Nosso laboratório vem trabalhando no metabolismo de GABA, projeto derivado de estudos da via prolinaglutamato em T. cruzi. Os efeitos dos psicofarmacos, acamprosato e levomepromazina, em diferentes aspectos da biologia do T. cruzi apontam estes como compostos líderes para o desenho de novas drogas com capacidade terapêutica otimizada contra o T. cruzi. / Our laboratory has been working on the metabolism of the GABA in T. cruzi, a project derived from studies on the prolineglutamate pathway in this organism. The effects of two psycodrugs, acamprosate and levomepromazine, showed that both could be leader compounds for the new drugs design with optimized therapeutic capacity against T.cruzi.

A proteína recombinante B13 contém repetições seriadas de 12 aminoácidos e corresponde a uma região do antígeno imunodominante de 140-116 KDa encontrado na superfície da forma tripomastigota de T. cruzi (cepa Y). A proteína B13 apresenta elevada sensibilidade e especificidade no diagnóstico sorológico da Doença de Chagas. A análise da distribuição de subclasses de IgG anti-B13 em soros de pacientes chagásicos cardiopatas (SCC) e de assintomáticos (SCI) mostrou o mesmo padrão: IgG1»IgG3>IgG2>IgG4. No entanto, a média de reatividade a B13 foi maior no grupo SCC do que no grupo SCI. Dados anteriores de nosso grupo indicam que a resposta de célula Ta B13 é restrita ao grupo HLA de classe II (HLA- DQA1*0501, DRB1*0101 and DRB5*0101 - denominado grupo HLA+). Por outro lado, dados da literatura sugerem que antígenos repetitivos de protozoários são antígenos T-independentes. Analisamos por ELISA a reatividade a B13 em soros de pacientes HLA+ e HLA- (portadores de outros alelos). Os resultados obtidos indicam que a média de reatividade a B13 é semelhante nos dois grupos de soros, sugerindo que no grupo HLA- a resposta de anticorpos anti-B13 pode ser T-independente. Utilizando peptídeos sintéticos derivados da seqüência de B13 concluímos que o epitopo imunodominante está contido na seqüência FGQAAAGDK. Visando mapear o epitopo responsável pela resposta anti-B13 e analisar uma possível correlação entre estrutura e atividade antigênica, três peptídeos sintéticos contendo o centro do epitopo AAAGDK (pB13 - GDKPSLFGQAAAGDKPSPLF; S4 -FGQAAAGDK e S5 -QAAAGDKPS) foram analisados quanto à sua capacidade de inibir a reatividade de soros de chagásicos à proteína recombinante B13. Os resultados mostram haver uma hierarquia na atividade antigênica inibitória dos peptídeos (pB13>S4>S5), que poderia estar relacionada com a capacidade distinta dos peptídeos em assumir uma estrutura secundária ordenada. As propriedades estruturais dos peptídeos foram analisadas por DC e RNM e indicam que os peptídeos apresentam uma hierarquia pB13>S4>S5 quanto à capacidade de adquirir uma conformação em hélice. Dados anteriores indicam que soros de pacientes chagásicos da América Central e do Sul apresentam diferenças na mediana de reatividade à proteína B13 em testes de ELISA: por ex. Argentina MD=1.79; Brasil MD=1.51; Honduras MD=0.91. Investigamos alguns parâmetros sorológicos que pudessem explicar as diferenças observadas. Soros de 224 indivíduos chagásicos da Argentina, Brasil, Bolívia, Colômbia, El Salvador, Honduras e Venezuela foram analisados com relação à subclasse de IgG responsável pelo reconhecimento de B13. Os dados mostram igual distribuição das subclasses com a seguinte ordem decrescente de reatividade: IgG1»IgG3>IgG2>IgG4. Também concluímos que os soros em questão reconhecem o mesmo epitopo imunodominante da proteína B13. Uma alternativa para explicar variações na resposta imune do hospedeiro a B13 seria a heterogeneidade molecular do antígeno correspondente a B13 nas cepas de T. cruzi. Primeiramente investigamos a massa molecular deste antígeno em sete cepas do parasita derivadas de diferentes regiões geográficas em ensaios de Western blot com soro anti-proteína recombinante B13. Observamos que a massa molecular deste antígeno varia de 100 a 190 KDa e que em várias cepas o soro anti-B13 reage com dois polipeptídeos. Com base nestes resultados investigamos a organização deste gene de cópia única no genoma das cepas. Concluímos que este gene está localizado em uma banda cromossômica única que apresenta variação de tamanho entre as cepas (1,25 a 0,9 Mpb). Análise por Southern blot indicou que o gene B13 apresenta arranjo diferente no genoma das cepas. Investigamos também o tamanho da região que contém as repetições seriadas no gene B13. A partir de dados da seqüência deste gene da cepa CA-1 desenhamos um par de oligonucleotídeos que flanqueiam esta região. DNA genômico de 23 cepas foi submetido a PCR com este par de iniciadores, detectando-se produtos de amplificações com tamanho variando de 2,1 a 3,5 Kb em 11 cepas. Após seqüenciamento da região a 3\' das repetições seriadas do gene B13 da cepa Y, foi desenhado um segundo par de oligonucleotídeos iniciadores. Amplificação foi obtida em quatro cepas adicionais. Em 73% das cepas houve amplificação de um único fragmento enquanto nas demais dois produtos foram obtidos. Os dois produtos podem corresponder a diferenças no tamanho da região das repetições dos dois alelos do gene B13. Também analisamos a seqüência de nucleotídeos de 83 unidades repetitivas em cinco cepas de T. cruzi. Concluiu-se que o epitopo imunodominante (FGQAAAGDK) é altamente conservado nas unidades das cepas embora algumas variações de aminoácidos foram observadas em algumas unidades. Tomados em conjunto os dados indicam haver polimorfismo do gene de B13 em cepas de T. cruzi quanto a: (a) grande variação no número de unidades repetitivas (de 58 a 97 unidades); (b) baixa variação na seqüência que flanqueia a região repetitiva; (c) certa variação na seqüência codificadora de aminoácidos da região imunodominante. Como conseqüência destas observações, sugere-se que as diferenças observadas no número de unidades repetitivas e na estrutura de algumas destas repetições no antígeno B13 de cepas de T. cruzi podem ter implicações na indução da resposta humoral e celular do hospedeiro e poderiam explicar, em conjunto com diferenças genéticas do indivíduo, a variação da resposta imune a B13 observada em soros de pacientes chagásicos. Que seja de nosso conhecimento este é o primeiro estudo que analisa a estrutura geral de um gene de antígeno que apresenta domínios repetitivos em cepas de T. cruzi. / The recombinant protein B13 contains 12 amino acid tandem repeats and corresponds to the immunodominant region of the 140/116 KDa surface antigen of T. cruzi trypomastigotes of the Y strain. B13 protein shows high sensitivity and specificity in the serological diagnosis of Chagas disease. The analysis of anti-B13 IgG subclass distribution in sera of chronic chagas disease cardiopathy patients (CCC) and asymptomatic patients (ASY) showed the same pattern: IgG1»IgG3>IgG2>IgG4. However, the mean of reactivity to B13 was higher in the CCC group as compared with ASY. Previous data from our laboratory indicate that T cell response to B13 protein is MHC class II-restricted (HLADQA1*0501, DRB1*0101 and DRB5*0101 - named as group HLA+). On the other hand, data from the literature suggest that repetitive antigens from protozoa are T-independent antigens. Reactivity to B13 was analyzed by ELISA in sera of patients HLA+ and HLA-(presenting the other alleles). Similar mean ODs values were obtained for the two groups of sera suggesting that at least in the HLA- group the humoral response to B13 could be T-independent. Competitive ELISA employing synthetic peptides derived from B13 sequence allowed concluding that the immunodominant epitope is included in the FGQAAAGDK sequence. To define the minimum epitope responsible for the anti-B13 response and to analyze a possible correlation between structural features and antigenic activity three synthetic peptides bearing the core (AAAGDK) of the immunodominant epitope (pB13 -GDKPSLFGQAAAGDKPSPLF; S4 -FGQAAAGDK e S5 -QAAAGDKPS) were assayed regarding their ability to inhibit chagasic sera reactivity to B13. A hierarchy in the inhibitory antigenic activity was observed (pB13>S4>S5), that could reflect the distinct capacity of the polypeptides to assume an ordered secondary structure. This feature was investigated by CD and NMR. Data are suggestive that the three peptides have the some hierarchy regarding their capacity to acquire a helical conformation (pB13>S4>S5). Previous analyses of chagasic sera from nine countries of Central and South America showed variations in the mean O.D. values of B13-ELISA according to the country (eg Argentina, MD=1.79; Brazil, MD=1.51; Honduras, MD=0.91). We investigated some serological parameters that could explain the observed variation. 224 chagasic sera from Argentina, Brazil, Bolívia, Colombia, EI Salvador, Honduras and Venezuela were investigated concerning the IgG subclass reactive to B13. Data indicate that all the sera displayed the some subclass distribution: IgG1»IgG3>IgG2>IgG4. It was also concluded that the some immunodominant epitope of B13 protein was recognized by the sera. As an alternative to explain variations in the host immune response to B13 we investigated the molecular heterogeneity of the native B13 antigen in different T. cruzi strains. Firstly we analyzed the molecular mass of this antigen in seven stocks derived from different hosts and geographic regions. Western blot experiments employing anti-recombinant protein B13 serum showed variations in the molecular mass of B13 antigen ranging from 100 to 190 KDa. In most of the stocks, anti-B13 serum reacted with two polypeptides. Based on these results we investigated the organization of the B13 single copy gene in the genome of the strains. It was concluded that the gene is localized in a single chromosomal band presenting size variation among the strains (1,25 to 0,9 Mbp). Southern blot analysis indicated that B13 gene has different genomic arrangement. We have also investigated the size of the region that contains the tandem repeats. Based on the sequence of a B13-homologous gene of the CA-1 strain we designed a pair of oligonucleotide primers flanking the repetitive region. Genomic DNA of 23 parasite strains was submitted to PCR with these primers. Amplification products ranging from 2.1 to 3.5 Kb were observed in 11 stocks. After sequencing of a region located at the 3\' end of the repetitive portion of B13 gene of the Y strain, a second pair of primers was designed. PCR amplification was obtained in four additional strains. Most of stocks (73%) originated only one amplified band while two products were detected in the remaining strains. The two products could derive from the independent amplification of the repetitive regions of the two alleles of B13 gene. We have also analyzed the nucleotide sequence of 83 repetitive units of f ive T. cruzi strains. It is concluded that the immunodominant epitope (FGQAAAGDK) is highly conserved among the units and the various parasite strains, although few amino acid variations were detected in some units. Taken together these data indicate polymorphism of B13 gene among T. cruzi strains regarding: (a) high degree of heterogeneity in the number of repetitive units (it is estimated that this number varies form 58 to 97 units); (b) discrete sequence variation upstream and downstream of the repetitive region; (c) minor variations in the codified amino acid of some repetitive units. Differences in the number of repetitive immunodominant units and in the structure of some of these repeats may have implications on the induction of humoral and cellular responses of the host to B13 antigen. These parameters in conjunction with genetic characteristics of the individuais could explain the variation of reactivity to B13 observed in sera of chagasic patients. To our knowledge this is the first report that describes the general structure of an antigen gene bearing repetitive domains in T. cruzi strains.

Diss. (sammanfattning) Stockholm : Karol. inst., 2006. / Härtill 4 uppsatser.

Orientador: Paulo Câmara Marques Pereira / Resumo: A doença de Chagas (DC), causada pelo protozoário Trypanosoma cruzi (T. cruzi), ainda é considerada como um problema de saúde pública em muitos países da América Latina. De acordo com a Organização Mundial da Saúde, estima-se que entre seis a sete milhões de pessoas no mundo estejam infectadas. Indivíduos na fase crônica da doença podem ser classificados como assintomáticos ou sintomáticos (estes, desenvolvendo as formas clínicas cardíaca, digestiva ou mista). Os assintomáticos correspondem a 70% dos indivíduos nessa fase e, embora apresentem sorologia positiva para anticorpos anti T-cruzi, não desenvolvem manifestações clínicas da doença. O motivo pelo qual alguns pacientes permanecem assintomáticos, e outros desenvolvem sintomas severos, ainda é desconhecido. Fatores genéticos do hospedeiro são bastante relevantes e podem explicar a heterogeneidade encontrada em pacientes que vivem com a doença em áreas endêmicas. Diante disso, o presente trabalho teve como objetivo avaliar SNPs (Single Nucleotide Polymorphisms) no gene TNF-α (rs1800629) e ACAT-1 (rs1044925) em indivíduos com DC crônica e verificar se os mesmos estão relacionados com a susceptibilidade para manifestação de formas clínicas sintomáticas com uso da técnica PCR-RFLP. Foram genotipadas 124 amostras para o gene TNF-α e 135 para o gene ACAT-1. Foi observada associação significativa da presença do alelo A do gene TNF- α em indivíduos sintomáticos em relação aos assintomáticos (p = 0,045). Também houve associação si... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Chagas disease (CD), caused by the protozoan Trypanosoma cruzi (T. cruzi), is still considered a public health problem in many Latin America countries. According to the World Health Organization, it is estimated that between six and seven million people worldwide are infected. Disease’s chronic phase individuals may be classified as asymptomatic or symptomatic (these, developing as clinical cardiac, digestive or mixed forms). Asymptomatic individuals account for 70% of the patients at this stage and, although they have positive serology for anti-T-cruzi antibodies, they do not develop it’s clinical manifestations. The reason why some patients remain asymptomatic, and others develop severe symptoms, is still unknown. Host’s genetic factors are quite relevant and may explain the heterogeneity found in patients living with the disease in endemic areas. The objective of this study was to evaluate SNPs in the TNF-α (rs1800629) and ACAT-1 (rs1044925) genes in individuals with chronic CD and to verify if the polymorphisms are related to the susceptibility to manifestation of symptomatic clinical forms using the PCR-RFLP technique. Were genotyped 124 samples for the TNF-α gene and 135 for the ACAT-1 gene. Significant association for the presence of the A allele of the TNF-α gene was observed for symptomatic individuals in relation to the asymptomatic ones (p = 0.045). There was also a significant association between the G allele (p = 0.008) and the GG genotype (p = 0.001) of the TNF-... (Complete abstract click electronic access below) / Mestre

Submitted by Ana Maria Fiscina Sampaio (fiscina@bahia.fiocruz.br) on 2013-10-15T15:59:59Z No. of bitstreams: 1 Gilmar José da Silva Ribeiro Jr. Alterações ambientais...2012.pdf: 1843460 bytes, checksum: 84bce3a0b6ee09c371706e76fb95ade3 (MD5) / Made available in DSpace on 2013-10-15T15:59:59Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Gilmar José da Silva Ribeiro Jr. Alterações ambientais...2012.pdf: 1843460 bytes, checksum: 84bce3a0b6ee09c371706e76fb95ade3 (MD5) Previous issue date: 2012 / Fundação Oswaldo Cruz. Centro de Pesquisas Gonçalo Moniz. Salvador, BA, Brasil / A Doença de Chagas, causada pelo Trypanosoma cruzi, cujos principais vetores são hemípteros hematófagos conhecidos por “barbeiros”, constitui um grande problema de saúde pública afetando milhares de pessoas no Brasil. Na década de 1970, em pesquisas e serviço, na cidade do Salvador, BA, Brasil, foram capturados diversos triatomíneos, inclusive contaminados por T. cruzi, caracterizando assim o encontro destes animais como sendo um problema de longa data, no entanto, a problemática dos anos 70 foi controlada por se tratarem de espécies domiciliares, a exemplo do Panstrongylus megistus. Atualmente, observamos o crescente encontro do Triatoma tibiamaculata em residências próximas a remanescentes florestais da cidade do Salvador. Desde 2007, foram capturados no ambiente domiciliar mais de 900 exemplares do Triatoma tibiamaculata, até agora com uma taxa média de infecção de aproximadamente 50%, quando analisadas as fezes à fresco. O padrão de encontro destes triatomíneos no ambiente peri e intadomiciliar indica que existe o risco de peridomiciliação da espécie em alguns locais. Este fato pode estar sendo influenciado pela antropização e destruição dos fragmentos de mata da região os quais constituem seu refúgio natural. Tipagens oleculares das cepas de T. cruzi isoladas dos triatomíneos demonstraram que existem mais que um tipo circulante, inclusive com co-infecção de cepas no mesmo triatomíneo (T. cruzi I=47%; T. cruzi II=39%, infecção múltipla=14%; N=212. Através de técnicas moleculares foram em 212 amostras, identificamos as fontes alimentares deste triatomíneo, tendo sido demosntrado que o alimento preferencial dentre os insetos testados foram aves (45%), marsupial (35%), ruminantes (5%) e roedores (5%); O Odds Ratio (OR) dos triatomíneos que stavam alimentados com sangue de marsupial e que se apresentarem infectados foi de OR=1.95 (IC=1.22-3.11). Para aqueles alimentados com sangue de aves foi observado um efeito protetor contra a infecção, OR=0.43(IC=0.30-0.73). Apesar dos resultados preliminares apontarem para o status de espécie silvestre em processo de peridomiciliação e não alimentação com sangue humano, a simples ocorrência de triatomíneos infectados no domicílio humano levanta a hipótese de risco de transmissão do mal de Chagas na cidade de Salvador por esta espécie. / Chagas disease, caused by Trypanosoma cruzi, whose main vectors are haematophagous bugs known as "kissing bugs", is a public health problem affecting millions of people on South America. In the 1970s, during researches and public services in Salvador city, Bahia, Brazil, several triatomines were captured, including infected by T. cruzi, thus characterizing the encounter of these animals as a longstanding problem, however, the problem of the 70’s were controlled for being intradomiciliar species of triatomines, such as the Panstrongylus megistus. Currently, we observe the increasing numbers of Triatoma tibiamaculata encounters inside homes near to the forest remnants inside Salvador city. Since 2007, inside the home environment were captured more than 900 specimens of Triatoma tibiamaculata so far, with an average infection rate of approximately 50% when analyzed only the fresh feces. The pattern of these triatomines on the peri and intadomiciliar environment indicates that there is a risk of peridomiciliação species in some locations. This fact can be influenced by human disturbance and destruction of forest fragments in the region which constitutes his natural refuge. Molecular typing of strains of T. cruzi isolated from triatomines showed that there are more than one strain circulating, including co-infection with strains of the same triatomine (T. cruzi I = 47%; T. cruzi II = 39%, multiple infections = 14%, N = 212) . Through molecular techniques were tested 212 samples to identify triatomine food sources, showing the follow results: birds (45%), marsupial (35%), ruminants (5%) and rodents (5%). The odds ratio (OR) of the insects that fed on marsupial blood and were infected was OR = 1.95 (CI = 1:22 to 3:11). For those who fed on birds blood we observed a protective effect against infection, OR = 0.43 (CI = 0.30-0.73). All the results points to the status of wild species in the process of peridomiciliação and not feed on human blood, but the mere occurrence of infected bugs in human dwellings hypothesizes risk of transmission of Chagas disease in the city of Salvador by this species.

Submitted by Andrea Hartke (andreamh@fiocruz.br) on 2014-11-24T13:25:54Z No. of bitstreams: 1 Dissertação Bruno Dias Ramos.pdf: 4916835 bytes, checksum: fa6000cbfecb89598eef24d308186fc7 (MD5) / Approved for entry into archive by Andrea Hartke (andreamh@fiocruz.br) on 2014-11-24T17:25:03Z (GMT) No. of bitstreams: 1 Dissertação Bruno Dias Ramos.pdf: 4916835 bytes, checksum: fa6000cbfecb89598eef24d308186fc7 (MD5) / Made available in DSpace on 2014-11-24T17:25:03Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Dissertação Bruno Dias Ramos.pdf: 4916835 bytes, checksum: fa6000cbfecb89598eef24d308186fc7 (MD5) Previous issue date: 2014 / Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Carlos Chagas. Pós-Graduação em Biociências e Biotecnologia. Curitiba, PR, Brasil. / Desde sua descoberta, no inicio do século 20, o protozoário parasita causador da Doença de Chagas, Trypanosoma cruzi, se tornou alvo de estudo em diversas instituições de pesquisa ao redor do mundo. Portador de características peculiares interessantes, T. cruzi é um excelente modelo de estudo de processo de regulação pós-transcricional. O parasita teve o seu genoma sequênciado em 2005, e foi observado que muitos dos genes contidas em seu genoma não apresentaram uma descrição funcional confiável, sendo anotados como codificadores de "proteínas hipotéticas". Tendo em vista essa ausência de caracterização funcional de uma parcela considerável do genoma de T. cruzi, o presente trabalho se propôs a realizar a caracterização molecular de um grupo de 10 proteínas de T. cruzi anotadas como "hipotéticas", e que se apresentavam diferencialmente expressas na forma celular tripomastigota metacíclica do parasita, a forma infectiva não-replicativa que inicialmente infecta o hospedeiro mamífero na via usual de transmissão da doença via o inseto vetor. Após amplificação, todos os dez genes selecionados no estudo foram clonados em vetor de entrada (pDONRTM221, Invitrogen), a partir do qual foi possível a transferência do fragmento gênico para outros vetores, visando diferentes abordagens de análise. Todos os genes foram transferidos com sucesso para o vetor de expressão pDESTTM17, de expressão em Escherichia coli, e nove para o vetor pTcGFP, de expressão no próprio T. cruzi e que fusiona à proteína uma etiqueta fluorescente. Dos genes inseridos no pDESTTM17, sete deles foram com sucesso expressos em E. coli, sendo obtidos anticorpos policlonais contra seis das proteínas expressas. Os ensaios de western blot realizados com os soros obtidos contra extratos das quatro formas celulares de T. cruzi corroboram os dados previamente obtidos de sequenciamento de mRNA. Foram realizados ensaios de imunolocalização com os soros obtidos, no entanto, os padrões encontrados nas imunolocalizações foram diferentes dos observados pelas proteínas fusionadas à etiqueta fluorescente GFP. Ensaios de nocaute gênico das proteínas estudadas foram iniciados, e em breve virão a contribuir para o trabalho. Espera-se que os dados obtidos com esse estudo venham melhorar a anotação funcional e a compreensão das proteínas selecionadas. / Since it discovery in early 20th century, the Chagas Disease causative protozoan parasite, Trypanosoma cruzi, became the subject of study in several research institutions around de world. Carrier of interesting peculiar characteristics, T. cruzi is an excellent study model of post-transcriptional regulation process. The parasite had its genome sequenced in 2005, and it was observed that several of it genes did not show a reliable functional description, been annotated as coding for "hypothetical proteins". Given this lack of functional characterization of a considerable portion of T. cruzi genome, the present study proposed to perform a molecular characterization of a group of ten T. cruzi proteins annotated as "hypothetical" that in mRNA studies had showed to be differentially expressed in the parasite metacyclic trypomastigotes cell form, the infective non-replicative that initially infect the mammalian host in the usual route of transmission of the disease via the insect vector. After been amplified all the ten genes selected in the study were cloned into entry vector (pDONRTM221, Invitrogen) from which it was possible to transfer the gene fragment to other vectors, targeting different approaches to analysis. All genes were successfully transferred to pDESTTM17 expression vector, for expression in Escherichia coli, and nine to the pTcGFP vector, for expression of the protein fused to a fluorescent tag in T. cruzi. From all genes inserted into pDESTTM17, seven were successfully expressed in E. coli, which six were purified and inoculated in mice for obtaining polyclonal antibody. Western blot assays performed against protein extracts of the four T. cruzi cell forms using this sera corroborate the date previously obtained by mRNA sequencing. Immunolocalization assays were performed, however, the localization patterns observed in the immunolocalizations were different from those observed by the proteins fused to the GFP fluorescent tag. Gene knockout assays of the studied proteins were started and soon will come to contribute to this characterization work. It is hoped that the data obtained from this study will improve the functional annotation and understanding of the selected proteins.

A doença de Chagas é uma zoonose causada pelo protozoário flagelado Trypanosoma cruzi. Estima-se que 8 milhões de pessoas estão infectadas com o T. cruzi em todo o mundo, principalmente na América Latina. Testes tradicionais de diagnóstico estão sendo gradualmente substituídos por métodos inovadores. A utilização de antígenos recombinantes foi proposta nos anos 90, e várias combinações foram testadas com soros de pacientes com diferentes formas clínicas de diferentes regiões da América Latina. Apesar do ganho em especificidade, estes testes apresentaram menor sensibilidade, frustrando expectativas. Este estudo objetivou analisar a variabilidade genética dos genes KMP11 e 1F8 que codificam antígenos comumente utilizados em diagnóstico experimental. Cepas de T. cruzi pertencentes a diferentes sub-grupos taxonômicos e de diferentes regiões foram analisadas para avaliar o impacto da variação antigênica em testes de diagnóstico. Maximizando a sensibilidade, evitar reatividade cruzada com epítopos de outros agentes patogênicos deve permitir a concepção de melhores testes rápidos. Num primeiro passo, DNA genômico foi extraído das seguintes cepas: Dm28c, Colombiana, Y, 3663, 4167, LL014 e CL Brener e foi realizada a amplificação dos genes 1F8 e KMP11 que codificam antígenos a partir destas cepas. Em seguida foram realizadas a clonagem, sequenciamento, expressão e detecção dos antígenos recombinantes. Na etapa final, análises de estruturas secundárias e terciárias, a última apenas para o antígeno 1F8, visualizaram as diferenças nas sequências de aminoácidos obtidas a partir de sequenciamento de DNA. Os resultados apresentados neste estudo mostram que o antígeno KMP11 de T. cruzi possui uma similaridade na sequência de aminoácidos muito elevada com o T. rangeli, mostrando a necessidade de um mapeamento antigênico desta proteína em todos os tripanosomatídeos que apresentaram alta similaridade com o antígeno de T. cruzi, como o T. rangeli, para verificar a presença de epítopos específicos de T. cruzi. O antígeno 1F8 pode ser uma ferramenta útil no diagnóstico da doença de Chagas e que será necessário aprofundar os conhecimentos sobre os determinantes antigênicos para futuramente elaborar poli-epítopos sintéticos adaptados de um maior número possível de antígenos, obtendo a maior especificidade e sensibilidade nos testes de diagnóstico sorológico e de teste rápido da doença de Chagas. Este estudo representa um passo crucial para a otimização de antígenos recombinantes para o diagnóstico da doença de Chagas. / Chagas disease is a zoonosis caused by the flagellate protozoan Trypanosoma cruzi. An estimated 8 million people are infected with T. cruzi worldwide, mostly in Latin America. Traditional diagnostic tests are gradually being replaced by more innovative methods, such as rapid tests and Real Time PCR. The use of recombinant antigens in serology or rapid tests has been proposed in the 90s, and several combinations were tested with sera from patients with different clinical forms in different regions in Latin America. Despite the gain in specificity, these tests showed lower sensitivity, frustrating expectations. This study aims to analyze the genetic variability of KMP11 and 1F8 genes coding for antigens commonly used in such experimental diagnostic. T. cruzi strains belonging to different taxonomic sub-groups and different regions were analyzed in order to assess the impact of antigenic variation in diagnostic tests. Maximizing sensitivity and avoiding cross-reactive epitopes for other pathogens should allow for the design of better rapid tests. In a first step, genomic DNA was extracted from the following strains: DM28c, Colombiana, Y, 3663, 4167, LL014 and CL Brener and we performed amplification of the 1F8 and KMP11 antigen encoding genes from these strains. Gene fragments were cloned, sequenced, and subcloned in expression vectors, followed by detection of the recombinant antigens. Using structural prediction and modeling, secondary and tertiary structures were analyzed the latter only for the 1F8 antigen, to visualize the differences in the amino acid sequences revealed from DNA sequencing. The results presented in this study show that the KMP11 T. cruzi antigen, has a very high similarity in amino acid sequence with T. rangeli, showing the need for antigenic mapping of this protein in all trypanosomatids that showed high similarity with the T. cruzi and T. rangeli, for the presence of specific epitopes of T. cruzi. The 1F8 antigen may be a useful tool in the diagnosis of Chagas disease and will need to know more about the antigenic determinants to further develop poly-epitope synthetic adapted from a larger number of possible antigens, obtaining the highest specificity and sensitivity in tests serological diagnosis and rapid test for Chagas disease.This study represents a crucial step for the optimization of recombinant antigens for the diagnosis of Chagas disease.

Quase 100 anos após a descoberta do Trypanosoma cruzi, agente etiológico da doença de Chagas, não existem tratamentos efetivos para esta doença tanto em sua fase aguda quanto crônica. Neste trabalho é apresentado um estudo em grande escala das proteínas preditas a partir de seqüências genômicas de T. cruzi, através de técnicas de bioinformática e modelagem comparativa, visando investigar e discutir os seguintes aspectos: (i) quais seqüências podem ter suas estruturas tridimensionais (3D) geradas e qualificadas por técnicas de modelagem comparativa, usando o workflow MHOLline; (ii) associar a estes modelos protéicos uma classificação enzimática (EC), através da ferramenta ECNGet (desenvolvida neste trabalho); (iii) através desta associação enzimática aos modelos, usá-los para inferir possíveis funções biológicas às suas seqüências alvos originalmente anotadas como hipotéticas, e/ou sugerir uma possível reanotação de seqüências; (iv) investigar dentre as enzimas com estruturas 3D geradas quais possuem similaridades (ortologias) com enzimas humanas (genoma de Homo sapiens); (v) determinar quais das enzimas identificadas fazem parte de alguma via metabólica representativa depositada em bancos de dados específicos. Dentre as enzimas de T. cruzi consideradas como alvos moleculares para o tratamento da doença de Chagas, as cisteíno proteases têm sido extensivamente estudadas experimentalmente. Neste presente estudo, as isoformas 1 e 2 da cruzipaína foram investigadas por simulações de dinâmica molecular (DM), nas temperaturas de 25C e 37C, tendo como controle a papaína, enzima representativa da família C1 de cisteíno proteases. Analisando 20.679 seqüências protéicas preditas a partir de CDS (Seqüência Codificante) não redundantes do genoma de T. cruzi (cepa CL Brener), 4.719 seqüências foram associadas a proteínas de membrana e foram gerados 2.786 modelos estruturais protéicos. Destes modelos, 1.888 foram associados a um EC, dos quais aproximadamente 79,5% foram classificados como tendo uma qualidade suficientemente boa para serem usados em estudos de desenho racional de fármacos baseado em estrutura, através de métodos de modelagem molecular. Dos 1.876 modelos enzimáticos com, pelo menos, uma sub-subclasse enzimática, foram identificadas 99 seqüências possivelmente análogas a enzimas humanas, 1.776 como similares e 1 bifuncional como análoga/similar. Também foi possível detectar um subgrupo de 10 modelos considerados como prováveis enzimas específicas de T. cruzi em relação a H. sapiens, não descartando possíveis relações destas seqüências com outros organismos. Nos estudos de DM realizados, o principal resultado obtido indica que a presença de resíduos ácidos na posição 158 (numeração da papaína) no sítio catalítico, pode induzir uma reorganização estrutural, suscetível a variações de temperatura, dos resíduos catalíticos em cisteíno proteases da família da papaína. Esta reorganização estrutural gera uma conformação semelhante à apresentada pela tríade catalítica (ASP/HIS/SER) em serino proteases.

Submitted by Thaysa Buss Carvalho (thata_carv@hotmail.com) on 2018-03-06T20:09:50Z No. of bitstreams: 1 Dissertação (versão final - Pós).pdf: 3710550 bytes, checksum: bab583912c5fbf652bf225a988df911b (MD5) / Approved for entry into archive by ROSANGELA APARECIDA LOBO null (rosangelalobo@btu.unesp.br) on 2018-03-08T18:01:27Z (GMT) No. of bitstreams: 1 carvalho_tb_me_bot.pdf: 3710550 bytes, checksum: bab583912c5fbf652bf225a988df911b (MD5) / Made available in DSpace on 2018-03-08T18:01:27Z (GMT). No. of bitstreams: 1 carvalho_tb_me_bot.pdf: 3710550 bytes, checksum: bab583912c5fbf652bf225a988df911b (MD5) Previous issue date: 2018-02-23 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / A doença de Chagas (DC), causada pelo protozoário Trypanosoma cruzi (T. cruzi), ainda é considerada como um problema de saúde pública em muitos países da América Latina. De acordo com a Organização Mundial da Saúde, estima-se que entre seis a sete milhões de pessoas no mundo estejam infectadas. Indivíduos na fase crônica da doença podem ser classificados como assintomáticos ou sintomáticos (estes, desenvolvendo as formas clínicas cardíaca, digestiva ou mista). Os assintomáticos correspondem a 70% dos indivíduos nessa fase e, embora apresentem sorologia positiva para anticorpos anti T-cruzi, não desenvolvem manifestações clínicas da doença. O motivo pelo qual alguns pacientes permanecem assintomáticos, e outros desenvolvem sintomas severos, ainda é desconhecido. Fatores genéticos do hospedeiro são bastante relevantes e podem explicar a heterogeneidade encontrada em pacientes que vivem com a doença em áreas endêmicas. Diante disso, o presente trabalho teve como objetivo avaliar SNPs (Single Nucleotide Polymorphisms) no gene TNF-α (rs1800629) e ACAT-1 (rs1044925) em indivíduos com DC crônica e verificar se os mesmos estão relacionados com a susceptibilidade para manifestação de formas clínicas sintomáticas com uso da técnica PCR-RFLP. Foram genotipadas 124 amostras para o gene TNF-α e 135 para o gene ACAT-1. Foi observada associação significativa da presença do alelo A do gene TNF- α em indivíduos sintomáticos em relação aos assintomáticos (p = 0,045). Também houve associação significativa entre o alelo G (p = 0,008) e o genótipo GG (p = 0,001) do gene TNF-α e os genótipos AA (p = 0,047) e AC (p = 0,016) do gene ACAT-1 nos indivíduos assintomáticos em relação aos sintomáticos. Nossos resultados sugerem que a presença do alelo A do gene TNF-α possa estar relacionada com a presença de manifestações clínicas sintomáticas na fase crônica da doença e o alelo G, bem como, genótipo GG possam estar associados com ausência de sintomas clínicos em indivíduos nessa fase. A respeito do SNP do gene ACAT-1, nossos dados sugerem efeito protetor dos genótipos AA e AC segundo apresentação de sintomas da doença na fase crônica, o que representa dado inédito em chagásicos. / Chagas disease (CD), caused by the protozoan Trypanosoma cruzi (T. cruzi), is still considered a public health problem in many Latin America countries. According to the World Health Organization, it is estimated that between six and seven million people worldwide are infected. Disease’s chronic phase individuals may be classified as asymptomatic or symptomatic (these, developing as clinical cardiac, digestive or mixed forms). Asymptomatic individuals account for 70% of the patients at this stage and, although they have positive serology for anti-T-cruzi antibodies, they do not develop it’s clinical manifestations. The reason why some patients remain asymptomatic, and others develop severe symptoms, is still unknown. Host’s genetic factors are quite relevant and may explain the heterogeneity found in patients living with the disease in endemic areas. The objective of this study was to evaluate SNPs in the TNF-α (rs1800629) and ACAT-1 (rs1044925) genes in individuals with chronic CD and to verify if the polymorphisms are related to the susceptibility to manifestation of symptomatic clinical forms using the PCR-RFLP technique. Were genotyped 124 samples for the TNF-α gene and 135 for the ACAT-1 gene. Significant association for the presence of the A allele of the TNF-α gene was observed for symptomatic individuals in relation to the asymptomatic ones (p = 0.045). There was also a significant association between the G allele (p = 0.008) and the GG genotype (p = 0.001) of the TNF-α gene and the AA (p = 0.047) and AC (p = 0.016) genotypes of the ACAT-1 gene for asymptomatic patients. Our results suggests that the presence of the TNF-α gene A allele may be related to the presence of symptomatic clinical manifestations in the chronic phase of the disease and the G allele as well as the GG genotype may be associated with absence of clinical symptoms in individuals at this stage. Regarding the ACAT-1 gene SNP, our data suggests a protective effect of AA and AC genotypes according to the to the presentation of chronic disease symptoms, which is an unprecedented finding in chagasic patients. / CAPES: 1578310

Made available in DSpace on 2014-12-17T14:03:40Z (GMT). No. of bitstreams: 1 JetheNOF_DISSERT.pdf: 2279868 bytes, checksum: 4d99a8a04626302078cb68e1b2a75887 (MD5) Previous issue date: 2013-02-01 / Conselho Nacional de Desenvolvimento Cient?fico e Tecnol?gico / Leishmania infantum and Trypanosoma cruzi are trypanosomatids of medical importance and are, respectively, the etiologic agents of visceral leishmaniasis (VL) and Chagas disease (CD) in Brazil. People infected with L. infantum or T. cruzi may develop asymptomatically, enabling the transmission of pathogens through blood transfusion and / or organs. The assessment of the infection by T. cruzi is included among the tests performed for screening blood donors in Brazil, however, there is no availability of tests for Leishmania. Serological tests for T. cruzi are very sensitive, but not specific, and may have cross-reactions with other microorganisms. Thus, the aim of this study was to determine the prevalence of Leishmania infection in blood donors and assess whether the serological test for T. cruzi detect L. infantum. Among the 300 blood samples from donors, discarded in 2011, 61 were T. cruzi positive, 203 were from donors with other infections and 36 were from handbags with low blood volume, but without infection. We also assessed 144 samples from donors without infections and able to donate blood, totaling 444 subjects. DNA was extracted from blood samples of all to perform quantitative PCR (qPCR) to detect Leishmania DNA. The buffy coat obtained from all samples was grown in Schneider medium supplemented and NNN. All samples were evaluated for the presence of anti-Leishmania antibody. The serological results indicate a percentage of 22% of Leishmania infection in blood samples obtained from discarded bags. A total of 60% of samples positive in ELISA for T. cruzi were negative by IFI, used as confirmatory test, ie 60% false positive for Chagas. Among these samples false positive for Chagas, 72% were positive by ELISA for Leishmania characterizing the occurrence of cross reaction between serologic assays. Of the 300 cultures performed, 18 grew parasites that were typed by qPCR and specific isoenzymes, found the species Leishmania infantum crops. Among the 18 cultures, 4 were purged from scholarships for low volume and all negative serology blood bank, thus demonstrating that there is a real risk of Leishmania transmission via transfusion. It is concluded that in an area endemic for leishmaniasis in Brazil, serological diagnosis performed to detect infection by T. cruzi among blood donors can identify infection by L. infantum and although cause false positive for Chagas, this cross-reactivity reduces the risk of Leishmania infection via blood transfusion, since tests are not applied specific detection of the parasite. In this way, there remains the need to discuss the implementation of a specific serological screening test for Leishmania in endemic countries such as Brazil / Leishmania infantum e Trypanosoma cruzi s?o tripanossomat?deos de import?ncia m?dica e s?o, respectivamente, os agentes etiol?gicos da leishmaniose visceral (LV) e da doen?a de Chagas (DC) no Brasil. Pessoas infectadas por L. infantum ou por T. cruzi podem evoluir de forma assintom?tica, possibilitando a transmiss?o destes pat?genos atrav?s de transfus?o sangu?nea e/ou ?rg?os. A avalia??o da infec??o por T. cruzi est? contemplada entre os exames realizados para triagem de doadores no Brasil, no entanto, n?o h? disponibilidade de exames para Leishmania. Os testes sorol?gicos para T. cruzi s?o muito sens?veis, mas n?o espec?ficos, podendo apresentar rea??es cruzadas com outros microorganismos. Desta forma, o objetivo desse estudo foi determinar a preval?ncia da infec??o por Leishmania em doadores de sangue e avaliar se os teste sorol?gicos para T. cruzi detectam L. infantum. Dentre as 300 amostras de sangue de doadores, descartadas em 2011, 61 eram T. cruzi positivas, 203 eram de doadores com outras infec??es e 36 eram oriundas de bolsas com baixo volume de sangue, mas sem infec??o. Foram tamb?m avaliadas 144 amostras de doadores sem infec??es e aptos a doarem sangue, totalizando 444 volunt?rios. DNA foi extra?do do sangue de todas as amostras para realizar PCR quantitativa (qPCR) a fim de detectar DNA de Leishmania. O creme leucocit?rio obtido de todas as amostras foi cultivado em meio Schneider e NNN suplementado. Todas as amostras foram avaliadas quanto a presen?a de anticorpo anti-Leishmania. Os resultados sorol?gicos apontam um percentual de 22% de infec??o por Leishmania nas amostras de sangue obtidas das bolsas descartadas. Um total de 60% das amostras positivas no ELISA para T. cruzi foram negativas na RIFI, teste usado como confirmat?rio, ou seja, 60% falso positivos para Chagas. Dentre essas amostras falso positivas para Chagas, 72% foram positivas no ELISA para Leishmania caracterizando a ocorr?ncia de rea??o cruzada entre os ensaios sorol?gicos. Do total de 300 culturas realizadas, 18 cresceram parasitas que foram tipados por isoenzimas e qPCR espec?fica, sendo encontrada a esp?cie Leishmania infantum nas culturas. Dentre as 18 culturas, 4 foram provenientes de bolsas expurgadas por baixo volume e negativas em todas as sorologias do banco de sangue, demonstrando assim que h? um risco real de transmiss?o de Leishmania por via transfusional. Conclui-se que em ?rea end?mica para leishmanioses no Brasil, diagn?sticos sorol?gicos realizados para detectar infec??o por T. cruzi em doadores de sangue podem identificar a infec??o por L. infantum e, apesar de ocasionar resultados falso positivos para Chagas, essa reatividade cruzada reduz o risco de infec??o por Leishmania via transfus?o sangu?nea, visto que n?o s?o aplicados testes espec?ficos detec??o desse parasita. Desde modo, persiste a necessidade de se discutir a implementa??o de um teste de triagem sorol?gica espec?fico para Leishmania em pa?ses end?micos como o Brasil