Submitted by Nuzia Santos (nuzia@cpqrr.fiocruz.br) on 2013-12-12T12:53:00Z No. of bitstreams: 1 Dissertacao_JulianadeOliveiraRodrigues - D_96.pdf.pdf: 4817215 bytes, checksum: 7ac1142aa29870d7fa74bb378fb8569d (MD5) / Made available in DSpace on 2013-12-12T12:53:00Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Dissertacao_JulianadeOliveiraRodrigues - D_96.pdf.pdf: 4817215 bytes, checksum: 7ac1142aa29870d7fa74bb378fb8569d (MD5) Previous issue date: 2013 / Fundação Oswaldo Cruz. Centro de Pesquisas René Rachou / A temperatura ambiental afeta diversos processos bioquímicos, fisiológicos e comportamentais, especialmente em animais ectotérmicos. Mudanças nesse parâmetro podem alterar o fitness de insetos vetores e sua distribuição no ambiente, modificando consequentemente, a dinâmica de transmissão de doenças. O objetivo do presente estudo foi avaliar os efeitos da temperatura no desenvolvimento da infecção de Trypanosoma cruzi e Trypanosoma rangeli em Rhodnius prolixus. Os ensaios com T. rangeli foram desenvolvidos com parasitos submetidos a dois tratamentos. T. rangeli T1 foram obtidos através de passagens em LIT por três meses. T. rangeli T2 foram mantidos em LIT por um mês após uma passagem triatomíneo-camundongo. Inicialmente, o crescimento dos parasitos em meio de cultura submetidos a diferentes temperarturas (21, 24, 27 e 30°C) foi avaliado. O crescimento do T. cruzi foi termodependente, com um aumento de 28 vezes da população mantida em 30°C ao final de sete dias. A mortali dade ficou abaixo dos 10%, exceto para os parasitos mantidos a 21°C, onde esse valor ficou próximo aos 20%. Para os dois tratamentos de T. rangeli , o crescimento máximo foi observado a 27°C. Entretanto, as populações de T. rangeli T2 cresceram mais do que as de T. rangeli T1 e apresentaram taxas de mortalidade mais baixas, em torno de 5%. O próximo objetivo foi avaliar diferentes parâmetros fisiológicos de R. prolixus infectados pelos parasitos e submetidos às mesmas condições de temperaturas. A infecção por T. cruzi prolongou o período intermudas em todas as temperaturas e reduziu o número de insetos aparentemente saudáveis em 20%. A virulência do parasito foi dependente da temperatura e do estado nutricional dos insetos. T. rangeli T1 foi mais virulento do que T. rangeli T2, particularmente nas temperaturas mais baixas. Finalmente, o crescimento do T. cruzi no inseto foi quantificado por qPCR e câmara de Neubauer. Os resultados, ainda preliminares, corroboraram com os dados do crescimento do parasito em LI T. De maneira geral, os resultados sugerem que os dois parasitos podem ser patogênicos ao vetor na natureza dependo das condições a que são submetidos.

Neglected diseases constitute a major public health problem worldwide, quantifying a total of 1 billion people suffering from some kind of infection of bacterial, viral or parasitic origin. Among them, we can highlight Chagas disease, caused by the parasite Trypanosoma cruzi, which affects more than 8 million people around the world. In order to discover new active compounds against T. cruzi, developed herein the synthesis of new prototypes of thiophene-2- thioureic and 2-iminothiazolidine rationally designed with potential antichagasic activity, biological evaluation and study docking. Initially, the start material was the polysubstituted thiophene derivatives synthesized via Gewald reaction, which were converted into thioureic derivatives and then cyclized with five different electrophiles, generating thiophene-2- iminothiazolidine derivatives. The intermediates and final compounds were synthesized in yields between 40 and 98%, and characterized by NMR. For docking study was initially performed by minimizing the energy of the ligands by ArgusLab® software, using AM1, and applying the software AutoDock Tools® and AutoDock Vina®, using the Gasteiger method. All compounds were evaluated in the anti-T. cruzi assays, in vitro, and the most active serie was selected for the cytotoxicity assay (MTT) in J774 cell line. It was possible to determine the enzymes involved in the probable mechanisms of action for the ligands. It has been observed that in 50% of cases, TcDHFR enzyme is the main target of the new compounds, in amastigotes. The pharmacological tests in amastigotes and trypomastigotes, line of C2C12 and MK2 cells was established as validation for the theoretical studies. The compound 3d probably develops its mechanism of action by inhibition of the enzyme TcTS (IC50= 10.3 µM) in trypomastigotes of the parasite. Since the compound 7c possibly acts by inhibition of the enzyme TcDHFR (IC50= 9.2 µM) in amastigotes. In additional, it was proposed that the compound 7b carries out its activity by inhibition of the enzyme TcDHFR (IC50 = 5.0 µM). Finally, it was observed that the most active compounds obtained in this study were more effective than the benznidazole, gold standard drug used in pharmacotherapy clinical of the Chagas disease, additionally has a low cytotoxicity (CC50> 100 µM). / As doenças negligenciadas configuram um grande problema de saúde pública mundial, quantificando um total de 1 bilhão de pessoas acometidas por algum tipo de infecção de origem bacteriana, viral ou parasitária. Dentre elas, podemos destacar a Doença de Chagas, causada pelo parasito Trypanosoma cruzi, a qual acomete mais de 8 milhões de pessoas em todo o mundo. No intuito de se descobrir novos compostos ativos capazes de combater o T. cruzi de maneira eficaz, desenvolvemos neste trabalho a síntese de novos protótipos de fármacos tiofeno-2-tioureicos e 2-iminotiazolidínicos racionalmente planejados com potencial atividade antichagásica, avaliação biológica e estudo de docking. Para a síntese dos compostos planejados, partiu-se de derivados tiofenos polissubstituídos, sintetizados via reação de Gewald, os quais foram convertidos em derivados tioureicos e, em seguida, ciclizados com cinco diferentes di-eletrófilos, gerando derivados tiofeno-2- iminotiazolidínicos. Os intermediários e compostos finais foram sintetizados com rendimentos entre 40 e 98%, e caracterizados por RMN. Para o estudo de docking, inicialmente foi realizada a minimização das energias dos ligantes pelo software ArgusLab®, usando o método AM1, e aplicando os softwares AutoDock Tools® e AutoDock Vina®, empregando o método de Gasteiger. Todos os compostos foram submetidos à avaliação in vitro de suas atividades anti-T. cruzi, e a série mais ativa foi selecionada para ensaio de citotoxicidade (MTT) em células da linhagem J774. Foi possível determinar as enzimas envolvidas nos prováveis mecanismos de ação para os ligantes. Foi observado que, em 50% dos casos, a enzima TcDHFR é o principal alvo dos novos composto, em formas amastigotas. Os ensaios farmacológicos em formas amastigotas e tripomastigotas, linhagem de células C2C12 e MK2 funcionaram como métodos de validação dos estudos teóricos. O composto 3d, provavelmente desenvolve seu mecanismo de ação através da inibição da enzima TcTS (IC50= 10.3 µM), em formas tripomastigotas do parasito. Já o composto 7c,possivelmente atua por meio da inibição da enzima TcDHFR (IC50= 9.2 µM) em formas amastigotas. Em adicional, foi proposto que o composto 7b desenvolve sua atividade através da inibição da enzima TcDHFR (IC50= 5.0 µM). Por fim, foi verificado que os compostos mais ativos obtidos neste trabalho se mostraram mais eficientes do que o fármaco benznidazol, padrão-ouro utilizado na clínica farmacológica da doença de Chagas, além destes apresentarem baixa citotoxicidade (CC50> 100 µM).

Made available in DSpace on 2015-07-22T20:50:07Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2008-05-28. Added 1 bitstream(s) on 2015-08-11T03:25:44Z : No. of bitstreams: 1 Publico-10788a.pdf: 1677698 bytes, checksum: 72b5f6391cabef25ece5a511c8284b1d (MD5). Added 1 bitstream(s) on 2015-08-11T03:25:44Z : No. of bitstreams: 2 Publico-10788a.pdf: 1677698 bytes, checksum: 72b5f6391cabef25ece5a511c8284b1d (MD5) Publico-10788b.pdf: 1134388 bytes, checksum: 43fdc7fcffc7621bc166ea26e5e7681f (MD5). Added 1 bitstream(s) on 2015-08-11T03:25:45Z : No. of bitstreams: 3 Publico-10788a.pdf: 1677698 bytes, checksum: 72b5f6391cabef25ece5a511c8284b1d (MD5) Publico-10788b.pdf: 1134388 bytes, checksum: 43fdc7fcffc7621bc166ea26e5e7681f (MD5) Publico-10788c.pdf: 1594628 bytes, checksum: fa7fab28f569affbc5aded02dd906e12 (MD5) / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) / Nosso principal objetivo foi caracterizar a família gp82 de proteínas, codificada pela família gênica gp82, que é parte da grande família multigênica gp85/trans-sialidase do T. cruzi. Até o início desse estudo, somente a gp82 de superfície, envolvida na invasão celular das formas metacíclicas da cepa CL e identificada pelo anticorpo monoclonal (MAb) 3F6, havia sido descrita. Na primeira parte, investigamos as bases da avirulência in vivo e in vitro das formas metacíclicas do clone CL-14 do T. cruzi , derivado da cepa CL. Descobrimos que a baixa infectividade desses parasitas está associada com a reduzida expressão da gp82 na superfície, reforçando o papel central da molécula na infecção pelo T. cruzi. Além disso, os dados sugeriram que devido à deficiência da gp82, as formas metacíclicas do clone CL-14, como as da cepa G, uti lizam preferencialmente as glicoproteínas gp35/50 para interagir com a célula hospedeira. Na segunda parte, analisamos a expressão e a localização de moléculas da família gp82 em formas metacíclicas das cepas G e CL do T. cruzi. Para isso, isolamos um novo membro (clone C03) que, em contraste com o clones de cDNA representantes da família gp82 previamente descritos, J18 (cepa G) e R31 (cepa CL), não contém o epítopo do MAb 3F6. Na análise comparativa da seqüência de aminoácidos do clone C03, observamos 59,1% de identidade com o clone J18 e 60,2% de identidade com o clone R31. Além disso, quando alinhamos as seqüências de aminoácidos dos clones C03 e Tc-85 (gp85 das formas tripomastigotas de cultura de tecido), observamos 57,2% de identidade, indicando que esse clone também é parte da família gp85/trans-sialidase. Utilizando os anticorpos policlonais anti-J18 e anti-C03, e o MAb 3F6, mostramos que membros da família gp82 são expressos em formas metacíclicas na superfície e intracelularmente, e que alguns desses membros têm localização diferenciada em parasitas dos grupos T. cruzi I e II. Ao contrário da gp82 reativa com o MAb 3F6, específica das formas metacíclicas, outras moléculas da família foram detectadas também nas formas tripomastigotas de cultura de tecido e amastigotas pelos anticorpos policlonais. Na terceira parte, investigamos o efeito da gp82 em sua forma recombinante (J18), sobre a linhagem de melanoma murino Tm5. Observamos que J18 liga-se a essas células induzindo a despolimerização dos filamentos de actina similar à citocalasina-D, droga indutora de apoptose em células de mamíferos. Em vista disso, fizemos uma análise comparativa das alterações no citoesqueleto de actina e eventos característicos de morte celular por apoptose nas células Tm5 tratadas com J18, e na linhagem de melanócitos melan-a, da qual Tm5 é derivada. Mostramos que J18 tem função indutora de apoptose somente sobre as células do melanoma Tm5. Descrevemos assim uma propriedade de um membro da família gp82, nunca antes descrita para nenhum outro componente molecularmente definido do T. cruzi. / The main goal of this work was to characterize the proteins encoded by the gp82 gene fami ly, which is part of the large T. cruzi gp85/trans-sialidase multigenic family. Previous studies had focused on the surface gp82, which is engaged in the cell invasion by CL strain metacyclic forms and is identified by monoclonal antibody (MAb) 3F6. Firstly, we investigated the molecular basis of the non-virulence of T. cruzi clone CL-14 metacyclic forms in vivo and in vitro. We found that the low infectivity of these parasites is associated with reduced expression of surface gp82, reinforcing the role of this molecule in T. cruzi infection. In addition, our data suggested that instead of gp82, metacyclic forms of clone CL-14, like G strain, preferentially engage gp35/50 glycoproteins to interact with the host cell. Secondly, we analyzed the expression and cellular localization of molecules of the gp82 family in T. cruzi metacyclic forms of G and CL strains. We cloned a new member of this family, designated C03, which lacks the MAb 3F6 epitope, in contrast to the previously described gp82 cDNA clones J18 (G strain) and R31 (CL strain). The predicted amino acid sequence of the C03 clone displayed 59,1% identity to J18 clone and 60,2% to R31 clone. When the amino acid sequences of C03 and Tc-85 (tissue culture trypomastigote gp85) clones were aligned, the identity was 57,2%, indicating that this new clone belongs to the gp85/trans-sialidase family. Using anti-J18 and anti-C03 polyclonal antibodies, as well as MAb 3F6, we demonstrated that members of the gp82 family are localized on the cell surface and intracellularly in metacyclic forms, and some members have different cellular localization in parasites from T. cruzi I and II groups. As opposed to metacyclic stage-specific gp82 identified by MAb 3F6, other gp82 fami ly molecules were also detected in tissue culture trypomastigotes and amastigotes by polyclonal antibodies. Thirdly, we investigated the effect of gp82, as a recombinant protein (J18), on the murine melanoma lineage Tm5. We observed that J18 binds to these cells disrupting actin filaments similarly to cytochalasin-D, drug that induces apoptosis in mammalian cells. Based on these information, we comparatively analyzed alterations in actin cytoskeleton and apoptotic events in J18-treated Tm5 cells, and in the melanocyte lineage melan-a, from which Tm5 is derived. J18 selectively induced apoptosis in Tm5 melanoma cells. Our results show an activity of a protein from gp82 family that has not been described for any other T. cruzi molecule. / TEDE

Made available in DSpace on 2015-07-22T20:50:11Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2011-03-25 / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / United Nations University (UNU-BIOLAC) / Formas tripomastigotas de T. cruzi expressam glicoproteínas de superfície da superfamília das trans-sialidases (TS), implicadas nos processos de invasão da célula hospedeira. As TSs constituem uma grande família gênica codificando grande número de proteínas de superfície. Populações de T. cruzi podem expressar diferentes formas antigênicas de TS. A identificação de genes TS localizados próximos aos telômeros sugeriu que as terminações cromossômicas poderiam atuar como local de geração de novas variantes TS. O objetivo deste trabalho é caracterizar as regiões teloméricas e subteloméricas do T. cruzi e investigar seu papel na recombinação e geração de variantes TS. Idfentificamos 49 “contigs” obtidos durante o projeto genoma que contém a repetição telomérica (TTAGGG). Destes “contigs”, em 45 a repetição telomérica está localizada em uma extremidade, e em quatro “contigs” está localizada internamente. A presença de repetições teloméricas internas poderia ser explicada por erros no alinhamento in silico das sequências ou por eventos de fusão de telômeros, formando cromossomos com repetições teloméricas intersticiais. Todos os contigs apresentam uma sequência conservada de 189 pb adjacente à repetição telomérica, denominada junção telomérica, que representa uma assinatura de extremidades cromossômicas de T. cruzi. Durante o trabalho, localizamos 40 dos 49 “contigs” teloméricos nos “contigs” cromossômicos de T. cruzi e relacionamos algumas extremidades cromossômicas às bandas cromossômicas separadas por eletroforese em gel de campo pulsado (PFGE). A estrutura das sequências subteloméricas de T. cruzi varia muito, principalmente como resultado de diferenças na quantidade e na organização de genes de proteínas de superfície (TS e DGF-1), genes “retrotransposon hot spot” (RHS), retroelementos e genes de RNA helicase e N–acetiltransferase entre as extremidades cromossômicas. As regiões subteloméricas possuem um grande número de pseudogenes, porém, também contêm genes completos, possivelmente expressos. Isto indica que estas regiões não representam apenas DNA não-funcional adjacente aos telômeros, mas formam parte do genoma expresso. O tamanho das regiões subteloméricas varia de 5 kb a 182 kb, sendo que as pequenas extremidades podem ter surgido de eventos recentes de quebra cromossômica e reparo dos telômeros. A falta de sintenia nas regiões subteloméricas sugere que genes localizados nestas regiões estão sujeitos a recombinação, o que aumenta sua variabilidade, inclusive em cromossomos homólogos. A presença de genes típicos subteloméricos pode facilitar a ocorrência de mecanismos de recombinação homóloga ou de recombinação mediada por micro-homologia, que podem usar estas regiões para o emparelhamento e recombinação de extremidades livres. Para verificar se eventos de recombinação envolvendo as extremidades cromossômicas estão ocorrendo no parasita construímos um cromossomo artificial de T. cruzi (TAC), uma construção linear que pode ser eficientemente introduzida em epimastigotas mantendo-se estável como um cromossomo do parasita. Estas construções (pTAC-gp85) não se integram ao genoma do parasita, e contém sequências subteloméricas, incluindo um pseudogene gp85, marcadores de seleção em ambos os braços e o gene repórter GFP. Após a eletroporação de epimastigotas com as construções, estas se mantiveram lineares epissomais e estáveis, por diversas gerações, mesmo na ausência de pressão seletiva com antibióticos. Ao longo do ciclo de vida do parasita, o cromossomo artificial se manteve estável, segregando-se junto aos outros cromossomos do parasita. Não foram detectados eventos de recombinação envolvedo deslocamento de genes do cromossomo articial para outro sítio genômico. Eventos de recombinação envolvendo genes TS subteloméricos podem estar ocorrendo em T. cruzi, mas possivelmente com menos frequência do que o esperado pela diversidade genética observada entre as linhagens e o grande número de variantes de antígenos de superfície no parasita. Eventos de recombinação em alguns parasitas da população dificilmente seriam detectados pela estratégia utilizada em nossos experimentos. O T. cruzi apresenta alta resistência aos efeitos da radiação ionizante, apresentando grande capacidade de reparo do DNA. A radiação gama causa a paralização do ciclo celular e fragmentação cromossômica, associada a quebras na dupla fita de DNA (DSBs – “double strand breaks”). No entanto, 48h após a irradiação, bandas cromossômicas de tamanho normal foram detectadas por PFGE. Embora tenha sido proposto que a recombinação mediada por Rad51 tenha papel importante no reparo de lesões do DNA, muitas dúvidas permanecem sobre a resposta do T. cruzi à radiação. Portanto, efetuamos experimentos para compreender o reparo dos cromossomos após a exposição de epimastigotas à radiação gama. Epimastigotas em crescimento exponencial (clone CL Brener e cepas G e CL) foram expostos a doses de 500 a 2000 Gy de radiação gama. Após a irradiação verificamos em intervalos regulares a sobrevivência das células, o crescimento celular, o dano e o reparo do DNA. A inibiçao do crescimento celular ocorreu imediatamente após a irradiação, e permaneceu por 96 h nos parasitas irradiados com 500 Gy e por até 12 dias nos parasitas irradiados com 1000 Gy. Parasitas irradiados com doses maiores (1500 e 2000 Gy) não sobreviveram. Utilizando ensaios que detectam DSBs (TUNEL) e fragmentação cromossômica (PFGE), avaliamos o efeito genotóxico da radiação em epimastigotas. Seis dias após a irradiação, a porcentagem de células irradiadas com 500 Gy marcadas positivamente com TUNEL é similar à de células não irradiadas e 3 vezes menor que nas células irradiadas com 1500 e 2000 Gy. Acreditamos que a fragmentação cromossômica e o número de células marcadas com o ensaio de TUNEL crescem conjuntamente. Comparamos o nível de sintenia entre parasitas irradiados e não irradiados pela análise de segmentos cromossômicos homólogos. Células irradiadas exibem uma impressionante conservação na organização dos genes em relação aos parasitas não irradiados. Nossos resultados confirmam a grande capacidade de reparo de DNA e de resistência à radiação apresentada pelo T. cruzi. / TEDE / BV UNIFESP: Teses e dissertações

Made available in DSpace on 2015-07-22T20:50:20Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2008-02-27 / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / Estudos pré-clínicos de vacinação mostram que a Proteína 2 de Superfície de Amastigotas (ASP-2) é um alvo importante para a imunidade protetora contra a infecção pelo Trypanosoma cruzi. Baseado nestas propriedades protetoras da ASP-2, nós pensamos que seria importante avaliar o seu polimorfismo nas diferentes cepas do parasita. Utilizando anticorpos policlonais e monoclonais contra a proteína recombinante da cepa Y, nós confirmamos a presença de epítopos associados a ASP-2 em amastigotas das cepas pertencentes ao grupo T. cruzi II (Y), T. cruzi I (Sylvio X10/4, Dm28c, Tulahuén, G e Colombiana) e na cepa híbrida (CL-Brener). A estrutura primária da ASP-2 em cada cepa diferente foi determinada a partir de cDNAs de amastigotas intracelulares. A comparação da estrutura primária da ASP-2 expressa pelas cepas Y, CL-Brener, Tulahuén, G (G2) e Colombiana confirmou os dados imunológicos revelando um alto grau de identidade entre eles (>82%). Por outro lado, a ASP-2 das cepas Sylvio X10/4 e G (G1) apresentaram uma identidade limitada em relação às outras cepas (<50%), mas um alto grau de identidade quando comparadas entre si (78,7%). Os estudos de vacinação confirmaram os dados estruturais. Camundongos altamente susceptíveis A/Sn imunizados com cDNAs das cepas Y (pIgSPclone9) ou CL-Brener (pIgSPclone50) apresentaram um grau semelhante de proteção contra desafio com a cepa Y. Em contrapartida, o cDNA da cepa G (pIgSPclone62, G1) foi significativamente menos efetivo. Dessa forma, nossos estudos forneceram evidências que a ASP-2 expressas por diferentes cepas de T. cruzi compartilham um alto grau de identidade estrutural e imunológica. Entretanto, há na natureza algumas poucas cepas que apresentam formas distintas desta proteína. Para estudar a possível função biológica da ASP-2, nós avaliamos inicialmente a ligação da proteína recombinante em células de mamíferos em cultura. Apesar desta proteína se ligar nas células em cultura, parasitas transfectados expressando a ASP-2 na sua superfície não induzem a mobilização de Ca+2 intracelular em célula HeLa, um fenômeno importante na invasão de células hospedeiras. xviii A ASP-2 contém um domínio C-terminal denominado FLY (VTVXNVFLYNR) que foi demonstrado interagir com a citoqueratina (CK18), uma proteína abundante no citoplasma da célula hospedeira. Baseado nesta informação, nós propusemos que a interação do domínio FLY da ASP-2 com a CK18 seria um passo crítico para a multiplicação do T. cruzi no citoplasma da célula hospedeira. RNAi foi utilizado para diminuir a expressão de CK18 em células HeLa in vitro e após 24h de transfecção, as células foram infectadas com tripomastigotas das cepas Y, CL-Brener ou Sylvio X10/4 de T. cruzi. A redução dos níveis do mRNA e da proteína da CK18 decorrentes da transfecção com RNAi, foram determinados por PCR em tempo real, Western blot e imunofluorescência. Seguindo a infecção por tripomastigotas de T. cruzi, nós não observamos uma redução significativa na porcentagem de células infectadas, indicando que a invasão dos parasitas não foi significativamente alterada pela ausência de CK18. Contudo, as células transfectadas com RNAi específicos para a CK18 e infectadas com tripomastigotas das cepas Y ou CL-Brener, apresentaram uma redução significativa no número de parasitas intracelulares 48 horas após a infecção quando comparados a células controles. Em contraste, a expressão reduzida de CK18 não afetou o número de parasitas intracelulares da cepa Sylvio X10/4. Experimento de dupla marcação mostrou que os parasitas da cepa Y, mas não da cepa Sylvio X10/4, co-localizam junto com a CK18. A redução nos níveis de CK18 não afetou a ligação da proteína recombinante His-65kDa à célula HeLa, nem a indução da fosforilação de ERK1/2 por esta proteína. Dessa forma, nossos estudos demonstraram que o RNAi pode ser utilizado para reduzir a expressão de CK18 in vitro em células HeLa e que a inibição de CK18 não interfere na invasão do T. cruzi, mas reduz a multiplicação das formas intracelulares de cepas que co-localizam com a CK18. Além disso, nossos resultados demonstraram que a CK18 não é necessária nem para a ligação da proteína recombinante a células HeLa nem para a ativação da via de sinalização de ERK1/2 induzida pela ASP-2. / Pre-clinical vaccination studies provided evidence that the Amastigote Surface Protein-2 (ASP-2) is an important target for protective immunity against Trypanosoma cruzi infection. Based on the remarkable protective properties of ASP-2, we thought it would be important to evaluate its polymorphism in different strains of T. cruzi. Using polyclonal and monoclonal antibodies against a bacterial recombinant protein representing ASP-2 expressed by the Y strain, we confirmed the presence of ASP-2 associated epitopes on amastigotes of a T. cruzi II strain (Y), T. cruzi I strains (Sylvio X10/4, Dm28c, Tulahuén, G and Colombian) and a hybrid strain (CL-Brener). The ASP-2 primary structure in each different strain was determined from intracellular amastigotes cDNAs. Comparison of the primary structure of ASP-2 expressed by Y, CL-Brener, Tulahuén, G (G2) and Colombian strains confirmed the immunological data revealing a high degree of identity between them (>82%). In contrast, ASP-2 deduced sequences from Sylvio X10/4 and G (G1) strains displayed a limited identity to the others (<50%) and a high degree of identity between them (78.7%). Vaccination studies confirmed the structural data. Highly susceptible A/Sn mice immunized with cDNAs from Y (pIgSPclone9) or CL-Brener (pIgSPclone50) strains had a similar degree of protective immunity against a challenge with the Y strain. In contrast, the cDNA of the G strain (pIgSPclone62, G1) was significantly less effective. Overall, our study provides evidence that ASP-2 expressed by different T. cruzi strains share a high degree of structural and immunological identity. However, there are few strains with distinct forms of this protein in nature. To study the possible function of ASP-2, we firstly evaluated the binding of the recombinant protein to mammalian cells in culture. Although the recombinant protein binds to cultured cells, transfected parasites expressing ASP-2 on the surface do not induce intracellular Ca2+ mobilization in HeLa cells, an important phenomenon in host cells invasion. ASP-2 contains a C-terminal domain denominated FLY domain (VTVXNVFLYNR) that was shown to interact with cytokeratin (CK18), a protein abundant on the host cell cytoplasm. Based on these observations, we hypothesized xx that the interaction of the FLY domain of ASP-2 with CK18 could be a critical step for T. cruzi multiplication in the host cell cytoplasm. RNAi was used to knock down the expression of CK18 in HeLa cells in vitro. Following RNAi transfection, reduced level of CK18 mRNA and protein were confirmed by real time RT-PCR, Western blot and immunofluorescence. Following infection with trypomastigotes of Y, CL-Brener or Sylvio X10/4 strains of T. cruzi, we could not observe a significant reduction in the percentage of cells infected, indicating that parasite invasion was not significantly altered by the absence of CK18. However, CK18 RNAi transfected cells infected with trypomastigotes of Y or CL-Brener strains displayed a significant reduction in the number of intracellular parasites 48 hours later when compared with control cells. The reduced level of CK18 did not affect the number of intracellular parasites of a third parasite strain (Sylvio X10/4). Colocalization experiments showed that parasites of Y strain, but not Sylvio X10/4 strain, may interact with CK18. The reduced level of CK18 did not affect the His-65kD recombinant protein binding to HeLa cells, nor the ERK1/2 phosphorilation. Our studies demonstrated that RNAi can be useful to reduce the CK18 expression in HeLa cells in vitro and the inhibition of CK18 does not interfere with T. cruzi invasion, but it seems to reduce the multiplication of intracellular forms in strains that interact with the CK18. Our results also showed that the CK18 is not necessary for the recombinant protein binding to HeLa cells nor the activation of ERK1/2 pathway signaling induced by ASP-2. / TEDE / BV UNIFESP: Teses e dissertações

Made available in DSpace on 2015-07-22T20:50:40Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2010-03-31 / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / Conselho Nacional de Pesquisas (CNPq e INV) / National Institute of Health (NIH) / Protozoários do gênero Trypanosoma possuem um complexo ciclo de vida, alternando entre hospedeiros vertebrados e invertebrados. A adaptação a essas diversas condições ambientais necessita de rápidas mudanças na expressão gênica para preencher os requerimentos metabólicos ou morfológicos para sobrevivência. Muito pouco se sabe sobre os mecanismos que controlam estas transformações e sobre as vias de sinalização celular implicadas. Como nestes organismos o controle da expressão gênica ocorre ao nível pós transcricional, decidimos neste trabalho estudar a função de proteínas quinases envolvidas no controle da síntese protéica e no crescimento destes parasitas. Em diversos eucariotos a proteína quinase TOR (Target Of Rapamycin) está envolvida no controle da síntese protéica e crescimento celular frente à disponibilidade de nutrientes ou fatores de crescimento. Por análise de seqüências de T. brucei disponíveis nos bancos de dados do genoma desses parasitas encontramos quatro candidatos para TOR (TbTOR1, TbTOR2, TbTOR-like1 and TbTOR-like 2). Dois complexos TOR em T. brucei (TbTORC1 e TbTORC2) foram descritos previamente. No primeiro capítulo desta tese estudamos: TbTOR-like 1 e a comparamos com TbTOR2. TbTOR-like 1 não se encontra em nenhum dos complexos TORC e possui um domínio PDZ não encontrado nas outras TORs de T. brucei ou de outros eucariotos. Ela se localiza em grânulos no citosol que após estresse hiperosmótico migram para a periferia celular. Depleção de TbTOR-like 1 causa uma inibição progressiva do crescimento celular, gerando células de tamanho maior que se acumulam na fase S/G2 do ciclo celular. Estas células também apresentam um aumento no número de acidocalcissomos assim como aumentos nos níveis de polifosfato e pirofosfato. Estes dados indicam que TbTOR-like1 parece estar envolvida no controle do crescimento celular e na biogênese de acidocalcissomos respondendo a variações osmóticas do meio. No segundo capítulo da tese estudamos proteínas quinases envolvidas no controle da síntese protéica através da fosforilação da subunidade &#61537; do fator de iniciação eucariótico 2 da tradução (eIF2α&#61481;. Estas quinases são ativadas por distintos tipos de estresse. T. brucei codifica para três potenciais proteínas quinases de eIF2α (TbeIF2K1, K2 e K3). Estudamos mais especificamente a K2. Mostramos que ela é uma glicoproteína transmembrânica localizada na região da bolsa flagelar em ambas as formas de T. brucei e nos compartimentos endossomais de Trypanosoma cruzi. Estes compartimentos endossomais são denominados de reservossomos e se formam apenas no estágio do parasita que vive no lúmen do tubo digestivo do inseto vetor. Este fato sugere que em ambos os parasitas esta proteína quinase possa estar funcionando como um sensor no transporte de nutrientes e proteínas. De maneira geral revelamos a existência de pelo menos dois mecanismos pelos quais os tripanossomas percebem e resistem às modificações ambientais durante seu ciclo de vida. / Protozoa of the genus Trypanosoma have a complex life cycle alternating between vertebrate and invertebrate hosts. The adaptation to different environmental conditions requires rapid changes in gene expression to fill up the morphological and metabolic requirements for survival. Very little is known about the mechanisms that control these changes and the signaling pathways involved. As in these organisms the control of gene expression occurs at post-transcriptional level, in this work we decided to investigate the function of protein kinases involved in the control of protein synthesis and growth of these parasites. In several eukaryotes TOR (target of rapamycin) protein kinases are involved in protein synthesis control and cell growth in response of the availability of nutrients or growth factors. By searching T. brucei genomic database we found four candidates for TOR (TbTOR1, TbTOR2, TbTOR-like1 and TbTOR-like 2). Two TOR complexes were previously described in T. brucei (TbTORC1 and TbTORC2). In the first chapter of this thesis we study: TbTOR-like 1 and compared it with TbTOR2. TbTOR-like 1 is not present in any of the TORC complexes and has a PDZ domain not found in any of other TORs of T brucei, or other eukaryotes. It is located cytosolic granules that migrate to the cell periphery after hyperosmotic stress. Depletion TbTOR-like 1 causes a progressive inhibition of cell growth, generating enlarged cells that accumulate in S/G2 phase of the cell cycle. These cells also show increased number of acidocalcisomes and augmented levels of polyphosphate and pyrophosphate. These data indicate that TbTOR-like seems to be involved in controlling cell growth and biogenesis of acidocalcisomes responding to osmotic changes in the medium. In the second chapter of the thesis we studied protein kinases involved in protein synthesis control through the phosphorylation of the &#61537; subunit of the eukaryotic translation initiation factor 2 (eIF2α).These kinases are activated by different types of stress. T. brucei encodes three potential eIF2α protein kinases (TbeIF2K1, K2 and K3). We studied more specifically the K2. We showed that it is a transmembrane glycoprotein located in the region of the flagellar pocket in both forms of T. brucei, and in the endosomal compartments of Trypanosoma cruzi. These endosomal compartments are known as reservosomes and they are formed only in the parasite’s stage that li ves in the digestive tract lumen of the insect vector. This fact suggests that in both parasites this protein kinase may be acting as a sensor in the transport of nutrients and proteins. In conclusion we revealed the existence of at least two mechanisms by which trypanosomes perceive and resist to environmental changes during their life cycle. / TEDE / BV UNIFESP: Teses e dissertações

Submitted by Éder Freyre (ederfreyre@icict.fiocruz.br) on 2012-01-26T18:26:50Z No. of bitstreams: 1 Tese_Fernanda Barbosa Nogueira final.pdf: 11450025 bytes, checksum: c179ee0162b50ea1a899a05b9d391bfb (MD5) / Made available in DSpace on 2012-01-26T18:26:50Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Tese_Fernanda Barbosa Nogueira final.pdf: 11450025 bytes, checksum: c179ee0162b50ea1a899a05b9d391bfb (MD5) / Este projeto foi realizado com financiamento da CAPES, CNPQ, FAPEMIG, PRONEX e PAPES 3/FIOCRUZ. / Fundação Oswaldo Cruz. Centro de Pesquisas René Rachou, Belo Horizonte, MG, Brasil. / O sistema de defesa antioxidante nos tripanosomatídeos é um potencial alvo para quimioterapia. Este sistema é baseado no tiol de baixa massa molecular “tripanotiona”, que mantêm o ambiente intracelular reduzido pela ação da tripanotiona redutase (TR). As vias que metabolizam o peróxido de hidrogênio em moléculas de água envolvem as enzimas triparedoxina peroxidase citosólica (cTcTXNPx) e mitocondrial (mTcTXNPx) e a ascorbato peroxidase (APX). No presente trabalho, os genes que codificam as enzimas antioxidantes cTcTXNPx, mTcTXNPx, APX e TR foram caracterizados em 18 populações do T. cruzi sensíveis e resistentes ao benzonidazol (BZ). Nossos resultados mostraram que os níveis de mRNA dos genes cTcTXNPx e mTcTXNPx foram duas vezes maior na população do T. cruzi com resistência induzida in vitro ao BZ (17LER), do que seu par sensível (17WTS). No entanto, estes genes não estão amplificados no genoma do parasito. Os genes cTcTXNPx e mTcTXNPx podem apresentam oito e duas cópias, respectivamente, dispersas ao longo do genoma do parasito. Análises de western blot, utilizando anticorpos policlonais anti-cTcTXNPx e anti-mTcTXNPx, mostraram que o nível de expressão destas proteínas nativas foi similar para todas as amostras, exceto na população 17LER que apresentou um aumento de duas vezes na expressão. Além disto, a proteína oxidada mTcTXNPx demonstrou uma expressão 5.5 vezes maior na população 17LER, comparada ao par sensível. Análises filogenéticas das proteínas do T. cruzi cTcTXNPx e mTcTXNPx com outros tripanosomatídeos mostraram que elas estão estreitamente relacionados com seus homólogos em T. brucei. A enzima APX do T. cruzi pode ser considerada um bom alvo para drogas, uma vez que ela não é encontrada em hospedeiros mamíferos. O nível de mRNA e número de cópias do gene TcAPX não apresentaram diferenças significativas entre as populações do T. cruzi sensíveis e resistentes ao BZ. O gene TcAPX pode apresentar duas cópias dispersas ao longo do genoma do parasito e está localizada em uma banda cromossômica em todas as cepas do parasito analisadas A proteína TcAPX apresentou maior similaridade com a APX de espécies de Leishmania, quando comparada com plantas. Observamos que o nível de expressão da proteína TcAPX foi duas vezes maior na população do T. cruzi com resistência selecionada in vivo ao BZ (BZR), do que seu par sensível (BZS). A tripanotiona redutase é a enzima chave do parasito que mantêm o ambiente intracelular reduzido. O nível de mRNA e o número de cópias do gene TR não apresentaram diferenças significativas nas amostras analisadas. Este gene apresenta uma única cópia no genoma do parasito e está mais relacionado com a TR de T. brucei, comparado com outros tripanosomatídeos. Baseado nos nossos resultados, sugerimos que a população do T. cruzi com resistência induzida in vitro ao BZ exibe um aumento no nível da proteína TXNPx juntamente com outras enzimas associadas com o sistema de defesa antioxidante, como a TcFeSOD-A previamente descrita (Nogueira et al., 2006), protegendo estes parasitos resistentes contra o estresse oxidativo. / Antioxidant defense in trypanosomatids have been indicated as a potential target for chemotherapy. This system is based on low molecular weight thiol trypanothione, which maintain the reduced intracellular environment by the action of trypanothione reductase (TR). The pathways that metabolize the hydrogen peroxide to water molecules surrounding the cytosolic (cTXNPx) and mitochondrial (mTXNPx) tryparedoxin peroxidase enzymes and ascorbate peroxidase (APX). In the present work, the genes that encode cTXNPx, mTXNPx, APX and TR antioxidants enzymes were characterized in 18 T. cruzi populations susceptible and resistant to benznidazole (BZ). Our results showed that the levels of cTcTXNPx and mTcTXNPx mRNA were two-fold higher in the T. cruzi population with in vitro-induced resistance to BZ (17LER) than its sensitive pair (17WTS). However, these genes are not amplified in the parasite genome. cTcTXNPx and mTcTXNPx genes can have eight and two copies, respectively, dispersed throughout of the parasite genome. Western blot analysis using anti-cTcTXNPx and anti-mTcTXNPx polyclonal antibodies showed that the expression level of native proteins was similar for all samples, except the 17LER population that showed the expression two-fold more. In addition, the oxidized mTcTXNPx protein demonstrated 5.5- fold greater expression in the 17LER population than 17WTS. Phylogenetic analysis of cTcTXNPx and mTcTXNPx proteins from T. cruzi and other trypanosomatids showed that they are closely related to their homolog in T. brucei. The T. cruzi APX enzyme is considered a good target for drug because it is not found in mammalian hosts. The mRNA level and copy number of the TcAPX gene showed no significant difference between T. cruzi populations susceptible and resistant to BZ. The TcAPX gene presents two copies dispersed throughout of the parasite genome and it is located in one chromosomal band in all T. cruzi strains analyzed. TcAPX protein showed greater similarity to APX from Leishmania than plants. The expression level of TcAPX protein was two-fold more in T. cruzi population with in vivoselected resistance to BZ (BZR), than its susceptible counterpart BZS. Trypanothione reductase is the key enzyme of the parasite to maintain a reduced intracellular environment. The mRNA level and copy number of the TR gene showed no significant difference in the samples analyzed. This gene presents a single copy in the parasite genome and it is more related to TR from T. brucei than other trypanosomatids. Based on our results, we suggest that the T. cruzi population with in vitro resistance to BZ exhibits an increase in TcTXNPx protein levels together with other enzymes associated with peroxide metabolism, such as the previously described TcFESOD (Nogueira et al., 2006), protecting these resistant parasites against oxidative stress.

Submitted by Anderson Silva (avargas@icict.fiocruz.br) on 2012-03-23T18:08:27Z No. of bitstreams: 1 lauren_h_jaeger_ioc_mt_0003_2010.pdf: 980575 bytes, checksum: 58e8d10d1a1194b26a55ff028cdccc2e (MD5) / Made available in DSpace on 2012-03-23T18:08:27Z (GMT). No. of bitstreams: 1 lauren_h_jaeger_ioc_mt_0003_2010.pdf: 980575 bytes, checksum: 58e8d10d1a1194b26a55ff028cdccc2e (MD5) Previous issue date: 2010 / Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Oswaldo Cruz, Rio de Janeiro, RJ, Brasil / Trypanosoma cruzi (T. cruzi) é o agente causador da doença de Chagas, que afeta entre 8 e 9 milhões de pessoas em todo mundo. Este protozoário é responsável por uma variedade de manifestações clínicas em humanos, possui uma ampla gama de hospedeiros e apresenta grande diversidade genética e biológica. As pequenas regiões codificantes (uORFs) presentes na região 5’não traduzida (5’UTR) de mRNAs maduros são conhecidas por afetar a eficiência da tradução de muitos genes eucariotos. Pouco é conhecido sobre a existência e conservação de uORFs em genes de Tripanossomatídeos. Este trabalho se propôs avaliar o grau de conservação das uORFs e seu potencial como marcador molecular das populações de T. cruzi, através da análise de sete genes contendo uORFs previamente selecionados. Oligonucleotídeos iniciadores foram desenhados e fragmentos das 5’UTRs contendo uORFs foram amplificados, através de PCR, de cepas representativas de cada um dos três grupos populacionais do parasito, TcI, TcII e ZIII. Após clonagem e sequenciamento, alto grau de conservação das uORFs foi observado de um ponto de vista populacional e a ruptura de uma uORF foi observada em apenas um gene. Isto é um forte indicativo de que em T. cruzi essas uORFs são funcionalmente ativas, pois do contrário teriam sido extintas das 5’UTRs durante o processo evolutivo sofrido pelos grupos populacionais de T. cruzi. A observação de mutações grupo-específicas nas sequências nucleotídicas das 5’UTRs de alguns genes, motivou a realização de testes para a utilização desses fragmentos como possíveis marcadores moleculares para as populações do parasito. A obtenção dos fragmentos dos genes codificantes de ATPase e Ferredoxina foi realizada em mais de 15 cepas e isolados. Verificou-se a existência de mutações grupo-específicas na 5’UTR do gene ATPase, que corroboram com a classificação filogenética proposta deste parasito. Na 5’UTR do gene Ferredoxina, notou-se a presença de uma sequência repetitiva simples, composta por dinucleotídeos CA (citosina e adenina) seguidos de mononucleotídeos A. As variações desta repetição puderam ser utilizadas para agrupar todos os isolados/cepas de T. cruzi do estudo em nove genótipos distintos, os quais são relativamente independentes da classificação atualmente proposta de três grandes grupos populacionais. O uso desta pequena repetição na 5’UTR do gene Ferredoxina permite uma nova forma de classificar os isolados e cepas de T. cruzi. / Trypanosoma cruzi is the causative agent of Chagas disease in humans, and affects about nine million of people around the world. It induces a variety of clinical presentations in patients, have a wide range of vertebrate hosts and exhibits great diversity of genetic and biological characteristics. Upstream Open Reading Frames (uORFs) are small open reading frames located in the 5’ UTR of a mature mRNA. They have been shown to affect the translation efficiency of many eukaryotic genes. Scarce information is available about the existence and conservation of uORFs in Trypanosomatids genes. This study aims to evaluate both the degree of sequence conservation in uORFs and its potential as molecular marker of populations of T. cruzi. To this end, upon a PCR amplification and cloning of 5'UTR fragments, sequence analysis of seven genes that presents uORFs were carried out in four strains that are typical representative of three main population groups in T. cruzi. A remarkable degree of conservation of uORFs was observed in all isolates. Out of several mutational events observed in these uORFs, a disruption of a uORF was observed in only one gene. This indicates that in T. cruzi these uORFs are functionally active, otherwise it would have changed during the evolutionary process. The observation of group-specific mutations in the 5'UTRs of some genes suggested that they could be used in an PCR amplification assay as molecular markers for T. cruzi populations. The fragments of genes ATPase and Ferredoxin were amplified from 15 strains and isolates. After sequencing, the group-specific mutations observed in the 5'UTR of the gene ATPase corroborate the current classification of T. cruzi populations in three main groups: TcI, TcII and ZIII. In the 5'UTR of the Ferredoxin gene, the sequence alignment revealed the presence of a small repetitive sequence composed of dinucleotides CA and mononucleotides Adenine. The variations in length and composition of this simple repetitive sequence allowed the clustering of all 15 isolates into nine distinct genotypes, which were not correlated to main population groups. Thus, a new approach to strain typing in T. cruzi can be envisaged by using this SSR (simple sequence repeat).

Made available in DSpace on 2012-05-07T14:43:53Z (GMT). No. of bitstreams: 2 license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) 000001.pdf: 706994 bytes, checksum: 3b1be365e85a6cde721c1c20730d3ac6 (MD5) Previous issue date: 2006 / (...) Sabe-se que a resposta de isotipos específicos tem sido associada às manifestações clínicas da doença de Chagas. Assim, nos propomos a pesquisar as subclasses de IgG no soro de indivíduos chagásicos frente a dois antígenos específicos do Trypanosoma cruzi, visando a obtenção de um perfil isotípico que seja capaz de discriminar as formas clínicas cardíaca (CARD), mista (MIS) e indeterminada (IND). Para isso, coletamos sangue para obtenção de soro de 60 pacientes chagásicos (CARD= 33, MIS= 7 e IND= 20), (...). Todos os pacientes foram avaliados clinicamente para caracterização das formas clínicas e realizaram exames confirmatórios para infecção pelo T. cruzi. Além disso, também coletamos sangue de 40 indivíduos sadios (indivíduos não-chagásicos= 20 e controles negativos para o cut-off= 20) que apresentaram sorologia negativa para infecção pelo T. cruzi. (...) Os antígenos recombinantes (Ags-Recs) Cytoplasmic Repetitive Antigen (CRA) e Flagellar Repetitive Antigen (FRA) foram analisados através de SDS-PAGE, seguido por colorações pela prata e pelo ácido periódico de Schiff, ficando comprovada a integridade dos Ags-Recs e ausência de contaminações bacterianas. As concentrações ideais dos Ags-Recs e dos anti-isotipos foram estabelecidas após titulação dos mesmos. Para detecção dos isotipos utilizamos a metodologia do ELISA indireto, onde as placas de ELISA foram sensibilizadas com os Ags-Recs CRA ou FRA. As amostras de soro foram depositadas em duplicata nos poços. A ligação dos anticorpos específicos foi detectada pela incubação dos anti-isotipos (anti-IgG1, anti-IgG2, anti-IgG3 e anti-IgG4) conjugados à biotina, seguida da incubação de estreptavidina conjugada à peroxidase. A quantificação da reação foi determinada através do leitor de ELISA a 490 nm. Os resultados foram analisados através de um índice de reatividade, onde as densidades ópticas das amostras foram divididas pelo cut-off (média dos controles negativos adicionada de dois desvios-padrão) de suas respectivas placas. Verificamos que a resposta imune humoral gerada pelos pacientes frente aos Ags-Recs foi bastante variada, com produção de quase todas as subclasses de IgG. Entretanto, apenas o isotipo IgG2 específico contra o Ag-Rec FRA foi capaz de diferenciar pacientes chagásicos portadores da forma CARD daqueles portadores da forma IND, podendo, após um estudo prospectivo, servir como marcador de evolução clínica para a forma cardíaca ....

Submitted by Nuzia Santos (nuzia@cpqrr.fiocruz.br) on 2012-08-21T18:46:11Z No. of bitstreams: 1 FERNANDO Tese FINAL!!.pdf: 9425666 bytes, checksum: 1a96c7aab4a723a257e2c184189c0b67 (MD5) / Made available in DSpace on 2012-08-21T18:46:11Z (GMT). No. of bitstreams: 1 FERNANDO Tese FINAL!!.pdf: 9425666 bytes, checksum: 1a96c7aab4a723a257e2c184189c0b67 (MD5) / Projeto Poor Land Use, Poor Health (PLUPH) International Development Research Centre (IDRC) Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) Fundação Oswaldo Cruz (FIOCRUZ). Centro de Pesquisa René Rachou (CPqRR) Centre Nationale de la Recherche Cientifique (CNRS) / O número crescente de casos agudos da doença de Chagas no estado do Pará, notificados nas últimas duas décadas, tem sido associados, em parte, a ingestão de suco de frutos de palmeiras locais, principalmente açaí e bacaba. O objetivo do presente trabalho foi avaliar os aspectos ecológicos da Tripanossomíase Americana em comunidades do médio Tapajós, Pará, Brasil, e riscos de transmissão do Trypanosoma cruzi às populações humanas da região. Para isto, foram dissecadas 136 palmeiras, sendo 60 no final do período chuvoso e 76 no final do período de seca. Destas, 73 (53,7%) estavam infestadas por triatomíneos e foram encontradas três espécies, a saber: Rhodnius robustus, Rhodnius pictipes e Panstrongylus lignarius. Foram coletados 743 triatomíneos, sendo predominante a presença de R. robustus (n=739). A identificação da infecção natural dos insetos por tripanosomatídeos revelou que 125 triatomíneos estavam infectados pelo T. cruzi, 69 por T. rangeli e 14 apresentaram ambos os parasitas, indicando a presença de infecção mista no mesmo vetor. Foi realizada a tipagem molecular de T. cruzi de acordo com a nova nomenclatura e os resultados demonstraram predominância do grupo TCI (n=29). Além disso, foi constatada a ocorrência de TCII, a presença de TCI e TCII no mesmo triatomíneo e 12 isolados de TCI apresentaram uma variante, sugerindo a existência de um subgrupo dentro de TCI. A análise das fontes alimentares revelou que R. robustus, espécie predominante de triatomíneo coletada nas palmeiras investigadas, alimentou-se na sua grande maioria em mamíferos silvestres. Foram também identificados “sangue” de outras fontes alimentares, como aves e répteis no conteúdo digestivo dos espécies investigados. As análises cartográficas de Kernel e do Interpolador de Médias demonstraram que a comunidade São Tomé apresenta maiores aglomerados (hotspots) tanto em infestação das palmeiras, quanto na densidade triatomínica e número de insetos infectados. Desta forma, os resultados sugerem que São Tomé é a comunidade com maior risco de infecção à população e demonstram a existência de um ciclo silvestre intenso na região que demanda vigilância para prevenção da transmissão. / The increasing number of acute cases of Chagas Disease in the state of Pará, notified in the last two decades, were in part associated with the ingestion of juice from fruits of local palm trees, mainly açaí and babaca. The objective of this study was to evaluate the ecological aspects of American Trypanosomiasis in communities from the middle of Tapajós, Pará, Brazil, as well as the risks of transmission of Trypanasoma cruzi to the human populations of the region. In order to achieve this, 136 palm trees were dissected; 60 of them during the rainy season and 76 during the end of the dry season. Seventy-three (53.7%) of these were infested with three different species of triatomines: Rhodnius robustus, Rhodnius pictipes and Panstrongylus lignarius. In total, 743 triatomines were collected with R. robustus (n=739) as the most abundant. Through dissection of the collected insects, the presence of a natural infection by T. cruzi (n=125) and T. rangeli (n=69) was shown, while 14 insects had a mixed infection of both parasites. The molecular typing of T. cruzi according to the new nomenclature showed a predominance of the group TCI (n=29). The presence of TCII was also observed, as well as the presence of mixed infections of TCI and TCII, but most importantly, 12 isolates of TCI presented a variation, suggesting the presence of a subgroup within TCI. Analysis of the food sources revealed that R. robustus, the predominant triatomine species collected from the investigated palm trees, fed mainly from wild mammals. “Blood” from other food sources, like birds and reptiles, were also found in the digestive content of the species collected. The analysis of Kernel´s cartography and of the Interpolatation of Average showed that the community of São Tomé presents the largest hotspots with respect to the infestation of palm trees, the density of triatomines and the number of insects with natural infections. Therefore, the population of the community of São Tomé is considered to be the one with the greatest risk of infection and our results show the existence of an intense sylvatic cycle that demands surveillance in order to prevent transmission in the region.