Macrophages are professional phagocytes that efficiently clear microbes, dying cells, and debris. Nonetheless, some pathogenic bacteria and parasites can subvert the macrophage phagosome into a vacuolar replicative niche. Exogenous macrophage activation by the cytokine interferon gamma (IFNγ) tips the equilibrium toward pathogen restriction, host survival, and subsequent adaptive immune responses. The relevance of IFNγ-induced immunity to human health has been demonstrated in patients with genetic defects in IFNγ signaling, who are profoundly susceptible to vacuolar pathogens such as Mycobacterium tuberculosis. Still, much remains to be discovered about IFNγ effector functions, and about their co-regulation by signaling downstream of the many innate immune sensors in macrophages. First, we asked whether IFNγ-induced vesicle trafficking mechanisms affect the maturation of phagosomes containing the bacterium Legionella pneumophila, the causative agent of Legionnaire's disease. We used functional genetic screening to discover candidate genes involved. From 380 genes in a curated vesicle trafficking-related set, 15 were selected as candidate IFNγ pathway members by RNAi screening in cell line and primary mouse macrophages. Functional validation of top candidates was inconclusive, but revealed potential roles for membrane tetraspanins and the AP3 complex in IFNγ-induced microbial restriction. Our second goal was to determine whether innate immune sensing affects IFNγ-induced bacterial restriction. Using macrophages from mice deficient in key elements of innate immune sensing pathways, we discovered that the antiviral transcription factor IRF3, which functions downstream of many nucleic acid sensing pathways, suppresses IFNγ-induced restriction of L. pneumophila and the protozoan parasite Trypanosoma cruzi. While activated IRF3 localizes to the nuclei in resting macrophages infected with L. pneumophila, it is mostly excluded from nuclei in macrophages activated with IFNγ prior to infection. This suggests a cascade of suppression in which IFNγ responses inhibit IRF3 activation, but residual IRF3 activity antagonizes IFNγ effectors. IRF3-mediated inhibition of IFNγ-inducible nitric oxide synthase was partially, but incompletely responsible for the phenotype observed; further candidate effectors were identified by gene expression profiling. We speculate that antagonism between IFNγ and IRF3-mediated mechanisms may facilitate a balance of vacuolar pathogen immunity with viral defense, or with protection of tissue damage by nitric oxide and other IFNγ-dependent responses.

Submitted by MARCOS LEANDRO TEIXEIRA DE OLIVEIRA (marcosteixeira@ufv.br) on 2018-11-21T16:38:57Z No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 32483634 bytes, checksum: 512f1ad54959a915407448133a75d3ed (MD5) / Made available in DSpace on 2018-11-21T16:38:57Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 32483634 bytes, checksum: 512f1ad54959a915407448133a75d3ed (MD5) Previous issue date: 2018-07-30 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / O protozoário Trypanosoma cruzi é o agente etiológico da doença de Chagas, responsável por promover diversas alterações hematológicas e teciduais que afetam mais de 10 milhões de pessoas em todo o mundo. A espécie possui um ciclo evolutivo digene'tico. 0 T. cruzi possui uma grande diversidade genética o que lhe dá a habilidade de poder invadir uma ampla variedade de tecidos como o cardíaco, hepático, digestivo, conjuntivo e nervoso causando deficiências fisiológicas generalizadas. Neste estudo nós realizamos mediante revisões sistemáticas a avaliação das principais alterações hematológicas e morfológicas no Sistema Nervoso Central (SNC) que acontecem em mamíferos não humanos durante infecções naturais e experimentais com T. cruzi. Foram realizadas duas revisões sistemáticas utilizando bases de dados PubMed e Scopus e, através do Guia Prisma os estudos foram selecionados e submetidos à extração de dados e análise de vie's metodológico. A Tabela Arrive, foi utilizada para avaliar o nível de detalhamento cientifico dos trabalhos. No artigo 1, onde analisamos as alterações hematológicas em animais infectados com T. cruzi, dos Trinta e um estudos selecionados, a metade demostrou uma redução no número de eritrócitos, indicando anemia e, na maioria dos estudos a quantidade total de valores de leucograma aumentou, sugerindo infecção. No artigo 2, analisamos as alterações morfológicas no SNC em indivíduos infectados com T. cruzi, os 32 estudos selecionados mostraram que as alterações mais frequentes no SNC são a presença de T. cruzi e infiltrado inflamatório mononuclear, principalmente formado por linfócitos. Os principais focos de parasitismo foram as zonas perivasculares no cérebro, cerebelo, e medula espinal. Em geral nossos achados demostraram que: 1) os parâmetros hematológicos podem direcionar o diagnóstico da doença de Chagas na fase inicial; 2) O encéfalo e' o principal alvo de T. cruzi, e as alterações inflamatórias no SNC são mais frequentes na fase aguda da infecção; 3) As alterações morfológicas dependem das características da patogenicidade e virulência das cepas de T. cruzi; 4) As alterações inflamatórias foram dependentes das cepas indicando que há tropismo diferencial no SNC. / The protozoan Trypanosoma cruzi is the etiologic agent of Chagas’ disease, responsible for several hematological and tissue changes affecting more than 10 million people worldwide. The species has a digenetic evolutionary cycle. T. cruzi is endowed with great genetic diversity which gives it the ability to invade a wide variety of tissues such as the heart, liver, digestive, connective and nervous, causing generalized physiological deficiencies. In this study, we performed systematic reviews of the major hematological and morphological changes in the Central Nervous System (CNS) that occur in non-human mammals during natural and experimental T. cruzi infections. Two systematic reviews were carried out through systematic surveys in PubMed and Scopus by publications. Using the Prisma Guide, the studies were selected and submitted to data extraction and methodological bias analysis and, through the Arrive Table, the level of scientific detail of the work was evaluated. In the article 1, wherein analyzing the hematological changes in animals infected with T. cruzi, the selected Thirty-one study, half demonstrated a reduction in the number of erythrocytes, indicating anemia and, in most studies the total number of WBC values increased, suggesting infection. Article 2, we analyzed morphological changes in the CNS in subjects infected with T cruzi, the 32 selected studies showed that the more frequent changes in the CNS are the presence of T. cruzi and mononuclear inflammatory infiltrate primarily consists of T lymphocytes. The main foci of parasitism were the perivascular zones in the brain, cerebellum, and spinal cord. In general, our findings demonstrated that: 1) hematological parameters can direct the diagnosis of Chagas disease in the initial phase; 2) The brain is the main target of T cruzi, inflammatory changes in the CNS are more frequent in the acute phase of infection; 3) The morphological changes depend of the pathogenicity and virulence of T. cruzi strains; 4) Inflammatory changes were dependent on the strains indicating that there is differential tropism in the CNS.

Le but de cette étude est d'analyser les relations mutuelles de la co-infection VlH-llTrypanosoma cruzi dans un modèle de cellules de type microglial dérivées de monocytes humains. Un modèle de co-infection de MDMi par le T. cruzi et le VIH-1 a été établi. Le T. cruzi peut être inhibé par la co-infection T.cruzi/VIH-l dans les MDMi : nos résultats indiquent que l'infection par le VIH-1 conduit à une réduction de l'entrée et de la multiplication du T. cruzi dans les MDMi. De son côté, l'infection par le T. cruzi, aussi bien que ses facteurs solubles, semble exercer une forte inhibition de l'entrée, l'expression et la replication du VIH-1 dans ces cellules. Ces résultats sont en accord avec les rares études effectuées sur le sujet. De plus, nos résultats montrent qu'une co-entrée dans la même cellule n'est pas nécessaire à l'inhibition mutuelle exercée par ces deux pathogènes.

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A β-D-galactofuranose é um componente de várias macromoléculas de muitos organismos, incluindo bactérias, protozoários e fungos. Interessantemente este carboidrato não usual está ausente de glicoconjugados de mamíferos. Um método alternativo foi utilizado para purificar a β-D-galactofuranosidase utilizando p-nitrofenil-β-D-galactofuranosideo como substrato. O meio de cultura concentrado do fungo Penicillium fellutanum foi cromatografado em coluna de DEAE-Sepharose CL 6B, seguido de cromatografia em coluna de afinidade de 4-aminofenil-1-tio-β-D-galactofuranosideo-Sepharose, que permitiu a separação de dois picos com atividade enzimática após a eluição com D-galactônico-γ-lactona em um gradiente de 100 a 500 mM de NaCl. Os dois picos resultaram, quando analisados por SDS-PAGE, em um polipeptídeo de 70 kDa. Anticorpos produzidos contra a mistura das bandas recortadas do gel são capazes de imunoprecipitar 77 % das unidades totais de enzima. Uma das bandas recortadas foi submetida a microseqüenciamento, obtendo-se seqüências para 3 peptídeos (65, 73, 101). Anticorpos foram produzidos contra os peptídeos sintéticos e usados para imunoprecipitar um polipeptídeo com atividade de β-D-galactofuranosidase. Para verificar a presença de β-D-galactofuranosidase em T. cruzi, usamos a mesma coluna de afinidade de 4-aminofenil-1-tio-β-D-galactofuranosideo-Sepharose. Um extrato de formas epimastigotas marcadas metabolicamente com 35S-metionina foi aplicado na coluna de afinidade. A enzima foi eluída após a lavagem com D-galactônico-γ-lactona em um gradiente de NaCl 100 a 500 mM. A análise por SDS-PAGE do material eluido mostrou um polipeptídeo de massa molecular aparente 50-60 kDa que é reconhecido por anticorpos anti-β-D-galactofuranosidase. Os anticorpos reagem por imunoflorescência indireta também com parasitas fixados com paraformaldeído. O polipeptídio de 50-60 kDa foi empregado em ensaios de atividade enzimática. Praticamente nenhuma atividade foi detectada utilizando-se p-nitrofenil-β-D-galactofuranosideo como substrato. A LPPG (lipopeptideofosfoglicana), um glicoconjugado isolado de epimastigotas de T. cruzi foi empregada como substrato. A galactopiranose, produto da hidrólise da atividade enzimática, foi detectada por cromatografia de troca iônica em alto pH sugerindo a presença de β-D-galactofuranosidase em T.cruzi. / β-D-galactofuranose is a component of several galactofuranose containing macromolecules of many organisms, including bacteria, protozoa and fungi. Interestingly, this unusual sugar is absent in mammalian glycoconjugates. An alternative and fast method for the purification of β-D-galactofuranosidase was developed using p-nitrophenyl-β-D-galactofuranoside as substrate. A concentrated culture medium from Penicillium fellutanum was chromatographed on DEAE-Sepharose CL 6B followed by an affinity chromatography column of 4-aminophenyl-1-thio-β-D-galactofuranoside-Sepharose which yielded two separate peaks of enzyme activity when elution was performed with 10mM D-galactonic acid-γ-lactone in a 100-500 mM NaCl gradient. Both peaks rendered a single 70 kDa protein as detected by SDS-PAGE. Antibodies elicited against a mixture of the single bands excised from the gel were capable to immunoprecipitate 77 % units out of total units of the enzyme from the crude extract. One of the excised bands was submited to microsequencing and the sequence for 3 peptides (65, 73, 101) was obtained. Antibodies were raised against the corresponding synthetic peptides and used to immunoprecipitade a polypeptide with β-D-galactofuranosidase activity. To verify the presence of β-D-galactofuranosidase in T. cruzi we used the same 4-aminophenyl-1-thio-β-D-galactofuranoside-Sepharose affinity column. An extract of epimastigotes metabolically labelled with 35S-methionine was applied on the affinity colunm. After washing, the putative enzyme was eluted by 10 mM D-galactonic acidy-γ-lactone and 100-500 mM NaCl gradient. SDS-PAGE analysis of the eluted material show a polypeptide with an apparent molecular mass of 50-60 kDa that is recognized by all the antibodies raised against β-D-galactofuranosidase from P. fellutanum. Also the antibodies react with p-formaldehyde fixed parasites as detected by indirect immunofluorescence. The 50-60 kDa polypeptide was then employed in enzymatic assays. Almost no enzymatic activity was observed when p-nitrophenyl galactofuranoside was employed as substrate. LPPG (lipopeptidophosphoglycan), a galactofuranose-con taining glycoconjugate isolated from epimastigotes of T. cruzi was then employed as substrate. Galactopyranose, the product of the enzymatic activity, was detected by high pH anion-exchange chromatography, suggesting the presence of β-D-galactofuranosidase in T. cruzi.

A Doença de Chagas, causada pelo parasito tripanossomatídeo Trypanosoma cruzi, é endêmica e se distribuí por toda América Latina. É uma das parasitoses mais negligenciadas pela indústria farmacêutica e os únicos fármacos disponíveis para seu tratamento foram introduzidos há décadas. Infelizmente, eles são ineficientes e apresentam sérios efeitos colaterais. Esse panorama mostra a necessidade do desenvolvimento de novos fármacos para a quimioterapia contra a doença de Chagas. As enzimas pertencentes a vias metabólicas essenciais para a sobrevivência do parasito tais como a via glicolítica e a de síntese de novo de nucleotídeos de pirimidinas, têm sido propostas como alvos interessantes no planejamento novos fármacos para o tratamento da doença de Chagas. Neste trabalho, as enzimas Gliceraldeído 3-fosfato desidrogenase (TcGAPDH) e a Diidroorotato desidrogenase (TcDHODH) de Trypanosoma cruzi foram estudadas como alvos para o planejamento de inibidores enzimáticos com propriedades físico-químicas e características estruturais similares à de compostos-líderes. Para isso, foram utilizados métodos e ferramentas de Quiminformática tanto baseadas nas estruturas dos ligantes (LBVS) quanto dos receptores (SBVS). Para a identificação e seleção de potenciais inibidores da enzima GAPDH, uma coleção virtual obtida do banco de dados ZINC, contendo aproximadamente 2,5 milhões de compostos, foi avaliada através de vários filtros de seleção com o objetivo de priorizar aqueles compostos mais interessantes do ponto de vista estrutural, de propriedades físico-químicas e farmacocinéticas. A aplicação desses filtros originou uma subcoleção de aproximadamente 450 mil estruturas que foram avaliadas segundo a complementaridade de interações com a estrutura da enzima através de métodos de docagem molecular. Com base nestes resultados, doze compostos que se mostraram promissores foram selecionados e adquiridos comercialmente para serem testadas in vitro contra a enzima TcGAPDH. Dos doze compostos testados, três exibiram afinidade (Ki) pela enzima em concentrações inferiores a 80 μM, Além disso, esses compostos também são caracterizados pelo baixo peso molecular (274 a 330 g mol-1) e no máximo 24 átomos diferentes do hidrogênio e, como consequência, apresentam eficiências do ligante entre 0,24 e 0,34 Kcal mol-1 átomo-1, o que os tornam ótimos candidatos à otimização molecular visando aumento da afinidade pelo alvo. Para a busca de inibidores da enzima TcDHODH, primeiramente foi realizada uma busca por cavidades na estrutura 3D do alvo para a identificação de regiões distintas do sítio catalítico e passíveis de serem exploradas no planejamento de ligantes. Através desta análise foi possível o estabelecimento de quatro novas regiões com forma, volume e localizações adequadas para acomodar pequenas moléculas capazes de modular a atividade da TcDHODH. Uma destas regiões, chamada S2, localizada sob a alça β4-αA e no canal de acesso dos substratos ao sítio ativo, foi escolhida para o planejamento baseado na estrutura do alvo. As estruturas de aproximadamente cem compostos derivados de pirimidinas, substituídos em posições estrategicamente definidas e selecionados através de buscas por subestruturas, foram docadas no sítio de interesse e nove compostos adquiridos e testados in vitro contra a enzima com o objetivo de validar as hipóteses estabelecidas inicialmente. Destes, cinco compostos mostraram potências (IC50) superiores à do produto de reação (inferior a 150 μM), Os resultados encontrados validaram as hipóteses geradas na primeira etapa e foram usados para direcionar a seleção de outras quinze novas moléculas através de um protocolo de docagem molecular com ajuste induzido. A avaliação in vitro desses compostos contra a enzima TcDHODH resultou na identificação de outros 11 compostos ativos, dos quais o mais potente exibiu afinidade pela enzima em concentração igual a 124 nM. Este composto possui eficiência do ligante igual a 0,56 Kcal mol-1 átomo-1 e pode ser considerado um fragmento molecular com excelentes características do ponto de vista do potencial para futuro desenvolvimento como agente terapêutico. Os resultados encontrados também evidenciaram a importância de determinadas características estruturais impressas nos inibidores da TcDHODH para a complementaridade com o novo sítio de interação identificado. Assim, novos compostos foram propostos para otimização molecular com o objetivo de melhorar afinidade e aumentar a diversidade de classes e, deste modo, ampliar o espectro de perfis farmacocinéticos para posteriores ensaios celulares e in vivo, Através da realização deste trabalho foi possível validar as estratégias adotadas na utilização dos métodos computacionais e também as hipóteses construídas a partir da aplicação dos mesmos. A taxa de acerto (TA) alcançada foi superior a 30% no planejamento de inibidores para ambos os alvos, ou seja, muito superiores às encontradas em experimentos de ensaio em massa. Deste modo, este estudo contribuiu com a proposição de novos esqueletos moleculares que podem ser usados como compostos-líderes no desenvolvimento de novos agentes tripanocidas focando nas enzimas TcGAPDH e TcDHODH como alvos. / Chagas\' disease, an endemic illness widely distributed throughout Latin America, is caused by the protozoa parasite Trypanosoma cruzi. It is one of the tropical diseases that are among the most neglected by the pharmaceutical industry, for which available treatments were launched more than 30 years ago. In addition, these drugs are ineffective and cause severe side effects to patients. This panorama shows the need for the development of new and more effective chemotherapeutic agents for the treatment of the disease. Enzymes belonging to metabolic pathways that are essential for the parasite survival such as the glycolysis and pyrimidine nucleotide biosynthesis have been proposed as attractive targets for the design of new drugs for the treatment of Chagas disease. In this work, the enzymes Gyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (TcGAPDH) and the Dihydroorotate dehydrogenase (TcDHODH) from Trypanosoma cruzi were studied as targets for the design of inhibitors with physicochemical properties and structural characteristics similar to lead-compounds. Methods in Cheminformatics within the Ligand- and Structure-based Virtual Screening (LBVS and SBVS, respectively) approaches were thoroughly employed as tools to identify new hits. For the selection and identification of potential inhibitors of the GAPDH enzyme, a compound database containing nearly 2.5 million of small molecules retrievable from ZINC was evaluated through several molecular filters aiming at prioritizing those compounds more interesting from the point of view of their structures, physicochemical and predicted ADME/Tox properties. The application of Filter originated a subcollection of approximately 450 thousand structures that were then scored according to their complementary interactions with the 3D structure of the enzyme through molecular docking. Based on docking results, twelve compounds that showed to be promising ligands were selected and commercially acquired for in vitro assays against the TcGAPDH. Of the twelve compounds evaluated in vitro, three exhibited affinity constants (Ki) at concentrations lower than 80 μM. Furthermore, the selected compounds are also characterized by the low molecular weight (274 to 330 g mol-1) and a maximum of non-hydrogen atom count of 24, as a result, they have Ligand Efficiencies between 0,24 and 0,34 Kcal mol-1 átomo-1, what grant them great potential as candidates for molecular optimization and potency improvement. For the search of TcDHODH inhibitors, cavities in the 3D structure of the target for the identification of areas apart from catalytic site but likely to be explored in the design of ligands were selected a priori. This resulted in four new regions with appropriate shape, volume and locations to accommodate small molecules capable of modulating the activity of TcDHODH. One of the areas, called S2 site, is located under the α4 - βA loop and in the access channel of the substrate to the active site and was chosen to be explored in the SBDD studies. Approximately one hundred of pyrimidine derivatives containing strategically defined posítions for molecular substitution were retrieved from commercially available compounds database through substructure searching and docked into the previously defined site. Based on the docking results nine compounds were selected, purchased and assayed in vitro against the enzyme with the objective of validating the hypothesis. Of these, five compounds showed potencies (IC50) better than that exhibited by the product of the reaction (values lower than 150 μM). Thus, the results found validated the hypotheses generated in the first stage of the designing and they were used to drive the selection of other fifteen new molecules through induced fit molecular docking protocol. The in vitro evaluation of those compounds against the TcDHODH enzyme resulted in the identification of other eleven ligands, of which the most potent exhibited affinity for enzyme at the concentration of 124 nM. This molecule has a Ligand Efficiency of 0.56 Kcal mol-1 atom-1 and can be considered a fragment-like compound with excellent characteristics from the point of view of its potential for future development as therapeutic agent. The results found also evidenced the importance of certain structural characteristics in the inhibitor of TcDHODH for the complementarily with the new identified site of interaction. Thus, new compounds were proposed for potency and class diversity improvement. By doing so we hope to enlarge ADME profile spectrum for further cellular and in vivo assays. Through the success of this work, it was possible to validate the strategies adopted in the use of computational methods and also the hypotheses built from the application of that. The success rate (TA) obtained was higher than 30% in the design of ligands for both studied targets, which is much better than that usually found along High Throughput Screening assays. Thus, this study contributed with the proposítion of new molecular scaffolds that can be used as lead compounds in the development of new tripanocidal agents having as targets the enzymes TcGAPDH or TcDHODH.

Os tripanosomatídeos inferiores, que infectam plantas e insetos, apresentam propriedades bioquímicas e moleculares similares a Leishmania sp. e Trypanosoma cruzi. Similaridades antigênicas entre estes parasitas são conhecidas à muito tempo, mas somente alguns poucos estudos comparativos sobre a imunorreatividade humoral cruzada foram descritos. No presente trabalho nós analisamos a imunorreatividade cruzada de extratos antigênicos totais de oito tripanosomatídeos inferiores por ELISA, com soros de humanos e cães infectados com T. cruzi e Leishmania sp. Segundo as positividades e dados de reatividade média para ELISA os tripanosomatídeos inferiores foram divididos em dois grupos. ELISA-G1 compreendeu 4 parasitas para os quais se obtiveram 100% de positividade e elevadas médias de absorbância, similar aos dados obtidos para L. chagasi para hospedeiros humanos e cães. Nos casos humanos, soros de pacientes chagásicos crônicos apresentaram 100% de positividade somente para o ELISA com T. cruzi, sem diferenças entre os tripanosomatídeos inferiores. Por outro lado amostras de doenças não relacionadas apresentaram baixa reatividade cruzada com os tripanosomatídeos inferiores. Apesar da sua posição taxonômica em várias sessões e sua antiga divergência estes resultados mostraram semelhança antigênica entre os tripanosomatídeos inferiores e os patogênicos, e podem ser uma fonte alternativa de antígenos para a detecção de anticorpos principalmente em casos de leishmaniose visceral. / \"Lower trypanosomatids\", that infect plant and insect, present biochemical and molecular similarities to Leishmania sp. and Trypanosoma cruzi. Antigenic similarities between those parasites are known for a long time, but only few comparative investigations about immune humoral cross-reaction were described. In the current work we analyze the cross-immunoreactivity of crude extract from eight lower trypanosomatids by ELISA, with human and dog host samples infected with T. cruzi and Leishmania sp. ELISA positivity and data of mean title of human or dog visceral leishmaniasis cases, the lower trypanosomatids were divided in two groups. ELISA-G1 comprised by 4 parasites resulted in 100% positivity and high mean of absorbance, similar data to those obtained with L. chagasi, with human or dog hosts. In human cases, Chagas disease chronic cases showed 100% positive only with ELISA performed with T. cruzi, with no differences among lower trypanosomatids. Otherwise samples with other non correlated disease presented low cross-reaction with lower trypanososmatids. In spite of, their taxonomic position in various sections and their old divergence these results showed a strong antigenic similarity between pathogenic and lower trypanosomatids, and could be an alternative source of antigen for the detection of antibodies against host mainly with visceral leishmaniasis cases.

Trypanosoma cruzi, causador da tripanossomíase americana, é um microrganismo exposto a uma variedade de espécies reativas de oxigênio, geradas como conseqüência do metabolismo de drogas tripanocidas, ou pelo hospedeiro como resposta fisiológica à invasão, além daqueles produzidos internamente em conseqüência dos processos oxidativos do parasita. Em qualquer circunstância, as células precisam proteger-se contra os produtos da redução parcial do oxigênio. Os tripanossomatídeos são aparentemente deficientes na defesa antioxidante. Embora possuindo uma superóxido dismutase, carecem de glutationa peroxidase e catalase, que são necessárias para a remoção do peróxido de hidrogênio. Além disso, glutationa, o maior composto sulfidrílico antioxidante em células de mamíferos, está presente em baixas concentrações nos tripanossomatídeos. No seu lugar, têm um composto sui generis, um conjugado de glutationa e de espermidina, conhecido como tripanotiona (N1, N8-bis(glutationil)espermidina), o qual junto com a tripanotiona redutase e o sistema peroxidase tripanotiona-dependente, parece estar envolvido no mecanismo de defesa antioxidante em Crithidia fasciculata. Este sistema parece existir em outros tripanossomatídeos, representando um importante alvo quimioterápico. A existência deste sistema metabólico em T. cruzi foi demonstrada inicialmente por uma baixa atividade peroxidásica tripanotiona-dependente, detectada em extratos celulares de formas epimastigotas e tripomastigotas. Imunoquimicamente, a existência deste sistema foi evidenciada ao se usar anticorpos heterólogos contra triparredoxina (Cf16) e triparredoxina peroxidase (Cf21) de C. fasciculata. Enquanto a reatividade em epimastigotas de T. cruzi é homogeneamente distribuída no citoplasma, as formas tripomastigotas apresentam uma reatividade descontínua localizada próxima à membrana plasmática. Os mesmos anticorpos policlonais foram utilizados para identificar por Western blot, as proteínas correspondentes em T. cruzi, sendo reconhecidas duas proteínas com massas moleculares aparente de 16 e 21 kDa, Tc16 e Tc21, respectivamente. Oligonucleotídeos foram então sintetizados baseados em regiões conservadas de seqüências codantes de DNA de peroxirredoxinas de tripanossomatídeos e de outros organismos e utilizados em ensaios de PCR com cDNA, amplificando-se um produto de 525 pb. Esta seqüência parcial apresentou uma homologia de 75% com o gene da triparredoxina peroxidase de C. fasciculata. No mesmo período foi depositada no GenBank (acc. n°. AJ012101) uma seqüência codante para uma proteína do tipo peroxirredoxina em T. cruzi e que apresentou uma homologia de 100% em relação à seqüência (correspondente às posições 1 a 525 de Acc. Nr. AJ012101). Utilizando a seqüência publicada, novos oligonucleotídeos correspondentes às regiões 5\' e 3\' foram desenhados, o gene putativo da triparredoxina peroxidase em T. cruzi (Tc21) foi amplificado a partir de DNA de T. cruzi por PCR, o produto clonado no vetor pET21b(+) e expresso em E.coli BL21(DE3). A proteína obtida apresentou atividade de tripanotiona peroxidase. Esta enzima, a triparredoxina peroxidase é membro de uma família de proteínas antioxidantes, denominadas de peroxirredoxinas, que são caracterizadas pela presença de dois domínios conservados - VCP, contendo as cisteínas envolvidas na catálise. Em relação à triparredoxina, apesar das várias tentativas empreendidas, o isolamento do respectivo gene foi infrutífero. No entanto, sua existência foi demonstrada por Western blot e imunofluorescência usando-se o anticorpo contra a triparredoxina de C. fasciculata. A triparredoxina de C. fasciculata é um membro da super-família das tiorredoxinas, com uma massa molecular de 16 kDa, maior que a tiorredoxina em vertebrados. Embora possuindo o motivo WCPPCR próximo à extremidade N-terminal, o qual é similar ao motivo WCGPCK(R), típico do sítio ativo das tiorredoxinas, a triparredoxina mostra uma baixa identidade em relação a estas últimas. A demonstração da existência de triparredoxina, triparredoxina peroxidase e tripanotiona redutase em T. cruzi sugere similaridade com o sistema de peroxidase descrito em C. fasciculata e que a defesa antioxidante em T. cruzi envolve um sistema enzimático mediado por tripanotiona e dependente de NADPH. As evidências disponíveis confirmam a existência do sistema peroxidase tripanotiona-dependente em T. cruzi, contrariando a afirmativa prévia da literatura que considerava a redução de peróxidos como uma reação não-enzimática. Esses resultados abrem a perspectiva de utilização do sistema como um potencial alvo para o desenvolvimento de quimioterápicos. / The American trypanosome Trypanosoma cruzi is exposed to a variety of toxic oxygen metabolites normally produced by endogenous processes as well as by responses to drugs or the action of the immune system. In either case, the cells need to be protected against the products of the partial reduction of oxygen. Trypanosomes are particularly weak in antioxidant defenses. Although possessing superoxide dismutase activity, they lack glutathione peroxidase and catalase which are necessary for the removal of hydrogen peroxide. Moreover, glutathione, the major antioxidant sulphydryl compound in mammalian cells, is present in low concentration in trypanosomes. Instead they contain a unique cofactor, a glutathione-spermidine conjugate, known as trypanothione (N1, N8-bis(glutathionyl)spermidine) which together with its ancillary enzymes, trypanothione reductase and trypanothione-dependent peroxidase system, appears to play a central role in the antioxidant defense mechanism in C. fasciculate. This system seems to be widespread among trypanosomatids, being an important target for a direct chemotherapeutic attack. The existence of this metabolic system in the human pathogen T. cruzi is supported by a low trypanothione-dependent peroxidase activity. It was found in crude extracts of epimastigote and trypomastigote forms using t-butyl hydroperoxide as oxidant. The existence of this metabolic pathway in T. cruzi is demonstrated by immunohistochemistry using antibodies raised against tryparedoxin (Cf16) and tryparedoxin peroxidase (Cf21) from C. fasciculate. Epimastigotes and trypomastigotes of T. cruzi display strong immunoreactivity by indirect immunofluorescence with these antibodies. White in epimastigotes immunofluorescence is homogeneously distributed in the cytoplasm, in trypamastigostes - the infective form for vertebrates - it appears in a discontinuous manner closer to the cytoplasmic side of the plasmic membrane. These polyclonal antibodies were employed to identify, by Western blot, the correspondening T. cruzi proteins. Two proteins with apparent molecular masses of 16 and 21 kDa, Tc16 and Tc21, were, respectively, recognized. In addition, oligonucleotides were synthesized using sequences based on the conserved regions of DNA coding sequence of peroxiredoxin from trypanosomatids and other organisms. Using these primers in PCR assays with cDNA, a product with 525 bp was amplified. This partial gene sequence shared identity with the homologous enzyme of C. fasciculate. The partial tryparedoxin peroxidase gene sequence of T. cruzi (Tc21) obtained up to this point (corresponding to positions 1 to 525) matched 100% with a published sequence presumed to encode a peroxiredoxintype protein in T. cruzi (acc. nr. AJ012101). Taking advantage of this full-length open reading frame, the putative Tc21 gene from T. cruzi was amplified from genomic DNA by PCR, cloned the PCR product into the vector pET21b(+) and expressed in E.colli BL21(DE3). Activity of tryparedoxin peroxidase was mesured by an heterologous coupled system monitoring the NADPH consumption upon hydroperoxide addition. This enzyme is a member of the peroxiredoxin family of antioxidant proteins and is characterized by the presence of two conserved domains - VCP - containing redox active cysteines. Although attempted, the isolation of the tryparedoxin gene was not successfull. Notwithstanding, the existence of the protein was apparent as seen by Western blot and immunofluorescence using the C. fasciculate heterologous antibody. Tryparedoxin is a new member of the thioredoxin superfamily of proteins isolated from C. fasciculate. With a molecular weight of 16 kDa, it is larger than thioredoxin from vertebrates. Moreover, apart from the sequence motif WCPPC near its N-terminus, which is similar to the thioredoxin-type active site motif WCGPCK(R), tryparedoxin display low similarity to the classical thioredoxin. The active motif WCPPCR is common to all known tryparedoxins. The demonstration of the existence of tryparedoxin, tryparedoxin peroxidase and trypanothione reductase in T. cruzi suggests that the antioxidant defense of this pathogenic protozoan also depends on the NADPH-fuelled, trypanothione-mediated enzymatic hydroperoxide metabolism, similarly to the C. fasciculate metabolic pathway. As oppsed to previous claims, the available evidence confirms the existence of trypanothione peroxidase activity in T. cruzi, making the enzymes system as molecular targets for the design of trypanocidal compounds.

Made available in DSpace on 2016-08-10T10:55:14Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Suleimy Marinho Fernandes Cardoso.pdf: 1298477 bytes, checksum: 2bc33390b33dfabc78bb1026fbca028f (MD5) Previous issue date: 2006-08-30 / The objective of this study was to evaluate the diversity of found vectors as well as their habitat preference and apatial distribution in a region around Brasília within the area of direct influence of the reservoir of the Corumbá IV hydroelectric power plant (UEH Corumbá IV) comparing the data with the history of occurrence and prevalence of the Chagas disease in the region and the environmental impact of the power plant. In canopies of guariroba palm trees (Syagrus oleraceae) and graveteiro nests (Phacellodomus rufifrons) 1981 triatomines (barbeiros) were collected belonging to the species Rhodnius neglectus, Panstrongylus neglectus, Panstrongylus diasi and Psammolestes tertius within February 19th 2005 and January 21st 2006. The triatomines were also searched for in armadillo holes, hen houses, and rural houses but no specimens were found. A parasitological examination was performed and none of the triatomines analyzed were contaminated by Trypanosoma cruzi despite the notification of Chagas disease cases in the surrounding cities of the study area. In conclusion, despite the presence of R. neglectus, pontecial vector, it was not possible to detect T. cruzi in the analyzed insects. However, the risk of human and triatomines infection should be carefully evaluated. / O objetivo deste trabalho foi fazer um levantamento de vetores encontrados, bem como sua preferência de habitat e a sua distribuição espacial, numa região do entorno de Brasília, dentro da área de influência direta da usina hidrelétrica Corumbá IV (UHE Corumbá IV), relacionando os dados com a história de ocorrência e prevalência da doença de Chagas na região e o provável impacto ambiental. Em copas de palmeiras guariroba (Syagrus oleracea) e ninhos de graveteiro (Phacellodomus rufifrons) foram coletados 1.981 triatomíneos (barbeiros), pertencentes às espécies Rhodnius neglectus, Panstrongylus geniculatus, Panstrongylus diasi e Psammolestes tertius, no período de 19 de fevereiro de 2005 a 21 de janeiro de 2006. Os triatomíneos também foram procurados em buracos de tatu, galinheiros e em residências rurais, mas nenhum espécime foi encontrado. Foi realizado exame parasitológico e nenhum dos triatomíneos analisados estavam contaminados pelo Trypanosoma cruzi, embora ocorra notificação de casos da doença de Chagas nas cidades vizinhas da região em estudo. Concluindo assim que, apesar da presença de R. neglectus potencial vetor, não foi possível constatar a presença do T. cruzi nos insetos examinados, porém o risco de infecção humana e de triatomíneos deve ser cuidadosamente avaliado.