Submitted by Ana Maria Fiscina Sampaio (fiscina@bahia.fiocruz.br) on 2013-10-16T19:49:06Z No. of bitstreams: 1 Monica Cardozo Rebouças. Resposta a quimioterapia...2012.pdf: 2111449 bytes, checksum: c4c3f7eeb987c9afdfca54d06568dd45 (MD5) / Made available in DSpace on 2013-10-16T19:49:06Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Monica Cardozo Rebouças. Resposta a quimioterapia...2012.pdf: 2111449 bytes, checksum: c4c3f7eeb987c9afdfca54d06568dd45 (MD5) Previous issue date: 2012 / Fundação Oswaldo Cruz. Centro de Pesquisas Gonçalo Moniz. Salvador, BA, Brasil / Populações que residem em áreas endêmicas da doença de Chagas são submetidas a múltiplas infecções pelo Trypanosoma cruzi e podem estar infectadas com cepas ou clones com diferentes graus de virulência e susceptibilidade à quimioterapia. Este é um fator importante para o desenvolvimento e morbidade da doença. As cepas de Trypanosoma cruzi representam complexas populações multiclonais, homogêneas ou heterogêneas, com predominância de um clone principal. São biologicamente classificados em Biodemas (Tipos I, II e III) que apresentam diferentes graus de resistência à quimioterapia. Cepas do Tipo I são muito suscetíveis ao tratamento; cepas do Tipo II possuem uma média susceptibilidade (cepa 21SF); cepas de Tipo III são muito resistentes (cepa Colombiana). No presente estudo, é avaliado o resultado do tratamento de camundongos triplamente infectados com clones da cepa 21SF, em comparação com os infectados com a cepa parental. 50 camundongos foram infectados com a cepa 21SF (infecção única). O inóculo foi de 5 x 104 formas tripomastigotas sanguícolas. 80 camundongos foram infectados, sucessivamente, com 3 clones da cepa 21SF (C6, C7 e C8), inóculo: 1x104 formas tripomastigotas (infecção tripla). A infecção simples com cada clone também foi feita. Os camundongos de ambos os grupos foram divididos em dois subgrupos: tratados com Benzonidazol – BZ (100 mg/kg/dia - 60 doses) e controles não tratados. Após 60 dias do final do tratamento, os camundongos sobreviventes foram eutanasiados, por exsanguinação, pós-anestesia; o sangue foi coletado para o exame sorológico de imunofluorescência indireta; testes de cura foram realizados (parasitemia, xenodiagnósticos, hemocultura) e seções do coração e músculo esquelético foram coletadas, fixadas e processadas para o estudo histopatológico em cortes corados com Hematoxilina & Eosina. A PCR foi também usada como uma técnica diagnóstica complementar. Os testes parasitológicos mostraram uma positividade variando de 54,4% nos camundongos infectados com a cepa parental e tratados; 33,4 a 66,7% nos animais com infecção única pelos diversos clones e tratados e 26,7% nos camundongos com infecção tríplice, tratados. Os títulos sorológicos (TIFI) variaram de 1:20 a 1:280 nos infectados com cepa parental tratados com BZ e de 1:640 a 1:1280 para controles não tratados. Os títulos sorológicos na infecção única com cada clone variaram de 1:10 a 1:1280 em camundongos tratados e de 1:160 a 1:1280 nos controles não tratados. A PCR revelou positividade em todos os animais infectados, tratados. O resultado final foi obtido pela combinação dos testes parasitológicos com os títulos sorológicos revelando positividade de 6,6% nos camundongos infectados com a cepa parental e tratados; 0 a 18,2% nos animais com infecção única pelos diversos clones e tratados e 12% nos camundongos com infecção tríplice, tratados. Estudo histopatológico: Os camundongos infectados com a cepa parental apresentaram lesões que variavam de leves a moderadas, na maioria dos casos, predominante no miocárdio (animais tratados e controles não tratados) camundongos submetidos à infecção única por cada clone apresentaram lesões semelhantes aos demonstrados pela infecção com cepa parental. Os camundongos com infecção tripla apresentaram uma exacerbação de lesões, evoluindo para a miocardite crônica. Nestes casos, havia intensas lesões no músculo esquelético; animais tratados apresentaram uma nítida redução das lesões no miocárdio e no músculo esquelético. Os resultados da quimioterapia com Benzonidazol em animais triplamente infectados, considerando os testes parasitológicos e sorológicos, revelaram baixos índices de cura e agravamento das lesões tissulares nos camundongos submetidos a múltiplas infecções com clones obtidos da cepa 21SF. / People living in endemic areas of Chagas disease are submitted to multiple infections during their lives and could be infected with strains or clones with different virulence and susceptibility to chemotherapy. This is an important factor in the development and morbidity of the disease. Strains of Trypanosoma cruzi represent complex multiclonal populations, which can be homogeneous or heterogenous with predominance of a principal clone. The strains are biologically classified in different Biodemes (Types I, II and III) which disclose different degrees of resistance to chemotherapy. Type I strains are very susceptible to treatment; Type II strains disclose medium susceptibility (21SF strain); strains of Type III are very resistant (Colombian strain). The clones isolated from different strains can also present different degrees of resistance. In the present study the results of treatment of mice triple infected with clones of the 21SF strain is evaluated, in comparison with the infected with the parental strain. For the present study, 50 Swiss mice were infected with the 21SF strain (single infection).The inoculum was of 5 x 104 blood trypomastigotes. 80 mice were infected successively with 3 clones of the 21SF strain (C6, C7 and C8) inoculum: 1x104 trypomastigotes (triple infection). Single infection with each Clone was also done. The mice of both groups were divided into 2 sub-groups: treated with Benzonidazol –BZ (100mg/kg/day – 60 doses) and untreated controls. After 60 days of the end of treatment, surviving mice were killed by exsanguinations after anesthesia; the blood was collected for indirect immunofluorescence serological test; cure tests were performed (parasitemia, xenodiagnosis, haemoculture) and sections of the heart and skeletal muscle were collected, fixed and then processed for the histopathological study in sections stained with Hematoxilin end Eosin. PCR reaction was also performed in blood samples as a complementary diagnostic technique. Parasitological tests have shown positive results that varied from 54.4% for the group of mice infected with the parental strain and treated with BZ; 33.4 to 66.7% for the mice with single infection, with each clone, treated with BZ, and 26.7% with triple infection with the three clones, treated with BZ. Serology titers (IIFT) varied from 1:20 a 1:280 for the mice infected with parental strain treated with BZ and from 1:640 to 1:1280 for untreated controls. Serology titers in the single infection with each clone varied from 1:10 to 1:1280 in treated mice and from 1:160 to 1:1280 in the untreated controls. PCR reaction was positive in all the infected mice, treated. Parasitological tests combined with the sorological titers have shown a positivity of 6.6% for the mice infected with the parental strain and treated with BZ; 0 to 18.2% for the mice with single infection with each clone and treated an 12% for the mice with triple infection and treated with BZ. Histopathological examination revealed in mice infected with the parental strain, mild to moderate inflammatory lesions. Mice submitted to single infection with clones of the 21SF strain presented similar lesions to those determined by infection with parental strain. Mice with triple infection present an intensification of lesions, and evolution to a chronic myocarditis and intense lesions in skeletal muscle; Treated animals presented clear reduction of lesions in myocardium and in skeletal muscle. Results of chemotherapy with BZ in mice with triple infection with clones of the 21 SF T. cruzi strain, considering the results of parasitological and serological tests, revealed low cure rates and aggravation of tissue lesions in those animals submitted to triple infections with clones of the parental strain.

Submitted by Anderson Silva (avargas@icict.fiocruz.br) on 2012-09-17T17:49:32Z No. of bitstreams: 1 cristiane_f_silva_ioc_bp_0051_2011.pdf: 4625689 bytes, checksum: 9b9576a91ed1d5f8dcd03755634e513e (MD5) / Made available in DSpace on 2012-09-17T17:49:32Z (GMT). No. of bitstreams: 1 cristiane_f_silva_ioc_bp_0051_2011.pdf: 4625689 bytes, checksum: 9b9576a91ed1d5f8dcd03755634e513e (MD5) / Fundação Carlos Chagas Filho de Amparo, Conselho Nacional Desenvolvimento Científico e Tecnológico,PAPES V/FIOCRUZ,Consortium for Parasitic Drug Development / Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Oswaldo Cruz. Departamento de Ultra-Estrutura e Biologia Celular. Rio de Janeiro, RJ, Brasil / O atual tratamento da doença de Chagas (DC) se baseia em dois compostos nitroderivados, o Nifurtimox (Nf) e benznidazol (Bz), ambos introduzidos na clínica médica há cerca de 40 anos e que têm sido considerados insatisfatórios principalmente devido à baixa atividade, sobretudo na fase crônica, além de alta toxicidade e/ou ocorrência de isolados do parasito resistentes a ambos nitroderivados. Assim como um dos principais desafios ainda a serem enfrentados há mais de cem anos depois da descoberta da DC diz respeito a identificação de novas terapias alternativas para o tratamento desta negligenciada parasitose, esta temática representou o principal objetivo da presente tese. Assim, estudos in vitro e in vivo foram conduzidos visando avaliar a eficácia de amidinas aromáticas, incluindo diamidinas e arilimidamidas (AIAs) sobre o T.cruzi, analisando ainda a localização e distribuição dos compostos aromáticos assim como seus alvos celulares. Nossos dados revelaram a ação tripanocida de diamidinas e AIAs sobre formas sanguíneas e amastigotas do parasito, em faixa micro e nanomolar, respectivamente. Alguns dos compostos estudados, em especial as AIAs DB745 e DB1831 exibiram excelente efeito sobre formas sanguíneas na presença de sangue a 4oC, demonstrando seu potencial uso também na profilaxia de bancos de sangue. De modo geral, as amidinas testadas, incluindo as AIAs, apresentaram superior eficácia que as drogas de referencia, incluindo o Bz e a violeta de genciana. AIAs como a DB745 foram ativas sobre diferentes cepas do T.cruzi, incluindo YuYu e Colombiana, que apresentam resistência natural a nitroderivados. Estudos ultra-estruturais e por ensaios fluorescentes (microscopia e citometria de fluxo) revelaram que o núcleo e a mitocôndria do parasito representam potenciais alvos dos compostos estudados. No entanto, não foi observada correlação entre atividade e maior acúmulo destes agentes na mitocôndria (kDNA) do T.cruzi. Os ensaios in vivo demonstraram que estes compostos aromáticos são ativos sobre modelos experimentais de infecção aguda pelo T.cruzi, reduzindo carga parasitária e a inflamação, oferecendo 100% de proteção na mortalidade dos animais tratados. A AIA DB1965 revelou eficácia semelhante ao Bz e a sua combinação com esta droga de referência resultou em 100% de sobrevida e níveis superiores a 99% de supressão de parasitemia, sem alcançar cura parasitológica avaliada pelo hemocultivo e PCR. O excelente efeito de amdinas, em especial de AIAs contra o T. cruzi, reforça o rastreamento por novos análogos que possam ser usados sozinhos ou em combinações com outras drogas, para o tratamento da doença de Chagas. / The current treatment of Chagas disease (CD) is based on two old drugs, the Nifurtimox (Nf) and benznidazole (Bz), both introduced in clinical medicine for nearly 40 years ago. Both are not considered adequate mainly due to their low activity, especially in the chronic phase, and high toxicity and/or occurrence of parasite strains naturally resistant to both nitro-derivatives. Then, one of the main challenges still to be faced after more than a century after the discovery of CD is respect to need of identifying new alternative therapies for the treatment of this neglected illness, and this issue represents the main objective of the present thesis. Thus, in vitro and in vivo studies were conducted to evaluate the efficacy of aromatic amidines, including diamidines and arylimidamides (AIAs), and to evaluate the localization and distribution of these compounds as well as their potential cellular targets upon T. cruzi. Our data revealed trypanocidal activity of diamidines and AIAs against bloodstream and intracellular amastigotes under micro and nanomolar range, respectively. Some of the studied compounds, especially AIAs, DB745 and DB1831, exhibited an outstanding effect on bloodstream forms even in the presence of blood at 4oC, also demonstrating their potential prophylactic use in blood banks. In general, amidines mainly AIAs, showed higher efficacy than the reference drugs, including Bz and gentian violet. AIAs, as DB745, were active on different strains of T. cruzi, including Colombian and YuYu, which have natural resistance to nitro-derivatives. Ultrastructural studies and fluorescent tests (microscopy and flow cytometry) revealed that the nucleus and mitochondria of the parasite are potential targets of the compounds studied. However, there was no correlation between activity and greater accumulation of these agents in the mitochondria (kDNA) of T. cruzi. In vivo testing demonstrated that these aromatic compounds are active on experimental models of acute infection of T. cruzi, by reducing cardiac parasite load and inflammation, and offering 100% of protection upon the mortality of treated animals. The AIA, DB1965, also showed similar efficacy of Bz and its combination with this reference drug resulted in 100% survival and >99% of parasitemia suppression, without achieving, parasitological cure assessed by blood culture and PCR. The excellent effect of amidines (especially of AIAs) against T. cruzi, justify the screening of novel amidine analogues that could be used alone or in combination with other drugs to treat Chagas disease.

Submitted by Anderson Silva (avargas@icict.fiocruz.br) on 2012-10-16T16:18:56Z No. of bitstreams: 1 ana_carolina_r_guimaraes_ioc_bcm_0008_2010.pdf: 7783704 bytes, checksum: c55aa365e04b94c51640b1937be9e63d (MD5) / Made available in DSpace on 2012-10-16T16:18:56Z (GMT). No. of bitstreams: 1 ana_carolina_r_guimaraes_ioc_bcm_0008_2010.pdf: 7783704 bytes, checksum: c55aa365e04b94c51640b1937be9e63d (MD5) Previous issue date: 2010 / Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Oswaldo Cruz. Laboratório de Genômica Funcional e Bioinformática. Rio de Janeiro, RJ, Brasil / O estudo da reconstrução metabólica em diversos organismos expõe a existência de compostos cruciais para a sua sobrevivência. Dentre estes compostos, estão as enzimas, responsáveis pela catálise das reações bioquímicas em vias metabólicas. Diferentemente das enzimas homólogas, as enzimas análogas (também conhecidas como enzimas isofuncionais não homólogas) são capazes de catalisar as mesmas reações, mas sem apresentar similaridade de sequência significativa no nível primário e, possivelmente, com diferentes estruturas tridimensionais. Um estudo detalhado destas enzimas pode desvendar novos mecanismos catalíticos, adicionar informações sobre a origem e evolução de vias bioquímicas e revelar alvos potenciais para o desenvolvimento de drogas. Para muitas enfermidades causadas por parasitas, as opções terapêuticas permanecem ineficientes ou inexistentes, exigindo a busca de novos alvos. Estes podem ser proteínas específicas do parasita ausentes no hospedeiro ou compostos presentes em ambos, mas com estrutura tridimensional substancialmente diferente, como as enzimas análogas. A ferramenta AnEnPi, capaz de identificar, anotar e comparar enzimas homólogas e análogas, foi desenvolvida e utilizada para reconstruir computacionalmente as vias metabólicas de alguns organismos modelo, como os tripanossomatídeos. Uma análise mais focada no metabolismo de aminoácidos de Trypanosoma cruzi identificou alvos promissores para o desenvolvimento de novas drogas. Além disso, uma revisão do metabolismo geral de T. cruzi foi realizada em outras vias metabólicas, levando em consideração esta nova abordagem de busca por potenciais alvos terapêuticos. Uma vez que a estrutura tridimensional é importante no estudo de analogia, a ferramenta MHOLline foi utilizada para a obtenção de modelos 3D a partir de homólogos, análogos e proteínas específicas de T. cruzi versus Homo sapiens. As estratégias utilizadas nesse trabalho apóiam o conceito de análise estrutural, juntamente com a análise funcional de proteínas, como uma interessante metodologia computacional para detectar potenciais alvos para o desenvolvimento de novas drogas. / The study of metabolic reconstruction in different organisms exposes the existence of crucial compounds for its survival. Examples of these compounds are the enzymes that are responsible for the catalysis of biochemical reactions in metabolic pathways. Unlike the homologous enzymes, the analogous enzymes (also known as non- homologous isofunctional enzymes) are able to catalyze the same reactions, but without significant sequence similarity at the primary level and possibly with different three-dimensional structures. A detailed study of these enzymes may exhibit new catalytic mechanisms, add information about the origin and evolution of biochemical pathways and reveal potential targets for drug development. For many diseases caused by parasites, therapeutic options remain inefficient or nonexistent, requiring the search for new drug targets. These targets may be specific proteins of the parasite (absent in the host) or compounds present in the both organisms but with different three-dimensional structure, like analogous enzymes. The tool AnEnPi approach was able to identify, annotate and compare homologous and analogous enzymes. It was developed and used to reconstruct computationally the metabolic pathways of some model organisms such as trypanosomes. A more focused analysis on the amino acids metabolism of Trypanosoma cruzi identified promising targets for the development of new drugs. Furthermore, a review of the general metabolism of T. cruzi was carried out in other metabolic pathways, taking into account this new approach in the search for potential therapeutic targets. Since the three-dimensional structure is important in the study of analogy, the tool MHOLline was used to obtain 3D models for homologous, analogous and specific proteins of T. cruzi versus Homo sapiens. The strategies used in this study support the concept that structural analysis together with protein functional analysis could be an interesting computational methodology to detect potential targets for structure-based rational drug design.

Em diferentes diretrizes para doença de Chagas crônica há diferentes algoritmos de execução de testes sorológicos. No entanto, há poucas referências quanto aos pacientes que devem ser submetidos à investigação sorológica, além dos indícios de que os testes ELISA possuem limitações e que o uso da PCR é controverso. Este trabalho contém resultados de dois estudos; o primeiro teve como objetivo rever a literatura sobre diagnóstico de doença de Chagas crônica e sumarizar a performance dos testes ELISA e PCR, e o segundo desenvolver um modelo de predição clínica para doença de Chagas crônica. O primeiro estudo foi uma revisão sistemática. Resumos relevantes foram procurados em bases remotas (MEDLINE, LILACS, EMBASE, SCOPUS, ISIWeb) e em bibliografia de textos completos. As investigações originais foram consideradas elegíveis para este trabalho quando estimassem sensibilidade e especificidade, ou confiabilidade (ou permitissem sua estimação) de testes ELISA ou PCR para o diagnóstico de doença de Chagas crônica. A heterogeneidade mostrou-se elevada em cada teste (ELISA e PCR) e o efeito de ponto de corte foi detectado em subgrupos. A sensibilidade e a especificidade sumárias do teste ELISA foram 97,7% [96,7%-98,5%] e 96,3% [94,6%-97,6%] respectivamente. O teste ELISA com antígenos recombinantes apresentou medidas sumárias de sensibilidade e especificidade de 99,3% [97,9%-99,9%] e 97,5% [88,5%-99,5%], respectivamente. A heterogeneidade da PCR não foi explicada, porém foi detectado um efeito de ponto de corte. A sensibilidade sumária da PCR foi de 50% a 90%, e sua especificidade sumária foi de aproximadamente 100%. Há testes comerciais cujos relatórios técnicos não são acessíveis e por isso não foram incluídos nesta revisão. O segundo trabalho foi um estudo transversal com pacientes recrutados sequencialmente por estarem sob suspeita de serem portadores de doença de Chagas. Neste estudo foram incluídos 352 pacientes e a prevalência da doença de Chagas foi de 20,74%. Os preditores que compuseram o modelo final foram: referenciamento por banco de sangue, número de irmãos com doença de Chagas, presença de BRD 3 grau ao ECG, presença de EV isolada ao ECG, relato de ter residido em área rural no passado, presença de BDAS ao ECG, radiografia com sinal de cardiomegalia, ausência de hipertensão arterial, número de parentes com AVE, relato de ter habitado em vivenda de estuque/taipa no passado. Esse modelo apresentou uma área sob a curva ROC de 0,90. Um nomograma foi elaborado para estimativa individual de probabilidades de ser portador de doença de Chagas crônica.

Benznidazol (BZ) é uma das duas drogas usadas no tratamento da doença de Chagas. Falhas terapêuticas são observadas em muitos pacientes, que foram atribuídas, principalmente, às diferenças na suscetibilidade de cepas do Trypanosoma cruzi a essa droga. Alguns genes foram implicados na resistência induzida a BZ, mas não na resistência natural. O objetivo geral deste estudo foi investigar diferenças de expressão gênica em cepas de T. cruzi naturalmente resistentes e suscetíveis a BZ, utilizando microarranjos de DNA. Quantificamos a sensibilidade à droga em cepas de laboratório e isolados obtidos de pacientes crônicos submetidos a quimioterapia com BZ. Concluímos que os valores de CI50 não são preditivos cura. Os experimentos de microarranjos e ensaios de RT-PCR mostram que a abundância de transcritos do gene TcABCG1, foi maior em cepas naturalmente resistentes a BZ. Não observamos variação na abundância de transcritos de alguns genes implicados no fenótipo de resistência induzida. Nossos dados sugerem o envolvimento do transportador TcABCG1 na resistência a BZ. / Benznidazole (BZ) is one of the two drugs used to treat Chagas disease. Therapeutic failures were reported in many chronic patients, which were mostly attributed to different susceptibilities of Trypanosoma cruzi strains to BZ. A few genes have been implicated in the induced resistance to BZ, but none in the natural resistance. The general goal of this study was to investigate differences in gene expression between susceptible and naturally resistant T. cruzi strains employing DNA microarray technology. We have quantified the drug activity for laboratory strains and for isolates retrieved from chronic patients submitted to BZ therapy. Our results indicate that the IC50 values are not predictive of cure. The microarray and RT-PCR experiments showed the higher abundance of transcript of TcABCG1 gene in naturally resistant strains as compared to sensitive strains. We observed no variation in the transcripts levels of the genes implicated in the induced drug resistance. Our data suggest that TcABCG1 transporter may be involved in natural drug resistance in T. cruzi.

Submitted by Luciana Sebin (lusebin@ufscar.br) on 2016-09-26T19:33:26Z No. of bitstreams: 1 DissJPPS.pdf: 2939420 bytes, checksum: 44366c4d259a65ba75e54d36b01b8483 (MD5) / Approved for entry into archive by Marina Freitas (marinapf@ufscar.br) on 2016-09-27T19:57:29Z (GMT) No. of bitstreams: 1 DissJPPS.pdf: 2939420 bytes, checksum: 44366c4d259a65ba75e54d36b01b8483 (MD5) / Approved for entry into archive by Marina Freitas (marinapf@ufscar.br) on 2016-09-27T19:57:35Z (GMT) No. of bitstreams: 1 DissJPPS.pdf: 2939420 bytes, checksum: 44366c4d259a65ba75e54d36b01b8483 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-09-27T19:57:40Z (GMT). No. of bitstreams: 1 DissJPPS.pdf: 2939420 bytes, checksum: 44366c4d259a65ba75e54d36b01b8483 (MD5) Previous issue date: 2016-03-23 / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) / Knowledge about horizontal gene transfer has been proposed even before the determination of the molecular structure of DNA. It has been experimentally shown that micro-homologies rich in adenine and cytosine mediates the integration of Trypanosoma cruzi’s kDNA minicircle, in the vertebrate genome. After human genome sequencing, the genome characterization of different organisms has been one of the main driving forces of science, providing a quantity of biological data for modern biomedical research, unprecedented in the history of science. However, even though traditional DNA mapping algorithms are highly accurate, they operate at a much lower rate than that needed for the next generation sequencers to accumulate new data. This great asymmetry between data generation and analysis capability requires the rapid evolution of mapping and reading algorithms so that this large volume of information can be worked through targeted searches. Thus, this work proposes an efficient, fast and easy way to search and locate multiple signatures of indicators that allow exogenous kDNA integration in the human genome, by creating a set of scripts for in silico analysis adapted to large files sequences. Three scripts based in R language were developed: to permute the elements (nucleic acids or amino acids codes); for search, grouping and plotting matches in genome; and for counting total matches and chromosomal window. All adenine and cytosine signatures were properly identified in the human genome, but no point more susceptible to T. cruzi kDNA integration was identified. With the obtained data, a genetic map was created, listing all matchings in each cytogenetic band, but it was not possible to identify which chromosome was more prone to mutations, since the bigger the chromosome is, the higher the quantity of matches are. / Com o sequenciamento do genoma humano e tantas outras espécies, abre-se agora uma nova janela de oportunidades analíticas. Podemos pensar em fazer buscas orientadas dentro dessa massa enorme de dados publicados em bancos de dados biológicos. Tendo isso em foco, buscamos estruturar uma forma automatizada de busca dentro do genoma humano, pela qual pudéssemos inferir sobre os sítios mais prováveis de integração de DNA exógeno. Para isso utilizamos como modelo os trabalhos que indicam que a doença de Chagas é produzida pela introgressão do kDNA de Trypanosoma cruzi no genoma hospedeiro, por meio de herança genética horizontal. Já foi demonstrado experimentalmente que micro-homologias ricas em adenina e citosina medeiam as integrações de minicírculos de kDNA do T. cruzi, no genoma de vertebrados. Deste modo, o presente trabalho propõe uma maneira eficiente, fácil e rápida para a busca e localização de múltiplas assinaturas dos sinalizadores que propiciam a introgressão do kDNA exógeno no genoma humano, através da criação de um conjunto de scripts para análises in silico, adaptados a grandes arquivos de sequências. Foram desenvolvidos três scripts, baseados na linguagem R: para permutação de elementos (ácidos nucleicos ou aminoácidos); para busca, agrupamento e plotagem das correspondências em genoma; e para contagem total de correspondências e contagem por janela cromossômica. Todas as assinaturas compostas por adenina e citosina (motivos CA’s) foram devidamente identificadas no genoma humano, porém não foi identificado nenhum ponto mais suscetível à integração do kDNA de T. cruzi. Com os dados obtidos, um mapa genético foi criado, listando as correspondências em cada banda citogenética, porém não foi possível identificar qual cromossomo possui maior propensão à mutações, já que quanto maior o cromossomo, maior é a quantidade de correspondências presentes.

Submitted by Carlos Augusto Rolim da Silva Junior (carlos_jrolim@hotmail.com) on 2016-03-08T16:31:38Z No. of bitstreams: 1 arquivototal.pdf: 3636595 bytes, checksum: 9bfe0585b173a3a85bd2f365a0090726 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-03-08T16:31:38Z (GMT). No. of bitstreams: 1 arquivototal.pdf: 3636595 bytes, checksum: 9bfe0585b173a3a85bd2f365a0090726 (MD5) Previous issue date: 2015-10-15 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - CAPES / First, this study evaluated the risk imposed by Triatoma triatoma in the Chagasic epidemiology in distinct rural sites in Paraíba (PB; Cajazeiras, São José de Espinharas, Condado, Santa Teresinha and São Mamede) and Rio Grande do Norte (RN; Caicó and Currais Novos) with the use of entomological indicators. The rate of natural infection by T. cruzi and the parasite diversity, according to the two major lineages (TCI e TCII) were also evaluated via molecular techniques. With the field information, the compositional age structure of natural T. brasiliensis populations was also characterized. A total of 3,021 triatomines were captured, with a notable prevalence of T. brasiliensis (80%), followed by T. pseudomaculata (16%) and T. petrochii (4%). Overall, the domestic colonization was low and most of collected insects were peridomestic, which minimizes the risks of T. cruzi transmission. Even though Condado had exhibited the highest indexes of domiciliary infestation (50%) and colonization (40%), these indexes were followed by null natural infection by T. cruzi and low triatomine density (10.1 insects/house). Contrarialy, for Currais Novos there were hight triatomine density (37%) and colonization (37%), as well as natural infection by T. cruzi (mean 24.4%), suggesting it is the most exposed municipality to T. cruzi human infection. The observed variation in natural infection by T. cruzi in domiciliary unities is probably associated to ecotope structures, as in PB municipalities insects are found in chicken crops whereas in Currais Novos (RN) rock, cobblestone and branch piles are infested as much by T. brasiliensis as they are by sylvatic Caviidae mammals (Galea spixx and Kerodon rupestris). The lower (mean 3.4%) natural infection prevalence for T. cruzi in wild natural populations of T. brasiliensis in spots of PB if compared to those sampled in RN (mean 51.8%) is probably associated with environmental degradation of natural habitats observed in the first. Molecular techniques pointed out the two major parasite lineages of T. cruzi co-occurring in peridomiciles and also in sylvatic environments. From September to December it is observed a higher incidence of adults in the sylvatic environments, if compared to field work of March and studies surveyed from literature. It alerts for the possibility of a higher incidence of domiciliary invasions of winged forms of T. brasiliensis during the last months of the year. / Em uma primeira etapa, este estudo avaliou os riscos impostos por Triatoma brasiliensis na epidemiologia Chagásica em distintos pontos rurais de municípios da Paraíba (PB; Cajazeiras, São José de Espinharas, Condado, Santa Teresinha e São Mamede) e Rio Grande do Norte (RN; Caicó e Currais Novos) com a aplicação de indicadores entomológicos. O índice de infecção natural e a diversidade do parasita Trypanosoma cruzi de acordo com as duas principais linhagens (TCI e TCII) foram também avaliados por técnicas moleculares. Com as informações de campo, a estrutura composicional etária de populações de T. brasiliensis foi caracterizada. Um total de 3.021 triatomíneos foi capturado, com uma destacada prevalência de T. brasiliensis (80%), seguido por T. pseudomaculata (16%) e T. petrochii (4%). A colonização domiciliar foi baixa em todos os pontos investigados, sendo os insetos predominantemente peridomiciliares, o que minimiza os riscos de transmissão de T. cruzi. Embora Condado tenha apresentado os mais altos índices de infestação (50%) e colonização (40%) domiciliar, estes foram acompanhados por índices nulos de infeção natural e de baixa densidade triatomínica (10,1 insetos/casa). Já em Currais Novos houve a mais alta densidade triatomínica (41,1 insetos/casa) e valores também altos de infestação (37%) e colonização domiciliar (37%), bem como de infecção natural (média de 24,4%), indicando que este município apresenta o mais alto risco de transmissão de T. cruzi a humanos. A variação nos índices de infecção natural por T. cruzi em unidades domiciliares está possivelmente associada à estrutura ecotípica, pois nos municípios da PB os insetos peridomiciliares são encontrados principalmente em galinheiros ao passo que em Currais Novos (RN) os amontoados de pedras, paralelepípedos e galhos no peridomicílio estão infestados tanto por T. brasiliensis, quanto por roedores silvestres da família Caviidae (Galea spixx e Kerodon rupestris). A mais baixa prevalência de infecção por T. cruzi em populações silvestres de T. brasiliensis nos pontos de PB (média de 3,4%) se comparado aos pontos amostrados do RN (média de 51,8%) está possivelmente associada à degradação ambiental observada na Paraíba. Técnicas moleculares apontaram a presença das duas linhagens do parasita coabitando tanto no peridomicílio quanto no ambiente silvestre. De setembro a dezembro foi observada maior incidência de adultos nos ambientes silvestres, em relação às coletas de março e aos trabalhos encontrados na literatura. Estes resultados alertam para a possibilidade de uma maior incidência de invasões domiciliares pelas formas alares de T. brasiliensis nos últimos meses do ano.

Em diferentes diretrizes para doença de Chagas crônica há diferentes algoritmos de execução de testes sorológicos. No entanto, há poucas referências quanto aos pacientes que devem ser submetidos à investigação sorológica, além dos indícios de que os testes ELISA possuem limitações e que o uso da PCR é controverso. Este trabalho contém resultados de dois estudos; o primeiro teve como objetivo rever a literatura sobre diagnóstico de doença de Chagas crônica e sumarizar a performance dos testes ELISA e PCR, e o segundo desenvolver um modelo de predição clínica para doença de Chagas crônica. O primeiro estudo foi uma revisão sistemática. Resumos relevantes foram procurados em bases remotas (MEDLINE, LILACS, EMBASE, SCOPUS, ISIWeb) e em bibliografia de textos completos. As investigações originais foram consideradas elegíveis para este trabalho quando estimassem sensibilidade e especificidade, ou confiabilidade (ou permitissem sua estimação) de testes ELISA ou PCR para o diagnóstico de doença de Chagas crônica. A heterogeneidade mostrou-se elevada em cada teste (ELISA e PCR) e o efeito de ponto de corte foi detectado em subgrupos. A sensibilidade e a especificidade sumárias do teste ELISA foram 97,7% [96,7%-98,5%] e 96,3% [94,6%-97,6%] respectivamente. O teste ELISA com antígenos recombinantes apresentou medidas sumárias de sensibilidade e especificidade de 99,3% [97,9%-99,9%] e 97,5% [88,5%-99,5%], respectivamente. A heterogeneidade da PCR não foi explicada, porém foi detectado um efeito de ponto de corte. A sensibilidade sumária da PCR foi de 50% a 90%, e sua especificidade sumária foi de aproximadamente 100%. Há testes comerciais cujos relatórios técnicos não são acessíveis e por isso não foram incluídos nesta revisão. O segundo trabalho foi um estudo transversal com pacientes recrutados sequencialmente por estarem sob suspeita de serem portadores de doença de Chagas. Neste estudo foram incluídos 352 pacientes e a prevalência da doença de Chagas foi de 20,74%. Os preditores que compuseram o modelo final foram: referenciamento por banco de sangue, número de irmãos com doença de Chagas, presença de BRD 3 grau ao ECG, presença de EV isolada ao ECG, relato de ter residido em área rural no passado, presença de BDAS ao ECG, radiografia com sinal de cardiomegalia, ausência de hipertensão arterial, número de parentes com AVE, relato de ter habitado em vivenda de estuque/taipa no passado. Esse modelo apresentou uma área sob a curva ROC de 0,90. Um nomograma foi elaborado para estimativa individual de probabilidades de ser portador de doença de Chagas crônica.

A proteína P21 do Trypanosoma cruzi participa no processo de infecção da célula hospedeira, desse modo é de grande importância: elucidar as vias de sinalização induzidas pela proteína, bem como caracterizar a nível molecular e estrutural a P21. O que vai auxiliar no entendimento da função biológica da P21 e sua participação no processo de infecção. A P21 recombinante é expressa Escherichia coli em sua maioria na fração insolúvel. Visando aumento de proteína na fração solúvel, foi realizada a clonagem do gene da P21 em vetor pSMT3, bem como testes de expressão subsequentes em diferentes cepas de expressão de E. coli, em vetor pET-28 e pSMT3 e variadas condições de expressão e lise celular. Desse modo obtiveram-se as condições que permitissem uma maior concentração da P21 na fração solúvel. A expressão foi realizada no vetor pET-28, cepa BL21, a 37°C com meio 2xYT a 0.5 mM de IPTG, utilizando a técnica de sonicação como lise. A P21 foi purificada em cromatografia de afinidade e posteriormente em coluna de exclusão molecular. Foram realizados estudos de modelagem por homologia levaram a elaborar a hipótese de que a P21 tem a função de inibidor de serinoprotease do tipo kunitz. Posteriormente essa hipótese foi confirmada com ensaios de avaliação da atividade inibitória da P21 frente à tripsina, quimiotripsina e elastase neutrofílica, o qual a P21 mostrou capaz de inibir a elastase neutrofílica. Estudos com espalhamento dinâmico da luz (DLS) revelaram que as amostras testadas de P21 contém diferentes concentrações de agregados de alto peso molecular em todos os pHs avaliados. Outras medidas foram realizadas para avaliar o estado de agregação da P21 de acordo com a temperatura e verificou-se que entre 32-52 °C, a proteína apresenta menor raio hidrodinâmico, indicando menor agregação nesse intervalo. Estudos de dicroísmo circular revelaram que a P21 apresenta por volta de 20% de α hélice, 32% de folha-β, 22% de volta e 23 % estrutura randômica. De acordo com a curva de desnaturação referente ao espectro de CD obtido, a P21 se mostra desnaturada a partir de 64°C. / The Trypanosoma cruzi protein P21 participates in the host cell infection process, but its specific function is poorly described. Thus it is important to elucidate the signaling pathways induced by the protein and characterize the P21 at the structural and molecular levels, as a contribution towards the understanding of the P21 biological function and its role in the infection process. The Escherichia coli recombinant P21 is expressed mostly in the insoluble fraction. Aiming to increase protein in the soluble fraction, we performed the cloning of the P21 gene in pSMT3 vector and subsequent expression tests in different expression strains of E. coli in pET-28 and pSMT3 vectors and varied expression conditions and cell lysis. Thus we obtained conditions that allow a greater concentration of the P21 in the soluble fraction. The expression vector was performed using vector pET-28, in Bl21 strain at 37°C in 2xYT culture medium with 0.5 mM IPTG, using the sonication technique in cell lysis. The recombinant P21 was purified by Ni affinity chromatography and subsequently a molecular exclusion column. We performed homology modeling studies which led to assume that P21 can be a serinprotease inhibitor of Kunitz type. Furthermore, this hypothesis was confirmed in the experiments testing the P21 inhibitory activity against the trypsin, chymotrypsin and elastase. We found the P21 exclusively inhibit neutrophil elastase. Studies using dynamic light scattering (DLS) revealed that the samples containing P21 contained large molecular weigth aggregates in different concentrations at all evaluated pHs. Others measurements were performed to assess the P21 aggregation state according to the temperature and we found that between 32-52 °C the protein had a smaller hydrodynamic radius, indicating less aggregation in this range. Circular dichroism (CD) studies revealed that P21 has about 20% α-helix, 32% β, -sheet, 22% turn and 23% of random structure. According to the denaturation curve for the CD spectrum obtained, the P21 was denatured from 64°C.

A doença de Chagas é caracterizada por um amplo espectro de manifestações clínicas, que vão desde a ausência de sintomas à doença grave com comprometimento cardíaco e/ou digestivo. A influência do parasito, Trypanosoma cruzi (T. cruzi), agente etiológico da doença, nessas apresentações clínicas têm sido largamente estudada, não se tendo demonstrado o papel da diversidade genética de populações de T. cruzi na determinação das diferentes formas clínicas em humanos. Este trabalho teve como objetivos: a) geral: analisar as características moleculares de T. cruzi em pacientes com doença de Chagas com e sem imunodepressão (infecção por HIV e transplante de órgãos com e sem reativação); b) específicos: 1. Analisar comparativamente isolados do parasito quanto à distribuição em DTU; 2. Relacionar os resultados obtidos pela análise molecular do gene ND7 com a forma clínica e origem; 3. Avaliar por LSSP-PCR a variabilidade da sequência do kDNA de T. cruzi diretamente de amostras biológicas assim como em isolados de T. cruzi obtidos pelos exames de hemocultura/xenodiagnóstico; 4. Comparar os padrões polimórficos obtidos por LSSP-PCR em amostras repetidas de um mesmo paciente no mesmo sítio ou distintos sítios biológicos. Foram incluídos, após aprovação do protocolo na CAPPesq e mediante assinatura de TCLE, 106 pacientes com doença de Chagas crônica ou com imunossupressão, provenientes dos ambulatórios e enfermarias do HCFMUSP, além de 75 indivíduos controle, com provas sorológicas e moleculares negativas. Foram analisadas 187 amostras isoladas de hemocultura/xenodiagnóstico e 236 diretamente de amostras sanguíneas de pacientes. Os seguintes grupos foram constituídos: Agudo-AG, Crônico-CR, Crônico Imunodeprimido-CRI (doenças autoimunes/neoplasias), Coinfecção-CO (infecção por HIV/T.cruzi), Coinfecção-CO/RE (infecção por HIV/T.cruzi e reativação da doença de Chagas), Transplantado-TX, Transplantado-TX/RE (Transplantado com reativação da doença de Chagas). Foram identificados DTU TcI, TcV, TcVI e em maior número TcII, por ensaios de tipagem molecular do parasito, com distribuição estatisticamente significantemente de acordo com a naturalidade dos pacientes (P=0,013). Quanto ao gene ND7, observou-se que a banda de ~900 bp ocorreu em 83,0% das amostras das regiões norte, nordeste, centro-oeste e Bolívia e a de ~400pb em 54% das amostras nas regiões sul e sudeste brasileiras sendo esta diferença estatisticamente significante (P < 0,001). A comparação dos perfis observados por LSSP-PCR a partir de amostras extraídas diretamente do sangue e de isolados obtidos de hemocultura/xenodiagnóstico mostrou maior variabilidade em amostras sanguíneas, confirmada pelo dendrograma. Adicionalmente, o estudo de amostras repetidas do mesmo paciente permitiu confirmar a maior variabilidade nas amostras diretamente extraídas do sangue, com mudança dos padrões durante e após o tratamento com reaparecimento de perfis antigos não presentes no período prétratamento imediato, além de presença de perfis diferentes em distintos sítios biológicos do mesmo paciente. O encontro de DTU diferentes de TcII nos grupos CR/CRI e AG enfatiza a necessidade de atentar para a diferença em limiares de reatividade segundo DTU na análise da parasitemia por PCRq (quantitativa), conforme registrado na literatura. Os dados observados por LSSP-PCR acrescentam informações adicionais não revelados por tipagem molecular, representando novos desafios para o entendimento da relação hospedeiro-parasito em pacientes com doença de Chagas sem e com imunossupressão, ao lado de fatores como nível de parasitemia e pressão seletiva de medicamentos antiparasitários e imunossupressores / Chagas\' disease is characterized by a broad spectrum of clinical manifestations, ranging from asymptomatic cases to severe cardiovascular and/or gastrointestinal involvement. The clinical presentations are thought to be determined primarily by genetic diversity of populations of Trypanosoma cruzi (T. cruzi), but no correlation was clearly demonstrated yet. This study aimed to: a) general: to analyze the molecular characteristics of T. cruzi in patients with Chagas\' disease with and without immunosuppression (HIV infection and organ transplantation with or without reactivation); b) specifics: 1.To analyze comparatively isolates from the parasite as for the distribution in DTU; 2. To describe the results obtained by molecular analysis of gene ND7 in relationship with the clinical form and origin; 3. To assess by LSSP-PCR the variability of the sequence of the T. cruzi kDNA directly from biological samples, as well as in T. cruzi isolates obtained by examination of blood culture/xenodiagnosis; 4. To compare the polymorphic patterns obtained by LSSP-PCR in repeated samples of the same patient on the same site or different biological sites. After approval of the protocol in CAPPesq and by signing an informed consent, 106 patients with chronic Chagas disease or immunosuppression, from the HCFMUSP\'s clinics and wards, and 75 control subjects with negative serological and molecular tests were included. They were analyzed 187 isolated samples from blood culture/xenodiagnosis and 236 directly from blood samples of patients. The following groups were formed: Acute-AC, Chronic-CR, Chronic immunocompromised-CRI (autoimmune diseases/ neoplasms), Coinfection-CO (HIV/T. cruzi infection), Coinfection-CO/RE (HIV/T. cruzi and reactivation of Chagas disease), Transplantation-TX, Transplantation-TX/RE (Transplantation/ with reactivation of Chagas\' disease). DTU TcI, TcV, TcVI and higher TcII number were identified for molecular typing assays of the parasite and the distribution of DTU was statistically significant according to patient´s naturality (P=0.013). As for ND7 gene, was observed that the band of ~ 900 bp was prevalent in 83% of the samples in the North, Northeast, Midwest regions and Bolivia and the band of ~400bp occurred in 54% of the samples of Brazilian\' South and Southeast regions, this distribution was statistically significant (P < 0.001). The comparison between the profiles observed by LSSP-PCR from samples taken directly from blood and isolates obtained from blood culture/xenodiagnosis showed greater variability in blood samples, confirmed by dendrogram. Additionally, the study of repeated samples from the same patient allowed to confirm the greater variability in blood samples taken directly, with changing patterns during and after the treatment with reappearance of old profiles not present in the immediate pre-treatment period, and the presence of different profiles at different biological sites in the same patient. The presence of other DTUs than TcII in chronic and chronic immunosuppressed patients and AC groups emphasizes the need to pay attention to the different reactivity thresholds for the various DTU in the analysis of parasitaemia by PCRq (quantitative), according to the data registered in the literature. The results observed by LSSP-PCR add further information not revealed by molecular typing, representing new challenges for the understanding of the host-parasite relationship in patients with Chagas\' disease with and without immunosuppression, alongside factors such as level of parasitaemia and selective pressure of antiparasitic drugs and immunosuppressive