Introdução: A reativação da doença de Chagas crônica, descrita em aproximadamente 20% dos pacientes co-infectados por HIV/Trypanosoma cruzi (T. cruzi), apresenta-se geralmente como doença grave, com meningoencefalite e miocardite. O diagnóstico baseia-se em métodos diretos, no sangue ou outro material biológico, podendo ser estabelecido em exame histopatológico, sendo associado à elevada parasitemia ou a multiplicação de T. cruzi nos tecidos comprometidos. A letalidade é elevada principalmente nos pacientes que não receberam pelo menos 30 dias de terapêutica. Dessa forma métodos mais sensíveis e mais rápidos são necessários visando a detecção precoce do parasito. A proposta deste estudo é avaliar o papel da PCR em tempo real na determinação do nível de parasitemia em pacientes infectados por HIV com e sem reativação da doença de Chagas. Métodos: Noventa e uma amostras coletadas de pacientes com doença de Chagas 57 com doença de Chagas crônica (CR), 34 com co-infecção HIV-T cruzi, destes, 29 sem reativação (CO) e 5 com reativação da doença de Chagas foram analisadas por provas qualitativas: PCR para seqüência de DNA do cientoplasto (kDNA), hemocultura e xenodiagnóstico, e provas quantitativas: PCR em tempo real (qPCRTR), PCR competitiva (PCR-C), hemocultura considerando % de tubos positivos e xenodiagnóstico com % de ninfas positivas. As variáveis quantitativas moleculares e parasitológicas foram avaliadas pelo coeficiente de correlação de Spearman, bem como as variáveis moleculares, número de T. cruzi/mL e carga viral HIV, número de T. cruzi/mL e nível de células CD4 +/mm3, CD8 +/mm3 e razão CD4 +/CD8 +. Resultados: Foram observadas diferenças significantes entre pacientes co-infectados com e sem reativação. A maior parasitemia, detectada por qRT-PCR, foi em pacientes com reativação da doença de Chagas crônica (média 102235,3; mediana 51333,3 e número de T. cruzi/mL de sangue entre 939 e 352000), seguido pelos pacientes com co-infecção (média 255; mediana 54,3 e parasitemia entre 0 e 2405 T. cruzi/mL de sangue) e finalmente pelo grupo de pacientes com doença crônica (média 14,3; mediana 1; e parasitemia entre 0 e 146 T. cruzi/mL de sangue). O coeficiente de correlação de Spearman mostrou correlação entre xenodiagnostico x hemocultura, e entre xenodiagnostico x PCR competitiva ou PCR em tempo real. Houve maior correlação entre PCR competitiva x PCR em tempo real, e número de parasitos e as variáveis: carga viral do HIV, número de células T CD4 + ou razão CD4 +/CD8 +. Conclusões: RT-PCR foi capaz de distinguir entre pacientes co-infectados HIV/T. cruzi com e sem reativação sendo proposta sua utilização como marcador para terapia preemptiva na reativação da doença de Chagas em pacientes com HIV/T. cruzi. Adicionalmente, o nível de parasitemia foi correlacionado positivamente com carga viral e negativamente com nível de células T CD4+/mm3 de sangue e razão CD4+/CD8+ / Background. The reactivation of chronic Chagas disease, described in approximately 20% of HIV/Trypanosoma cruzi infected patients, is commonly expressed by severe and lethal meningoencephalitis and myocarditis. The gold standard for the reactivation diagnosis is based on direct methods, the parasite is observed by direct microscopic examination of fresh buffy coat or through the Quantitative Buffy Coat, wich can be applied to samples of cerebrospinal fluid or blood. The diagnosis of reactivation can be achieved by histological study, showing large numbers of parasites in tissue and acute inflamatory infiltrate. However diagnosis of reactivation is often difficult, it has been established in patients with high parasitemia, usually with severe clinical symptoms, this patients death before or during therapy. The purpose of this study was to evaluate the role of real time PCR for evaluation of the level of parasitemia on patients with HIV and T.cruzi infection with and without reactivation of Chagas disease. Methods. Ninety-one samples from patients with Chagas disease, 57 with chronic Chagas\' disease (CR), 34 with infection HIV/T. cruzi, 29 without reactivation (CO) and 5 with reactivation of Chagas\' disease, were analyzed by qualitative methods: Polymerase chain reaction with kDNA S35/S36 sequence, xenodiagnosis and blood culture, and quantitative methods: Real-time PCR, competitive PCR, blood culture considering % of positive tubes, xenodiagnosis with % of positive nymphs. Results: There were significant differences between groups, the highest parasitemia was observed in patients with reactivation of chronic Chagas\' disease (mean 102,235.3; median 51,333.3 and number of T. cruzi/ml of blood between 939 and 352,000), followed by patients with co-infection (mean 255, median 54.3 and parasitemia 0 to 2405 T. cruzi/mL of blood) and finally by the group of patients with chronic disease (mean 14.3, median 1 and parasitemia 0 to 146 T. cruzi/ml of blood). Spearman correlation coefficient showed correlation between xenodiagnosis x blood culture and between xenodiagnosis x competitive PCR or real time PCR. Stronger Spearman correlation index was found between cPCR x RTPCR, number of parasites and the variables: HIV viral load or CD4 + number or CD4 +/CD8 + ratio Conclusions. RT-PCR is able to distinguish between HIV/T. cruzi infected patients with or without reactivation and is proposed as a marker for preemptive therapy in Chagas disease reactivation. Additionally, the level of parasitemia was correlated positively with viral HIV load and negatively with CD4+/mm3 of the blood and CD4+/CD8+ ratio

Trypanosoma cruzi é dependente de prolina para diversos processos tal como metabolismo energético, invasão celular, diferenciação e resistência a estresse osmótico, metabólico e oxidativo. O ácido L-tiazolidina-4-carboxílico (T4C), um análogo estrutural da prolina, inibe competitivamente o transporte deste aminoácido em T. cruzi, e interage sinergicamente com fatores de estresse que ocorrem ao longo do seu ciclo de vida. Aqui nós avaliamos o efeito de T4C na infecção de camundongos pelo T. cruzi. Foi observada uma redução de 49% do pico parasitêmico de animais infectados e tratados com dose única de T4C (100 mg/Kg). A análise histológica e por PCR quantitativa de diferentes tecidos revelou uma redução significativa da carga parasitária apenas no intestino de animais tratados com T4C (100 ou 150 mg/Kg). Por outro lado, a dose única de 200 mg/Kg diminuiu o peso corporal e sobrevida de animais não infectados. O tratamento prolongado (10 mg/Kg dia) não reduziu a parasitemia, mas aumentou a sobrevida e diminuiu a carga parasitária no intestino. T4C não afetou a expressão gênica de IFN-g e IL-10 em qualquer um dos tecidos analisados (coração, baço, intestino). Em conclusão, T4C contribui em reduzir a virulência da infecção, mas é tóxico em doses que superem 150 mg/kg. / Trypanosoma cruzi is dependent on proline for a variety of processes such as energy metabolism, host cell invasion, differentiation and resistance to osmotic, metabolic and oxidative stress. L-thiazolidine-4-carboxylic acid (T4C), a proline structural analogue, inhibits the proline uptake and interacts with several stress factors that the parasite undergoes throughout its life cycle. Herein, we evaluated the T4C effects on mice infection by T. cruzi. It was observed a reduction of 49% of the parasitemia peak in infected mice that were treated with a unique dose of T4C (100 mg/Kg). Histological and quantitative PCR analysis of several tissues revealed a significant reduction of parasite load in the intestine (100 or 150 mg/kg). In the other hand, the unique dose of 200 mg/Kg reduced the body weight and survival of non-infected mice. A T4C prolonged treatment (10 mg/Kg day), did not diminish the parasitemia, but increased survival and reduced the parasite load in the intestine. T4C did not affect the gene expression of g-IFN and IL-10 in any of the organs analyzed (heart, spleen, intestine). In conclusion, T4C-treatment contributes to reduce the virulence of T. cruzi infection, but it was toxic in doses over 150 mg/kg.

Descoberto e caracterizado em 1909 por Carlos Chagas, o Trypanosoma cruzi é o agente etiológico da Doença de Chagas. Durante a fase crônica da doença de Chagas, onde a parasitemia é baixa, o diagnóstico se baseia na busca de anticorpos contra os antígenos de T. cruzi no sangue. Para aumentar a certeza do resultado recomenda-se o uso de pelo menos dois métodos sorológicos (geralmente ensaio ELISA, Imunofluorescência Indireta ou Hemaglutinação Indireta) para a confirmação de diagnóstico. Embora os ensaios mencionados sejam de uso amplamente difundido, nenhum deles possui suficiente especificidade para definir o diagnóstico isoladamente, especialmente em pacientes provenientes de regiões onde há sobreposição geográfica com outros parasitos, especialmente do gênero Leishmania ou T. rangeli. Uma alternativa de interesse que foi levantada por alguns autores na década de oitenta é a busca de moléculas de interesse diagnóstico (anticorpos, antígenos ou imunocomplexos) na urina de pacientes. Durante os últimos anos técnicas de proteômica têm sido aplicadas a muitos campos da medicina. Uma das aplicações é na nefrologia para o melhor entendimento da fisiologia renal, explorar a complexidade de mecanismos de doenças e para identificar novos biomarcadores. Além do mais, a maioria das proteínas na urina são glicosiladas e suas propriedades são únicas fazendo delas uma importante fonte de biomarcadores. De maneira geral, percebe-se que apesar dos avanços significativos nos métodos de diagnósticos para a detecção da infecção por T. cruzi, há algumas lacunas que ainda precisam ser preenchidas. O fato de que a sorologia convencional para busca de anticorpos IgGs manter-se-á positiva ao longo da vida do paciente, mesmo após tratamento devido a persistência da resposta imune humoral, é uma limitação, já que não permite ter um critério confiável de cura. Por outro lado, a falta de um sistema rápido e confiável para acompanhar a evolução do tratamento, gera sérias limitações para avaliar o desempenho de novos protocolos de tratamento com fármacos já existentes ou de novos fármacos. Em função dessas limitações, propõe-se desenvolver e validar novos métodos de diagnóstico baseado em espectrometria de massas para a detecção da infecção pelo T. cruzi utilizando a urina como fonte de biomarcadores. / Discovered and characterized in 1909 by Carlos Chagas, Trypanosoma cruzi is the etiologic agent of Chagas\' disease. During the chronic phase of Chagas\' disease, where parasitemia is low, the diagnosis is based on the search for antibodies against T. cruzi antigens in the blood. To increase the certainty of the result, is recommended two serological methods (usually ELISA, Indirect Immunofluorescence or Indirect Hemagglutination) for diagnostic confirmation. Although the aforementioned assays are widely used, none of them has sufficient specificity to define the diagnosis alone, especially in patients from regions where there is geographical overlap with other parasites, especially of the genus Leishmania or T. rangeli. An interesting alternative that was raised by some authors in the 1980s is the use of molecules of diagnostic interest (antibodies, antigens or immunomplexes) in the patients\' urine. During the last years techniques of proteomics have been applied to many fields of medicine. One of the applications is nephrology for the better understanding of renal physiology, to explore the completeness of disease mechanisms and identify new biomarkers. Moreover, most of the proteins in the urine are glycosylated. Their properties are unique, making them an important source of biomarkers. In general, perceived that despite significant advances in diagnostic methods for the detection of T. cruzi infection, there are some gaps that need to be filled. The fact that conventional IgG antibody serology will remain positive over the life of the patient, despite the persistence of the humoral immune response, is a limitation, since it does not allow a reliable criterion of cure. On the other hand, the lack of a reliable system to follow the evolution of the treatment generates serious limitations to evaluate the performance of new treatment protocols with existing drugs or new drugs. Due to these limitations, we propose to develop new methods of diagnosis based on mass spectrometry for the detection of T. cruzi infection using urine as a source of biomarkers.

A doença de Chagas é uma doença tropical negligenciada e um grande problema de saúde mundial, principalmente na América Latina. O agente etiológico da doença é o protozoário Trypanosoma cruzi. Segundo a Organização Mundial da Saúde (OMS), cerca de 8 milhões de pessoas estão infectadas com o parasita e 25 milhões vivem áreas de risco de contaminação. A farmacoterapia consiste nos fármacos nifurtimox e benzonidazol. Ambos apresentam sérios efeitos adversos como dermatite, neurotoxicidade e hepatite, e baixa eficácia na fase crônica da doença. Nesse contexto, há urgência no desenvolvimento de novos fármacos seguros e eficazes para o tratamento da doença. Dentre os alvos moleculares validados para o desenvolvimento de novos fármacos para a doença de Chagas, destaca-se a cruzaína, principal cisteíno-protease do parasita. A cruzaína é expressa em todo o ciclo de vida do parasita e está envolvida em diversos processos biológicos do protozoário, como nutrição, reprodução, invasão, reconhecimento molecular e evasão. A alta atividade que muitos inibidores apresentam contra a enzima, não se traduz, para grande parte destes inibidores, em alta atividade e seletividade em ensaios fenotípicos. Isso ocorre devido a fatores como propriedades farmacocinéticas inadequadas. Nesse contexto, essa tese de doutorado aborda dois temas: o primeiro consiste na construção de modelos de redes neurais artificiais (r² = 0,81 e r²pred = 0,81) e KPLS, na sigla em inglês para Kernel-Based Partial Least Squares (N = 3, r² = 0,81 e r²pred =0,85). Esses modelos foram utilizados para investigar propriedades estruturais, fragmentos privigeligiados e propriedades físico-químicas associadas à atividade em ensaios fenotípicos in vitro. Em seguida, foram desenvolvidos modelos de floresta randômica (número de árvores = 100, r² = 0,97 e r²pred = 0,77) e KPLS radial (N= 4, r² = 0,88 e r²pred = 0,88) para avaliar as propriedades moleculares e estruturais relacionados à seletividade. Posteriormente, essas informações foram combinadas para a realização de triagens virtuais em larga escala. Por fim, um conjunto de estruturas selecionadas foram docadas no sítio ativo cruzaína e submetidas a submetidas à predição de permeabilidade através de membrana e absorção, distribuição, metabolismo, excreção e toxicidade (ADME-Tox). Esses estudos conduziram à descoberta de 260 novos compostos, os quais foram avaliados in silico quanto a atividade biológica, seletividade, e quanto aos pontos de clivagen pela enzima CYP3A4. O segundo tema consiste em simulações de dinâmica molecular do complexo K777-cruzaína em pH 5,5 e 8,0 combinadas a modelagem por redes neurais artificiais (RNAs). De acordo com as RNAs, a mudança nos estados de protonação de duas histidinas, causada por mudanças no pH pode deslocar alças, hélices-α e folhas-β. Estes deslocamentos causam uma alteração do ambiente químico no sítio de interação, alterando a afinidade do inibidor pela enzima (energia livre de ligação). Em pH 5,5, a HIS162 interage principalmente com os resíduos ASP161, GLY163 e ASN182, e a CYS25 permanece disponível para realizar um ataque nucleofílico ao inibidor. Em pH 8,0, no entanto, a HIS162 perde as interações com o ASP161 e a GLY163, e interage com a cadeia lateral da CYS25 e com a cadeia principal da SER183. Estas alterações podem bloquear o ataque nucleofílico da CYS25 ao inibidor K777. Este estudo constribuiu para o avaliar a influência do pH na alteração dos elementos de estrutura secundária da enzima e sua relação com a afinidade dos inibidores pela cruzaína. Por fim, foram desenvolvidos modelos de QSAR 2D e 3D a partir de uma série de oxadiazóis (r²pred KPLS e r²pred CoMFA de 0,81 e 0,82, respectivamente). A integração de métodos de QSAR 2D e 3D e as estratégias de docagem molecular possibilitaram mapear os subsítios do sítio ativo da cruzaína quanto a ligações de hidrogênio, ligações de halogênio e interações do tipo π-π e CH-π. Estes estudos fornecem informações quanto ao espaço químico a ser explorado e alterações estruturais relevantes para o planejamento e avaliação de novos agentes antichagásicos e inibidores da cruzaína. / Chagas disease is a neglected tropical disease and a major global health problem, especially in Latin America. The etiological agent of the disease is the protozoan Trypanosoma cruzi. According to the World Health Organization (WHO), approximately 7 million people are infected with the parasite and 25 million live at risk of infection. Pharmacotherapy consists of the drugs nifurtimox and benznidazole. Both have serious adverse effects, such as dermatitis, neurotoxicity and hepatites, and low efficacy in the chronic phase of the disease. In this context, there is an urgent need for the development of novel, safe and effective drugs for the treatment of the disease. Among the molecular targets validated for the development of new drugs for Chagas disease, cruzain, the major cysteine protease of the parasite can be highlighted. Cruzain is expressed in the whole lifecycle of the parasite and is involved in several protozoan biological processes such as nutrition, reproduction, invasion, molecular recognition and evasion. The high activity that many inhibitors present against the enzyme does not translate, for most of these inhibitors, into high activity and selectivity in phenotypic assays. This is due to factors such as unfavorable pharmacokinetic properties. In this context, this doctoral thesis deals with two themes: the first is the construction of artificial neural network models (r² = 0.81 and r²pred = 0.81) and Kernel-Based Partial Least Squares (N = 3, r² = 0.81 and r²pred = 0.85). These models were used to investigate structural properties, fragments and physicochemical properties associated the in vitro activity in phenotypic assays. Next, random forest models were developed (number of trees = 100, r² = 0.97 and r²pred = 0.77) and radial KPLS (N= 4, r² = 0.88 and r²pred = 0.88) to evaluate the molecular and structural properties related to selectivity. Subsequently, this information was combined for the development of a large-scale virtual screening. Finally, a set of selected structures were docked in the active site of cruzain and subjected to prediction of membrane permeability, and absorption, distribution, metabolism, excretion and toxicity (ADME-Tox). These studies led to the discovery of 260 novel compounds, which were evaluated in silico for biological activity, selectivity and cleavage by the CYP3A4 enzyme. The second theme consists of molecular dynamics simulations of the K777-cruzain complex at pH 5.5. and 8.0 combined with artificial neural network modeling (ANN). According to the ANNs, the change in the protonation states of histidine residues caused by changes in pH can displace loops, α-helices and β-sheets. These shifts cause changes in the chemical environment of the interaction site, altering the affinity of the inhibitor by the enzyme (free binding energy). At pH 5.5, HIS162 interacts primarily with residues ASP161, GLY163 and ASN182, and CYS25 remains available to make the nucleophilic attack to the inhibitor. At pH 8.0, however, HIS162 loses interactions with ASP161 and GLY163, and interacts with the CYS25 side chain and the SER183 main chain. These changes can block the nucleophilic attack by CYS25 to the K777 inhibitor. This study contributed to evaluate the role played by the pH on the alteration of secondary structure elements of the enzyme and its relationship with the affinity of the inhibitors by cruzain. Finally, 2D and 3D QSAR models were developed for oxadiazole derivatives (r²pred KPLS and r²pred CoMFA of 0.81 and 0.82, respectively). The integration of 2D and 3D QSAR methods and molecular docking strategies enabled the mapping of the the subsites of the cruzain active site regarding hydrogen bonding, halogen bonding and π-π and CH-π interactions. These studies provide information on the chemical space to be explored and structural changes relevant for the design and evaluation of new antichagasic agents and cruzain inhibitors.

A doença de Chagas, uma infecção causada pelo protozoário Trypanosoma cruzi, é um grave problema de saúde pública. Atualmente, cerca de dez milhões de pessoas em todo o mundo estão infectadas, sendo que a situação é mais crítica na América Latina, onde a doença é endêmica. A necessidade de novas alternativas terapêuticas é grande, pois os fármacos disponíveis apresentam sérias limitações, como baixa eficácia e alta toxicidade. A enzima cruzaína, uma cisteíno-protease essencial à sobrevivência do parasita, é considerada um importante alvo para o desenvolvimento de novos agentes antichagásicos. Neste trabalho, o objetivo foi o desenvolvimento de novos inibidores da enzima cruzaína empregando como modelo um composto hit (1) com propriedades anti-T. cruzi. Este inibidor competitivo (um derivado imidazólico), que apresenta elevada potência e afinidade contra a enzima alvo (IC50 = 1 µM e Ki = 120 nM, respectivamente), foi identificado em trabalhos anteriores de nosso grupo por meio da integração de técnicas computacionais (triagem virtual) e experimentais (avaliação bioquímica in vitro). A presente proposta de planejamento molecular, empregando métodos de química medicinal, levou a investigação de padrões estruturais explorando a complementaridade entre as moléculas pequenas e os resíduos de aminoácidos dos subsítios da cruzaína. Um conjunto promissor de 38 compostos foi planejado, sintetizado e avaliado em ensaios in vitro frente à enzima cruzaína e posteriormente, contra o parasita. Entre os derivados do composto hit (1), que apresentaram valores de IC50 contra a enzima alvo na faixa nano- e micromolar, destaca-se o composto 14 (IC50 = 120 nM e Ki = 20 nM), um inibidor competitivo, potente e de alta afinidade contra a enzima alvo, que também apresentou atividade in vitro e in vivo contra o parasita. A integração de métodos experimentais e computacionais foi útil no processo de otimização de inibidores inéditos da cruzaína. As relações entre a estrutura e atividade obtidas são de grande relevância para o desenvolvimento de candidatos a novos fármacos para a terapia da doença de Chagas. / Chagas´ disease, an infection caused by Trypanosoma cruzi, is a serious public health problem. Currently, about ten million people are infected worldwide, and the situation is more critical in Latin America, where the disease is endemic. The need for new therapies is urgent, since the drugs available have serious limitations, such as low efficiency and high toxicity. The cruzain enzyme, an essential cysteine protease for the parasite survival is considered an important target for the development of new antichagasic agents. In this work, the goal was the development of new cruzain inhibitors based on modifications of a hit compound (1) with properties anti-T. cruzi. This competitive inhibitor (an imidazole derivative), shows high affinity and potency (IC50 = 1 µM and Ki = 120 nM, respectively), and was identified in a previous work in our group by integrating computational techniques (virtual screening) and experimental (in vitro biochemical evaluation). The proposed molecular design, employing methods of medicinal chemistry, aimed to investigate structural patterns exploiting the complementarity between small molecules and amino acid residues of the subsites of cruzain. A promising set of 38 compounds was designed, synthesized and evaluated in in vitro assays against the cruzain enzyme and subsequently against the parasite. Among the derivatives of the hit compound (1), which had IC50 values against the target enzyme in the nano- and micromolar range, the compound 14 (IC50 = 120 nM and Ki = 20 nM), a potent and high affinity competitive inhibitor against cruzain showed activity in vitro and in vivo against the parasite. This work illustrates the importance of the integration of experimental and computational methods in the optimization process of novel cruzain inhibitors. The structure-activity relationship studies revealed in this work are useful for the development of new drug candidates for the treatment of Chagas´ disease.

As formas tripomastigotas do Trypanosoma cruzi expressam as Tc-85, glicoproteínas de superficie. A Tc85-11, um dos membros da família da Tc-85, foi caracterizado como uma proteína de adesão, com os sítios de ligação a laminina e citoqueratina 18 localizados, respectivamente, nos domínios amino e carboxiterminal. Utilizando-se primers consensos, um produto de cerca de 2000 pb foi amplificado do cDNA de formas tripomastigotas de T cruzi da cepa Y. Uma biblioteca enriquecida em membros da família da Tc-85 foi construída utilizando-se esses primers e o plasmídeo pCR T7/NT Topo Cloning (Invitrogen). O sequenciamento de cerca de 60 clones resultou em 30 ORFs completas. O sequenciamento de DNA foi realizado com o método dideoxi de terminação de cadeia e as seqüências foram analisadas. Por análise comparativa, identidades de 40-90% entres os clones sequenciados e 30-70% com membros da superfamília de proteínas das gp85/trans-sialidases foram encontradas. Os dados foram compilados nas seguintes ferramentas: ORF finder (NCBI), Cap3, Smith-Waterman, ClustalW, BioEdit e BLASTX/BLASTN (NCBI). Para a análise filogenética, foi utilizado o programa Paup empregando máxima parsimônia (MP), \"neighbor joining\" (NJ) e máxima probabilidade (MP). A árvore possuia dois grupos e foi submetida a análise de bootstrapping, com busca heurística completa e com 100 e 500 repetições. Os mesmos dois grupos apareceram quando a comparação de seqüências e análise filogenética foram correlacionadas. Em experimentos utilizando-se elementos de matriz extracelular - laminina e fibronectina- foi testada a ligação de proteínas recombinantes purificadas. A proteína codificada pelo inserto de cDNA Tc85-45 foi capaz de se ligar de maneira saturável a laminina e a fibronectina, mas não a albumina e gelatina. Os dados sugerem fortemente que, apesar da família da Tc-85- e por conseqüência a superfamília das gp85/trans-sialidases- codificarem proteínas com graus variáveis de seqüências similares, as seqüências específicas de peptídeos para a ligação a diferentes moléculas de matriz e receptores celulares variam entre membros da família, constituindo, assim, uma família multiadesiva de glicoproteínas que capacita o parasita a ultrapassar as barreiras impostas pelas membranas celulares, matrizes extracelulares e lâminas basais. / Trypomastigote forms of Trypanosoma cruzi express Tc-85 surface glycoproteins. Tc85-11, one member of the Tc-85 family, was characterized as an adhesion protein, with laminin and cytokeratin-18 binding sites localized, respectively, on the amino and carboxy terminal domains. Using consensus primers, a 2000 bp product was amplified from cDNA of trypomastigote forms of T. cruzi of the Y strain. A library enriched in Tc-85 cDNA was constructed using these primers and pCR T7/NT Topo Cloning (Invitrogen) plasmid. Sequencing of about 60 clones gave 30 complete ORFs. DNA sequencing was performed by the dideoxi-chain termination method and the sequences have been analyzed. By comparative analysis, identity of 40-90% was found among the sequenced clones and 30-70%, with members of the gp85/trans-sialidase superfamily proteins. The data were compiled in the following tools: ORF finder (NCBI), Cap3, Smith-Waterman algorithm, ClustalW, BioEdit and BLASTX/BLASTN (NCBI). For phylogenetic analysis, the Paup program was employed using maximum parsimony (MP), neighbor joining (NJ), and maximum likelihood (ML). The inferred tree had two groups and was submitted to full heuristic bootstrapping with 100 and 500 repetitions. The same two groups appeared when comparative sequence and phylogenetic analyses were correlated. In experiments in which extracellular matrix elements - laminin and fibronectin- were tested for binding to purified recombinant proteins, the protein coded by the cDNA insert Tc85-45 was able to bind in a saturable manner to laminin and fibronectin, but not to albumin and gelatin. The data strongly suggest that although the Tc-85 family, and by extension the gp85/glycoprotein superfamily, encode glycoproteins with variable degrees of similar sequences, the peptide sequences specific for the binding to different matrix molecules and cell receptors varies among the family members, thus, constituting a multi-adhesion family of glycoproteins that enables the parasite to overcome the barriers imposed by cell membranes, extracellular matrices and basal laminae.

Vários laboratórios descreveram moléculas que estão envolvidas na invasão do Trypanosoma cruzi à célula hospedeira. Nosso laboratório foi o primeiro a descrever moléculas de 85 kDa pertencentes a uma família de glicoproteínas (Tc-85) que possuem graus diferentes de homologia de seqüência com os membros da superfamília das gp85/transialidases. Um componente acídico (Tc85-11) da família Tc-85 que se liga à laminina e a receptores da célula hospedeira foi clonado e expresso (Giordano et al., JBC 274, 3461,1999). Nós levantamos a hipótese de que o polimorfismo dos diferentes membros da família Tc-85 poderiam determinar diferentes propriedades da adesão à célula hospedeira. Para provar tal hipótese, uma biblioteca genômica de Tc-85 utilizando o vetor pTEX e os seguintes primers: R-1 (5\') ATGTCCCGGCGTGTGTTTACTTCC e GPI-2(3\') TCACAAAGTCGCAAAGCCCCACAGTCC, foi digerida com enzimas de restrição resultando em fragmentos de tamanho esperado (~2-2,5 kb) em 91% dos clones selecionados. Treze clones foram seqüenciados em suas extremidades 5\' e 3\'. Nenhum era idêntico entre si apesar da variabilidade da homologia de seqüência (40-70%). No entanto, quando comparadas as regiões codantes para o peptídeo sinal foi encontrada uma homologia de 90%. Para assegurar a clonagem de genes funcionais, uma biblioteca de cDNA foi construída com primers degenerados (5\'-ATTTTTGTTCCGCAGAAGACGCAGGTG, 3\'ATTCAGTGGGCGGTTGTACAGAAAGAC) por transcrição reversa de seqüências conservadas da superfamília das gp85/transialidases, excluindo a seqüência codante para o peptídeo sinal e a seqüência codante para âncora de GPI (presença de aminoácidos hidrofóbicos). Os cDNAs foram amplificados e clonados no vetor de expressão pCR®T7/NT-TOPO. Foram selecionados 60 clones que foram submetidos à análise de restrição e 90% deles mostraram fragmentos com tamanho esperado. As proteínas de fusão de 4 destes clones foram reconhecidas em Western blot por um anticorpo policlonal feito contra um fragmento da Tc85-11 (H3.3). As seqüências obtidas da extremidade 5\' revelou que os quatro clones pertencem à superfamília das gp85/transialidase (GenBank). O alinhamento destas seqüências com a Tc85-11 mostrou uma homologia de 60-80% e uma identidade de 40-70% na seqüência de aminoácidos. Estes dados confirmam a heterogeneidade da família da Tc-85 que é expressa pelo parasita. Ademais, a expressão de elevadas quantidades das proteínas correspondentes permitirá a identificação dos ligantes respectivos para estas proteínas de superfície específicas de tripomastigotas. / Several laboratories described molecules that are involved in Trypanosoma cruzi invasion of host-cells. Our laboratory was the first to describe molecules of 85 kDa belonging to a glycoprotein family (Tc-85) having different degrees of sequence homology with the members of the gp85/trans-sialidase supergene family. An acidic component (Tc85-11) of the Tc-85 family that binds to laminin and to host-cell receptors was cloned and expressed (Giordano et al., JBC 274, 3461, 1999). We raised the hypothesis that the polymorphism of different members of the Tc-85 family could specify different adhesion properties to host proteins. In order to prove the hypothesis, a genomic Iibrary of Tc-85 using the pTEX vector and primers R-1 (5\') ATGTCCCGGCGTGTGTTTACTTCC and GPI-2 (3\') TCACAAAGTCGCAAAGCCCCACAGTCC was cut with restriction enzymes resulting in fragments of the expected size (~2-2.5 kb) in 91% of the clones. Thirteen clones were sequenced from their 5\' and 3\' terminal ends. None were identical in spite of a variable sequence homology (40-70%), as opposed to 90% of homology when the signal peptide coding regions were compared. In order to assure the cloning of functional genes, a cDNA Iibrary was constructed with degenerated primers ((5\') ATTTTTGTTCCGCAGAAGACGCAGGTG / (3\') ATTCAGTGGGCGGTTGTACAGAAAGAC) for reverse transcription of conserved sequences from the gp85/trans-sialidase supergene family excluding the hydrophobic sequences from both extremities. The cDNAs were amplified by PCR and cloned into pCR ®T7/NT-TOPO expression vector. 60 clones were selected and were subjected to restriction analysis and 90% of the clones showed fragments with the expected size. The expressed fusion proteins of 4 of these clones were recognized in Western blots by a polyclonal antibody raised against a fragment of Tc85-11 (H3.3). The sequences obtained from the 5\' termini revealed that all four clones belong to the gp85/trans-sialidase supergene family (GenBank TM). The alignment of these sequences with Tc85-11 showed a homology of 60-80% and an identity of 40-70% in aminoacid sequence. These data confirm the heterogeneity of the Tc-85 family that is expressed by the parasite. Additionally, the expression of high amounts of the corresponding proteins will allow the identification of putative Iigands for these trypomastigote specific surface proteins.

Trinta novos membros de Tc85 (superfamília das gp85/trans-sialidases) foram clonados e seqüenciados (30-90% identidade), mostrando um intenso polimorfismo entre os genes e levantando a hipótese de que a família possui propriedades multi-adesivas, que garantem ao Trypanosoma cruzi sucesso na invasão. Para verificar os distintos padrões de interação de diferentes membros de Tc85, duas proteínas recombinantes, Tc85-12r e Tc85-45r, foram testadas frente à matriz extracelular (MEC) e células LLC-MK2. As duas proteínas ligam-se dose-dependentemente à MEC imobilizada e apresentam ligação em laminina e fibronectina. Também foi observado um ligante de 60kDa, não identificado, de ambas Tc85 na MEC. Ensaios de ligação destas proteínas à células LLC-MK2 mostram que Tc85-45r têm ligação maior que Tc85-12r. Se a ligação é inibida com o tripeptídeo RGD, (presente somente na seqüência de Tc85-45r) observamos uma redução de 98% na adesão de Tc85-45r em LLC-MK2 contra 60% em Tc85-12r. No ensaio de invasão de tripomastigotas em LLC-MK2, RGD exógeno e Tc85-45r foram as que mais contribuiram para a inibição da invasão, mostrando a importância de RGD. Os resultados ressaltam as diferenças em motivos de adesão putativos e a capacidade de ligação de proteínas recombinantes tanto em célula hospedeira quanto em MEC, que podem ser importantes para o parasita durante a colonização do hospedeiro. / Thirty new members of Tc85 (gp85/transialidases supergene family) were cloned and sequenced (30-90% of identity), showing an intense polimorfism between the genes and raising the hypothesis that the family has multi-adhesive properties that assures the success of the invasion process of Trypanosoma cruzi. Two recombinants proteins, Tc85-12r and Tc85-45r, were assayed in order to verify the distinctive patterns of interaction between different members of Tc85 and extra cellular matrix (ECM) or LLC-MK2 cells. Both proteins exhibit a dose-dependent binding to immobilized ECM, laminin and fibronectin. We also noticed an unidentified 60 kDa ligand in the ECM that can bind to both Tc85. Binding assays of both proteins to LLC-MK2 cells show that Tc85-45r exhibit a higher number of bound cells at the saturation point than Tc85-12r. If the binding is inhibited with the RGD tripeptide (present just in Tc85-45r sequence), there is a 98% reduction of LLC-MK2 cells adhesion to Tc85-45r against a 60% reduction of adhesion to Tc85-12r. The tripomastigotes invasion to LLC-MK2 assay showed that both exogenous RGD and Tc85-45r were the most efficient inhibitors in the process thus confirming the importance of RGD. The results point out the difference between putative adhesion motifs and the recombinants proteins binding capacity to host cells and ECM, two characteristics that might be important to the parasite during the host colonization.

Ensaios clínicos indicam haver diferenças regionais na eficácia do tratamento da doença de Chagas com (BZ) e Nifurtimox (NFX). Transportadores ABC desempenham um papel importante na resistência a drogas. Evidências indicam que o transportador TcABCG1 é superexpresso em cepas resistentes a BZ. O objetivo geral foi obter evidências para o envolvimento de TcABCG1 no fenótipo de resistência a BZ. Determinamos a classificação de seis cepas em suscetíveis e resistentes a BZ, e o efeito de três inibidores de transportadores ABC de eucariotos. Transfectamos em CL Brener os genes TcABCG1 de cepas resistentes. Nas culturas transfectadas com os genes de Silvio e YuYu verificamos aumento da resistência a BZ e a NFX, e aumento da abundância relativa de transcritos de TcABCG1. Genes ABC ortólogos aos de T. cruzi foram identificados em tripanossomas africanos e Leishmania spp. Dados referentes à análise filogenética e classificação dos transportadores ABC de T. cruzi nas oito subfamílias das proteínas ABC de eucariotos são apresentados. / Clinical trials indicate regional differences in the efficacy of Chagas disease treatment with (BZ) and nifurtimox (NFX). ABC transporters play an important role in drug resistance. Evidences indicate that TcABCG1 is overexpressed in BZ-resistant strains. The overall aim was to obtain evidence for the involvement of TcABCG1 in the BZ resistance phenotype. We determined the classification of six BZ susceptible and resistant strains and the effect of three eukaryotic ABC transporters inhibitors. We transfected TcABCG1 genes from resistant strains in CL Brener. In cultures transfected with Silvio and YuYu genes we observed an increased resistance to BZ and NFX, and increased relative abundance for TcABCG1 transcripts. ABC orthologue genes to those of T. cruzi were identified in African trypanosomes and Leishmania spp. Data relating to classification and phylogenetic analysis of T. cruzi ABC transporters in eight eukaryotic ABC proteins subfamilies are presented.

Nosso laboratório vem trabalhando no metabolismo de GABA, projeto derivado de estudos da via prolinaglutamato em T. cruzi. Os efeitos dos psicofarmacos, acamprosato e levomepromazina, em diferentes aspectos da biologia do T. cruzi apontam estes como compostos líderes para o desenho de novas drogas com capacidade terapêutica otimizada contra o T. cruzi. / Our laboratory has been working on the metabolism of the GABA in T. cruzi, a project derived from studies on the prolineglutamate pathway in this organism. The effects of two psycodrugs, acamprosate and levomepromazine, showed that both could be leader compounds for the new drugs design with optimized therapeutic capacity against T.cruzi.