Made available in DSpace on 2016-02-26T13:34:38Z (GMT). No. of bitstreams: 2 marianne_silva_ioc_mest_2015.pdf: 2399331 bytes, checksum: 4ca5147a85916a54e8f78b5504ea6ba3 (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2016-02-23 / A doença de Chagas (DC), causada pelo protozoário Trypanosoma cruzi, é uma doença negligenciada endêmica em diferentes regiões empobrecidas da América Latina. O tratamento, baseado em dois nitroderivados, Nifurtimox e Benzonidazol (Bz), é insatisfatório, demandando a busca de novos fármacos com ação tripanocida que sejam mais seletivos e eficazes. Nesse âmbito, o presente trabalho busca a identificação de novos agentes antiparasitários para a DC, explorando a avaliação fenotípica de novas amidinas aromáticas sintéticas in vitro incluindo ensaios de combinação entre estes compostos. Dez novas amidinas foram testadas sobre tripomastigotas sanguíneos e amastigotas de diferentes cepas do T. cruzi (Y e Tulahuen) e também sobre células de mamífero hospedeiras (linhagem L929 e células cardíacas) para determinar seu perfil eficácia e de toxicidade, respectivamente. Dentre as moléculas testadas (apresentando um ou dois grupamentos catiônicos terminais), cinco foram mais ativas sobre tripomastigotas sanguíneos que o fármaco de referência (Bz), sendo uma delas, a DB2267 (molécula dicatiônica) a mais eficaz, exibindo EC50 de 0,23 \03BCM e um índice de seletividade (IS) de 417. Esta diamidina foi 28 vezes mais ativa e cerca de três vezes mais seletiva que Bz Para determinar se a combinação de duas amidinas teria um efeito tripanocida superior ao seu uso em monoterapia, tripomastigotas sanguíneos foram incubados com DB2267 e DB2236 em proporções fixas e os resultados mostraram apenas um efeito aditivo com \01A9FIC<4. Interessantemente, quando formas intracelulares foram expostas à DB2267, sua atividade foi relacionada à cepa do parasito, sendo eficaz (EC50 = 0.87 ± 0.05 \03BCM) contra DTU II (cepa Y), mas não contra um representante da DTU VI (Tulahuen), mesmo quando utilizamos veículo diferente do DMSO (\03B2-ciclodextrina). Esta divergência pode estar relacionada a diferenças inerentes aos alvos e/ou rotas metabólicas das cepas do parasito e que merecem ser mais investigadas visando conhecer melhor a relação entre as características estruturais e ação universal das moléculas sobre DTUs e formas do T. cruzi para o desenho de compostos mais promissores. Devido à fluorescência intrínseca apresentada pelas amidinas, a captação de duas delas foi avaliada. Os dados obtidos com a amidina não ativa (DB2236) e com a outra ativa (DB2267) sobre amastigotas da cepa Y revelaram que ambas foram localizadas intracelularmente, mas em compartimentos distintos: DB2236 no citoplasma, enquanto DB2267 no núcleo. Nossos dados são encorajadores a respeito da atividade antiparasitária das amidinas aromáticas, no tocante a futuras investigações de novos agentes promissores para o tratamento da DC / Chagas disease (CD), caused by the protozoan Trypanosoma cruzi, is a neglected disease endemic in different poor areas of Latin America. The treatment, based on two nitroderivatives, Nifurtimox and Benznidazole (Bz), is unsatisfactory, demanding the screening of new potential trypanocidal drugs more selective and potent. In this scope, the present work deals with the identification of new anti - parasitic agents for CD, exploring the phenotypic screening of novel synthetic aromatic amidines in vitro and also combination assays between these compounds. The novel ten amidines were tested against bloodstream trypomastigotes (BT) and amastigote forms of different T.cruzi strains (Y and Tulahuen) and were also evaluated on mammalian host cells (L929 cells and cardiac cells) to check their toxicity profile. Among these molecules, five were more active against BT than the reference drug (Bz), being one of them, the DB2267 (a dicationic molecule) the most potent, exhibiting an EC 50 value of 0.23 μM and a se lectivity index (SI) of 417. This diamidine was 28 - fold more active and about 3 times more selective than Bz. To ascertain if the combination of two amidines could improve their trypanocidal activity, BT were incubated with DB2267 and DB2236 in fixed - ratio proportions and the data showed only an additive effect with ƩFIC<4. Interest ingly, when intracellular forms were exposed to DB2267, its activity was related to the parasite strain, being effective (EC 50 = 0.87 ± 0.05 μM) against DTU II (Y strain) but not against one representative of DTU VI (Tulahuen) even using different vehicles (β - cyclodextrins and DMSO). This discrepancy might be related to differences concerning the targets and/or metabolic pathways of the parasite that deserve to be more investigated aiming to better understand the relationship between the structural characte ristics and universal action of the molecules against DTUs and forms of the T.cruzi for the design of more promising compounds . Due to the intrinsic fluorescence presented by the amidines, the uptake of two of them was assessed. The data obtained with the non - active amidine (DB2236) and the other active one (DB2267) against amastigotes of the Y strain showed that both were localized intracellular ly , but in distinct compartments : DB2236 in the cytoplasm , while DB2267 in the nucleus . Our results are encouragi ng regarding the antiparasitic activity of the a romatic amidines , referring to future investigations of new promising agents for the treatment of CD / Chagas disease (CD), caused by the protozoan Trypanosoma cruzi, is a neglected disease endemic in different poor areas of Latin America. The treatment, based on two nitroderivatives, Nifurtimox and Benznidazole (Bz), is unsatisfactory, demanding the screening of new potential trypanocidal drugs more selective and potent. In this scope, the present work deals with the identification of new anti - parasitic agents for CD, exploring the phenotypic screening of novel synthetic aromatic amidines in vitro and also combination assays between these compounds. The novel ten amidines were tested against bloodstream trypomastigotes (BT) and amastigote forms of different T.cruzi strains (Y and Tulahuen) and were also evaluated on mammalian host cells (L929 cells and cardiac cells) to check their toxicity profile. Among these molecules, five were more active against BT than the reference drug (Bz), being one of them, the DB2267 (a dicationic molecule) the most potent, exhibiting an EC 50 value of 0.23 μM and a se lectivity index (SI) of 417. This diamidine was 28 - fold more active and about 3 times more selective than Bz. To ascertain if the combination of two amidines could improve their trypanocidal activity, BT were incubated with DB2267 and DB2236 in fixed - ratio proportions and the data showed only an additive effect with ƩFIC<4. Interest ingly, when intracellular forms were exposed to DB2267, its activity was related to the parasite strain, being effective (EC 50 = 0.87 ± 0.05 μM) against DTU II (Y strain) but not against one representative of DTU VI (Tulahuen) even using different vehicles (β - cyclodextrins and DMSO). This discrepancy might be related to differences concerning the targets and/or metabolic pathways of the parasite that deserve to be more investigated aiming to better understand the relationship between the structural characte ristics and universal action of the molecules against DTUs and forms of the T.cruzi for the design of more promising compounds . Due to the intrinsic fluorescence presented by the amidines, the uptake of two of them was assessed. The data obtained with the non - active amidine (DB2236) and the other active one (DB2267) against amastigotes of the Y strain showed that both were localized intracellular ly , but in distinct compartments : DB2236 in the cytoplasm , while DB2267 in the nucleus . Our results are encouragi ng regarding the antiparasitic activity of the a romatic amidines , referring to future investigations of new promising agents for the treatment of CD

Made available in DSpace on 2016-02-26T13:34:40Z (GMT). No. of bitstreams: 2 francisco_junior_ioc_mest_2007.pdf: 5291215 bytes, checksum: 88ec236330fd3ac74ad110315d9ceb1b (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2016-01-13 / Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Oswaldo Cruz. Rio de Janeiro, RJ, Brasil / A capacidade do Trypanosoma cruzi de reconhecer moléculas na superfície de células fagociticas e não-fagociticas profissionais é essencial para sua sobrevivência no hospedeiro vertebrado. O papel de proteoglicanos sulfatados no processo de reconhecimento celular tem sido relatado em muitos patógenos humanos, incluindo o T. cruzi. Dados do nosso grupo demonstraram a participação de proteoglicanos de heparam sulfato (PGHS) de cardiomiócitos na invasão por formas tripomastigotas. Entretanto, a estrutura da molécula de PGHS envolvida na interação receptor-ligante e o papel de outros glicosaminoglicanos (GAGs) sulfatados no processo de invasão ainda não foram elucidados. Para avaliar a participação dos GAGs na invasão do T. cruzi, tripomastigotas, clone Dm28c, foram pré-tratados com 20µg/ml de heparina, queratam sulfato (KS) ou três fragmentos distintos de heparam sulfato (HS), os quais foram obtidos por tratamento enzimático (heparitinase I e II) e ácido nitroso. Nos ensaios de competição, os parasitas controles ou pré-tratados com GAGs solúveis foram incubados por 2hs a 37°C com culturas de cardiomiócitos e o percentual de infecção foi determinado após coloração pelo Giemsa. Nossos resultados revelaram uma inibição significante no índice de infecção de 84,8% e 45% após tratamento dos parasitas com heparina e com o fragmento N-acetilado/N-sulfatado (NA/NS), respectivamente, sugerindo o importante papel do domínio ([IdoUA-GlcNAc]-[GlcUA-GlcNS]3-[GlcUA-GlcNAc]4[GlcNAc]), da cadeia de HS no reconhecimento T. cruzi-cardiomiócito. Em contraste, o tratamento dos parasitas com KS, fragmento N-acetilado ou N-sulfatado não apresentou efeito no processo de invasão. O papel da sulfatação no processo de reconhecimento e invasão foi avaliado pelo tratamento de culturas de cardiomiócitos por 16hs a 37°C com diferentes concentrações de clorato de sódio e posteriormente, infectados com tripomastigotas (2hs)... (...) O declínio da sulfatação resultou na redução (dose dependente) do índice de infecção, alcançando níveis de inibição de 26%, 48,5% e 73,6% após o tratamento de cardiomiócitos com 25 mM, 50 mM e 75 mM de clorato de sódio, respectivamente, sugerindo a participação da carga negativa como moduladora do reconhecimento específico com o domínio NA/NS da cadeia de HS. Adicionalmente, ensaios bioquímicos foram realizados para caracterizar a proteína de ligação a heparina presente na superfície do T. cruzi. Duas bandas majoritárias de 65,8 kDa e 59 kDa foram identificadas no extrato protéico total das 3 formas evolutivas do T. cruzi por Western blotting, utilizando heparina, condroitim sulfato (CS) e HS conjugados a biotina. O ligante de heparina de T. cruzi foi isolado pela associação do método do Triton X-114 e cromatografia de afinidade a heparina-Sepharose. Após marcação metabólica (35S-Metionina), as proteínas hidrofóbicas foram isoladas em coluna de afinidade e separadas por SDS-PAGE, revelando um perfil protéico, similar ao extrato total, com duas bandas majoritárias (65,8 kDa e 59 kDa) eluídas com 0,5 M e 1,0 M de NaCl em tripomastigotas e epimastigotas, respectivamente. A análise isotópica também revelou uma expressão superior deste ligante (1,3-2 vezes) em tripomastigotas quando comparado com epimastigotas. As proteínas de ligação a heparina (65,8 kDa e 59 kDa) foram detectadas na fração de membrana de epimastigotas obtida pelo método de fracionamento subcelular associado a purificação em coluna de afinidade. A detecção das proteínas eluídas da coluna de afinidade a heparina por Western blotting com heparina-, HS- e CS-biotinilados revelou intensa marcação principalmente na proteína de 59 kDa. Além disso, a análise das proteínas por eletroforese não desnaturante revelou a presença de duas bandas nas formas tripomastigotas e epimastigotas de T. cruzi... (...) Ensaios bioquímicos complementares serão realizados a fim de obter informações detalhadas sobre a proteína de ligação a heparina de T. cruzi. / The ability of Trypanosoma cruzi to recognize molecules at the surface of both the phagocytic and non-phagocytic cells is essential to its survival in the vertebrate host. The role of the sulfated proteoglycans in the cell reco gnition process has been reported in several human pathogens, including T. cruzi . Data from our group have demonstrated the participation of heparan sulfated proteoglycan (HSP G) of cardiomyocytes in the invasion for forms trypomastigotes. However, the structure of th e HSPG molecule involved in the receptor-ligand interaction and the role of other s ulfated glycosaminoglycans (GAGs) in the invasion process have not been elucidated yet. To evaluate the participation of GAGs in T. cruzi invasion, trypomastigotes, clone Dm28c, were pre-treated with 20μg/ml of heparin, ke ratan sulfate (KS) or three distinct fragments of heparan sulfate (HS) obtained by enzym atic (heparitinase I and II) and nitrous acid treatments. For competition assays, the untrea ted or soluble GAGs pre-treated parasites were incubated for 2h at 37°C with the ca rdiomyocyte cultures and the percentage of infection was determined after Giemsa staining. Our results revealed a significant inhibition of the infection index of 84.8% and 45% after treatment of the parasites with heparin and the N-acetylated/ N-sulfated fragment, respectively, suggesting the important role of the ([IdoUA-GlcNAc]-[GlcUA-GlcNS] 3 -[GlcUA-GlcNAc] 4 [GlcNAc]) domain of the HS chain in the T. cruzi -cardiomyocyte recognition. In contrast, the treatm ent of the parasites with KS, N- acetylated or N-sulfated fragments did not display any effect in the invasion process. The role of sulfation in the recognition and invasion p rocess was evaluated by treating the cardiomyocytes cultures for 16h at 37°C with differ ent concentrations of sodium chlorate, followed by trypomastigotes infection (2h). The dec line of sulfation resulted in the reduction (dose dependent) of the infection index, achieving inhibition levels of 26%, 48.5% and 73.6% after treatment of cardiomyocyte cultures with 25mM , 50mM and 75mM of sodium chlorate, respectively, suggesting the participation of negat ive charge as modulator of the specific recognition with the NA/NS domain of HS chain. Additionately, biochemical assays were performed to characterize the heparin binding protein present at the surface of T. cruzi . Two major protein bands of 65.8 kDa and 59 kDa were identified in the total protein extract of all evolutive forms of T. cruzi by Western blotting , using biotin conjugated-heparin, -chondroitin sulfa te (CS) and -HS. The T. cruzi heparin ligand was isolated by association of Triton X-114 extraction method and heparin-Sepharose affinity chromatography. After metabolic labeling ( 35 S-Methionine), the hydrophobic proteins were isolated by affinity column and separated by S DS-PAGE, revealing a protein profile, similar to total protein extract, with two major ba nds (65.8 kDa and 59 kDa) eluted with 0.5M and 1M NaCl in trypomastigotes and epimastigotes, r espectively. The isotopic analysis also revealed a higher expression of heparin ligand (1.3 -2X) in trypomastigotes when compared to epimastigotes. The heparin binding proteins were detected at membrane fraction of epimastigotes obtained by cell fractionation method ology associated to the affinity column purification. The detection of proteins eluted from heparin affinity column with biotinilated heparin, CS and HS by Western blotting revealed intense labeling mainly at the 59 kDa protein. In addition, the analysis of the proteins by denaturant electrophoresis revealed the presence of two protein band in both trypomastigote s and epimastigotes forms of T. cruzi . Complementary biochemical assays will be carried ou t to get more detailed information about the T. cruzi heparin binding protein.

Made available in DSpace on 2016-03-01T13:55:37Z (GMT). No. of bitstreams: 2 tatiana_silva_ioc_mest_2015.pdf: 3067653 bytes, checksum: 41c1cf15490ae626f7e3749c47bd19a5 (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2016-02-23 / Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Oswaldo Cruz. Rio de Janeiro, RJ, Brasil / As manifestações mais severas da doença de Chagas são a cardiomiopatia e fibrose cardíaca, mas o tecido muscular esquelético também é afetado pela infecção pelo T. cruzi, resultando em necrose e miosite. O acúmulo de matriz extracelular (MEC) durante o processo de fibrose está envolvido com a patogenia da doença de Chagas, mas seus mecanismos de regulação durante a infecção ainda não estão elucidados. Assim, nos propomos a comparar a resposta de cardiomiócitos (CM), fibroblastos cardíacos (FC) e mioblastos esqueléticos (L6E9) infectados pelo T. cruzi frente ao estímulo de TGF-\03B2, importante citocina fibrogênica envolvida no desenvolvimento da cardiomiopatia chagásica, analisando também os mecanismos de sinalização envolvidos neste processo. FC foram purificados a partir de culturas de CM. Purificação adequada de FC foi obtida somente a partir da 5ª dissociação de culturas de CM, revelada pela baixa detecção de desmina, proteína específica de cardiomiócitos. Culturas de CM, FC e L6E9 normais e infectados pelo T. cruzi (cepa Y) foram tratadas por 1h ou 48h com TGF-\03B2 (1-10 ng/ml). A expressão de FN, SMAD 2 fosforilada (PS2), fosfo-p38 e fosfo-c-Jun foram avaliadas por Western blot (WB) após 1h e 48h de tratamento com TGF-\03B2 (1-10 ng/ml). Análises de WB revelaram que mioblastos L6E9 e FC apresentam aumento de FN já a partir de 1ng/ml de TGF-\03B2, em contraste com CM, em que só foi observado aumento de MEC com 15ng/mL. A infecção pelo T. cruzi induziu uma diminuição da expressão deste componente de MEC em L6E9. FC, por sua vez, apresentam modulação de FN de acordo com o grau de infecção da cultura, com culturas com baixo grau de infecção apresentando redução de FN e culturas altamente infectadas mostrando aumento desta proteína de MEC. A distribuição de fibronectina (FN) também foi analisada por imunofluorescência indireta FC e L6E9 apresentaram um aumento na expressão de FN a partir de 1ng/ml de TGF-\03B2, confirmando o WB. Após infecção pelo T. cruzi, foi observada uma desorganização e redução na expressão de FN em CM, FC e L6E9 infectados, enquanto células não infectadas adjacentes apresentaram perfis de FN similares ao controle. A resposta diferencial entre os tipos celulares frente ao estímulo com TGF-\03B2 resulta de mecanismos distintos de sinalização intracelular, uma vez que FC e L6E9 apresentam maior disparo da via de SMADs que CM, enquanto a via de p38 (independente de SMADS) é menos estimulada em FC quando comparados com CM e L6E9. Também foi avaliado o perfil de expressão de proteínas das vias de sinalização clássica e alternativa do TGF-\03B2 em culturas de FC normais e infectados com T. cruzi e tratados com 10ng/ml da citocina. Culturas infectadas e tratadas com TGF-\03B2 (10ng/ml) apresentaram uma redução nos níveis de fosforilação de SMAD 2 quando comparados com células normais tratadas. Culturas de FC infectadas não apresentaram aumento de fosfo-p38MAPK, mas disparo na via foi observado após tratamento com 10ng/ml de TGF-\03B2 em FC infectados. Aumento na fosforilação de c-Jun após a infecção e após tratamento com 10ng/ml de TGF-\03B2 também foi detectado em FC. Em conjunto, nossos dados sugerem que a expressão de FN é modulada diferencialmente por TGF-\03B2 em mioblastos L6E9, FC e CM, e que as vias moduladas por SMADS, p38 MAPK e c-Jun possam estar participando no processo de regulação de fibrose mediado pela citocina TGF-\03B2 após infecção pelo T. cruzi / The most severe manifestations of Chagas disease are cardiomyopathy and cardiac fibrosis, but the skeletal muscle tissue is also affected by T. cruzi infection, resulting in necrosis and myositis. The accumulation of extracellular matrix (ECM) during the fibrosis process is involved in the pathogenesis of Chagas disease, but the mechanisms of its regulation during infection are not clear yet. Therefore, we propose to compare the response of cardiomyocytes (CM), cardiac fibroblasts (CF) and skeletal myoblasts (L6E9) infected with T. cruzi after TGF - β stimulation, which is an important fibrogenic cytokine involved in the development of Chagas cardiomyopathy, also analyzing the signaling mechanisms involved in this process. CF were purified from CM cultures . Adequate purification was obtained after the 5th dissociation of CM cultures , as revealed b y low detection of desmin, a cardiomyocyte - specific protein. Cultures of normal and T. cruzi (Y strain) infected CM, CF and L6E9 were treated for 1h or 48 hs with TGF - β (1 - 10 ng/ml) . The expression of FN , phosphorylated SMAD 2 (PS2), phospho - p38, and phospho - c - Jun were also evaluated by Western blot (WB) after 1h and 48h treatment with TGF - β (1 - 10 ng / ml). WB analysis revealed that CF and L6E9 showed an increase in FN expression from 1ng/ml of TGF - β , contrasting to CM, in which an increased in ECM was only o bserved after 15ng/ml treatment . T. cruzi infection induced a decrease in the expression of this ECM component in L6E9. CF presented FN modulation according to the d egree of infection of the culture, with cultures containing a low degree of infection presenting a reduction of FN and highly infected cultures showing an increase of this ECM protein. T he distribution of fibronectin (FN) was also analyzed by indirect immu nofluorescence. CF and L6E9 displayed a raise in FN expression rfom 1 ng/mL, confirming WB. After T. cruzi infection, disorganization and reduced FN expression was observed in infected CM , CF and L6E9, while adjacent uninfected cells showed similar FN prof iles as controls. The differential response between cellular types facing TGF - β stimulation results from distinct intracellular signaling mechanisms, since CF and L6E9 have higher activation of SMAD s pathway than CM, while p38 pathway (independent of SMAD S ) is less stimulated in CF when compared to CM and L6E9. We also evaluated the protein expression profile of classical and alternative TGF - β signaling pathways in normal and T. cruzi infected CF cultures, treated with 10 ng/ml of the cytokine. Infected CF cultures treated with TGF - β (10ng/ml) showed a reduction in the levels of phosphorylation of SMAD 2 when compared with normal and treated controls. CF infected cultures did not show increased phosphorylation of p38MAPK, but activation in the pathway was ob served after treatment with 10 ng/ml TGF - β . An increase in phosphorylation of c - Jun after infection and after treatment with 10 ng/ml TGF - β was also detected in CF. When considered together, o ur data suggest that FN expression is differentially modulated b y TGF - β in L6E9 mioblasts, CF and CM, and pathways modulated by SMAD S, p38 MAPK and c - Jun may be participating in fibrosis regulatory process mediated by with TGF - β cytokine after T. cruzi infection

Made available in DSpace on 2016-03-18T12:16:56Z (GMT). No. of bitstreams: 2 cecilia_vieira_ioc_dout_2015.pdf: 5478933 bytes, checksum: 82e22f21a3f655c7a35e09359316e42f (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2016-02-23 / Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Oswaldo Cruz. Rio de Janeiro, RJ, Brasil / Rhodnius prolixus é um dos principais insetos vetores de Trypanosoma cruzi e de Trypanosoma rangeli na América Latina. A produção de peptídeos antimicrobianos (AMPs) no trato digestivo ou corpo gorduroso do inseto é vital para evitar a proliferação de microrganismos patogênicos além de manter a homeostasia da microbiota nativa. O presente trabalho focou na modulação da imunidade humoral do intestino médio de R. prolixus desafiados oralmente com a bactéria Gram-positiva Staphylococcus aureus e Gram-negativa Escherichia coli, além de seus tripanosomatídeos naturais T. rangeli e T. cruzi, considerando a influência do desenvolvimento dos parasitas sobre a microbiota intestinal. Em condições normais, a região anterior do intestino médio houve maior abundância de transcritos de genes de lisozimas (lis) e defensinas (def), enquanto na posterior, do gene da prolixicina (prol). Insetos alimentados com bactérias Gramnegativas apresentaram maior quantidade de transcritos de defC e prol, enquanto a ingestão de bactérias Gram-positivas induziu a expressão de defA e defB no intestino médio A infecção por T. rangeli cepa Macias diminuiu a atividade fenoloxidásica, os níveis de expressão de lisozimas e prolixicina, ao mesmo tempo em que induziu aumento de atividade antibacteriana e dos níveis de defensina C no tubo digestivo do inseto, também modificando a composição de bactérias nativas. Além disso, foi verificado que as diferentes cepas de T. cruzi Dm 28c e Y modulam a resposta imune e a microbiota no intestino médio de R. prolixus de forma variável. T. cruzi Dm 28c induziu um aumento na expressão de genes de defensina C e uma diminuição da expressão de genes de prolixicina, reduzindo drasticamente a população bacteriana cultivável. Em contraste, T. cruzi Y não foi capaz de induzir a expressão de AMPs no intestino médio nem de reduzir consideravelmente a microbiota neste mesmo órgão. Nossos resultados sugerem que R. prolixus em resposta a ingestão de microrganismos, modula diferencialmente a expressão de AMPs pelas células epiteliais do intestino que acarreta a redução da microbiota e um favorecimento do desenvolvimento de T. rangeli e T. cruzi, dependendo do genótipo do parasita / Rhodnius prolixus is a major vector of Trypanosoma rangeli and Trypanosoma cruzi , in Latin America. T he production of antimicrobial peptides (AMPs) in the midgut of the insect is vital to control possible infection, and to maintain the microbiota already present in the digestive tract. This work focuses on the modulation of the humoral im mune responses of the midgut of R. prolixus orally challenged with Gram positive and Gram negative bacteria as well with T. rangeli Macias strain, T. cruzi Dm 28c and Y strain, considering the influence of the parasite s on the intestinal microbiota . Our re sults showed that the anterior midgut contents of control insects contain a higher inducible antibacterial activity and AMPs transcript abundance than those of the posterior midgut. Insects orally fed with Gram - negative bacteria presented higher amount of defC and prol transcripts, while the ingestion of Gram - positive induced defA and defB expression in the midgut. T. rangeli Macias strain successfully colonized R. prolixus midgut through a decreasing in PO activities , prolixicin and lysozyme levels, while at the same time in duc ed an increase in antibacterial activity and upregulated defC levels in the insect anterior midgut. T. rangeli infection also diminishes the amount of cultivable gut bacteria as well modif ied the composition of indigenous microo rganisms. Furthermore, different T. cruzi strains present distinct profile s of immune system and microbiota modulation in R. prolixus midgut, where T. cruzi Dm 28c was able to induce an increase in defensin C genes and a depression in prolixicin genes, whi le drastically reduce the cultivable bacteria population. In the other hand T. cruzi Y was not competent to induce AMPs expression in the gut or considerably reduce the microbiota in the anterior midgut. Our findings suggest that R. prolixus modulates AMP gene expression upon ingestion of bacteria and tripanosomatids with patterns that are distinct and dependent upon the species of the invading pathogen. Besides, t he trypanosome ability to induce immune peptides in epithelial cells seems to favor its development in the insect digestive tract by decreasing intestinal microbiota , depending on the parasite genotype

Made available in DSpace on 2016-03-28T12:39:37Z (GMT). No. of bitstreams: 2 patricia_ferrao_ioc_dout_2014.pdf: 5118660 bytes, checksum: d25122b18e1bcb82dee22e425b2ed062 (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2016-01-13 / Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Oswaldo Cruz. Rio de Janeiro, RJ, Brasil / Estudos recentes mostraram que TGF-\03B2 esta envolvido na cardiopatia chagásica aguda e crônica. O aumento de seus níveis plasmáticos e a ativação da sua via de sinalização celular são aspectos peculiares da doença chagásica crônica. Além do seu relevante papel na patologia chagásica, também se observou que esta citocina está intimamente associada ao T. cruzi como um regulador de diferentes etapas de seus ciclo de vida. Trabalhos anteriores demostraram que T. cruzi é capaz de ativar TGT-\03B2 latente, utilizando-o na invação às células hospedeiras e que amastigotas de T. cruzi se ligam e internalizam TGF-\03B2 recombinante, estando este evento relacionado à capacidade de proliferação de amastigotas e sua diferenciação em tripomastigotas no final do ciclo intracelular. Este conjunto de informações nos levou ao questionamento de quais moléculas de T. cruzi poderiam estar envolvidas nos processos de proliferação e diferenciação celular frente ao estímulo por TGF-\03B2. Neste sentido, o presente projeto tem por principal objetivo a caracterização de moléculas responsivas ao estimulo de TGF-\03B2 através de uma abordagem fosfoproteômica. Para tal, extratos de proteínas totais de epimastigotas de T. cruzi (cepa Y), incubadas ou não com TGF-\03B2, foram preparados durante a fase exponencial de crescimento do parasito. Evidenciamos que a dose ótima de TGF-\03B2 para maior indução de fosforilação seria de 5 ng/ml. em seguida, o tempo ótimo de indução com TGF-\03B2 (1,5,15,30 e 60 minutos) foi testado e concluímos que as diferenças entre os padrões de fosforilação são muitos sutis em géis unidimensionais, nos fazendo optar pela análise exclusiava dos perfins em géis bidimensionais de 7 cm com faiza de PH 3-10 não-linear. A avaliação dos perfis bidimensionais demonstrou diferenças nos padrões de fosforilação entre os tempos estudados, nos levando a manter um estudo de cinética de tempo. As imagens dos géis foram analisadas e algumas das proteínas consideradas responsivas a TGF-\03B2 foram identificadas por espectrometria de massas. Observamos que as proteínas de choque térmico, tubulinas, desidrogenases, enolases, ciclofilina A, GrpE, cruzipaína, fator de elongamento 1-\03B1, fator de iniciação eucariótica 5a, entre outras, têm sua fosforilação e/ou expressão moduladas em resposta a TGF-\03B2. Buscamos correlacionar a função já descrita na literatura para cada proteína com seu possível papel na sinalização intracelular dsparada por TGF-\03B2, em concordância com o comportamento de fosforilação e/ou expressão apresentado em novas análises. Por último, foi avaliado se a adição de TGF-\03B2 a culturas de epimastigotas teria algum efeito sobre a proliferação dos parasitos. Verificamos que a adição de TGF-\03B2 promoveu um aumento de até 73% no crescimento dos parasitos nas primeiras 24 horas de estudo. O conjunto de dados obtidos contribui para a elucidação dos mecanismos moleculares relacionados à sinalização de TGF-\03B2, proporcionando uma fonte para detecção de novos alvos terapêuticos para a doença de Chagas / Recent studies show that TGF - β is involved in the acute and chronic chagasic cardiopathy. High levels of TGF - β and the activation of its signaling pathway were shown to be peculiar aspects of patients with chron ic Chagas disease. Besides its relevant role in the pathology of Chagas dis ease, this cytokine was also observed to be intimately associated with Trypanosoma cruzi as a regulator of different stages of the parasite ́s life cycle. Previous works have show n that T. cruzi , using it in the process of h ost cell invasion. In addition, amastigote forms are able to bind and internalize recombinant TGF - β , and this event is related to their capacity to proliferate and differentiate int o trypomastigote forms at the end of the intracellular cycle. Taken togethe r, this set of information raises the question as molecules are involved in the processe of cellular proliferation and differentiation stimulated by TGF - β . Therefore, this work aims to characterize TGF responsive molecules through a pho sphoproteomic approach. For this purpose, total T. cruzi epimastigotes (Y strain), incubated or not with TGF were prepared from parasites in the exponential gro wth phase. We determined that 5 was the dose that induce d the highest number of phosphorylation events. Next, the optimal induction time (1, 5, 15, 30 and 60 minutes) was evaluated and we concluded that the phosphorylation patterns from the studied times showed only subtle differences using 1 -DE analysis, leadi ng us to evaluate these profiles DE gels (7cm pH 3 -10 non- linear). The profiles obtained showed differences in phosphorylation patterns duri ng the time - which led us to maintain a time - kinetics study. Gel images wer responsive proteins were identified by mass spectr ometry. We observed that heat shock proteins, tubulins, dehydr ogenases, enolases, cyclophilin A, GrpE, cruzipain, elongation factor - 1 α , eukaryotic initiation factor their phosphorylation and/or expression levels modu lated by TGF correlate the function already described in the lit erature for each protein with their possible role in intracellular signaling triggered by TGF - β , in agreement with thei phosphorylation and/or expression behavior shown in our analysis. Finally, we assessed whether the addition of TGF - β to epimastigotes cultures would have some effect on parasite proliferation. We found that TGF - β addition led to an increase of up in parasite growth in the first 24 hours of culture . The data presented here contributes to the elucidation of the molecular mec hanisms related to TGF , providing a source of new potential therapeutic t argets against in response to TGF - β is involved in the acute and chronic chagasic and the activation of its signaling pathway were shown to be peculiar aspects of patients with chron ic Chagas disease. Besides its ease, this cytokine was also observed to as a regulator of different stages of T. cruzi is able to activate ost cell invasion. In addition, amastigote , and this event is related to their capacity to proliferate and differentiate int o trypomastigote forms at the end of r, this set of information raises the question as molecules are involved in the processe of cellular proliferation and . Therefore, this work aims to characterize TGF - β sphoproteomic approach. For this purpose, total epimastigotes (Y strain), incubated or not with TGF - β , were prepared from parasites in the exponential gro wth phase. We determined that 5 d the highest number of phosphorylation events. Next, the optimal induction time (1, 5, 15, 30 and 60 minutes) was evaluated and we concluded that the phosphorylation patterns from the studied times showed ng us to evaluate these profiles linear). The profiles obtained - course under study, kinetics study. Gel images wer e analyzed and responsive proteins were identified by mass spectr ometry. We observed that heat shock proteins, tubulins, dehydr ogenases, enolases, cyclophilin , eukaryotic initiation factor -5a and others had their phosphorylation and/or expression levels modu lated by TGF - β . We tried to correlate the function already described in the lit erature for each protein with their , in agreement with thei r phosphorylation and/or expression behavior shown in our analysis. Finally, we to epimastigotes cultures would have some addition led to an increase of up in parasite growth in the first 24 hours of culture . The data presented here contributes to the elucidation of the molecular mec hanisms related to TGF - β , providing a source of new potential therapeutic t argets against Chagas disease

Made available in DSpace on 2016-04-04T12:35:28Z (GMT). No. of bitstreams: 2 fabiane_oliveira_ioc_mest_2011.pdf: 3896096 bytes, checksum: 9a40f48ee5a31a58097d262a13401dc9 (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2011 / Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Oswaldo Cruz. Rio de Janeiro, RJ, Brasil / O fator de crescimento de transformação beta (TGF-\03B2) é uma citocina multifuncional envolvida na modulação de diversos processos celulares, como proliferação celular, formação e degradação de matriz extracelular, tanto em eventos fisiológicos como patológicos. Nosso grupo tem demonstrado o papel regulador de TGF-\03B2 na invasão, crescimento e diferenciação do Trypanosoma cruzi (T. cruzi), o agente etiológico da doença de Chagas, uma importante causa de mortalidade e morbidade em países endêmicos na América latina. Haja vista que o remodelamento da matriz extracelular está diretamente relacionado à extensa fibrose observada no curso da doença de Chagas, nosso objetivo foi avaliar a ação terapêutica de um inibidor da via de sinalização de TGF-\03B2 (GW-788388) sobre a infecção aguda experimental pelo T. cruzi. Para essa análise foi utilizado o modelo de infecção pelo T. cruzi (cepa Y) em camundongos suíços submetidos ao tratamento oral com o composto em diferentes dias pós-infecção (3º, 13º e 20º dpi). Nossos dados revelaram diferentes respostas terapêuticas de acordo com o dia pós-infecção no qual o composto foi administrado. Quando administrado no 3º dpi, GW-788388 foi capaz de reduzir: (i) o parasitismo tissular e inflamação no coração e fígado; (ii) os níveis plasmáticos de AST, ALT e uréia e; (iii) a deposição de colágeno I e fibronectina no coração dos animais infectados. Neste esquema de tratamento, GW-788388 reverteu ainda a queda na expressão de conexina-43 e os danos de condução elétrica, sugerindo um papel protetor contra os danos cardíaco, hepático e renal, induzidos na infecção por este parasito. Interessantemente, o tratamento no 13º dpi com GW-788388, apesar de não alterar os parâmetros parasitológicos e clínicos avaliados em relação ao grupo não tratado, aumentou a mortalidade, sugerindo a relevância da via de TGF-\03B2 neste período da infecção em que os camundongos estão em choque sistêmico. No entanto, quando a administração do composto foi realizada no 20º dpi, os resultados revelaram uma significativa diminuição na expressão de colágeno I, indicando a eficiência deste tratamento em promover a degradação dos elementos de matriz no tecido cardíaco infectado. Em resumo, a inibição da via de sinalização de TGF-\03B2 reduziu a infecção pelo T. cruzi, previniu os danos cardíacos e reverteu a deposição de componentes de matriz extracelular, observados durante esta infecção in vivo. O conjunto dos resultados apresentados sugere que o bloqueio da atividade de TGF-\03B2 pode representar uma importante intervenção terapêutica a ser investigada em modelos de infecção aguda e crônica pelo T. cruzi. / Transforming growth factor beta (TGF - β ) is a multifunctional cytokine involved in modulating many cellular processes such as cell prolife ration, formation and degradation of extracellular matrix in physiological and pathological events. Our group has demonstrated the regulatory role of TGF - β in parasite host - cell invasion, growth and differentiation of Trypanosoma cruzi ( T. cruzi ), the eti ologic agent of Chagas disease, an important cause of morbidity and mortality in endemic countries in Latin America. Considering that the extracellular matrix remodeling is directly related to the extensive fibrosis observed in Chagas disease outcome, our objective was to evaluate the therapeutic action of an inhibitor of the signaling pathway of TGF - β (GW - 788388) during acute experimental T. cruzi infection. For this analysis we used the model of T. cruzi infection (Y strain) in Swiss mice subjected to oral treatment with the compound at different days post - infection (3 rd , 13 th and 20 th dpi). Our data revealed different therapeutic responses according to the day post - infection in which the compound was administered. When administered in the 3 rd dpi, GW - 788388 was able to reduce: (i) the tissue parasitism and inflammation in heart and liver, (ii) the pl asma levels of AST, ALT and urea, and (iii) collagen I and fibronectin deposition in the hearts of infected animals. In this treatment scheme, GW - 788388 reversed the decrease of connexin - 43 expression and electrical conduction damages, suggesting a protect ive role of this compound in the heart, kidney and liver damage, induced by this parasitic infection. Interestingly, treatment in the 13 th dpi with GW - 788388, although presented similar parasitological parameters in relation to the untreated group, an incr eased mortality was observed, suggesting the relevance of TGF - β pathway in this period of the infection, in which mice were in systemic shock. However, when the compound administration was performed at the 20 th dpi, the results revealed a significant collagen I expression decrease, indicating the effectiveness of thi s treatment in promoting the degradation of extracellular matrix elements in the infected cardiac tissue. In summary, TGF - β signaling pathway inhibition reduced the infection by T. cruzi , prevented heart damage and reversed the extracellular matrix compone nts deposition, observed during this infection in vivo . The combined results suggest that blocking the activity of TGF - β may represent an important therapeutic intervention to be investigated in acute and chronic models of T. cruzi infection.

Made available in DSpace on 2016-04-04T12:40:38Z (GMT). No. of bitstreams: 2 vanessa_neves_ioc_mest_2010.pdf: 3872823 bytes, checksum: 90bf38dc504d5226b7598ef2772eb07c (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2010 / Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Oswaldo Cruz. Rio de Janeiro, RJ, Brasil / A automatização da Reação em Cadeia da Polimerase (PRC) abriu uma nova perspectiva no diagnóstico do Trypanossoma Cruzi tanto em amostras clínicas humanas, como na identificação do parasita em seus vetores e reservatórios. Para a realização da PCR é necessária a realização da extração do DNA (pré-etapa da amplificação), onde o ácido nucléico é liberado e purificado a partir da amostra biológica, tendo como condição ideal a obtenção de um DNA puro e em altas concentrações. Este trabalho visou avaliar o desempenho de protocolos de extração de DNA descritos na literatura científica, através dos seguintes parâmetros: concentração de DNA, grau de pureza, PCR (ampliação de uma seqüência de DNA específica), reprodutibilidade, praticidade e custo. Foram testados 12 protocolos, cujos critérios de seleção foram \201Cmétodos de extração de DNA in house de espécimes do Filo Arthropoda\201D e \201Ckits e/ou preparados comerciais mais citados na literatura científica no período de janeiro de 2002 a julho de 2009\201D. A extração foi realizada em exemplares da espécie Rhodnius brethesi infectados através de experimentos de reconstituição (infecção artificial) com 3 concentrações distintas de T. cruzi (1, 10 e 100 parasitas por amostra extraída). Os melhores resultados nos parâmetros concentração de DNA, grau de pureza e PCR, foram apresentados pelos protocolos 08 (in house) e 09 (QIAamp DNA Stool Mini Kit, Marca Qiagen, nº de cat 51504), tendo o protocolo 08 mostrado maior concentração estimada de DNA total e um maior número de amostras com valores dentro da faixa de pureza, em relação ao protocolo 09 e a todos os outros protocolos testados Atribuímos essa melhor performance a uma associação eficiente entre número de etapas de purificação e os componentes do tampão de lise. Em relação aos parâmetros custo e praticidade, o protocolo 09 (kit) revelou ser o mais econômico e demandar menos tempo na sua execução total, comparado ao protocolo 08. Dentro do questionário de opinião, que apontou grau de pureza como parâmetro mais importante, o protocolo mais indicado para extração de amostras a partir de triatomíneos foi o protocolo 08. Assim, dois protocolos podem ser indicados: o 08 e o 09. Dos seis parâmetros analisados, os valores de estimativa de concentração de DNA, obtidos como método da espectrofotometria, apresentaram-se discrepantes; devido a isso não indicamos esse método para avaliar o parâmetro concentração. / The Polymerase Chain Reaction (PCR) enabled a new diagnosis of Trypanosoma cruzi in human vertebrate samples such as the parasite identification in its vectors and reservoirs. PCR demands a pure and high concentrated DNA; therefore DNA extraction is an important step that must be well performed. Considering this, we have evaluated specific parameters – concentration and purity of the DNA, PCR (specific DNA sequence ampli ficat ion), reproducibility, practicality and cost – in order to assess the performance of extraction protocols. Twelve protocols were selected according to two criteria: 1 -in house methods used to extract DNA from specimens belonging to the Phylum Arthropo da; 2 -kits and/or commercial preparations most often cited in scientific papers from january 2002 to july 2009. Extraction was carried out on specimens of Rhodnius brethesi artificially infected with three different concentrations of T. cruzi (1, 10 and 10 0 parasites per sample extracted). Protocols 08 (in house CTAB based) and 09 (QIAamp DNA Stool Mini Kit, Qiagen, Cat number 51504) revealed the best concentration and purity of the DNA results in addition to the higher number of amplified samples. Comparat ively, protocol 08 was even better than 09 on these parameters, presumabily for the efficient association between number of purification steps and components of the lysis buffer. On the other hand, protocol 09 was less costly than protocol 08, besides fast er to execute. Participants of a survey designated DNA purity as the most important parameter regarding a DNA extraction protocol leading us to indicate protocol 08 for the extraction of samples taken from triatomine. Besides protocol 08, the kit represent ed by protocol 09 can also be indicated because of its lower cost and fastness. The discrepancy in the results obtained for DNA concentration lead us to discourage the uso of spectrophotometry to estimate DNA concentration

Made available in DSpace on 2016-04-20T12:49:38Z (GMT). No. of bitstreams: 2 amanda_tucci_ioc_mest_2015.pdf: 5122366 bytes, checksum: 8fea49a02fa58dc27c0339860fdb91fd (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2015 / Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Oswaldo Cruz. Rio de Janeiro, RJ, Brasil / A diversidade genética do Trypanosoma cruzi influencia diferentes parâmetros biológicos e tem sido apontada como fator importante para o desfecho clínico da doença de Chagas. A expressão diferencial de genes e proteínas entre as diferentes DTUs do T. cruzi parece determinar a virulência do parasito e sua capacidade de subverter a resposta imune e persistir no hospedeiro mamífero. Dentre o repertório de moléculas de superfície dos parasitos envolvido no reconhecimento celular, destacamos as proteínas de ligação à heparina (PLHs) que atuam no ciclo de vida de diferentes patógenos intracelulares, incluindo o T. cruzi. PLHs desempenham importante papel na citoaderência e entrada do T. cruzi através do reconhecimento de proteoglicanos de heparam sulfato (PGHS) na superfície de células de mamíferos. O mecanismo de invasão disparado pela interação PLHs-PGHS, assim como a presença de PLHs em T. cruzi de diferentes genótipos (TCI e TCII) ainda não foi elucidado. O presente estudo teve como objetivo avaliar a expressão de PLHs e glicoproteínas (GPs), gp35/50, gp82 e gp90, envolvidas na invasão de tripomastigotas derivados de cultivo celular (TCT), tripomastigotas sanguíneos (BT) e metacíclicos (MT) de T. cruzi da cepa Y (TcII) e isolado silvestre SMM36 (isolado de espécimes de Triatoma vitticeps da região de Santa Maria Madalena, RJ; Zimodema 3), bem como sua atuação nos eventos de internalização destes parasitos. A expressão e localização subcelular de PLHs e GPs em T. cruzi foi determinada pela incubação por 1h no gelo de tripomastigotas com 20\03BCg/mL de heparina ou heparam sulfato (HS) conjugados à biotina seguido de processamento para citometria de fluxo e microscopia de fluorescência As análises de citometria de fluxo revelaram que tripomastigotas (TCT, BT e MT) de diferentes genótipos (cepa Y e isolado SMM36) possuem uma expressão diferencial de PLHs e GPs em sua superfície. TCTs e BT (cepa Y) possuem elevada expressão de PLHs comparado aos MTs. Cerca de 90% da população de TCTs apresentam marcação positiva para PLHs enquanto apenas 10-25% dos MTs possuem esta proteína expressa na superfície. Em contraste, MTs apresentam níveis mais elevados de gp35/50, gp82 e gp90 comparados aos TCTs. A localização subcelular de PLHs em domínios de sinalização do T. cruzi é bastante peculiar. Em TCTs e BT (cepa Y), PLHs estão localizadas na membrana flagelar enquanto as GPs estão distribuídas ao longo do corpo do parasito (TCT e MT), exceto gp90 que é negativa nos TCTs. Ainda, a capacidade invasiva dos parasitos e o papel de proteoglicanos sulfatados foi analisada utilizando células de ovário de hamster chinês competentes (CHO-K1) e mutantes deficientes em glicosaminoglicanos (CHO-745) como modelo experimental de invasão. Os dados quantitativos da infecção revelaram que TCTs (cepa Y e isolado SMM36) são mais infectivos que MTs. TCTs alcançaram um perfil de infecção entre 52-85% após 2h de interação com CHO-K1, de acordo com a razão parasito-célula alvo, enquanto MTs atingiram o máximo de 6% de infecção neste tempo de interação Embora o percentual de infecção tenha sido similar entre TCTs dos diferentes genótipos, a análise do índice endocítico revelou maior eficiência do isolado SMM36 na invasão, apresentando valores cerca de 40% maior de parasitos interiorizados. Ainda, CHO-745 infectadas com TCT (Y e SMM36) apresentaram redução de aproximadamente 30% nos níveis de infecção quando comparadas a CHO-K1. Este fenômeno não foi observado em MTs mesmo após 24h de interação, cujo percentual de infecção alcançou 37% na maior relação parasito-célula alvo (60:1). Este conjunto de dados sugere que a interação PLHs-PGHS possa disparar vias de sinalização importantes para entrada de parasitos que expressam elevados níveis de PLHs em sua superfície. O mecanismo de invasão mediado pela interação PLHs-PGHS será alvo de futura investigação / The genetic diversity of Trypanosoma cruzi influences different biological parameters and has been identified as an important factor for the clinical outcome of Chagas’ disease. The differential gene and protein expression between different DTUs of T. cruzi seems to determine the virulence of the parasite and its capacity to subvert the immune response and persist in the mammalian host. Among the surface molecules repertoire of parasites involved in cell recognition, we highlight the heparin binding proteins (PLHs) acting in the life cycle of different intracellular pathogens, including T. cruzi. PLHs play an important role in cytoadherence and entrance of T. cruzi by recognizing heparan sulfate proteoglycan (PGHS) in the mammalian cell surface. The mechanism of invasion triggered by PLHs-PGHS interaction, as well as the presence of PLHs in different genotypes (TCI and TCII) of T. cruzi has not yet been elucidated. This study aimed to evaluate the expression of PLHs and glycoproteins (GPs), GP35/50, gp82 and gp90, involved in the invasion of cell culture derived trypomastigotes (TCT), bloodstream trypomastigotes (BT) and metacyclics (MT) of T. cruzi of Y strain (TCII) and the sylvatic isolate SMM36 (isolated from specimens of Triatoma vitticeps from Santa Maria Madalena region, RJ; Zymodeme 3), as well as their role in the events of internalization of these parasites. Expression and subcellular localization of PLHs and GPs in T. cruzi was determined by incubation for 1 h on ice of trypomastigotes with 20μg/mL of biotin-conjugated heparin or heparan sulfate (HS) followed by processing for flow cytometry and fluorescence microscopy. The flow cytometry analysis showed that trypomastigotes (TCT, BT and MT) of different genotypes (Y strain and SMM36 isolate) have differential expression of PLHs and GPs on their surface. TCTs and BT (Y strain) have high expression of PLHs compared to MTs. About 90% of TCT population has positive labeling to PLHs while only 10-25% of MTs have expressed this protein on the surface. In contrast, MTs have higher levels of GP35/50, gp82 and gp90 when compared to TCTs. The subcellular localization of PLHs in signaling domains of T. cruzi is quite peculiar. In TCTs and BT (Y strain), PLHs are located in the flagellar membrane while GPs are distributed throughout the parasite's body (TCT and MT), except that gp90 is negative in TCTs. Also, the invasive capacity of the parasites, and the role of sulfated proteoglycans were analyzed using wild-type chinese hamster ovary cells (CHO-K1), and its mutant cell line deficient in glycosaminoglycan (CHO-745) as experimental model of invasion. The quantitative data of infection revealed that TCTs (Y strain and SMM36 isolate) are more infective than MTs. TCTs reached a range of infection between 52-85% after 2h of interaction with CHO-K1, according to the parasite- host cell ratio, while MTs reached a maximum of 6% infection at this time of interaction. Although the percentage of infection was similar between TCTs of different genotypes, the analysis of the endocytic index showed higher efficiency of invasion in the SMM36 isolate, showing values about 40% more of internalized parasites. Also, CHO-745 infected with TCT (Y strain and SMM36 isolate) exhibit approximately 30% decrease in infection levels compared to CHO-K1. This phenomenon was not observed in MTs even after 24 hours of interaction, whose percentage of infection reached 37% at the highest parasite-target cell ratio (60: 1). These data suggest that PGHS-PLHs interaction may trigger signaling pathways important for entry of parasites that express high levels of PLHs on its surface. These invasion mechanisms mediated by PLHs PGHS-interaction will be the focus of future research. / 2016-10-29

Made available in DSpace on 2016-05-11T13:02:55Z (GMT). No. of bitstreams: 2 rafael_silva_ioc_dout_2015.pdf: 3184979 bytes, checksum: 424c613846e42fb4bb955e915c629888 (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2015 / Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Oswaldo Cruz. Rio de Janeiro, RJ, Brasil / A doença de Chagas (DC) é causada pela infecção pelo Trypanosoma cruzi e consiste num importante problema de saúde pública nas Américas do Sul e Central. Embora não caracterizado, o acometimento do sistema nervoso central (SNC) na DC foi demonstrado na fase aguda em crianças e na reativação da infecção em pacientes crônicos imunossuprimidos. Porém, os alvos celulares do T. cruzi e a origem dos parasitos no SNC em episódios de reativação crônica não estão claros. Os astrócitos são as células gliais mais abundantes do SNC humano e sua participação na DC carece de informação, bem como o papel das citocinas Interferon-gama (IFN\03B3) e fator de necrose tumoral (TNF), duas importantes citocinas no contexto da infecção pelo T. cruzi, no processo de infecção do SNC. Estudos nesse sentido são importantes diante da crescente ocorrência de co-infecção T. cruzi/HIV, bem como acesso dos pacientes a transplantes e demais situações que causam imunossupressão. Assim, investigamos a infecção de astrócitos pelo T. cruzi e os efeitos de IFN\03B3 e TNF nesse processo. Mostramos que o T. cruzi persistiu no SNC de camundongos da linhagem C3H/He cronicamente infectados em paralelo à expressão de mRNA de IFN\03B3, e a maioria das células albergando o T. cruzi eram astrócitos frequentemente localizados próximo a células mononucleares IFN\03B3+, micrógliais, como mostrado por imunoistoquímica. Utilizamos cultivos primários de astrócitos de camundongos C3H/He e C57BL/6 tratados com IFN\03B3 ou TNF na presença de tripomastigotas da cepa Colombiana do T. cruzi e analisamos taxa de infecção, crescimento do parasito e produção de mediadores inflamatórios in vitro; e o efeito do bloqueio de TNF na infecção do SNC pelo T. cruzi Confirmamos que astrócitos de ambas as linhagens foram suscetíveis à infecção pelo T. cruzi, e que o pré-tratamento com IFN\03B3 ou TNF favoreceu a invasão dos astrócitos pelo parasito e aumentou o número de formas amastigotas nos astrócitos. Tanto o T. cruzi quanto o IFN\03B3 não foram capazes de induzir sozinhos produção de óxido nítrico (NO), que só foi induzido pela associação de ambos os estímulos. O tratamento com L-NAME (inibidor de síntese de NO) reduziu parcialmente o número de formas amastigotas do T. cruzi em astrócitos tratados com IFN\03B3, enquanto o tratamento com Infliximab (anticorpo neutralizante anti-TNF) preveniu completamente o efeito de IFN\03B3 no favorecimento à infecção de astrocitos pelo T. cruzi, indicando que IFN\03B3 favorece a infecção de astrócitos pelo T. cruzi via TNF. Somado a isso, a expressão de mRNA e a produção de TNF foram aumentadas nos cultivos de astrócitos infectados pelo T. cruzi, enquanto que o seu receptor TNFR1 teve expressão aumentada apenas quando a infecção ocorreu na presença de TNF. O inibidor de expressão de TNFR1 reduziu o número de amastigotas/célula e a porcentagem de células infectadas nos cultivos pré-tratados com TNF. Finalmente, a administração de anti-TNF a camundongos C3H/He agudamente infectados reduziu o número de áreas positivas para antígenos do T. cruzi no SNC Em conjunto, os nossos dados sugerem que IFN\03B3 e TNF são possíveis facilitadores da entrada do T. cruzi em astrócitos, contribuindo para a manutenção de um ambiente inflamatório no SNC, o que poderia levar à morte células neuronais, além de facilitar a persistência do T. cruzi nesse sítio, possivelmente albergado em astrócitos, os quais agiriam como fonte de parasitos em episódios de reativação crônica / Chagas disease (CD) is caused by Trypanosoma cruzi infection and is a major public health problem in South and Central America. Although not characterized, the involvement of the central nervous system (CNS) in DC was demonstrated in the acute phase in children and reactivation of infection in immunosuppressed chronic patients. However, the cellular targets of T. cruzi and the origin of the parasites in the CNS in episodes of chronic reactivation are not clear. Astrocytes are the most abundant glial cells in the human CNS and its involvement in AD lacks information as well as the role of the cytokines interferon-gamma (IFN\03B3) and tumor necrosis factor (TNF), two cytokines important in the context of T. cruzi, in the process CNS infection. Studies in this direction are important given the increasing occurrence of coinfection T. cruzi/HIV, as well as patient access to transplants and other situations that cause immunosuppression. Thus, we investigated the infection of astrocytes by T. cruzi and the effects of IFN\03B3 and TNF in the process. We show that the T. cruzi persisted in the CNS of mice C3H/He chronically infected parallel to IFN\03B3 mRNA expression, and most of the T. cruzi-cells were astrocytes frequently located near IFN\03B3+-mononuclear cells, microglia, as shown by immunohistochemistry. We used primary astrocytes C3H/He and C57BL/6 mices treated with IFN\03B3 or TNF in the presence of trypomastigotes of T. cruzi Colombian strain and analyzed rate of infection, parasite growth and production of inflammatory mediators in vitro; and the effect of TNF blockade in CNS infection with T. cruzi We confirm that astrocytes of both strains were susceptible to infection with T. cruzi, and that pretreatment with IFN\03B3 or TNF favored the invasion of astrocytes by the parasite and increased the number of amastigotes in astrocytes. Both the T. cruzi as IFN\03B3 was not alone capable of inducing nitric oxide (NO) production, which was induced just by combination of both stimuli. Treatment with L-NAME (NO synthase inhibitor) partially reduced the number of amastigotes of T. cruzi in astrocytes treated with IFN\03B3, while treatment with infliximab (anti-TNF-neutralizing antibody) completely prevented the effect of IFN\03B3 in favoring infection of astrocytes by T. cruzi, indicating that IFN\03B3 favors infection of astrocytes by T. cruzi via TNF. In addition to this, expression of mRNA and TNF production were increased in cultures of astrocytes infected with T. cruzi, while its TNFR1 receptor expression was increased only when the infection occurred in the presence of TNF. The TNFR1 expression inhibitor reduced the number of amastigotes/cell and the percentage of infected cells in cultures pretreated with TNF. Finally, the anti-TNF administration acutely infected C3H/He mice reduced the number of positive areas for T. cruzi antigens in the CNS. Together, our data suggest that IFN\03B3 and TNF are possible facilitating the entry of T. cruzi in astrocytes, thereby contributing to the maintenance of a CNS inflammatory environment, which could lead to neuronal cell death, and to facilitate the persistence of T. cruzi in that site, possibly housed in astrocytes, which would act as a source of parasites in episodes of chronic reactivation / 2100-08-17

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Rio de Janeiro, RJ, Brasil / A doença de Chagas é considerada uma doença infecciosa negligenciada que causa, anualmente cerca de 15.000 mortes na América Latina, causando impactos econômicos e redução da produtividade em países endêmicos. A expansão da infecção por Trypanosoma cruzi tem induzido avanços científicos na prevenção da doença por meio da vacinação. A principal resposta contra o parasito é celular de perfil Th1 com ativação de linfócitos T CD8+ e produção de citocinas como IFN-\03B3, TNF-\03B1. A construção de vírus recombinantes utilizando o vírus vacinal da febre amarela (VFA) 17DD como vetor para expressão da proteína ASP-2 de T. cruzi, constitui uma promissora abordagem para protótipos vacinais para Doença de Chagas, já estudada por nosso grupo. O objetivo deste trabalho foi avaliar a resposta imunológica induzida por vírus recombinante expressando um fragmento de ASP-2 através da imunização de camundongos C57BL/6 e A/J. Visando melhorar a imunogenicidade, novas construções virais foram realizadas e testadas neste trabalho. Esses vírus recombinantes diferem entre si quanto à plataforma de expressão e quanto ao inserto. O primeiro, VFA Tc1, possui um fragmento maior da protéina ASP-2296-560 expresso na plataforma I, entre as proteínas E/NS1 do VFA 17DD. O segundo possui epítopos imunodominantes para linfócitos T CD8+, TEWETGQI ou VNHRFTLV, expressos entre as proteínas NS2B/NS3 do VFA Análises da expressão do inserto heterólogo nesses vírus indicaram a capacidade de expressar o fragmento inserido, então foi realizada uma predição de epítopos imunodominates restritos a MHC classe I. Epítopos foram selecionados e testados, através da técnica de ELISPOT, em esplenócitos de camundongos imunizados com os vírus recombinantes. A imunização promoveu aumento de células produtoras de IFN-\03B3 responsivas ao inserto de ASP-2. A resposta humoral também foi avaliada, para o vírus da Febre Amarela e para a ASP-2. A maioria dos camundongos obtiveram soroconversão para o vírus FA pela técnica de PRNT, mas não foram detectados anticorpos anti-ASP2 por ELISA, no entanto quando realizada imunofluorescência com os soros dos camundongos imunizados em ninhos de amastigotas, houve marcação, indicando que há anticorpos anti-ASP2 nesses soros. Ensaios de desafio sugerem indução de resposta protetora, indicando tendências de redução de pico parasitêmico assim como retardo na morte de camundongos imunizados / Abstract: Chagas disease is considered an infectious neglected tropical disease that causes, annually, around 15.000 deaths in Latin America, decreasing productivity and causing an economic impact in endemic countries. The expansion of Trypanosoma cruzi infection has led to scientific advances, as new therapies and vaccine candidates. It´s known that the main response against the parasite is Th1, leading to CD8+ T cell activation and cytokine production as IFN-\03B3 and TNF-\03B1. The construction of recombinant viruses using the Yellow Fever 17DD vaccine strain as a vector for T. cruzi ASP-2 protein expression is considered a promising approach for a novel Chagas disease vaccine, which our laboratory has been investigating. This study aim was to evaluate the immune response induced by recombinant viruses expressing an ASP-2 fragment, a protein well known to induce cellular and humoral responses in animal model, through C57BL/6 and A/J mice immunization. Aiming to improve the immunogenicity, new viral constructions were obtained and tested in this study. These recombinant viruses differ in the expression platform and the insert. One of the recombinant virus has the ASP-2296-560 fragment inserted between E/NS1, while the other one has immunodominant CD8+ T cell epitope TEWETGQI or VNHRFTLV, inserted between NS2B/NS3 proteins The heterologous protein expression was evaluate by different assays, and the results showed the recombinant viruses were capable of expressing ASP-2. Thereafter, a MHC class I epitope prediction was performed, and immunodominant epitopes were selected and tested by ELISPOT, using splenocytes from immunized mice. This assay showed that the immunization was able to increase the number of IFN-\03B3 producing cells. The humoral response was also evaluated for 17DD virus and ASP-2. Results from PRNT assay, showed that the majority of the mice, from both lineages, presented serum-conversion for YFV, but anti- ASP-2 antibodies were not detected by ELISA. However, immunofluorescence using cells infected with amastigotes and serum obtained from immunized mice, detected antibodies anti-ASP2. Challenge assays results suggested a protective response in immunized mice, indicating a possible reduction in the parasitemic peak as well a delay in mortality