antiangiogénica de TcCRT se localiza en su dominio N-terminal (N-TcCRT), y su unión a laminina inhibe la adhesividad de células endoteliales a ésta. Los objetivos específicos propuestos para dar cuenta de estas hipótesis fueron: 1. Determinar si TcCRT y su dominio N-terminal inhiben la angiogénesis en ensayos in vitro y ex vivo, a partir de células endoteliales de cordón umbilical humano (HUVECs) y de anillos de aorta de rata, 2. Determinar si TcCRT se une a células endoteliales, 3. Estudiar el efecto comparativo equimolar de HuCRT, TcCRT y N-TcCRT sobre la proliferación de HUVECs, 4. Estudiar el efecto de TcCRT sobre la quimiotaxis de células endoteliales, 5. Determinar si TcCRT se une a laminina 6. Determinar si la interacción TcCRT/laminina inhibe la adhesión de HUVECs a esta última proteína y 7. Determinar el efecto de TcCRT sobre la expresión de genes reguladores del proceso angiogénico en HUVECs. Los ensayos ex vivo mostraron que TcCRT inhibe el crecimiento capilar en anillos aórticos de rata en forma dosis-dependiente. N-TcCRT (aa 20-191) también inhibió completamente el crecimiento capilar. TcCRT tuvo un efecto inhibitorio dosis-respuesta en experimentos de morfogénesis capilar in vitro, utilizando HUVECs. Comparaciones equimolares de TcCRT con su contraparte humana, mostraron que la molécula parasitaria y el dominio N-terminal, tienen un efecto inhibitorio claramente superior. Los dominios R (R-TcCRT) y S (S-TcCRT) de la proteína parasitaria (aa 136-281 y 159-281 respectivamente) no afectaron la morfogénesis capilar de HUVECs. Mediante experimentos de fluorescencia, demostramos que TcCRT se une y es internalizada por HUVECs y células de la línea endotelial EAhy926. La internalización es inhibida por fucoidina. TcCRT inhibió la proliferación de HUVECs en forma dosis y tiempo-dependiente. Este efecto es independiente de apoptosis. Cuando comparamos la acción de la molécula parasitaria y de su dominio N-terminal con la de la humana, sobre la proliferación de HUVECs, no encontramos diferencias significativas en condiciones equimolares. R-TcCRT no tuvo efecto en la proliferación de HUVECs. Mediante experimentos de migración, determinamos que TcCRT inhibe la migración de HUVECs y células EAhy926 en forma dosis-dependiente. En ELISA TcCRT, R-TcCRT y S-TcCRT, se unen a laminina en forma dosis-dependiente, pero en contraste con los resultados obtenidos con la molécula humana, esta interacción no afecta la adhesión de las células endoteliales a esta proteína. Finalmente, mediante experimentos de RT-PCR en tiempo real, determinamos que la incubación de HUVECs con TcCRT por 24 h, no activa la expresión de genes antiangiogénicos. En síntesis, en este trabajo demostramos un efecto antiangiogénico de TcCRT y su dominio Nterminal en células endoteliales arteriales y venosas de dos especies, Rattus rattus y Homo sapiens, en ensayos ex vivo e in vitro. Este efecto se correlaciona con la inhibición de la morfogénesis capilar, proliferación y migración de las células endoteliales, y también con la internalización de TcCRT en células endoteliales. Estas propiedades de TcCRT podrían explicar, al menos en parte, la resistencia relativa a ciertas agresiones por tumores sólidos inducida por infecciones tripanosómicas / Angiogenesis is the growth of new blood vessels from the pre-existing ones. The use of agents capable of inhibit this process would offer therapeutic options for pathologies dependent on blood supplied nutrients, such as cancer, obesity and inflammatory disorders. Calreticulin (CRT) is a multifunctional, highly conserved protein, expressed in every nucleated cell. It has been reported that human calreticulin (HuCRT), and its N-terminal domain, vasostatin, interferes with angiogenesis by inhibiting endothelial cell proliferation and their attachment to laminin, a basement membrane protein, by binding to it. Previously, we have described that T. cruzi calreticulin (TcCRT) is antiangiogenic in the in vivo chorioalantoid membrane chicken assay, which correlates with the reported anti-neoplasic properties for trypanosomic infection with several strains of the parasite. The aim of the present Thesis was to contribute furthermore to the knowledge of the cellular mechanisms that mediate the antitumoral effect of chagasic infection, focusing on the possible role of TcCRT, expressed in in vitro and ex vivo models. We proposed three Hypotheses: 1. TcCRT shows antiangiogenic effects in in vitro and ex vivo vertebrate models, 2. The TcCRT antiangiogenic effect is explained, at least partly, by its direct interaction with endothelial cells, inhibiting their proliferation, and 3. the antiangiogenic TcCRT activity is located on its N-terminal domain (NTcCRT), and its binding to laminin inhibits endothelial cell attachment. The proposed specific objectives were: 1. To determine if TcCRT and its N-terminal domain inhibits angiogenesis in in vitro and ex vivo assays, on human vein endothelial cells (HUVECs) and rat aortic rings, 2. To determine if TcCRT binds to endothelial cells, 3. To study the equimolar comparative effect of HuCRT, TcCRT and N-TcCRT on HUVECs proliferation, 4. To study the TcCRT effect on endothelial cell chemotaxis, 5. To determine if TcCRT binds to laminin, 6. To determine if TcCRT/laminin interaction inhibits endothelial cell attachment to laminin and 7. To determine the TcCRT effect on the expression of angiogenic genes in HUVECs. The ex vivo assays showed that TcCRT inhibits capillary growth on rat aortic rings, in a dosedependent manner. Complete capillary growth abrogation was also observed with N-TcCRT (aa 20- 191) incubation. TcCRT had a dose-response inhibitory effect in in vitro capillary morphogenesis experiments on HUVECs. When TcCRT and N-TcCRT were compared at equal molarities with HuCRT, the effects of the parasite derived molecules were clearly stronger than those of the human counterpart. The R (R-TcCRT) and S (S-TcCRT) domains of the parasite protein (aa 136-281 and 159-281 respectively) did not affect capillary morphogenesis. By fluorescence experiments we demonstrated that TcCRT binds and is internalized by HUVECs and EAhy926 endothelial cell line. The internalization was competed by fucoidan. TcCRT inhibited HUVECs proliferation in a dose and time-dependent manner. This effect is apoptosis independent. Non significant differences were observed in the proliferation inhibition capacity at TcCRT, N-TcCRT and HuCRT equimolar concentrations. R-TcCRT had no significant effect on HUVECs proliferation. HUVECs and EAhy cells migration was inhibited by TcCRT in a dose-response manner. TcCRT and its R and S domains bind to laminin in ELISA assays, but in contrast to the observed effects of the human molecule, this interaction does not impedes cell attachment to this protein. Finally by carrying out real time RTPCR experiments, we determined that HUVECs incubation with TcCRT for 24 h, does not activate the antiangiogenic gene expression. In synthesis, in this work we demonstrated an antiangiogenic effect of TcCRT and N-TcCRT on arterial and venous endothelial cells from two species, Rattus rattus and Homo sapiens, in ex vivo and in vitro assays. This effect correlates to capillary morphogenesis, proliferation and migration inhibition of endothelial cells, and also with TcCRT internalization to endothelial cells. These properties could explain, at least partly, the relative resistance to certain solid tumor aggressions induced by trypanosomic infections

Sialic acids are a family of 9 carbon acidic sugars that are often part of glycans that decorate glycoproteins and glycolipids. N-acetylneuraminic acid, or Neu5Ac, is the predominant sialic acid in Homo sapiens and is most commonly found on the terminus of glycan chains where it functions as a signalling molecule or providing a negatively-charged mask to cells. Neu5Ac is less commonly found in microbes. A number of pathogens, including the fungus Aspergillus fumigatus and the parasite Trypanosoma cruzi, present Neu5Ac on their surface which aids evasion of the host immune system. A. Fumigatus has no known sialic synthesis genes however a single sialidase, AfS, has been identified. This sialidase is relatively poor at cleaving Neu5Ac in comparison with other members of the sialidase family. Here we present the structure of AfS to 1.8Å, the first fungal sialidase structure published. The overall topology of AfS shares the 6-bladed β-propellor fold common to all known sialidases and has an rmsd of only 1.44 Å over 309 C[sub]αs with the bacterial sialidase from Micromonospora viridifaciens. The active site of AfS also contains all the residues necessary for efficient hydrolysis of sialic acids. Despite repeated attempts. It was not possible to crystallize AfS in complex with Neu5Ac. Closer inspection of the AfS active site revealed that the pocket that usually accommodates the N-acetyl moiety of Neu5Ac contained more polar residues and was shallower than that of other sialidases. The apo structure suggested that substitution of the N-acetyl group on C5 of Neu5Ac with a smaller group may be accommodated better in the active site of AfS. 2-Keto-3-deoxy-D-galactononulosonic acid (KDN), which has a hydroxyl group at this position, is capable of binding in the active site and is the preferred substrate of AfS. The structure of AfS in complex with KDN was determined to 1.45 Å and is the first KDN specific sialidase structure determined. Crystal complexes with either a di-fluoro-KDN or KDN2en allowed atomic snapshots to be obtained of the catalytic cycle from Michaelis complex, through transition state to covalent intermediate. Several KDN binding sites on the surface of the enzyme were discovered suggesting that the enzyme may be specific for polyKDN, which intruigingly has been found in the human lung. Mutations were made to AfS to enlarge the cavity around C5 to see if the enzyme could accommodate Neu5Ac-related substrates. Identification and mutation of arginine 171 in the active site to leucine increased the depth and hydrophobicity of the cavity and improved the ability of AfS to utilize Neu5Ac, albeit poorly. The structure AfS[sub](R171L) in complex with Neu5Ac2en was solved to 1.8 Å. Trypanosoma cruzi is the etiological agent of Chagas disease. The trans sialidase from T. cruzi, TcTs, is a verified virulence factor. Here we detail a fragment-based search for novel inhibitors of TcTs using a fluorogenic assay, STD-NMR and WaterLOGSY-NMR, in silico screening and X-ray crystallography. There was poor agreement between the techniques used and only fragment hits validated by X-ray crystallography were pursued. All protein-ligand complexes shared two common interactions. The verified compounds interacted with the arginine triad via a carboxylic acid, as is the case with the sialic acid substrate. Secondly, all compiunds possessed an amine that was within hydrogen bonding distance of the TcTs catalytic aspartic acid. One of these compunds, 3-piperidinic acid, was capable of binding in the TcTs active site in both of its anomeric forms. Interestingly, each anomer binds in 2 similar but distinct positions in the active site. In one of these conformations Tyr119 moves into the active site and hydrogen bonds with the fragment's amine. In an attempt to combine the interaction seen in both the R and S anomers of 3-piperidinic acid, (R)-2-piperazine carboxylic acid was soaked into TcTs crystals. This compound made additional interactions with the protein and demonstrated a 4-fold improvement in the IC50. A known sialidase inhibitor, Siastatin B, based on a 3-piperidinic acid frame was also investigated and we present a TcTs-siastatin B complex structure to 2.1 Å, the first structure of Siastatin B in complex with a glycoside hydrolase. There is much work to be done to these preliminary inhibitors however here we have identified 3 druggable sites within the TcTs active site. The research presented herein provides a platform for future drug design studies on TcTs.

Submitted by Amauri Alves (amauri.alves@ufv.br) on 2015-11-10T14:55:27Z No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 6235319 bytes, checksum: f05b70ae5d5554be5f69fb53db7ff002 (MD5) / Made available in DSpace on 2015-11-10T14:55:27Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 6235319 bytes, checksum: f05b70ae5d5554be5f69fb53db7ff002 (MD5) Previous issue date: 2014-12-18 / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / As doenças tropicais negligenciadas persistem ainda como graves problemas de saúde pública em vários países, incluindo o Brasil. Dentre elas estão: a doença de Chagas e as Leishmanioses, causadas por Trypanosoma cruzi e espécies do gênero Leishmania, respectivamente. As ectonucleotidases da família das E- NTPDases são enzimas capazes de hidrolisar nucleotídeos tri e/ou difosfatados, que atuam como sinalizadores em vários processos celulares. A hidrólise de ATP extracelular possui papel na infectividade e virulência de T. cruzi, bem como para Leishmania. As enzimas NTPDase-1 de T. cruzi (TcNTPDase-1) e NTPDase-2 de Leishmania infantum chagasi (LicNTPDase-2) demonstraram serem moléculas pró-adesão, agindo como facilitadores na infecção de células VERO e macrófagos, respectivamente. Uma expressão ubíqua dessas duas enzimas sugere ainda que elas podem estar envolvidas em diferentes processos biológicos, e apresentar funções desconhecidas. A detecção da LicNTPDase-2 em tecidos de cães diagnosticados com leishmaniose visceral, indica uma importância das ENTPDases na infecção natural. A descoberta de moléculas envolvidas com o processo de infecção é uma alternativa em potencial para o desenho racional de novas drogas. Para a doença de Chagas, atualmente, somente duas drogas são utilizadas para o tratamento, porém ambas apresentam sérios efeitos colaterais e não são efetivas na fase crônica da doença. Sendo assim, é urgente o desenvolvimento de um tratamento menos nocivo e mais eficiente. A TcNTPDase-1 recombinante foi expressa e purificada, e foram encontrados extratos capazes de abolir totalmente sua atividade nucleotidásica. A partir de um desses extratos foi extraído o composto puro bioativo responsável pela inibição. A ligação deste composto ao sítio ativo da enzima foi avaliada por modelagem molecular. Esses e outros extratos e vicompostos foram testados sobre o parasito e células de mamíferos. Um composto da classe das isobenzofuranonas apresentou eficiência contra os parasitos comparável à da droga de referência, o benzonidazol. A baixa toxicidade apresentada pelo composto para as células hospedeiras foi revertida ao final de 72 horas. O estudo desses compostos e sua modificação e otimização poderia fornecer ferramentas para o desenvolvimento de novos compostos, com potencial para uma nova droga para o tratamento da doença de Chagas. / Neglected tropical diseases persist as major public health problem in many countries, including Brazil. These include: Chagas disease and Leishmaniasis, caused by Trypanosoma cruzi and Leishmania species, respectively. The ectonucleotidases of the E-NTPDase family are enzymes that hydrolyze tri and / or diphosphate nucleotides, which act as signaling molecules in various cellular processes. Extracellular ATP hydrolysis has role in infectivity and virulence of T. cruzi and Leishmania. The enzymes NTPDase-1 of T. cruzi (TcNTPDase-1) and NTPDase-2 of Leishmania infantum chagasi (LicNTPDase-2) were demonstrated to be pro- adhesion molecules, acting as facilitators at the infection of VERO cells and macrophages, respectively. A ubiquitous expression of these two enzymes suggests that they may be involved in different biological processes, and present unknown functions. Detection of LicNTPDase-2 in dog tissues diagnosed with visceral leishmaniasis indicates an importance of ENTPDases in natural infection. The discovery of molecules involved in the infection process is a potential alternative to rational design of new drugs. For Chagas disease, currently, only two drugs are used for treatment, but both have serious side effects and are not effective in the chronic phase of the disease. Therefore, it is urgent to develop a less harmful and more efficient treatment. Recombinant TcNTPDase-1 was expressed and purified, and a few extracts were able to abolish its ectonucleotidase activity. From one of these extracts was extracted a pure bioactive compound, responsible for the inhibition. The binding of this compound to the active site of the enzyme, was evaluated by molecular modeling. These and other extracts and compounds were tested upon the parasite and mammalian cells. A compound of the isobenzofuranonas class presented efficiency against the parasites comparable to the reference drug, benznidazole. The low toxicity of the compound toward host cells was reversed after 72 hours. The study of these compounds and their modification and optimization viiicould provide tools for the development of new compounds with potential for a new drug for the treatment of Chagas disease.

Memoria para optar al Título Profesional de Médico Veterinario / La enfermedad de Chagas, también conocida como tripanosomiasis americana, es una enfermedad zoonótica producida por el protozoo flagelado Trypanosoma cruzi. Actualmente se reconocen seis linajes distintos de T. cruzi, conocidos también como unidades discretas de tipificación (DTUs). Estos corresponden a TcI-TcVI. La presencia de distintos linajes de T. cruzi ha sido detectada con anterioridad en el roedor endémico Octodon degus, observándose variaciones temporales en la presentación sanguínea de éstos. Un total de 11 ejemplares silvestres de O. degus, previa confirmación de infección con T. cruzi mediante ensayo de PCR a muestras de sangre periférica, fueron sometidos a dos ensayos de xenodiagnóstico separados por 6 meses en promedio. Utilizando los resultados del muestreo de sangre y ambos procedimientos de xenodiagnóstico se determinó la identidad del o los linajes de T. cruzi presentes en la sangre de los roedores en tres momentos distintos. Se utilizaron tres especies distintas de vectores, empleándose ejemplares de Triatoma infestans y Mepraia gajardoi durante el primer xenodiagnóstico y ejemplares T. infestans y Mepraia spinolai durante el segundo. Las heces de los triatominos fueron analizadas en tres oportunidades luego de cada xenodiagnóstico. Se detectaron variaciones en la identidad de los linajes de T. cruzi detectados en las heces de los triatominos a lo largo del seguimiento realizado de forma posterior a cada xenodiagnóstico. Conjuntamente fue posible evidenciar la existencia de variaciones temporales en la presentación sanguínea de linajes de T. cruzi en los 11 roedores estudiados luego de los tres procedimientos diagnósticos realizados / Proyecto Fondecyt 1120122

Orientador: Leonilda Maria Barbosa Santos / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-07-20T03:13:31Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Garcia_CeliaAparecidaAlmeidaChaves_M.pdf: 1544095 bytes, checksum: 6f62c5d06e42909fab243a2d386fcc1f (MD5) Previous issue date: 1994 / Não informado. / Not informed. / Mestrado / Imunologia / Mestre em Genética e Biologia Molecular

Submitted by Pedro Barros (pedro.silvabarros@ufpe.br) on 2018-10-05T22:05:41Z No. of bitstreams: 2 license_rdf: 811 bytes, checksum: e39d27027a6cc9cb039ad269a5db8e34 (MD5) TESE Gevanio Bezerra de Oliveira Filho.pdf: 5033481 bytes, checksum: e39ef8c02c9714792b205e25fca6b193 (MD5) / Approved for entry into archive by Alice Araujo (alice.caraujo@ufpe.br) on 2018-11-22T18:57:02Z (GMT) No. of bitstreams: 2 license_rdf: 811 bytes, checksum: e39d27027a6cc9cb039ad269a5db8e34 (MD5) TESE Gevanio Bezerra de Oliveira Filho.pdf: 5033481 bytes, checksum: e39ef8c02c9714792b205e25fca6b193 (MD5) / Made available in DSpace on 2018-11-22T18:57:02Z (GMT). No. of bitstreams: 2 license_rdf: 811 bytes, checksum: e39d27027a6cc9cb039ad269a5db8e34 (MD5) TESE Gevanio Bezerra de Oliveira Filho.pdf: 5033481 bytes, checksum: e39ef8c02c9714792b205e25fca6b193 (MD5) Previous issue date: 2017-02-20 / FACEPE / A doença de Chagas é uma infecção parasitária sistêmica causada pelo protozoário Trypanosoma cruzi, a qual afeta entre 7 a 8 milhões de pessoas em todo o mundo. O Benzonidazol é o único fármaco aprovado para o tratamento durante a fase aguda e crônica assintomática, contudo não é eficaz durante a fase crônica sintomática. Desta maneira, o desenvolvimento de novos fármacos úteis para o tratamento da doença de Chagas é necessário. O objetivo deste trabalho foi identificar fármacos tripanocidas, o planejamento estrutural e a síntese de inéditas aril-4-tiazolidinonas (26a–o) e seus análogos estruturais do tipo 5-benzilideno-4-tiazolidinonas (27a–z e 27α–γ) foram realizado. As aril-4-tiazolidinonas e 5-benzilideno-4-tiazolidinonas foram planejadas com intuito de identificar compostos tão potentes em inibir o parasito quanto os compostos protótipos (4-tiazolidinonas 5-7). Almejamos também compreender a relação estrutura-atividade anti-T. cruzi para essa classe de 4-tiazolidinonas e por isso, foram realizadas modificações na porção aril da série (26a-o), alternando os substituintes cloro nas posições 2,4; 2,5 e 2,3,4 do anel; bem como substituintes diversos foram inseridos na posição C5 do anel heterocíclico (metil, etil, isopropil, fenil). Para série (27a–z e 27α–γ) fixamos o anel 3,4-diclorobenzil e fizemos modificações especificamente na posição C5 do anel 4-tiazolidinona (anéis aromáticos com substituintes orto, meta, para e policíclicos como o naftil, antracenil, bifenil ou heterocíclicos como piridinil). Os compostos (26a–o, rend: 37-84%) e (27a–z e 27α–γ, rend: 10-93%) foram sintetizados e caracterizados por RMN ¹H e ¹³C, IV, AE e massas. Os compostos (26e CC₅₀= 14 μM, e 26m CC₅₀= 12 μM) foram os mais ativos das séries, demonstraram ser equipotentes ao Bdz, possuindo o (2,4-dicloro e fenila) e (2,3,4-tricloro e etila) como substituintes, respectivamente. O composto (27z CC₅₀= 26 μM), duas vezes menos potente que o Bdz, possui um grupo ferrocenil como substituinte. Esses compostos apresentaram baixa toxicidade para células de linhagem (L929) e para células do músculo cardíaco de camundongos (cardiomiócitos – tecido mais afetado pela infecção por T. cruzi). Esses resultados comprovam a atividade tripanocida e seletividade dessa classe de heterocíclicos, e demonstra que deve ser ainda mais estudada em busca de novos protótipos a fármacos antichagásicos, com maior seletividade e atividade. / Chagas disease is a parasitic infection caused by protozoan T. cruzi, which affects around 7 to 8 million people worldwide. Benznidazole is the sole drug approved for treatment during the acute and asymptomatic chronic phases, however it has no efficacy during the symptomatic chronic phase. Therefore, the development of new medicines is needed. To identify new trypanocidal compounds, we performed a structural planning and synthesis of new aryl-4-thiazolidines (26a-o) and their structurally-related analogs such as the 5-benzilidene-4-thiazolidines (27a–z e 27α–γ). Aryl-4-thiazolidines (26a-o) and 5-benzilidene-4-thiazolidines (27a–z e 27α–γ) were designed with the aim to identify more potent trypanocidal agents than the aryl-4-thiazolidines (5-7). We also aimed to understand the structure-anti-T. cruzi activity relationships for this class of thiazolidines. To this end, modifications were made in the aryl moiety of the series (26a-o) alternately chlorine substituents in positions 2,4; 2,5 and 2,3,4 ring; and various substituents have been inserted at the C5 position of the heterocycle ring (methyl, ethyl, phenyl). For series (27a–z e 27α–γ) pinned 3,4-dichlorobenzyl ring and modifications made specifically at the C5 position of the 4-thiazolinone ring (with various substituents in position 4 of the ring benzilidenes and inserting aromatics substituted ortho, meta and para, and polycyclic aromatic such as naphthyl, anthracenyl, biphenyl or heterocyclic groups such as pyridyl). Compounds (26a-o, yield: 37-84%) and (27a-z and 27α–γ, yield: 10-93%) were synthesized and characterized by ¹H and ¹³C NMR, IV, EA and mass. The compounds (26e EC₅₀ = 14 μM, and 26m EC₅₀ = 12 μM) were the most powerful the series, shown to be equipotent to Bdz, they have (2,4-dichloro and phenyl) and (2,3,4-trichloro and ethyl ) as substituents respectively. The compound 27z, which was two times less potent than Bdz, has a ferrocenyl group as the substituent. These compounds had low toxicity to (L929) and to cardiac muscle cells of mice (cardiomyocytes - tissue most affected by T. cruzi infection). These results confirm the activity and selectivity of this class of heterocyclics, and further studies seeking for new prototypes for antichagasic drugs with greater selectivity and activity are warranted.