Memoria para optar al Título Profesional de Médico Veterinario / En el presente trabajo se analizó la evolución de la infección con Trypanosoma cruzi en ratones ACA experimentalmente infectados con 2.000 tripomastigotes sanguíneos de las cepas Tulahuén, Munantá y San Antonio del parásito, evaluando la prepatencia, parasitemia y mortalidad acumulada, y su correlación con el número de pseudoquistes y la magnitud del daño inflamatorio en el tejido cardiaco de los individuos infectados. Los ratones infectados con la cepa Tulahuén mostraron una prepatencia sanguínea de 5 días, un máximo de 14,8 x 105 ± 2,21 x 105 parásitos/mL al día 11 post infección (p.i.) y una mortalidad acumulada del 100% al día 21 post infección. Los animales infectados con Munantá mostraron, en cambio, una prepatencia sanguínea de 7 días, un máximo de 40,06 x 105 ± 1,86 x 105 parásitos/mL al día 17 p.i. y una supervivencia cercana al 80% más allá de 6 meses p.i. Mientras que los infectados con San Antonio presentaron una prepatencia sanguínea de 7 días, un máximo de 1,73 x 105 ± 1,86x104 parásitos/mL al día 11 p.i. y una mortalidad acumulada del 100% al día 20 p.i. Los resultados sugieren la existencia de una correlación entre el parasitismo intracelular, magnitud del infiltrado inflamatorio mononuclear, severidad del daño en el tejido cardiaco, y mortalidad acumulada hasta la tercera semana p.i. en los ratones infectados con Tulahuén y San Antonio, situación que no ocurre en los ratones infectados con Munantá, a pesar de su significativamente elevada parasitemia (p<0,001). Estos resultados reafirman la sugerencia que no existe una relación directa entre la parasitemia, la virulencia de la cepa o aislado del parásito y la susceptibilidad a la infección / Proyecto DPA14LIHBAC1314003

Memoria para optar al Título Profesional de Médico Veterinario / El protozoo flagelado Trypanosoma cruzi es el agente causal de una de las endemias de mayor relevancia para la Salud Pública en América Latina, la Enfermedad de Chagas. Es una patología zoonótica que afecta aproximadamente a 18 millones de individuos en Sudamérica y alrededor de 150.000 en Chile. El diagnóstico de esta enfermedad es principalmente serológico, basándose en la detección inmunométrica de IgG contra antígenos parasitarios o el parásito completo. Esta metodología tiene la desventaja que, a pesar de tener un alta sensibilidad, la presencia de reacciones cruzadas con otros tripanosomátidos disminuye la especificidad del método. Este problema no es de mayor relevancia en Chile, ya que no existen datos acerca de la existencia de otros parásitos que pudieran producir resultados falsos positivos. Con el objetivo de mejorar la calidad del diagnóstico, numerosos laboratorios han desarrollado ensayos que usan proteínas recombinantes o péptidos sintéticos de T. cruzi. Se ha descrito que tanto sueros de ratones desafiados con tripomastigotes, como sueros humanos infectados con el parásito, presentan una respuesta humoral dirigida contra una proteína de 45 kDa de T. cruzi, descrita en el laboratorio donde se desarrolló esta Memoria, llamada en un comienzo Tc45, hoy día identificada como calreticulina de T. cruzi, TcCRT. En esta Memoria de Título se propone estandarizar ensayos inmunoenzimáticos para determinar la reactividad de sueros humanos con calreticulina recombinante de T. cruzi (rTcCRT), con el fin de aportar datos con un posible potencial diagnóstico de la enfermedad. Se utilizaron sueros humanos seropositivos y seronegativos a T. cruzi (según criterio del Centro de Referencia Nacional, ISP, Chile), y se desarrollaron ensayos inmunoenzimáticos utilizando extracto parasitario completo y calreticulina recombinante del parásito, para evaluar y comparar la reactividad de los sueros en estudio con estos reactivos. Además, se utilizaron inmunoglobulinas monoclonales y policlonales, dirigidas contra rTcCRT, para sensibilizar las placas de ELISA. Los resultados demostraron que el ensayo inmunoenzimático directo, utilizando extracto parasitario completo, es un buen método diagnóstico que permite discriminar entre individuos infectados y no infectados, ya que la especificidad de este ensayo no estaría comprometida, en Chile, por la presencia de reacciones no deseadas con otros tripanosomátidos. Aunque los resultados obtenidos en los ensayos indirectos no favorecen un valor diagnóstico para rTcCRT, indican que tanto en individuos infectados, como en individuos normales, la presencia de anticuerpos anti – TcCRT es un hecho frecuente. En los individuos seropositivos, este hecho se puede explicar por numerosos factores, tanto del hospedero como del parásito. En los individuos seronegativos, que no han estado en contacto con el parásito, al igual que en los seropositivos, se presume que la presencia de reactividad contra TcCRT podría tener un origen autoinmune, además de otros factores que se discuten en esta Memoria. A pesar que el ensayo de captura de la proteína nativa desde extracto parasitario con inmunoglobulinas policlonales lapinas anti rTcCRT ofrecía una posibilidad atractiva para discriminar entre sueros positivos y negativos, experimentos posteriores sugieren que la inmunogenicidad de nTcCRT es sólo una parte menor de un conjunto de otras interacciones complejas (no necesariamente inmunológicas), participantes en el ensayo. Una contribución inesperada de estos ensayos, es la participación paradójica de la fase sólida (representada por el PVC de la placa de ELISA, sensibilizada con inmunoglobulinas lapinas, inmunes o no, y la proteína saturante inespecífica). Así, independientemente de la especificidad de los anticuerpos unidos al PVC, se unieron antígenos parasitarios, inmunogénicos en humanos y discriminatorios entre sueros positivos y negativos. Es obvia, entonces, la necesidad futura de identificar estos antígenos parasitarios / Financiamiento: Proyecto FONDECYT Nº 1010930

Memoria para optar al Título Profesional de Médico Veterinario / La enfermedad de Chagas, producida por el protozoo Trypanosoma cruzi, afecta aproximadamente 18 millones de personas en Latinoamérica, existiendo alrededor 200.000 individuos infectados en Chile. En nuestros días, aún no existe vacuna y el tratamiento farmacológico de los casos crónicos es de escasa eficacia, constituyendo uno de los más importantes problemas de salud pública y socioeconómicos de nuestro continente. Aunque el agente causal infecta a todos los mamíferos, no existe información sobre el impacto patológico en animales con valor afectivo o productivo. Numerosos son los antígenos inmunodominantes que se han descrito relacionados con el agente. Uno de ellos es calreticulina, proteína multifuncional altamente conservada presente en el retículo endoplásmico de todas las células de los organismos superiores, con excepción de eritrocitos. Actualmente, el Laboratorio donde se realizó esta Memoria (Inmunología de la Agresión Microbiana, Programa de Inmunología, ICBM, Facultad de Medicina, Universidad de Chile) ha centrado su interés en tres funciones de calreticulina de T. cruzi (TcCRT), tales como: inhibición del sistema del complemento, capacidad ligante de calcio y propiedades anti-angiogénica. Los tripomastigotes infectantes de Trypanosoma cruzi, evaden la respuesta inmune. In vitro, el dominio S de TcCRT (TcS), une C1q del complemento humano, inhibiendo la activación de la ruta clásica. TcCRT induce inmunidad humoral (IgG) in vivo. Por ello, en un intento para generar un correlato in vitro de posibles situaciones inmunomoduladoras de la interacción in vivo entre TcCRT y C1q, se generaron fragmentos inmunoglobulínicos F(ab’)2 anti-TcS y anti-TcCRT recombinante (rTcCRT). Para esto, se inmunizaron conejas con ambos antígenos. Todas respondieron a las inmunizaciones produciendo sueros con alto título de inmunoglobulinas. Estas fueron purificadas por cromatografía de afinidad y se obtuvo la fracción IgG. Los anticuerpos policlonales se sometieron a una digestión enzimática, obteniendo sus fragmentos F(ab’)2, los cuales, fueron purificados y utilizados en un ensayo de ELISA para intentar bloquear la unión de rTcCRT a C1q del complemento humano. En síntesis, tanto rTcCRT como su dominio funcional TcS fueron inmunogénicos, obteniéndose anticuerpos policlonales, de los que se generaron fragmentos F(ab’)2, capaces de bloquear la unión de rTcCRT y TcS a C1q del complemento humano, representando un posible correlato de las situaciones in vivo

Memoria para optar al Título Profesional de Médico Veterinario / La enfermedad de Chagas es una enfermedad parasitaria humana grave en América, causada por el protozoo flagelado Trypanosoma cruzi y transmitida por insectos hematófagos de la subfamilia Triatominae. La detección de T. cruzi puede llevarse a cabo a través de diferentes metodologías como la observación directa al microscopio, el hemocultivo, el xenodiagnóstico y en la última década mediante la reacción de la polimerasa en cadena (PCR). Pruebas moleculares con la técnica de PCR mostraron un 16,4% de infección por T. cruzi en insectos Mepraia spinolai de la Región de Atacama (Chile), un 16% en la Comuna de Til-Til (Chile) y un 44,5% en la Comuna de Colina en la Región Metropolitana (Chile). Nuestros resultados muestran algunas diferencias en los niveles de infección entre los distintos estadios ninfales, pero estas diferencias no son estadísticamente significativas. Se debe destacar una nota de precaución para indicar el papel potencial de M. spinolai en la transmisión de T. cruzi en las zonas donde el nivel de infección detectado por análisis moleculares es alto / Financiamiento: Proyecto Fondecyt No. 1085154

Memoria para optar al Titulo Profesional de Médico Veterinario / La tripanosomiasis americana o enfermedad de Chagas, producida por el Trypanosoma cruzi, es una de las zoonosis más importantes en América latina. Chile contribuye con aproximadamente 150000 infectados, afectando las seis primeras regiones del país. Las drogas disponibles para el tratamiento son nifurtimox (Nx) y benznidazol (Bz), cuyo mecanismo de acción se basa en aumentar el estrés oxidativo y/o producción de metabolitos electrofílicos que se conjugan con las macromoléculas del protozoo. El principal mecanismo antioxidante es el tiol tripanotión (T(SH)2), que es un conjugado de espermidina y glutatión (GSH). El GSH es sintetizado a partir de glutamato y cisteína por la acción enzimática de la -glutamil-cisteinil-sintetasa (GGCS)(etapa limitante), la que puede ser inhibida por la butionina sulfoximina (BSO). En el hospedero mamífero, este protozoo evade la respuesta inmune induciendo una respuesta antiinflamatoria en los macrófagos, mediada por prostaglandina E2 (PGE2) y el factor de crecimiento transformante  (TGF-). Este proceso podría ser prevenido por el ácido acetilsalicílico (AAS), que es un inhibidor de la ciclooxigenasa (COX), y por lo tanto de la producción de prostaglandinas. En la presente memoria se estudió el efecto de BSO, AAS y nifurtimox en ratones infectados con T. cruzi. BSO en dosis de 220 mg/kg/día mostró efecto tripanocida, provocando una disminución en las parasitemias y aumento de la supervivencia de los ratones infectados; además de una disminución en la cantidad de parásitos y del infiltrado inflamatorio en los corazones de estos ratones. Al combinarse con Nx se observó un aumento del efecto tripanocida de este último. En el caso de AAS observamos que las dosis de 25 y 50 mg/kg/día, disminuyeron las parasitemias e incrementaron las supervivencias de los ratones infectados. Con respecto a los cortes histológicos, se aprecia una disminución en los nidos de amastigotes y en la cantidad de infiltrado inflamatorio. Por el contrario cuando fue combinada con Nx se observó un detrimento en el efecto tripanocida respecto al uso de las drogas individualmente. Por lo tanto, el uso de BSO en combinación con nifurtimox podría disminuir la dosis de droga necesaria para obtener el mismo efecto clínico y como consecuencia, podría disminuir los efectos colaterales y/o la duración de la terapia / Proyecto FONDECYT 1061072

Memoria para optar al Título Profesional de Médico Veterinario / Se investigó la presencia de clones del parásito Trypanosoma cruzi, en tres zonas consideradas endémicas para la enfermedad de Chagas en Chile. Estas áreas investigadas presentaban un determinado patrón de distribución para los vectores del parásito; Triatoma infestans en Calera de Tango (Región Metropolitana), Mepraia spinolai en Reserva Nacional Las Chinchillas (Región de Coquimbo) y la existencia de ambos vectores en Putaendo (Región de Valparaíso). Sé capturó un total de 113 micromamíferos de las 3 áreas, incluyendo ejemplares de Abrocoma bennetti, Abrothrix longipilis, Abrothrix olivaceus, Octodon degus, Phyllotis darwini, Thylamis elegans, Rattus norvegicus, Rattus rattus, Oligoryzomys longicaudatus. Para detectar a los individuos parasitados se realizó la técnica de la reacción de la polimerasa en cadena (PCR) de muestra de sangre obtenida mediante punción cardíaca, posteriormente las muestras que resultaron positivas a la PCR, se tipificaron mediante la prueba Southern blot hibridando con sondas específicas para determinar cuál clon de T. cruzi presentaban los micromamíferos parasitados. Se detectó la presencia de T. cruzi en 28 (24,7%) de las 113 muestras totales, en donde 26 individuos (93%) presentaron una infestación única por el clon DTU 1 (TcI) de T. cruzi, y 2 individuos (7%) presentaron una infestación mixta por los clones DTU 1 (TcI) y DTU 2 (TcIIe)

Memoria para optar al Título Profesional de Médico Veterinario / La enfermedad de Chagas, zoonosis ampliamente distribuida en América, es causada por el protozoo Trypanosoma cruzi que es transmitido principalmente a través de las deyecciones de insectos hematófagos de la subfamilia Reduviidae. En Chile existen tres vectores reconocidos: Triatoma infestans (ciclo doméstico), Mepraia spinolai (ciclo silvestre) y Mepraia gajardoi (ciclo silvestre, pero de zonas costeras) denominadas vulgarmente como vinchucas. El objetivo de esta memoria fue determinar la frecuencia de infección por T. cruzi en los perros procedentes de las viviendas con índice de infestación positivo a T. infestans en las provincias de Petorca, San Felipe y Los Andes durante el periodo 2005-2007. Durante mayo 2008 a enero 2009 se muestrearon 175 perros de viviendas cuyos vectores se encontraron positivos a la infección de T cruzi y de manera proporcional se muestrearon 81 perros de las casas cuyos vectores estaban negativos a T cruzi. Para realizar el diagnóstico se uso por primera vez en Chile una técnica serólogica por inmunocromatografía (Trypanosoma Detect Rapid Test for Canine, InBios. Inbios International, Inc.563 1st Ave. South Suite 600 Seattle, WA 98104). Se dispuso de 200 tiras reactivas. Los resultados obtenidos fueron negativos. Pudiendo concluir, que los perros al ser considerados animales centinelas para esta infección, no existe transmisión activa, a pesar de que la población esta expuesta. Lo anterior se podría deber a que los perros no son una fuente de alimentación preferencial para las vinchucas, o, que las vinchucas provienen de focos silvestres, ya alimentadas, y que solo llegan de manera circunstancial a las viviendas y no lo hacen en búsqueda de alimento

Memoria para optar al Título Profesional de Médico Veterinario / La enfermedad de Chagas es una parasitosis endémica en Latinoamérica. Es causada por Trypanosoma cruzi, protozoario hemoflagelado, que afecta al hombre como uno de los hospederos mamífero. La transmisión congénita ha adquirido cada vez más importancia epidemiológica y es parcialmente responsable de la “globalización” de esta patología. Nifurtimox (Nx) y Benznidazol (Bz) constituyen las principales drogas disponibles para el tratamiento de esta enfermedad. Sin embargo, presentan importantes efectos secundarios. En esta memoria de título se ha estudiado en un modelo de infección ex vivo de explantes de vellosidades coriónicas humanas con tripomastigotes de T. cruzi, los posibles efectos tóxicos y terapéuticos de Nx y Bz. La infección placentaria se comprobó mediante detección del parásito por PCR e inmunohistoquímica (Ac anti-cruzipaína). El análisis histopatológico se efectuó mediante tinciones de hematoxilina-eosina, picro rojo sirio e inmunohistoquímica (Ac anti-lactógeno placentario humano). La apoptosis se determinó por la detección de células TUNEL+ y la inducción de lipoperoxidación mediante determinación de malondialdehído mediante HPLC. El parásito provoca un marcado daño tisular así como inducción de apoptosis en las vellosidades coriónicas humanas. Nx muestra un efecto citotóxico sobre el tejido placentario, que no se observa con Bz. Este último además revierte parcialmente el daño tisular, causado por el parásito. Las drogas no eliminan al parásito del tejido placentario, ni con las concentraciones más altas ensayadas / Financiamiento: Proyectos Biecentenario Anillo ACT 29 y ACT 112 , Bicentenario Red 07, Fondecyt 11080166

Memoria para optar al Titulo Profesional de Médico Veterinario / Quince machos y quince hembras de ratones de la cepa AKR fueron infectados experimentalmente con 2000 tripomastigotes del clon Dm 28c de Trypanosoma cruzi. En ambos grupos se midieron los niveles de parasitemia y la mortalidad. Los días 14, 26 y 100 post infección se tomaron muestras de corazón, hígado, riñón, intestino grueso, músculo esquelético y cerebro de 2 ratones sacrificados en cada grupo, para detectar la presencia del parásito mediante la técnica de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR). Los animales de ambos sexos se comportaron como susceptibles a la infección, falleciendo un 100% de los machos y un 73% por ciento de las hembras durante el experimento. Las hembras mostraron un pico de parasitemia significativamente mayor que los machos (p<0,05). De las muestras sometidas a PCR, corazón resultó positivo en todos los ratones, tanto machos como hembras, en todos los días muestreados. Todas las muestras obtenidas de machos resultaron positivas a la presencia del parásito, mientras que en los tejidos de hembras se observaron numerosas muestras negativas, dependiendo del individuo muestreado. Los resultados del presente trabajo apoyan la idea que los individuos nunca se curan de la infección, y que a pesar de desaparecer los signos clínicos, el parásito permanece en forma latente en diferentes tejidos, tal vez durante todo el resto de la vida del individuo

Memoria para optar al Título Profesional de Médico Veterinario / En este estudio demostramos la detección de Trypanosoma cruzi en el roedor silvestre Octodon degus por medio de PCR en sangre y xenodiagnóstico usando los vectores doméstico (Triatoma infestans) y silvestre (Mepraia spinolai) de la enfermedad de Chagas. Se estudiaron 35 Octodon degus y 33 Oryctolagus cuniculus capturados en un área endémica de Chile. Para realizar el PCR se usaron muestras de sangre y contenido intestinal de los vectores alimentados con los animales. Los resultados muestran que el porcentaje de roedores naturalmente infectados con Trypanosoma cruzi depende de la muestra biológica usada en el PCR y la especie de vector usada en el xenodiagnóstico. Los PCR realizados en muestras de sangre no detectaron el DNA de Trypanosoma cruzi, pero el PCR del contenido intestinal indicó que ambos vectores fueron positivos al protozoo. Por lo tanto esta prueba resultó más sensible para detectar el Tripanosoma cruzi en estas especies. Por su parte Mepraia spinolai resultó 4 veces más sensible en detectar la infección por Trypanosoma cruzi en Octodon degus que Triatoma infestans, 22.9% y 5.7% respectivamente. Los resultados en Oryctolagus cuniculus fueron negativos tanto en las muestras de sangre como en los insectos. Todas las muestras positivas al PCR fueron analizadas con pruebas específicas de hibridación usando cuatro genotipos diferentes de Trypanosoma cruzi. Los resultados de la hibridación indican que Mepraia spinolai detectó más genotipos de Trypanosoma cruzi que Triatoma infestans. Estos resultados plantean que Mepraia spinolai es un insecto con una mejor capacidad vectorial que Triatoma infestans. Finalmente se informa el mejoramiento de la detección de Tripanosoma cruzi en animales silvestres con una combinación de PCR y xenodiagnóstico usando el vector endógeno y silvestre Mepraia spinolai / Proyecto FONDECYT No. 1040762 y Proyecto FONDECYT No. 1040711