Made available in DSpace on 2016-03-10T13:18:18Z (GMT). No. of bitstreams: 2 simone_kikuchi_ioc_dout_2014.pdf: 2479959 bytes, checksum: 2a905b9a047aa9c1b82436e5810d80f4 (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2016-02-23 / Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Oswaldo Cruz. Rio de Janeiro, RJ, Brasil / A doença de Chagas é uma doença tropical negligenciada que atinge principalmente a América Latina. Trypanosoma cruzi, agente etiológico desta enfermidade, é largamente distribuído no continente americano e apresenta uma grande variabilidade fenotípica e genotípica em suas cepas. Os fatores que determinam as diferentes formas clínicas da doença, assim como as razões pela qual uma cepa apresenta tropismo diferenciado não estão claros. De forma semelhante, a correlação entre a variabilidade genética do parasito, sua relação com o desenvolvimento clínico da doença, assim como sua distribuição geográfica também não está bem estabelecida. Estas observações associadas com a variabilidade na resposta ao tratamento conduzem ao fato de que este cenário complexo, possivelmente, será mais bem entendido quando houver uma completa caracterização do parasito e o entendimento da relação parasito-hospedeiro na doença de Chagas. Desta forma, com o objetivo de estudar esta diversidade, caracterizações de populações deste parasito têm sido realizadas através de técnicas biológicas, bioquímicas e moleculares tentando associar determinado grupo de parasito a um determinado perfil epidemiológico. Neste estudo, foram utilizados parâmetros moleculares e bioquímicos para caracterização de amostras de T.cruzi isolados silvestres de Triatoma vitticeps do município de Santa Maria Madalena (Rio de Janeiro) e cepas da Amazônia (Manaus e Barcelos). Estudos baseados no perfil eletroforético de isoenzimas, propuseram que o T.cruzi fosse classificado em 3 zimodemas (ZI, ZII e ZIII). Posteriormente, através de diversas técnicas de biologia molecular,classificou-se as cepas em duas grandes linhagens filogenéticas: T.cruzi I (que se correlaciona ao ZI) e T.cruzi II (que se correlaciona ao ZII) Dados ecológicos e moleculares sugerem que as cepas pertencentes ao ZIII estejam mais relacionadas a T. cruzi I do que T. cruzi II, mas na realidade a posição de ZIII permanece controversa. A diversidade encontrada entre os isolados, bem como entre estes e cepas já estabelecidas nos leva a indagações sobre as moléculas de superfície destas populações e de que forma estas poderiam influenciar na interação parasito-hospedeiro. Este trabalho tem como objetivo principal definir o mapa de proteínas solúveis das cepas e isolados pertencentes ao ZIII ressaltando as diferenças existentes. Desta forma, buscamos analisar as os mapas proteícos, perfil de proteases e estudar a expressão de glicoproteínas de superfície (Gp 82, Gp 35/50, Gp 90) destes isolados de T. cruzi (ZIII) (epimastigota e tripomastigota) obtidos de triatomíneos silvestres. Para isto foram utilizadas as técnicas de eletroforese bidimensional e espectrometria de massa. Foi feita a padronização de protocolos para a obtenção de extratos protéicos das formas epimastigotas e da separação das proteínas por eletroforese bidimensional. Os ensaios realizados na faixa de pH 3-10, revelaram uma grande diversidade de spots. Entretanto, quando a faixa de pH foi diminuida (4-7) houve um aumento no número de spots revelados. Uma diversidade considerável na expressão de proteína bem como na intensidade de vários spots também foi observada entre as cepas e isolados estudadas. Experimentos de western blot e citometria de fluxo mostraram uma expressão diferencial das gps nos diferentes isolados. Esses resultados contribuem para o conhecimento e registro do perfil de alguns isolados silvestres de T. cruzi em regiões ainda não acometidas pela doença. Nossos resultados apontaram uma heterogeneidade destes isolados de T. cruzi relacionados à biologia e expressão diferencial de enzimas de superfície / Chagas disease is a neglected tropical disease which affects mainly Latin America. Trypanosoma cruzi , the etiologic agent of Chagas disease, is widely distributed in the American continent. The factors that determine the different clinical forms of the disease, as well as the reasons why one strain shows differential tropism are not clear. Similarly, the correlation between the genetic variability of the parasite, its relationship with the clinical development of the disease, as well as their geographical distribution is also not well established. Genetical studies are important to clarify the intra - specific heterogeneity of the parasite, the study of the biological behavior and the host - parasite relationships could clarify the importance of different strains, in the determination of clinico - pathological manifestations of Chagas' disease. These observations associated with the variability in response to treatment leads to the fact that this complex scenario possibly be better understood when there is a complete characterization of the parasite and the understanding of host - parasite relationship in Chagas disease. Thus, aiming t o study aim of studying this diversity characterizations of populations of this parasite have been done by biological, biochemical and molecular techniques trying to associate certain group of a given parasite epidemiology. In this study, molecular and bio chemical parameters for the characterization of T. cruzi isolated from Triatoma vitticeps municipality of Santa Maria Madalena (Rio de Janeiro) and strains of the Amazon (Manaus and Barcelos) were used. Studies based on enzyme electrophoresis profile clust ered T.cruzi isolates into 3 zymodemes (ZI, ZII and ZIII). Molecular techniques showed a dimorphism among the isolates, grouping them into T.cruzi I (related to ZI) and T.cruzi II (related to ZII). Ecological and molecular data suggest that ZIII strains ar e more related to T. cruzi I than T. cruzi II , but their exact phylogeny is an unresolved issue. This work aims to define the map of soluble proteins of strains and isolates belonging to ZIII highlighting the differences. The diversity found among isolates , as well as between them and established strains leads to questions about the surface molecules of these populations and how these could influence the host - parasite interaction. Thus, we seek to analyze the protein maps, profile of proteases and study the expression of surface glycoproteins (Gp 82, Gp 35/50, Gp 90) of these isolates of T. cruzi (ZIII) (epimastigote and trypomastigote) obtained from silvatic triatomine s . To this end the techniques of two - dimensional electrophoresis and mass spectrometry wer e used. The present work describes the standardization of a protocol in order to obtain reproducible extraction and separation of soluble proteins using two dimensional gel electrophoresis from different ZIII strains. The experiments carried out in pH 3 - 10 , revealed a great diversity of spots . Further separation using a narrow pH range (4 - 7) showed an increase in number of spots. A considerable diversity in protein expression as well as the intensity of various spots was also observed between the strains a nd isolates studied. Experiments western blot and flow cytometry showed a differential expression of the different GPS isolated. These results contribute to the knowledge and record of some wild isolates of T. cruzi in areas not yet affected by the disease profile. Our results showed a heterogeneity of isolates of T. cruzi biology and related differential expression of enzymes surface.

Made available in DSpace on 2016-04-12T12:39:35Z (GMT). No. of bitstreams: 2 vitor_vidal_ioc_dout_2015.pdf: 6590315 bytes, checksum: d6d795223559de178805e770f1f778fc (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2015 / Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Oswaldo Cruz. Rio de Janeiro, RJ, Brasil / As calpaínas são cisteíno-peptidases intracelulares dependentes de cálcio classicamente citosólicas envolvidas em diversas funções moduladores da célula, como transdução de sinais, divisão celular, apoptose e diferenciação. Embora melhor caracterizadas em mamíferos, as calpaínas já foram descritas em insetos, nematódeos, plantas, fungos, protozoários e bactérias. No Trypanosoma cruzi, como nos demais tripanossomatídeos, já foi descrita a presença de uma ampla e diversa família de calpaínas em seu genoma, mas pouco se sabe a respeito das suas funções específicas. Portanto, o presente trabalho teve como objetivo buscar as sequências de calpaínas do T. cruzi em seu genoma no intuito de classificá-las, assim como avaliar a expressão gênica das sequências de maior similaridade com as calpaínas de mamíferos. Além disso, um anticorpo gerado contra uma sequência peptídica conservada entre as calpaínas selecionadas foi utilizado em ensaios de identificação, expressão e localização celular. Nesse contexto, as análises in silico identificaram ao todo 55 sequências relacionadas às calpaínas no genoma do T. cruzi. Em seguida, através de alinhamentos múltiplos e análise de domínios conservados, foi possível classificar as calpaínas em quatro grupos distintos de acordo com a presença de domínios conservados característicos desta família multigênica. Dos quatro grupos identificados, foi selecionado para aprofundamento do estudo aquele que possuía o maior número de domínios conservados e continha o domínio que alberga o sítio catalítico das calpaínas (conservado ou não) A análise de expressão gênica de um total de dezesseis genes selecionados por qPCR revelou a presença de seis genes com expressão aumentada nas formas clinicamente relevantes (amastigotas e tripomastigotas) em relação as formas epimastigotas, e cinco genes nesta última forma. Em paralelo, o anticorpo anti-calpaínas se mostrou reativo em ensaios de Western Blotting, citometria de fluxo e microscopia de eletrônica de transmissão. Os ensaios de Western Blotting revelaram uma calpaína específica em amastigotas e outra em tripomastigotas, além de outras sete de massas moleculares variadas presentes nas três formas do parasito. Os resultados de citometria de fluxo indicam maior marcação intracelular do anticorpo nas formas amastigotas e tripomastigotas em relação aos epimastigotas. Por fim, as análises ultraestruturais revelaram a presença das calpaínas em todo citoplasma, nas membranas de vesículas, na membrana plasmática, e no flagelo das diferentes formas do parasito. O estudo comparativo da expressão das calpaínas nas formas evolutivas do T. cruzi, assim como a determinação de sua localização celular, podem ajudar a determinar as funções gerais desta família multigênica no parasito / Calpains comprise a family of calcium dependent cy steine peptidases commonly present in cytoplasm implicated in a broad range of cellular modular functions such as signal transduction, cellular division, apoptosis and differentiation processes. Although well - characterized in mammals, these peptidases have also been described in insects, nematodes, plants, fungi, protozoa and bacteria . In Trypanosoma cruzi , as in other trypanosomatids, the presence of an extensive and diverse family of calpain s had already been described in its genome . However, the specific functions of these molecules are still unclear. In this context, the present study aimed to search calpain sequences in T. cruzi genome to classify the genes and to evaluate mRNA expression levels of the most conserved calpain sequences . In addition, an a ntibody against T. cruzi calpain was produced from a conserved sequence of trypanosomatid calpains to evaluate these proteases levels, also determining their ultrastructural localization. At first, in silico analysis revealed a total of 55 calpain sequence s in T. cruzi genome . Through multiple alignments and phylogenetic analysis of conserved domains in the se sequences, the calpains were sorted into four distinct groups characterized by the presence of classical domains of this multigenic family. After this in silico analysis, we decided to scrutiny the group that has the highest number of conserved domains and presents domain II, which contains the catalytic active site (either altered or conserved), in order to analyze mRNA and protein e xpression patterns in the different T. cruzi forms. The comparison of calpain mRNA abundance of sixteen genes by qPCR in the three distinct parasite forms revealed six genes with increased expression in the clinical relevant forms (amastigotes and trypomas tigotes) and five in the invertebrate form. S imultaneously , the anti - tritryp - calpain antibody was capable of recognizing reactive molecules in Western Blotting, flow citometry and transmission electron microscopy analysis. Altogether, Western Blotting anal ysis revealed seven calpains with different molecular masses present in the three forms of the parasite, while one specific calpain was detected either in amastigotes or tripomastigotes. Also, flow citometry results showed a higher intracellular expression in amastigotes and trypomastigotes in comparison with epimastigotes. Finally, ultrastructural analysis revealed the presence of theses proteases in the cytoplasm, vesicular membranes, plasma membranes and flagellum of the three life cycle forms. The compa rative study of calpain gene expression in the distinct T. cruzi forms, as well as the cellular localization of these molecules could be useful approaches to find out the calpain main functions in this parasite.

Made available in DSpace on 2016-04-15T13:05:47Z (GMT). No. of bitstreams: 2 franklyn_acosta_ioc_dout_2015.pdf: 13033375 bytes, checksum: 9f1b37e297e771e874ab4f5d3f7aed83 (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2015 / Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Oswaldo Cruz. Rio de Janeiro, RJ, Brasil / A transcrição dirigida pela RNA polimerase II nos tripanossomatídeos produz um RNA precursor que abriga dezenas a centenas de genes que são processados para formar unidades monocistrônicas. Os processos de trans-splicing e poliadenilação vinculados ao processamento do RNA precursor são os responsáveis pela formação dos extremos do mRNA e portanto representam pontos importantes de controle pós-transcricional e de geração de diversidade funcional em termos de regiões não traduzidas (UTRs). O genoma de T. cruzi abriga genes tanto multicópia como de poucas cópias, os quais são importantes para a interação com seus hospedeiros e para realizar processos biológicos fundamentais para a sua sobrevivência. Isto levanta questões relevantes em relação à transcrição e processamento de genes duplicados ou multicópia no T. cruzi. Para acrescentar o conhecimento sobre o processamento de genes de poucas cópias nós estudamos este processo em duas cepas de Trypanosoma cruzi: Y e clone CL-Brener Na cepa Y as formas epimastigota, amastigota e tripomastigota sanguínea da cepa Y foram estudadas usando uma abordagem baseada no pirosequencimento e em CL-Brener usamos RT-PCR, RACE, clonagem e sequenciamento pelo método de Sanger das UTRs para as formas epimastigotas e tripomastigotas metacíclicos. Os resultados indicam que a transcrição e processamento dos transcritos do locus de calmodulina nos estágios estudados de ambas cepas produz formas alternativas predominantes com 5'UTRs longas e 3'UTR curtas. Encontramos também, um marcado desequilíbrio alélico na frequência dos transcritos das cópias de calmodulina nas diferentes formas estudadas de CL-Brener. Finalmente, existe uma aparente frequência assimétrica das isoformas de calmodulina dentro de cada cópia e entre as cópias em todos os estágios de ambas cepas estudadas indicando que possivelmente o controle da abundância dos transcritos exerce um papel importante na regulação da expressão deste gene / The RNA pol II transcription in tripanosomatids produces a RNA precursor harboring ten to hundreds of genes that must be processed to produce monocistronic mRNAs. The trans-splicing and polyadenylation processing of the RNA precursor is responsibles for the mRNA ends formation, important points of post-transcriptional regulation and functional diversity around the UTRs. The T. cruzi genome harbor both multicopy and few copies genes that are important for the interaction with the parasite host and to carry out essential biological process for the T. cruzi survival. This fact rases relevant aspects about the transcription and processing of genes in T. cruzi. To increase the knowledge on the mRNA processing of genes with few copies we studied this process in two strains: Y and CL-Brener clone. We analyzed the final mRNA from the epimastigote, amastigote and blood trypomastigote of Y strain using amplicon pyrosequencing and for the CL-brener epimastigote and metacyclic stage we devised an RT-PCR and RACE to target calmodulin UTRs combined with amplicon cloning and Sanger sequencing. The results point out that the mRNA processing of the transcripts of the calmodulin locus in all T. cruzi stages from studied strains produced mostly calmodulin mRNA bearing long 5'UTR and short 3'UTR. Also, we found a remarkable allelic imbalance in the frequency of the transcripts from calmodulin copies in all stages of CL-Brener. Finally, there was an inter-copy and intra-copy asymmetric frequency of calmodulin mRNA in all stages of the T. cruzi strain studied here indicating that the control of transcript abundance may has an important role in the calmodulin gene expression regulation

Made available in DSpace on 2016-05-11T12:56:38Z (GMT). No. of bitstreams: 2 leonardo_ruivo_ioc_mest_2016.pdf: 2337878 bytes, checksum: 69b7ee821ee7eed53dca00b82150fc69 (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2016 / Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Oswaldo Cruz. Rio de Janeiro, RJ, Brasil / Alterações no perfil de glicosilação de proteínas, células e tecidos têm sido utilizadas como marcadores biológicos para processos fisiológicos e patológicos. Glicoconjugados contendo o ácido siálico (Neu5Ac) estão envolvidas em interações celulares e parasito-hospedeiro, tráfego de linfócitos e regulação do sistema imune. O Trypanosoma cruzi, agente etiológico da doença de Chagas (DC), expressa em sua superfície e libera no plasma do hospedeiro, uma enzima restrita ao gênero Trypanosoma, a trans-sialidase (TS). Esta é capaz de transferir Neu5Ac de moléculas doadoras e realocá-las em moléculas na superfície do parasito ou sialilar glicoproteínas de células do hospedeiro. A molécula CD43 é um importante aceptor de Neu5Ac em células T e um provável sítio de ação da TS. Na infecção experimental pelo T. cruzi, as células T CD8+ apresentam, majoritariamente, perfis segregados (i) perforina+ (Pfn+), com ação citotóxica, ou (ii) interferon-gama+ (IFN\03B3+), com perfil inflamatório. Estas células estão diferencialmente compartimentalizadas e atuam de forma antagônica, enquanto as Pfn+ se acumulam na inflamação cardíaca e contribuem para a injúria tecidual, as IFN\03B3+ estão majoritariamente na periferia (sangue e baço) e atuam de forma benéfica. Neste trabalho, propomos que na infecção pelo T. cruzi há alterações de glicofenótipos em proteínas séricas e subpopulações de linfócitos T CD8+ funcionalmente segregadas. Camundongos C57BL/6 foram infectados pela cepa Colombiana do T. cruzi e analisados clinicamente. O glicofenótipo de proteínas séricas foi analisado por espectrometria de massas (MALDI-TOF) e o glicofenótipo de tecido cardíaco e de células do baço foi analisado usando lectinas por histoquímica e citometria de fluxo, respectivamente Não detectamos modificação no perfil glicosídico em proteínas séricas em animais infectados. Observamos, no tecido cardíaco, reduzida marcação para a lectina Peanut agglutinin (PNA), aumento para Sambucus nigra (SNA) e não alteração para Maackia amurensis (MAL) em células musculares e inflamatórias. Notamos nas fases aguda (42 dpi) e crônica (120 dpi) aumento na frequência de células PNA+ nas células T CD8+CD43+ e CD4+CD43+, redução no percentual de células SNA+ nas células T CD8+ e CD4+ e diminuição na proporção de células MAL+ nas células T CD4+ e CD8+CD4+. Células T CD8+ totais ou CD8+PNA+ apresentaram perfis semelhantes de ativação (CD44+CD62L-), migração (LFA-1+CCR5+ ou LFA-1+CCR1+) e funcionalidade (Pfn+, Pfn+IFN\03B3+ ou IFN\03B3+). Em 120 dpi, detectou-se enriquecimento de células CD8+PNA+IFN\03B3+ no baço. Assim, durante a DC experimental, células T CD8+PNA+ apresentam-se ativadas e com potencial de migrar e exercer atividade inflamatória (IFN\03B3+), contudo estas não foram detectadas em tecido cardíaco. Resta-nos esclarecer se estas células não migram para este tecido, acumulando-se na periferia, ou se ao entrarem no tecido cardíaco têm seu glicofenótipo alterado ou morrem de modo seletivo. Embora nossos achados não permitam a identificação de biomarcadores de natureza glicosídica de progressão e/ou gravidade da DC, abrem perspectivas para explorar outros modelos experimentais de infecção e para estudos sobre a compartimentalização de células fenotipicamente distintas e funcionalmente relacionadas à proteção contra a injúria cardíaca na infecção pelo T. cruzi / Changes in glycosylation profile of proteins, cells and tissues have been used as biological markers of physiological and pathological processes. Glicoconjugates containing sialic acid (Neu5Ac) are involved in cell and host-parasite interactions, lymphocyte traffic and regulation of the immune system. Trypanosoma cruzi, the causative agent of Chagas disease (CD), expresses on the surface and releases in the host plasma, a restricted enzyme to the genus Trypanosoma, the trans-sialidase (TS). This enzyme transfers Neu5Ac from donor molecules and relocates them on parasite surface molecules or sialylates glycoproteins of the host cells. The CD43 molecule is a major acceptor of Neu5Ac on T cells and a target site for TS. In experimental T. cruzi infection, CD8+ T cells have, mostly, segregated profiles (i) perforin+ (Pfn+) with cytotoxic action, or (ii) interferon-gamma+ (IFN\03B3+), with inflammatory profile. These cells are differentially compartmentalized and play antagonistic roles, while the Pfn+ cells accumulate in cardiac inflammation and contribute to tissue injury, the IFN\03B3+ are, mostly, at the periphery (blood and spleen) and play a beneficial role. In the present study, we propose that in T. cruzi infection there are glycophenotype changes in serum proteins and subpopulations of functionally segregated CD8+ T lymphocytes. C57BL/6 mice were infected with the Colombian strain of T. cruzi and analyzed for clinical changes. The glycophenotype of serum proteins was analyzed by mass spectrometry (MALDI-TOF) and glycophenotypes of the cardiac tissue and splenic cells were analyzed using a lectin-based immunohistochemistry and flow cytometry, respectively In infected mice, we did not detect changes in glycoside profile of serum proteins. In the cardiac tissue, we observed reduced staining for the lectin Peanut agglutinin (PNA), increased for Sambucus nigra (SNA) and no alterations for Maackia amurensis (MAL) in muscle and inflammatory cells. In the acute (42 dpi) and chronic (120 dpi) phases, we noticed increased frequency of PNA+ cells among CD8+CD43+ and CD4+CD43+ T cells, reduced percentage of SNA+ cells among CD8+ and CD4+ T cells and decreased proportion of MAL+ cells among CD4+ and CD8+CD4+ T cells. Total and PNA+ CD8+ T cells showed similar profiles of activation (CD44+CD62L-), migration (LFA-1+CCR5+ cells or LFA-1+CCR1+) and functionality (Pfn+, Pfn+IFN\03B3+ or IFN\03B3+). At 120 dpi, there is an enrichment in IFN\03B3+ cells among splenic CD8+PNA+. Thus, in experimental CD PNA+ CD8+T cells are activated and potentially able to migrate towards heart tissue and show inflammatory profile (IFN\03B3+); however, PNA+ cells were not detected in this tissue. It remains to be clarified whether these cells do not migrate to this tissue, accumulating in peripheral tissues, or whether they enter the cardiac tissue but have their glycophenotype modified or selectively dye. Although, our finds do not allow identifying glycosidic biomarkers of progression and/or severity of CD, they open new pathways to be explored using other experimental models of infection and studying the compartmentalizationof phenotypically and functionally distinct cells associated with detrimental or protective role in heart injury in T. cruzi infection

Made available in DSpace on 2016-07-13T19:09:02Z (GMT). No. of bitstreams: 2 myllena_melo_ioc_dout_2015.pdf: 11571962 bytes, checksum: c96336caf2f321525cb5b9c9f73f9f0e (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2015 / Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Oswaldo Cruz. Rio de Janeiro, RJ, Brasil / Ensaios de PCR para o diagnóstico e monitoramento da carga parasitária em pacientes acometidos pela doença de Chagas são realizados a partir de DNA recuperado de sangue periférico. Uma perspectiva seria a possibilidade do uso de soro para a detecção e quantificação de DNA de T. cruzi, aproveitando amostras coletadas para triagem sorológica em laboratórios de referência e bancos de sangue. Outra limitação é que o diagnóstico molecular com os alvos mais comumente utilizados (kDNA, DNA Satélite) não é capaz de identificar as linhagens do parasito. Tem sido relatada uma baixa sensibilidade para alguns marcadores de genotipagem de T. cruzi quando aplicados diretamente em sangue de pacientes crônicos, uma vez que são cópias únicas ou distribuídos em baixa frequência no genoma do parasito. Estudos baseados em famílias multigênicas, como as proteínas de superfície (trans-sialidases), sugerem que estas sejam capazes de reunir cepas/isolados de T. cruzi em grupos biologicamente distintos, visando sua caracterização. A presença de sítios polimórficos nas regiões não traduzidas (UTRs) dos genes de trans-sialidases (TS), além de representar uma estratégia de sobrevivência do parasito ao estresse ambiental, propicia o uso destas regiões como potenciais marcadores moleculares para tipagem de T. cruzi. Este trabalho avaliou o potencial uso do soro e do segmento 5\2019 UTR de TS de T. cruzi, em ensaios de quantificação de DNA e genotipagem do parasito, respectivamente Neste sentido, empregamos a PCR em Tempo Real (qPCR) multiplex para a detecção/quantificação de T. cruzi em amostras pareadas de soro e sangue de 40 pacientes com a doença crônica. Para avaliar o uso da 5\2019 UTR de TS como marcador molecular de genotipagem, utilizamos um painel de cepas/clones de T. cruzi, representantes das seis DTUs (Unidades Discretas de Tipagem). Após amplificação do segmento contendo parte da 5\2019 UTR e uma porção da região codificante de TS das diferentes cepas/clones, e posterior sequenciamento por método capilar (SANGER), realizamos a análise composicional das sequências. Em seguida, novos iniciadores foram desenhados para os ensaios de COLD-PCR HRM (High Resolution Melting). Os resultados da qPCR revelaram sensibilidade de detecção de 95% e 97% para soro e sangue, respectivamente, e especificidade de 100% para ambos os tipos de amostras. As medianas de carga parasitária em soro e sangue, também não demonstraram diferenças significativas, sendo de 1,12 e 1,23 equivalentes parasito/mL, respectivamente, o que reproduz a baixa parasitemia observada nos pacientes com doença de Chagas crônica. A partir das análises composicionais das sequências de 5\2019 UTR de TS obtidas pelo método capilar, identificamos blocos conservados e sítios polimórficos entre as linhagens, porém não foi possível gerar assinaturas genômicas associadas à caracterização em DTUs. O sequenciamento New Generation Sequencing do segmento 5\2018 UTR de TS permitiu a caracterização das cepas/clones em seis DTUs, como demonstrado na árvore filogenética construída a partir de 4.568.225 sequências Os ensaios de COLD-PCR HRM, direcionados para diferentes seções do segmento 5\2019 UTR de TS, foram eficientes em agrupar cepas/clones em duas variantes, sugerindo uma associação com os ciclos de transmissão, virulência e evolução populacional destes parasitos. Os resultados gerados no presente estudo sugerem o uso de soro para o diagnóstico molecular da infecção pelo T. cruzi em laboratórios de referência, responsáveis pela manutenção de sorotecas, bem como demonstram o potencial discriminatório do alvo 5\2019 UTR de trans-sialidases para ser explorado em ensaios de genotipagem do parasito diretamente de amostras clínicas e biológicas, acoplado ao sequenciamento High Throughput dos produtos amplificados, como ferramenta complementar à pesquisa diagnóstica da doença de Chagas / Abstract: PCR-based assays for molecular diagnosis and to evaluate Trypanosoma cruzi load in patients with Chagas disease are usually performed with DNA recovered from peripheral blood samples. One promising approach would be the use of patients\2019 serum for the detection and quantification of T. cruzi DNA, as it would make possible to take advantage of the same samples collected for serological screening in blood banks and reference laboratories. Another limitation is that molecular diagnosis with the most common molecular targets (kDNA and Satellite DNA) is not suitable for identifying the infecting parasite strain. A low sensitivity of some T. cruzi genotyping markers has been reported, when those are applied directly to blood of chronic patients, since they are represented as a single copy or present low frequencies in the parasite genome. Studies based on multigene families, such as the surface proteins (trans-sialidase), suggested the ability of those genes to cluster strains/isolates of T. cruzi into biologically distinct groups. The presence of polymorphic sites in the untranslated regions (UTRs) of trans-sialidase genes (TS), as well as represents a parasite\2019s survival strategy to environmental stress, it promotes the use of these regions as potential molecular markers for T. cruzi typing. This study evaluated the potential use of serum and the segment 5' UTR of TS, as new approaches for DNA quantification and T. cruzi genotyping, respectively We used multiplex Real-Time PCR (qPCR) for detecting/quantifying parasites in serum and blood paired samples from 40 chronic Chagas disease patients. In order to investigate the potential use of 5' UTR of TS sequences as molecular markers for genotyping, we used a panel of T. cruzi strains/clones, representative of the six DTUs (Discrete Typing Units). Following amplification of the segment containing part of the 5' UTR and a portion of the TS coding region from different strains/clones and sequencing by capillary method (Sanger), we carried out the compositional analysis of the sequences. New primers were designed for the HRM COLD-PCR tests (High Resolution Melting). The qPCR results showed detection sensitivities of 95% and 97% for serum and blood, respectively, and a specificity of 100% for both sample types. The median of parasite load in blood and serum also showed no significant differences, with 1.12 and 1.23 parasite equivalents/mL respectively, which reproduces the low parasitemia observed in chronic Chagas disease patients. From the compositional analysis of the 5\2019 UTR of TS sequences obtained by capillary method, we identified conserved blocks and polymorphic sites, but no genomic signatures associated to the characterization into distinct DTUs were observed. New Generation Sequencing of the segment 5' UTR of TS allowed the characterization of strains/clones in six DTUs, as shown by the phylogenetic tree generated by the analysis of 4.568.225 sequences HRM COLD-PCR assays targeted to different sections of the segment 5' UTR of TS were effective for clustering the strains/clones in two variants, suggesting an association with the transmission cycles, virulence and evolution of these parasite populations. The set of evidences gathered in this study, reinforces the potential use of serum for molecular diagnosis of T. cruzi infection, in reference laboratories responsible for maintaining serum bank, as well as, indicates a discriminatory potential of 5\2019 UTR of TS, regarding the six DTUs, to be explored in genotyping assays directly from clinical and biological samples, associated to High Throughput sequencing of amplicons, as a complementary tool for diagnostic researches in Chagas disease

Submitted by Luciane Willcox (luwillcox@gmail.com) on 2016-09-01T15:43:49Z No. of bitstreams: 1 Tese - Alexandre Haruo Inoue.pdf: 17247513 bytes, checksum: f4009bd7092467ab9fc57f854d3cabcd (MD5) / Approved for entry into archive by Luciane Willcox (luwillcox@gmail.com) on 2016-09-01T15:59:00Z (GMT) No. of bitstreams: 1 Tese - Alexandre Haruo Inoue.pdf: 17247513 bytes, checksum: f4009bd7092467ab9fc57f854d3cabcd (MD5) / Made available in DSpace on 2016-09-01T15:59:00Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Tese - Alexandre Haruo Inoue.pdf: 17247513 bytes, checksum: f4009bd7092467ab9fc57f854d3cabcd (MD5) / Durante seu processo de evolução, os tripanossomatídeos desenvolveram características distintas de outros eucariotos em relação à sua biologia. Desde a transcrição do DNA no núcleo até tradução do RNA mensageiro no citoplasma, estão envolvidos fatores às vezes únicos, que atuam principalmente na regulação gênica pós-transcricional. Entretanto, o transporte de mRNA do núcleo para o citoplasma é pouco compreendido nesses parasitas. Análises de genômica comparativa revelaram que somente algumas proteínas envolvidas na exportação estão conservadas em espécies divergentes, como tripanossomatídeos, indicando que essa via pode apresentar fatores diferentes, ainda não identificados, ou ela não é tão especializada e complexa como a via descrita em mamíferos e leveduras. Por isso, a função de componentes da via de exportação de mRNA, buscando entender como esse processo funciona em parasitas merece ser melhor investigada. Este trabalho tem como foco o estudo de uma proteína de 45 kDa de T. cruzi, denominada de Hel45, que apresentou alta similaridade com RNA helicases de transporte, envolvidas com a exportação de mRNA em mamíferos e leveduras. Uma análise de filogenia determinou que Hel45 é a ortóloga da eIF4AIII, uma RNA helicase componente de Exon junction complex (EJC) em células de mamíferos. No entanto, até o momento, não existem publicações descrevendo homólogos de eIF4AIII em tripanossomatídeos. Dados experimentais demonstraram que Hel45 é uma proteína que migra entre o núcleo e o citoplasma devido a um sinal de exportação nuclear (NES) funcional. Esta migração depende da transcrição ativa e do receptor de exportação de mRNA Mex67. As análises fenotípicas de uma linhagem de T. cruzi nocaute de Hel45 mostraram que a ausência da proteína não foi letal ao parasita, mas resultou no atraso do crescimento e diminuiu a taxa de metaciclogênese in vitro. Apesar de não causar o acúmulo de mRNA no núcleo, o nocaute afetou a tradução, pois diminuiu a formação de polissomos e a taxa de tradução. No entanto, este efeito não altera a expressão de proteínas de modo geral, visto que ensaios de proteômica revelaram que o nocaute interfere com a expressão de apenas algumas poucas proteínas, indicando que Hel45 pode estar relacionada à modulação da expressão de genes específicos ou existe uma via/proteína compensatória na ausência de Hel45. Foram obtidas evidências de que Hel45 está presente em complexos ribonucleoproteicos que não estão associados aos polissomos e análises de proteômica identificaram as proteínas destes complexos que devem interagir com Hel45. Dados obtidos até o momento mostraram que Mago e Y14, proteínas de EJC que interagem com eIF4AIII, podem estar associadas com Hel45, assim como, Sub2 e FOP, que são proteínas essenciais para o recrutamento de Mex67 durante exportação de mRNA em outras células eucarióticas. Outra proteína que pode estar interagindo com Hel45 é uma exclusiva de tripanossomatídeos, que contém um domínio NTF2-like, típico de receptores de exportação. Assim, o conjunto de dados obtidos indica que Hel45 está envolvida com o metabolismo de mRNA em T. cruzi. Desta forma, tem sustentação a hipótese de que seu papel seria semelhante à eIF4AIII, agindo como um fator que se associa ao mRNA já durante a etapa transcrição/processamento e que é exportado para o citoplasma.

Submitted by Luciane Willcox (luwillcox@gmail.com) on 2016-09-01T16:09:03Z No. of bitstreams: 1 Dissertação - Juliane Soldi Malgarin.pdf: 2097033 bytes, checksum: 573efb30d4d55173655fa068944bf56d (MD5) / Approved for entry into archive by Luciane Willcox (luwillcox@gmail.com) on 2016-09-01T16:16:04Z (GMT) No. of bitstreams: 1 Dissertação - Juliane Soldi Malgarin.pdf: 2097033 bytes, checksum: 573efb30d4d55173655fa068944bf56d (MD5) / Made available in DSpace on 2016-09-01T16:16:04Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Dissertação - Juliane Soldi Malgarin.pdf: 2097033 bytes, checksum: 573efb30d4d55173655fa068944bf56d (MD5) Previous issue date: 2015 / Trypanosoma cruzi é o protozoário causador da doença de Chagas que afeta milhões de pessoas no mundo. A regulação da expressão gênica em tripanossomatídeos se dá majoritariamente a nível póstranscricional diferindo daquela de outros eucariotos. Apesar de demonstrada a mobilização diferencial de mRNAs em T. cruzi e a importância da regulação pós-transcricional, poucas proteínas de ligação ao RNA foram caracterizadas até o momento. O domínio RNA Recognition Motif (RRM) de ligação ao RNA é um dos mais abundantes domínios encontrados em proteínas de ligação a RNA (RBPs). Proteínas com esse domínio RRM estão envolvidas na maioria dos processos póstranscricionais. RBPs associadas a moléculas de mRNA e outras proteínas regulatórias formam os complexos ribonucleoproteicos (mRNPs), que estão envolvidos na regulação do RNA. Nesse trabalho, reportamos a caracterização de uma proteína de ligação a mRNAs que apresenta domínio RRM, denominada RBSR1. A proteína foi fusionada a uma etiqueta TAP-tagging N-terminal (RBSR1TAP tagging) e os experimentos foram realizados com parasitas transfectados. Ensaios de imunofluorescência, para determinar a localização da proteína, mostraram que a proteína apresenta um padrão de migração entre o núcleo e o citoplasma em diferentes etapas da diferenciação do parasita e que sua expressão é regulada ao longo do ciclo de vida, não sendo expressa em tripomastigotas metacíclicos. O ensaio também foi realizado sob condições de estresse e demonstrou-se a mudança de localização da proteína RBSR1 quando submetida a estresse nutricional e oxidativo. O perfil de polissomos em gradiente de sacarose mostrou que RBSR1, tanto em epimastigotas, quanto sob estresse nutricional, está relacionada a complexos ribonucleoproteicos pesados não associados à tradução. Foram realizados ensaios de imunoprecipitação para identificação dos mRNAs alvos da proteína, seguido de sequenciamento massivo, onde observou-se transcritos que codificam para proteínas ribossomais e também proteínas hipotéticas. Também foi realizada a identificação de proteínas parceiras a RBSR1 por imunoprecipitação de formas epimastigotas em fase exponencial de crescimento e sob estresse nutricional, seguida de espectrometria de massas. Em epimastigotas em crescimento exponencial foram identificadas 86 proteínas parceiras e sob estresse nutricional 31 proteínas, observou-se alta heterogeneidade das parceiras, a qual pode ser explicada pela mobilidade apresentada por RBSR1 nas diversas formas do parasita. Adicionalmente, foram vistas várias proteínas que se associam a grânulos de RNA, como por exemplo DHH1 e HSP70, e dessa forma é possível que haja a associação de RBSR1 com esses grânulos. O estudo do papel das RBPs na modulação da expressão gênica em tripanossomatídeos pode pavimentar o caminho para o desenvolvimento de novas estratégias para combater as doenças causadas por esses organismos e ajudar a elucidar sua biologia.

Os fármacos atualmente disponíveis para o tratamento da Doença de Chagas e leishmaniose possuem eficácia insatisfatória, principalmente devido à resistência parasitária e reações adversas severas. Duas entomobactérias, Photorhabdus luminescens e Xenorhabdus nematophila, produzem uma variedade de metabólicos secundários tóxicos a células eucarióticas. Diante disto, testou-se a toxicidade de metabólitos secretados por P. luminescens e X. nematophila sobre Leishmania amazonensis e Trypanosoma cruzi, in vitro. Os meios condicionados de ambas bactérias mostraram significativo efeito parasiticida de forma concentração e tempo-dependente (L. amazonensis: IC50 P. luminescens = 21,80 μg/mL e X. nematophila = 0,33 mg/mL; T. cruzi: IC50 P. luminescens = 1,0 mg/mL e IC50 X. nematophila = 0,34 mg/mL) e apresentaram alta seletividade ao parasito (L. amazonensis: SIP. luminescens = 3.92 e SIX. nematophila = 19,85; T. cruzi: SIP. luminescens = 7,23 e SIX. nematophila = 14.17 para promastigotas e tripomastigotas, respectivamente). Além disso, os metabolitos estimulam a atividade de macrófagos contra amastigotas por um mecanismo independente de óxido nítrico. Com relação à caracterização dos compostos antiparasitários, sugere-se que moléculas com diferentes características atuem sobre cada parasito. P. luminescens secreta uma molécula leishmanicida de natureza peptídica menor que 3 kDa e uma molécula tripanocida de natureza não proteica, resistente a aquecimento a 100 ºC. X. nematophila produz uma molécula leishmanicida de polaridade inferior à tripanocida, uma vez que a atividade antiparasitária ficou em fases diferentes na extração com metanol. O mecanismo de ação de ambas bactérias sobre promastigotas parece estar relacionado à lesão mitocondrial, uma vez que ambas levaram à despolarização da membrana mitocondrial. X. nematophila, além disso, estimula a produção de ROS pelas formas promastigotas. A seletividade pelo parasito aliada a baixa citotoxicidade tornam estas bactérias promissoras fontes de compostos com potencial terapêutico contra leishmanioses e doença de Chagas. / Drugs currently available for Chagas disease and leishmaniasis have unsatisfactory efficacy, mainly due to parasitic resistance and severe adverse reactions. Two entomobacteria, Photorhabdus luminescens and Xenorhabdus nematophila, produce a variety of secondary metabolites toxic to eukaryotic cells. So, the toxicity of the metabolites secreted by Photorhabdus luminescens and Xenorhabdus nematophila were tested against Trypanosoma cruzi and Leishmania amazonensis. The mean values of both bacteria showed a significant concentration-dependent and time-dependent effect 14.17 (L. amazonensis: IC50P. luminescens = 21.80 μg / mL and IC50X. nematophila = 0.33 mg / mL, T. cruzi: IC50P. luminescens = 1,0 mg/mL and IC50X. nematophila = 0 , 34 mg / mL), and showed a high selectivity to the parasite (L. amazonensis: SIP. luminescens = 3,92 and SIX.nematophila = 19.85, T. cruzi: SIP. luminescens = 7.23 and SIX.nematophila = 14.17 for promastigotes and trypomastigotes, respectively). In addition, cultures stimulate the activity of macrophages against amastigotes by an independent mechanism of nitric oxide. Regarding the characterization of antiparasitic compounds, it is suggested that molecules with different characteristics act on each parasite. P. luminescens secretes a leishmanicidal peptide molecule lesser than 3 kDa and a trypanocidal molecule of non-protein nature, resistant to heating at 100 °C. X. nematophila produces a leishmanicidal molecule of lower polarity than trypanocidal, since antiparasitic activity was at different phases in methanol extraction. The mechanism of action of both bacteria on promastigotes seems to be related to the mitochondrial injury, since both led to the depolarization of the mitochondrial membrane. X. nematophila, furthermore, stimulates the production of ROS by the promastigote. Selectivity by the parasite coupled with low cytotoxicity makes these bacteria promising sources of compounds with therapeutic potential against leishmaniasis or Chagas' disease.

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:31:11Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2007-11-30Bitstream added on 2014-06-13T21:02:22Z : No. of bitstreams: 1 souza_ai_dr_jabo.pdf: 1146677 bytes, checksum: ac9276512764cc5723060e8848ecdce5 (MD5) / Fundação Manoel de Barros / O trabalho teve como objetivo descrever as características clínicas da infecção natural pelo T. cruzi em cães residentes em uma área rural do estado de Mato Grosso do Sul, Brasil. Foram utilizados métodos sorológicos convencionais e não convencionais em 75 cães residentes na área e avaliação cardiovascular e da bioquímica sérica em quatro animais confirmadamente chagásicos. Foram usados os testes de reação de imunofluorescência indireta (RIFI), ELISA com antígenos da forma epimastigota do T. cruzi (EAE ELISA) e ELISA com antígeno excretado e secretado da forma tripomastigota do T. cruzi (TESA-ELISA), que detectaram anticorpos em 45,33% (n=34), 24,0% (n=18) e 12,0% (n=09) dos cães, respectivamente. A real prevalência da infecção foi confirmada como 10,7% (n=08) pela técnica de immunoblotting com antígeno secretado e excretado da forma tripomastigota do T. cruzi (TESA-blot). O teste com melhor índice de concordância (Kappa; 0,93), sensibilidade (100%) e especificidade (98,5%) foi o TESA-ELISA, que quando associado à RIFI igualou-se aos dados obtidos com o TESA-blot (10,7%). Três dos quatro animais chagásicos apresentaram aumento da silhueta cardíaca direta, aumento da duração de onda P e do complexo QRS. Um cão apresentou bloqueio de ramo direto e outro, bloqueio atrioventricular de primeiro grau e parada sinusal. Notou-se, também, espessamento de parede livre de ventrículo esquerdo em diástole, redução da fração de encurtamento e inversão dos picos de velocidade das onda E e A, indicando disfunção sistólica e diastólica... / This study was conduted to describe the clinical characteristics of the natural infection caused by the T. cruzi in dogs residing in a rural area of Mato Grosso do Sul, Brazil. Conventional and nonconventional diagnosis methods were used in 75 dogs living in this area for screening T. cruzi infection. Cardiovascular and biochemical serum were also performed in four confirmed positive dogs. The following tests were used: indirect immunofluorescence test (IFAT), enzyme-linked immunosorbent assay with T .cruzi. epimastigote antigens (EAE ELISA) and enzymelinked immunosorbent assay with T.cruzi excreted-secreted trypomastigote antigens (TESA-ELISA) with detected antibodies in 45,33% (n=34), 24,0% (n=18) and 12,0% (n=09) of the dogs, respectively. The real prevalence of the infection was confirmed as 10,7% (n=08) by immunoblotting test with T. cruzi excreted-secreted antigens (TESAblot). The test with the best concordance index (Kappa; 0,93), sensibility (100%) and specifity (98,5%) was the TESA-ELISA, which, when associated with IFAT had the same as results those obtained with the TESA-blot (10,7%). Three out of the four chagasic animals showed enlarged cardiac silhouette on x-ray and an increase of the P-wave duration and QRS complex in electrocardiogram. Two dogs presented conduction disturbances, right bundle block in one dog and the first-degree atrioventricular block and sinus arrest in another...(Complete abstract, click electronic access below)

Made available in DSpace on 2016-06-02T20:34:16Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2112.pdf: 5693137 bytes, checksum: ed718439c222617a1ea873a2cb8344f3 (MD5) Previous issue date: 2008-10-24 / Universidade Federal de Minas Gerais / The present work describes the search of bioactive secondary metabolites isolated from plants, against enzymes: gGAPDH (glyceraldehydes-3- phosphate dehydrogenase from Trypanosoma cruzi and lysosomal cathepsins K, V, L and S. This work is divided in two parts: Part I: Study of the oil from the nut shells of Anacardium occidentale (Anacardiaceae) - Chagas disease, a parasitic infection caused by the flagellate protozoan Trypanosoma cruzi, is a major public health problem affecting millions of individuals in Latin America. On the basis of the essential role in the life cycle of T. cruzi, the enzyme gGAPDH has been considered an attractive target for the development of novel antitrypanosomatid agents. From the dicloromethane extract of A. occidentale were isolated phenolic compounds which were investigated on their inhibition activity against gGAPDH and trypomastigote forms of T. cruzi. The most promising compound was the 6-n-pentadecylsalicylic acid (AC1) with IC50 values of 28 μM against gGAPDH and 66.7 μg/mL against trypomastigote forms. In addition, a detailed mechanistic characterization of the effects of AC1 on the T. cruzi gGAPDHcatalyzed reaction showed clear noncompetitive inhibition with respect to both substrate G-3-P and cofactor NAD+. Part II: Study of natural products and synthetic derivatives searching for inhibitors of lysosomal cysteine peptidases - After completing the human genome, eleven lysosomal cysteine peptidases were identified. Those enzymes are involved in general protein degradation. The lysosomal cysteine peptidases are found in various tissues and those are found in many organs. Cathepsin K is associated to bone resorption, cathepsin L to skin cancer, at last cathepsins V and S are associated to the immune system. In this work, four enzymes (cathepsins K, V, L and S) were selected as a molecular target for the identification of new inhibitors. Some potent inhibitors of cathepsin V were found, and a study including kinetic characterization of the most potent inhibitors, including potency (IC50), mechanism of action and constant Ki was carried out. The most promising compound is the acridone alkaloid citbrasine (107), with values of IC50 of 1.2 μM and Ki of 0.24 μM. Moreover, it was determined that citbrasine is a competitive inhibitor against cathepsin V in relation to the substrate ZFRMCA. Additionally, it was carried out the study of molecular modeling for acridone alkaloids that showed significant inhibition of cathepsin V. / Este trabalho descreve a busca de metabólitos secundários bioativos de plantas, com o intuito de serem avaliados contra as enzimas: gGAPDH (gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase glicossomal) do Trypanosoma cruzi e as catepsinas lisossomais K, V, L e S. A descrição deste trabalho está dividida em duas partes. Parte I: Estudo do óleo das cascas da castanha de Anacardium occidentale (Anacardiaceae) - A doença de Chagas, uma infecção parasitária causada pelo protozoário flagelado Trypanosoma cruzi, é um importante problema de saúde pública que afeta milhões de pessoas na América Latina. Com base no papel essencial no ciclo de vida de T. cruzi, a enzima gGAPDH tem sido considerada um alvo atraente para o desenvolvimento de novos agentes tripanocidas. Do extrato diclorometânico das cascas da castanha de A. occidentale obtiveram-se compostos fenólicos que foram avaliados frente à enzima gGAPDH e as formas tripomastigotas de T. cruzi. A substância mais promissora foi o ácido 2-pentadecenil-6- hidroxibenzóico (AC 1), com valores de IC50 de 28 μM na enzima gGAPDH e 66,7 μg/mL nas formas tripomastigostas. Além disso, foi determinado que AC1 é um inibidor do tipo não-competitivo para a enzima gGAPDH em relação tanto ao substrato G-3-P (Ki = 2 μM ) quanto ao cofator NAD+ (Ki = 4 μM). Parte II: Estudo de produtos naturais e derivados sintéticos buscando inibidores de cisteíno peptidases lisossomais - Depois de completado o genoma humano, onze cisteíno peptidases lisossomais foram identificadas. Essas enzimas têm a função primária de degradar proteínas, de forma não seletiva, dentro do lisossomo e são encontradas em vários órgãos e tecidos. A catepsina K está associada ao processo de reabsorção óssea, catepsina L ao câncer de pele e as catepsinas V e S ao sistema imune. Neste trabalho, foram selecionadas quatro enzimas (catepsinas K, V, L e S) como alvos moleculares para a identificação de novos inibidores. Foi realizada a caracterização cinética dos inibidores mais potentes frente à catepsina V, através da potência biológica (IC50), mecanismo de ação e constante Ki. A substância mais promissora foi o alcalóide acridônico citibrasina (107), com valor de IC50 de 1,2 μM e Ki de 0,24 μM. Além disso, foi determinado que citibrasina é um inibidor do tipo competitivo para a catepsina V em relação ao substrato ZFRMCA. Adicionalmente foi realizado o estudo de modelagem molecular para os alcalóides acridônicos que apresentaram inibição significativa frente à catepsina V.