Submitted by Anderson Silva (avargas@icict.fiocruz.br) on 2012-10-18T20:17:52Z No. of bitstreams: 1 anissa_daliry_ioc_bcm_0031_2011.pdf: 14613668 bytes, checksum: 93e5077e14be3ffeb54129fc214799c9 (MD5) / Made available in DSpace on 2012-10-18T20:17:52Z (GMT). No. of bitstreams: 1 anissa_daliry_ioc_bcm_0031_2011.pdf: 14613668 bytes, checksum: 93e5077e14be3ffeb54129fc214799c9 (MD5) Previous issue date: 2011 / Universidade Federal do Rio de Janeiro. Instituto de Biofísica Carlos Chagas Filho. Rio de Janeiro, RJ, Brasil / A doença de Chagas, causada pelo Trypanosoma cruzi, é endêmica na América Latina, afetando mais de 15 milhões de pessoas. Como seu tratamento apresenta eficácia limitada e considerável toxicidade novas drogas são necessárias. Neste contexto, com a colaboração de grupos de química medicinal, nosso objetivo é a investigação da atividade tripanocida, seletividade, alvos celulares e mecanismos de ação de diamidinas aromáticas (DAs) e análogos. Inicialmente avaliamos o efeito tripanocida de onze DAs sobre as formas tripomastigotas e amastigotas intracelulares, assim como sua toxicidade para células de mamíferos e localização intracelular no parasito. Entre estes onze compostos, 2, 5 e 7 foram os mais ativos, com valores de IC50 na faixa micromolar e um alto índice de seletividade sobre as duas formas de T. cruzi. Através de microscopia de fluorescência (MF) foi possível localizar todos os compostos em organelas ricas em DNA, núcleo e mitocôndria (kDNA) e a análise ultraestrutural utilizando os compostos 5 e 7 revelou que estes compostos levam a danos mitocondriais, incluindo desorganização do kDNA em formas tripomastigotas. O acúmulo das diamidinas foi maior no kDNA do que no núcleo, porém tal acúmulo não está correlacionado a uma maior atividade tripanocida. A seguir, visando um melhor entendimento do mecanismo de ação de diamidinas e análogos, investigamos uma possível correlação entre as propriedades de ligação ao kDNA de treze compostos com a atividade tripanocida, através de estudos de desnaturação térmica (Tm) e dicroísmo circular (DiC). Nossos resultados mostram tanto com kDNA purificado de epimastigotas como com uma sequência conservada de 22-mer presente em minicírculos de T. cruzi, que a forte interação de amidinas ao kDNA não é o fator determinante para desencadear sua atividade tripanocida. Nosso próximo passo foi a avaliação de alterações topológicas induzidas por dez compostos aromáticos sobre o kDNA de T. cruzi através de alteração da mobilidade em gel e MF. Os estudos eletroforéticos foram conduzidos pela incubação de fragmentos de kDNA, obtidos pela digestão com as endonucleases EcoRI e CvQI, com os compostos por análise em gel de poliacrilamida. As diamidinas DB889 e DB185 induziram consideráveis alterações na mobilidade dos fragmentos. Além disso, incubando a rede intacta e purificada de kDNA com a DB75 e monitorando o efeito por MF, obervarmos a capacidade desta DA de induzir um grande aumento da área da rede. Em resumo, nossos resultados revelam que diamidinas e congêneres são capazes de induzir profundas alterações na topologia do kDNA do T. cruzi sugerindo que esta estrutura pode ser um dos possíveis alvos destes compostos. Entretanto, a localização preferencial dos compostos no kDNA, assim como sua afinidade à esta estrutura e capacidade de alterar a mobilidade dos fragmentos em géis de poliacrilamida não está correlacionada com sua atividade tripanocida. Estes dados sugerem fortemente que outros fatores podem estar envolvidos no mecanismo de ação destes compostos, operando de modo primário ou secundário a interação composto:kDNA. Outros estudos serão necessários para melhor identificar os mecanismos envolvidos na ação destes compostos, visando contribuir para o desenho racional de compostos líderes para o tratamento da doença de Chagas. / Chagas disease, caused by Trypanosoma cruzi, is endemic in Latin America, affecting more de 15 million people. Due to the limited efficacy and considerable toxicity, the therapy for Chagas disease is far from being considerable ideal and thus alternative drugs are urgently needed. In this context, with the collaborations of medicinal chemistry groups, our aim was to investigate the trypanocidal activity, selectivity, cellular targets and mechanisms of action of aromatic diamidines (ADs) and analogues. First, we tested the trypanocidal effect of eleven ADs upon intracellular amastigotes and trypomastigotes, their toxicity towards mammalian cells and their sub-cellular localization. Compounds 2, 5 and 7 were the most active, presenting IC50 values on the micromolar range and displaying high selectivity indexes for both T. cruzi forms. Using fluorescence microscopy (FM), all the compounds were localized in organelles rich in DNA, nucleus and mitochondrion (kDNA) and in bloodstream forms treated with the compounds 5 and 7 we observed ultrastructural damages on mitochondrial organelle, including kDNA disorganization. The accumulation of the diamidines was higher in the kDNA than in the nucleus, but such accumulation could not be correlated with a higher trypanocidal activity. Next, aiming to better understand the mechanism of action of diamidines and analogues, we investigated the possible correlation between kDNA binding properties of thirteen compounds with their anti-T. cruzi effect, through thermal denaturation (T m) and circular dichroism (CiD) studies. Our data demonstrated using the purified kDNA of epimastigotes or a conserved synthetic parasite sequence of 22-mer present in T. cruzi minicircles, that the strong interaction of the amidines with the kDNA is not a determinant factor to the triggering of the trypanocidal activity. Our next step was the evaluation of topological changes induced by ten aromatic compounds on T. cruzi kDNA, through gel mobility shifts and FM. The eletrophoretic studies were conducted by the incubation of kDNA fragments obtained by digestion with the endonucleases EcoRI e CvQI with the compounds and analysis by poliacrylamide gel. The diamidines DB889 and DB185 induced substantial mobility shifts in the fragmented bands. Additionally, by FM of whole kDNA network incubated with DB75 we observed the ability of this diamidine to cause a striking expansion of the kDNA network area. Taken together our results suggest that diamidines and related compounds provoke profound alterations in the normal topology of T. cruzi kDNA suggesting that this structure may represent one of the potential targets of these compounds. However, the compound preferential accumulation in kDNA, as well as their affinity and capability of inducing topological changes in that structure is not correlated with their anti-T. cruzi activity. These findings strongly suggest that other molecular mechanisms may be also operating primarily or secondarily to the drug:KDNA interaction. Further studies are needed to better identify the mechanisms involved in the activity of this class of chemical, aiming to contribute to the rational design of lead compounds for the treatment of Chagas disease .

Submitted by Anderson Silva (avargas@icict.fiocruz.br) on 2012-11-26T15:43:37Z No. of bitstreams: 1 daniel_a_p_martins_ioc_bcm_0024_2010.pdf: 10130276 bytes, checksum: 596c01e9402f3b4dd80395ef8bc4aa50 (MD5) / Made available in DSpace on 2012-11-26T15:43:37Z (GMT). No. of bitstreams: 1 daniel_a_p_martins_ioc_bcm_0024_2010.pdf: 10130276 bytes, checksum: 596c01e9402f3b4dd80395ef8bc4aa50 (MD5) Previous issue date: 2010 / Universidade Federal do Rio de Janeiro. Instituto de Biofísica Carlos Chagas Filho. Departamento de Neurobiologia. Rio de Janeiro, RJ,Brasil / A doença de Chagas é causada pelo protozoário Trypanosoma cruzi sendo a principal causa de morbi-mortalidade entre as cardiopatias na América Latina, onde é endêmica. No presente trabalho nós utilizamos modelos experimentais tais como cultivo celular e infecção de camundongos albinos para avaliar aspectos relacionados à patogênese desta doença. Primeiramente utilizamos a técnica de microarranjos de oligonucleotídeos para determinar as diferentes assinaturas transcriptômicas induzidas por quatro diferentes cepas de T. cruzi em uma linhagem de células musculares. Neste trabalho, verificamos que os genes alterados significativamente nas células infectadas (p<0,05) foram diferentes para cada cepa e apenas 21 sofreram a mesma alteração nas quatro cepas estudadas. No entanto, mioblastos apresentaram assinaturas transcriptômicas únicas após infecção pelas quatro cepas de T. cruzi utilizadas. Estes resultados indicam que a infecção com diferentes cepas do parasito modula vias similares, porém não idênticas, nas células hospedeiras. Em seguida analisamos o impacto da infecção de cardiomiócitos murinos na expressão de caveolina-3 (Cav-3), proteína formadora das cavéolas, importantes para a manutenção da homeostase de cálcio intracelular e envolvida em processos de hipertrofia cardíaca. A infecção in vitro e in vivo por T. cruzi induziu redução significativa (p<0,05) nos níveis de Cav-3. Esta redução foi acompanhada pela ativação da quinase regulada por sinal extracelular (ERK), majoritariamente envolvida no processo de remodelamento e hipertrofia cardíacos, sugerindo a participação desta via de sinalização na patogênese da doença de Chagas. Por último, avaliamos a capacidade tripanocida do composto antiarrítmico amiodarona em culturas de cardiomiócitos infectadas. Este composto apresentou atividade seletiva anti-T. cruzi, promovendo danos ultra-estruturais às formas amastigotas intracelulares e a recuperação da célula hospedeira, incluindo restabelecimento do citoesqueleto de actina e junções comunicantes, além da contratilidade espontânea das culturas. O conjunto de dados gerado com esta tese traz importantes avanços para o entendimento do estabelecimento da doença de Chagas cardíaca e novas opções para o tratamento etiológico desta doença negligenciada. / Chagas’disease is caused by the protozoan Trypanosoma cruzi and is the main cause of morbidity and mortality by heart problems in endemic countries in Latin America. In the present work we employed as experimental models cell cultures and murine experimental infection to evaluate aspects related to the pathogenesis of this disease. In the first part we determined through oligonucleotide microarrays the transcriptomic signatures induced in a myoblast cell line by four reference T. cruzi strains. We observed that the significantly altered (p<0.05) genes differed for each strain studied and only 21 suffered changes in the same direction in all four strains. However, infected myoblasts presented proportional alterations in the the overall transcriptome. These results indicate that the infection with distinct strains modulate similar, but not identical, pathways in the host cell. Next we analyzed the impact of T. cruzi infection on cardiac caveolin-3 (Cav-3) expression, which has an important role in the maintenance of intracellular calcium homeostasis and is also involved in cardiac hypertrophy pathways. Both in vitro and in vivo infection induced a significant reduction of Cav-3 levels. This reduction was followed by the activation of extracellular signal regulated kinase (ERK), which plays a major role in cardiac remodeling and hypertrophy, suggesting that this pathway may be involved in the pathogenesis of Chagas’ heart disease. Finally we tested the tripanocidal potential of the anti-arrhythmic drug amiodarone in infected cultures of cardiac myocytes. This compound displayed a selective anti-T. cruzi activity, inducing ultrastructural alterations in intracellular amastigotes and promoted host cell recovery with actin cytoskeleton and gap junction reassembly, followed by restoration of the spontaneous contractility. The data generated in this work bring important advances into the understanding of Chagas heart disease establishment and also a new option for the etiological treatment of this neglected disease.

Submitted by Tatiana Silva (tsilva@icict.fiocruz.br) on 2013-02-15T18:25:22Z No. of bitstreams: 1 vitor_e_vidal_ioc_bcm_0021_2010.pdf: 5115263 bytes, checksum: fa627a814efc2aa5bda7207fe780c399 (MD5) / Made available in DSpace on 2013-02-15T18:25:22Z (GMT). No. of bitstreams: 1 vitor_e_vidal_ioc_bcm_0021_2010.pdf: 5115263 bytes, checksum: fa627a814efc2aa5bda7207fe780c399 (MD5) Previous issue date: 2010 / Fundação Oswaldo Cruz.Instituto Oswaldo Cruz. Rio de janeiro, RJ, Brasil / As calpaínas constituem uma família de cisteína-peptidases neutras dependentes de cálcio presentes numa ampla variedade de organismos. Em virtude da relevância fisiológica dessa proteases, inibidores de calpaínas já vêm sendo desenvolvidos para o tratamento de doenças humanas e microbianas. Estudos recentes vêm relatando a presença de diversas proteínas relacionadas às calpaínas em tripanossomatídeos, mas pouco se sabe a respeito das funções específicas dessas proteínas nesses micro-organismos. Nesse contexto, uma vez que os fármacos atualmente disponíveis para o tratamento da doença de Chagas apresentam sérios efeitos colaterais e podem ser ineficazes, inibidores proteolíticos poderiam ser uma alternativa no tratamento desta doença. Portanto, o presente trabalho investiga a presença de moléculas similares às calpaínas no Trypanosoma cruzi e o efeito inibidor do inibidor III de calpaínas (MDL28170) sobre a proliferação, viabilidade, diferenciação, ultraestrutura e interação das diferentes formas do parasito com células hospedeiras em ensaios in vitro. Nossos resultados revelam a reatividade cruzada de anticorpos produzidos contra calpaínas já bem caracterizadas de Drosophila melanogaster, Homarus americanus e. Trypanosoma brucei contra moléculas de superfície do T. cruzi, conforme demonstrado por imunofluorescência e citometria de fluxo. Em ensaios de Western Blotting foi possível observar que o anticorpo anti-DM-calpaína foi capaz de reagir contra uma proteína de 80 kDa. Pesquisas realizadas no GenBank demonstraram a presença de 4 seqüências nomólogas à calpaína de D. melanogaster no genoma do T. cruzi. Essas 4 seqüências foram identificadas como cisteína-paptidases de massa molecular predita em torno de 80kDa. Nos ensaios de inibição com o MDL28170 foi possível observar a redução da proliferação das formas epimastigotas ao longo de 5 dias de cultura; e a redução significativa da viabilidade das formas tripomastigotas sanguíneas dos parasitos tratados com 25 µM do composto. O inibidor, adicionado nas concentrações de 6,25 à 25 µM, também foi capaz de diminuir de forma dose- e tempo-dependente o número de macrófagos parasitados e o número de parasitas interiorizados nos ensaios de interação com macrófagos peritoneais murinos. O MDL28170 em concentração a partir de 12,5 µM teve ainda um efeito inibitório significativo sobre a adesão de formas epimastigotas ao epitélio intestinal de Rhodnius prolixus; assim como os anticorpos anti-calpaínas foram capazes de inibir significativamente a interação com o inseto vetor. Por fim, foi possível observar uma redução significativa no processo de diferenciação por metaciclogênese em meio TAU e alterações ultraestruturais em reservossomos, Golgi e membrana plasmática quando formas epimastigotas do T. cruzi foram tratadas com MDL28170.. Embora mais estudos sejam necessários para melhor caracterizar moléculas similares às calpaínas no T. cruzi, o nosso trabalho acrescenta novos conhecimentos sobre as possíveis funções dessas moléculas e sobre a possibilidade de utilização de inibidores de calpaínas como uma alternativa promissora para o desenvolvimento de compostos mais potentes e seletivos para o tratamento da doença de Chagas. / The calpains are a family of cysteine ​​peptidases neutral calcium dependent present in a wide variety of organisms. Due to the physiological relevance of such proteases, calpain inhibitors have already been developed for the treatment of human diseases and microbial. Recent studies have reported the presence of several proteins related to calpain in trypanosomatids, but little is known about the specific functions of these proteins in these micro-organisms. In this context, since the drugs currently available for the treatment of Chagas' disease have serious side effects and can be ineffective, proteolytic inhibitors could be an alternative in treatment of this disease. Therefore, the present study investigates the presence of molecules similar to calpain in Trypanosoma cruzi and the inhibitory effect of calpain inhibitor III (MDL28170) on proliferation, viability, differentiation, ultrastructure and interaction of the different forms of the parasite with host cells in vitro tests . Our results reveal the cross-reactivity of antibodies produced against calpains already well-characterized Drosophila melanogaster, and Homarus americanus. Trypanosoma brucei against surface molecules of T. cruzi, as demonstrated by immunofluorescence and flow cytometry. In assays Western Blotting was observed that the anti-DM-calpain was able to react against a protein of 80 kDa. Surveys conducted in GenBank showed the presence of 4 nomólogas the calpain sequences of D. melanogaster genome of T. cruzi. These four sequences were identified as cysteine ​​paptidases predicted molecular mass of around 80 kDa. In inhibition assays with MDL28170 was possible to observe a reduction in the proliferation of epimastigotes over 5 days of culture, a significant reduction in the viability of blood trypomastigotes of parasites treated with 25 mM of the compound. The inhibitor added at concentrations of 6.25 to 25 mM, was also able to decrease in a dose-and time-dependent number of infected macrophages and the number of parasites internalized interaction assays with murine peritoneal macrophages. The MDL28170 in concentration from 12.5 mM still had a significant inhibitory effect on the adhesion of epimastigotes to the intestinal epithelium of Rhodnius prolixus, as well as anti-calpain were able to significantly inhibit the interaction with the insect vector. Finally, we observed a significant reduction in the differentiation process by metacyclogenesis amid TAU and ultrastructural changes in reservossomos, Golgi and the plasma membrane when epimastigotes of T. cruzi were treated with MDL28170 .. Although more studies are needed to better characterize molecules similar to calpains in T. cruzi, our work adds new insights into the possible roles of these molecules and the possibility of using inhibitors of calpain as a promising alternative for the development of more potent and selective compounds for the treatment of Chagas' disease.

Made available in DSpace on 2014-12-05T18:38:23Z (GMT). No. of bitstreams: 2 license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) delma_cunha_ipec_dout_2012.pdf: 1253714 bytes, checksum: bc086d9616225051a4033e536dadb1c8 (MD5) Previous issue date: 2014-11-18 / Fundamentos: A Cardiopatia Chagásica Crônica (CCC) cujo agente etiológico é o Trypanosoma cruzi (T.cruzi) compromete 20 a 30 % dos indivíduos infectados. No Brasil, 2 a 3 milhões de pessoas estavam infectadas até 1980 e na América Latina 18 milhões de pessoas. Dados mais recentes da OMS (1991) mostram que esse número diminuiu para 11 milhões até 1990. Um dos mecanismos propostos para explicar o dano miocárdico na CCC é o autoimune. Objetivos: Relacionar a titulação dos anticorpos anti \03B21 e anti M2 com função ventricular esquerda, disautonomia e arritmias cardíacas. Metodologia: Estudo transversal com 64 pacientes portadores de CCC confirmada sorologicamente por Elisa e Hemaglutinação. A titulação dos anticorpos anti-\03B21 e anti-M2 foi obtida pelo imunoensaio ELISA. A análise da função ventricular esquerda foi feita pelo ecocardiograma através da fração de ejeção (FE) pelo método de Simpson. As arritmias cardíacas foram avaliadas pelo Holter cardíaco de 24 h assim como a disautonomia (variabilidade da freqüência cardíaca). O teste ergométrico avaliou disautonomia (queda da frequência cardíaca no primeiro minuto de recuperação) e desempenho cardíaco durante o esforço. O eletrocardiograma de alta resolução (ECGAR) avaliou o potencial arritmogênico em pacientes sem distúrbios de condução ao eletrocardiograma (ECG) Resultados: Holter de 24h: existe uma correlação inversa significativa entre a titulação de anti-\03B21 com o SDNN index de 2 às 6h (rs = - 0,313; p= 0,041; n=43) e uma correlação direta significativa entre a titulação do anti- M2 com SDANN de 2 às 6h (rs = 0,317; 0,039; n=43) . Teste ergométrico: observou-se correlação direta significativa entre a titulação anti-\03B21 e o duplo produto (rs=0,371; p=0,005, n=56).O subgrupo com resposta cronotrópica normal apresentou titulação anti-\03B21 significativamente maior que o subgrupo com resposta cronotrópica deprimida (p = 0,023). O subgrupo com resposta inotrópica normal apresentou titulação anti-M2 significativamente maior que o subgrupo com resposta inotrópica deprimida (p=0,044). Ecocardiograma: FE (Simpson) não correlacionou significativamente com anti-B1 e anti-M2 (rs =0,045; p = 0,73 ; n=62), (rs =-0,036; p = 0,78), respectivamente. ECGAR: RMS>20 e LAS <38 não mostrou correlação significativa de RMS com as titulações de anti- \03B21 (rs-0,268; p= 0,26; n=18) e anti-M2 (rs= - 0,121; p=0,63; n=18) e de LAS com anti- \03B21 (rs =0,006; p = 0,98; n=18) e anti- M2 (rs=0,059; p=0,82; n=18). ECG: titulação de anti-\03B21 e anti- M2 foram significativamente maiores no grupo com Fibrilação atrial (FA) que no grupo sem FA (p=0,01) e (p=0,029) respectivamente. O subgrupo com ritmo cardíaco sinusal apresentou anti-M2 significativamente menor que o subgrupo sem ritmo cardíaco sinusal (p= 0,035) Análise multivariada: o Duplo Produto (p=0,016) foi variável independente, ao nível de 5%, para titulação anti-\03B21. SDANN de 2 ás 6h (p=0,13) foi variável independente ao nível de 15% para explicar a titulação de anti-M2. Conclusões: Os anticorpos anti- \03B21 correlacionam de forma inversa e significativa com o SDNN index e o SDANN ao Holter de 24h no período de 2 às 6h, de forma direta com duplo produto ao teste ergométrico, resposta cronotrópica e com fibrilação atrial ao ECG. Os anticorpos anti-M2 correlacionam diretamente com o SDNN index e SDANN ao Holter, com a resposta inotrópica normal ao teste ergométrico e com a fibrilação atrial ao ECG. Análise multivariada: o duplo produto é variável independente (5%) para anti-\03B21 e SDANN(15%) é variável independente para anti- M2 / Fundamentals: The chronic chagas’ cardiopathy (CCC), whose etiologic agent is the Trypanosoma cruzi (T.cruzi), commits 20 to 30 % of the infected subjects. I n B r a zi l , 2 to 3 million people were infected until 1980 and, in Latin America, 18 million people. More recent data from OMS (1991) showed that this number decreased to 11 million until 1990. Thus, one of the mechanisms proposed to explain the myocardial damage is auto-immunity. Objectives: To relate anti-β1 and anti-M2 antibodies titration with left ventricular function, dysautonomia and cardiac arrhythmias. Methodology: Cross-sectional study with 64 patients serologically confirmed by ELISA and He- magglutination to have CCC. The titration of the anti-β1 and anti-M2 antibodies was obtained by ELISA. The analysis of the left ventricular function was performed by echocardiography using the ejection fraction (EF) by the Simpson method. The cardiac arrhythmias were evaluated by 24h Holter and so was the dysautonomia (HEART RATE Variability). The stress test was used to evaluate the dysautonomia (heart rate recovery at the first minute) and the cardiac performance during stress. The signal-average electrocardiogram (SAECG) was used to study the arrhythmogenic potential in patients without conduction disturbances at the electrocardiogram (ECG). Results: 24h Holter: there is a significant inverse correlation between the anti-β1 antibodies titration and SDNN index from 2 to 6h (rs=- 0.313; p=0.041; n=43). Also, there is a significant direct correlation between the anti-M2 antibodies titration and SDANN from 2 to 6h (rs = 0.317; 0.039; n=43). StressTest: we observed a significant direct correlation between the anti-β1 and the Double Product (rs=0.371; p=0.005, n=56). The subgroup with normal chronotropic response showed significantly higher anti- β1 titration than the one with depressed chronotropic response (p = 0.023). The subgroup with normal inotropic response showed significantly higher anti-M2 titration than the subgroup with depressed inotropic response (p=0.044). Echocardiography: EF (Simpson) had no significant correla- tion with anti-β1 and anti-M2 antibodies (rs =0.045; p = 0.73; n=62), (rs=-0.036; p = 0.78), respectively. SAECG: RMS>20 and LAS <38 didn’t show significant correlation between the RMS and the anti-β1 (rs -0.268; p= 0.26; n=18) and anti-M2 (rs = -0.121; p = 0.63; n=18) titration, and neither between LAS and both, anti- β1 (rs=0.006; p = 0.98; n=18) and anti-M2 (rs =0.059; p = 0.82; n=18), titrations. ECG: anti-β1 and anti-M2 antibodies titrations were significantly higher in the group with atrial fibrillation (AF) than in the one without AF (p=0.01 and p=0.029, respectively). The subgroup with sinus cardiac rhythm showed anti-M2 antibodies titration significantly lower than the subgroup without (p=0.035). Multivariate Analysis: the Double Product (p=0.016) was the independent variable, at the level of 5%, for the anti-β1 titration. SDANN from 2 to 6h (p=0.13) was the independent variable, at the level of 15%, to explain the anti-M2 titration. Conclusion: The anti-β1 antibodies significantly inversely correlate with the SDNN index and the SDANN at the 24h Holter in the period of 2 to 6h, and directly with the double product at the stress test, chronotropic response and atrial fibrillation at the ECG. The anti-M2 antibodies directly correlate with the SDNN index and SDANN at the Holter, with a normal inotropic response at the stress test and with atrial fibrillation at the ECG. Multivariate analysis: the double product is the independent variable (5%) for anti- β1 and SDANN (15%) is the independent variable for anti-M2

Made available in DSpace on 2014-12-05T18:40:16Z (GMT). No. of bitstreams: 2 fernanda_mariz_ioc_mest_2002.pdf: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) 1_fernanda_mariz_ioc_mest_2002.pdf: 397710 bytes, checksum: c5806b803bc46b6c3532cd3281026b69 (MD5) Previous issue date: 2014-11-18 / Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Oswaldo Cruz. Rio de Janeiro, RJ, Brasil / A doença de Chagas, cujo agente etiológico é o Trypanosoma cruzi, é considerada uma parasitose endêmica que acomete mais de 18 milhões de indivíduos na América Latina. Uma parte destes apresenta acometimento do sistema nervoso central e periférico. Vem sendo descrito, durante a fase aguda da doença, um intenso infiltrado inflamatório em regiões do tecido nervoso. Entretanto, os mecanismos envolvidos no aporte de células T e nas interações celulares neste tecido permanecem pouco esclarecidos. Assim, utilizamos neste trabalho um modelo in vitro visando estudar as interações entre células T de camundongos na fase aguda de infecção e células neuronais, exemplificadas por uma linhagem de neuroblastoma murino (N2a), e por neurônios do córtex cerebral oriundos de cultivo primário. Em particular, procuramos avaliar as interações mediadas por elementos de matriz extracelular (ECM), os quais sabidamente são capazes de interferir com os eventos de migração celular Inicialmente, observamos que células N2a e neurônios de cultivo primário expressam constitutivamente proteínas de ECM (laminina, fibronectina e colágeno tipo IV), cuja presença é aumentada na vigência de infecção in vitro pelo T. cruzi. Também pudemos notar aumento na adesão de células T às células N2a quando estas são infectadas in vitro e/ou quando os linfócitos T são oriundos de animais infectados. Este fenômeno é mediado, pelo menos em parte, por elementos de ECM, visto que pôde ser bloqueado por anticorpos antifibronectina, antilaminina e anticolágeno tipo IV. Nossos resultados indicam que ligantes e receptores de ECM encontram-se envolvidos na interação células T/células neuronais, a qual pode ocorrer após a infecção experimental pelo T. cruzi / Chagas disease, caused by the protozoan Trypanosoma cruzi , is an endemic parasitic disease affecting more than 18 million individuals in Latin America. Part of these patients develop symptoms related to the disorders in the pe ripheral and central nervous system. It has been described, during the acute phase of the d isease, an intense inflammatory infiltrate in the nervous tissue, but the mechanism (s) driving T cells to this tissue remain(s) to be clarified. We used an in vitro model to study the interactions between T cells derived T. cruzi -infected mice and neurons, herein exemplified by t he N2a murine neuroblastoma cell line, as well as by a brain cort ex-derived primary culture of murine neurons. In particular, we looked for extracellular matrix (ECM)- mediated interactions, known to affect T cell migration. We first showed that N2a cells and the primary cult ures of neurons constitutively express the ECM proteins, laminin, fibronectin and collagen type IV and that such an expression is upregulated upon T. cruzi infection in vitro . Moreover, adhesion of peripheral T cells was enhanc ed (as compared to non- infected conditions) when N2a cells were infected in vitro , or when T cells were derived from T. cruzi infected mice. This likely represents an ECM- medi ated event since it could be partially inhibited with anti-ECM antibodies. In conclusion, our results indicate that ECM ligand s and receptors are involved in the T cell/neuronal interactions that may occur following T. cruzi infection

Submitted by Ana Maria Fiscina Sampaio (fiscina@bahia.fiocruz.br) on 2015-03-27T17:55:05Z No. of bitstreams: 1 Marcos Lazaro Silva Guerreiro Influencia....pdf: 2165714 bytes, checksum: 9a6d8386215fdb4bd40dfb88b8b772a4 (MD5) / Approved for entry into archive by Ana Maria Fiscina Sampaio (fiscina@bahia.fiocruz.br) on 2015-03-27T17:55:17Z (GMT) No. of bitstreams: 1 Marcos Lazaro Silva Guerreiro Influencia....pdf: 2165714 bytes, checksum: 9a6d8386215fdb4bd40dfb88b8b772a4 (MD5) / Made available in DSpace on 2015-03-27T17:55:17Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Marcos Lazaro Silva Guerreiro Influencia....pdf: 2165714 bytes, checksum: 9a6d8386215fdb4bd40dfb88b8b772a4 (MD5) Previous issue date: 2014 / Fundação Oswaldo Cruz. Centro de Pesquisas Gonçalo Moniz. Salvador, BA, Brasil / A infecção pelo Trypanosoma cruzi determina uma resposta imunológica inata do hospedeiro vertebrado, decorrente da multiplicação parasitaria em macrófagos e a produção de Interferon gama (IFNy) pelas células T ativadas, além de estimulação policlonal de células do baço, com imunossupressão. Por outro lado tem sido demonstrado que o tratamento com quimioterápico Benzonidazol em camundongos infectados, além de determinar uma destruição dos parasitos, tem também uma ação sobre o sistema imunológico em camundongos infectados com cepas do T. cruzi com diferentes graus de suscetibilidade ao Benzonidazol, como a cepa Y (suscetível ao quimioterápico) e a cepa Colombiana (resistente). No presente estudo procura-se investigar a influência do tratamento com o Benzonidazol sobre a resposta imunológica em camundongos infectados com cepa suscetível (Cepa Y) ou resistente (Colombiana). Foram utilizados 320 camundongos, subdivididos em grupos experimentais: Infectados tratados cepa Y (YT) e não tratados (Y-NT); Colombiana tratados (COL-T) e não tratados (COL-NT), Tratados não infectados (TNI) e Controles sem tratamento (CI). O inóculo foi de 1,0 x 104 por via intraperitoneal. O tratamento foi iniciado no pico parasitêmico de cada cepa, sendo no 7º dia após a infecção nos animais infectados pela cepa Y e, nos tratados e não infectados, no 18º dia de infecção na cepa Colombiana. A quimioterapia foi realizada em 60 doses (100mg/kg/dia de Benzonidazol-Benz). Os camundongos sacrificados na fase aguda e na fase crônica em todos os grupos tiveram as secções de coração e músculo esquelético coletadas, fixadas e processadas para o estudo histopatológico em secções coradas pela Hematoxilina & Eosina e Picro-Sirius. Investigou-se a resposta humoral pela sorologia (Imunofluorescência indireta) e pela reação de Elisa. A resposta celular pela proliferação celular do baço, e pela avaliação quantitativa das subpopulações celulares no baço de CD4+, CD8+, células de memórias CD62L, células B e macrófagos. Também foi investigada a hipersensibilidade tardia pelo teste cutâneo (DTH). Os títulos sorológicos variaram de negativo a 1/640 YT, de 1/80 a 1/640 COL-T, de 1/80 a 1/2560 COL-NT, de negativo a 1/10 nos grupos TNI e CI. A dosagem das imunoglobulinas IgM, IgG1, IgG2a e IgG total, mostraram-se mais elevadas no grupo COL-NT em relação aos grupos avaliados. A dosagem das citocinas circulantes IL-6 IL-10, MCP-1, INF-γ e TNF-α, foram mais elevados na cepa Y, e o tratamento com Benz, não foi capaz de alterar os índices circulantes nos animais TNI. As análises citométricas do baço na fase aguda demonstraram maior frequência de CD4+ e CD8+ no grupo TNI; de células de memória (CD62L/CD4 e CD8) no grupo YT; de CD11b no grupo COL-NT fase aguda e na YT na fase crônica; e de células B (B220) no grupo CI. Na fase crônica foi evidenciado maior frequência de CD4+ e CD8+ no grupo COL-T; de células de memória: (CD4/CD62L) no grupo YT e (CD8/CD62L) no COL-T; de CD11b no YT; e de células B (B220) CI. Em nossos resultados constatamos pela análise dos infiltrados inflamatórios (miocárdio e músculo esquelético) lesões mais extensas no grupo COL-NT em relação a todos os grupos analisados (COL-T, YT). A análise do teste cutâneo de hipersensibilidade tardia demonstrou maior celularidade evidenciada pelos infiltrados inflamatórios e pelo edema nos tempos de 48 e 72 horas no grupo YT. Nossos resultados sugerem que o tratamento com Benz tem influência sobre a resposta imunológica em camundongos. / Infection with T. cruzi determines an immunological response in the vertebrate host, wit h parasites multiplication in macrophages, with production of TNFα by these cells an IFNγ, by stimulated T. cells: a polyclonal multiplication of spleen cells is present, with immunossuppression. Treatment of infected mice with BENZ showed that this chemotherapy determines parasitic destruction and also stimulates the immunological system in mice infected either with the Y or the Colombian strain which differs in the susceptibility to chemotherapy with BENZ. In the present study we intend to investigate the influence of treatment with BENZ on the immunological response in mice infected either with the Y strain (susceptible) or the Colombian strain (resistant). This study was performed by comparing the results obtained with the groups of mice not infected and treated, and infected controls, not treated. Material and methods : Number of animals: 320, sub-divided in the experimental groups:Ystrain infected and treated with BENZ(YT) or not-treated (YNT); Colombian treated (COL-T) and not-treated (COL-NT); treated not infected (TNI); Control not treated (COL-NT). Inoculum : 1x104 trypomastigotes, (blood forms) injected intraperitoneally. Treatment was initiated in the peak of parasitemia for each strain:7th day for the Y strain and in the 18th day in the infection with the Colombian strain. Chemotherapy was performed in 60 doses (100mg x kg x day) of BENZ. Mice were killed in the acute and chronic phases post infection; sections of the heart and skeletal muscles were collected, fixed and processed for histopathology, in sections stained with Hematoxylin and Eosin, and with Picro-Sirius staining, for collagen. The humoral response was evaluated by serological reactium of indirect immununofluorescence and ELISA reaction. Celular responses were evaluated by celular proliferation in the spleen of CD4+, CD8+ and memory cells (CD62L) macrophages and B cells. DTH was evaluated by intradermal skin teste. Serological titles varied in ted several grupos follows: YT: 0 - 1/640; COL-T: 1/80 to 1/640; COL-NT: 1/80 to 1/2560; TNI and CI: 0 – 1/10. Immunoglobulins leves (IgM, IgG1, IgG2a and total IgG) were higher in the groups COL-NT as ampered with the other groups. Evaluation of serum cytokines leves (IL-6, IL-10, MCP-1, IFN-γ and TNF-α): They were higler in mice infected with the Y strain. Treatment with Benzonidazole/BENZ did not influence the levels of cytokines in the group TNI. Cytometric analysis of the spleen in the acute phase showed a higher frequency of CD4+ and CD8+ cells in the group TNI; B cells (B220) in the CI group. In the chronic phase it has been show a higler frequency of CD4+ AND CD8+ in the groups COL-T; memory cells (CD4/CD62L) in the group YT; CD8/CD62L in the group COL-T; CD11B in the group COL-T acute phases the YT acute chronic . Histopathology of the heart and muscles showed presence of inflammatory infiltrates more intense in the group COL-NT as compared whit the several groups. The Skin Test for DTH revealed a higler cellularity of the inflammatory infiltrates in the groups YT, with 48 and 72 hours. Results suggest an influence of treatment with BENZ on the immunological response.

Submitted by Nuzia Santos (nuzia@cpqrr.fiocruz.br) on 2015-04-09T18:17:38Z No. of bitstreams: 1 Dissertacao_DIP_LauraCottaRepoles.pdf: 2325297 bytes, checksum: be8a47328cb27845c949da8c4cdb022f (MD5) / Approved for entry into archive by Nuzia Santos (nuzia@cpqrr.fiocruz.br) on 2015-04-09T18:17:48Z (GMT) No. of bitstreams: 1 Dissertacao_DIP_LauraCottaRepoles.pdf: 2325297 bytes, checksum: be8a47328cb27845c949da8c4cdb022f (MD5) / Approved for entry into archive by Nuzia Santos (nuzia@cpqrr.fiocruz.br) on 2015-04-09T18:17:58Z (GMT) No. of bitstreams: 1 Dissertacao_DIP_LauraCottaRepoles.pdf: 2325297 bytes, checksum: be8a47328cb27845c949da8c4cdb022f (MD5) / Made available in DSpace on 2015-04-09T18:17:58Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Dissertacao_DIP_LauraCottaRepoles.pdf: 2325297 bytes, checksum: be8a47328cb27845c949da8c4cdb022f (MD5) Previous issue date: 2014 / Fundação Oswaldo Cruz. Centro de Pesquisa René Rachou. Belo Horizonte, MG, Brasil / A triagem sorológica para doença de Chagas em bancos de sangue, obrigatória no Brasil desde 1969, aliada ao desenvolvimento de métodos para detecção de anticorpos anti-T.cruzi cada vez mais sensíveis, permitiram a diminuição da transmissão transfusional desta doença. No entanto, os resultados não negativos (positivos ou indeterminados/inconclusivos) e a discordância entre testes aumentaram consideravelmente, passando a representar um grande desafio para os hemocentros. Outro desafio está relacionado à reinclusão de indivíduos não negativos em triagens prévias como potenciais doadores. Resultados falso-positivos e inconclusivos promovem o descarte desnecessário de bolsas de sangue, além de rotular pessoas saudáveis como portadoras de uma doença grave. Assim, verifica-se a necessidade de desenvolver métodos capazes de distinguir com segurança resultados positivos verdadeiros dos falsos, além de resolver os resultados indeterminados. Neste contexto, o FC-TRIPLEX-IgG1 se apresenta como um método confirmatório inovador para o diagnóstico diferencial da doença de Chagas, leishmaniose visceral e leishmaniose tegumentar em plataforma única, utilizando citometria de fluxo. O objetivo deste estudo foi verificar o desempenho desta nova metodologia para o esclarecimento diagnóstico de amostras não negativas (n=91) e para o monitoramento sorológico de indivíduos com antecedente de não negatividade (n=100) na triagem para doença de Chagas realizada em três grandes hemocentros brasileiros. Para isto, as amostras foram triadas com os métodos ELISA (I e II) e RIFI e, em seguida, foram realizados os métodos confirmatórios recELISA e FC-TRIPLEX-IgG1. Os resultados mostraram alta discordância entre os testes de triagem (78,0%), além de grande número de reações indeterminadas. Nas amostras positivas em todos os testes de triagem, o FC-TRIPLEX-IgG1 e o recELISA apresentaram desempenho semelhante na confirmação dos resultados. Porém, o desempenho dos métodos no esclarecimento diagnóstico das amostras discordantes foi diferente (p=0,001). O FC-TRIPLEX-IgG1 foi positivo em muitas amostras positivas no ELISA-I e indeterminadas na RIFI, sugerindo sua aplicabilidade na confirmação de resultados e no esclarecimento diagnóstico de amostras não negativas. Já o recELISA foi positivo em muitas amostras negativas nos outros testes, o que mostrou sua baixa especificidade neste estudo. O teste de maior concordância com o FC-TRIPLEX-IgG1 foi a RIFI (k=0,5), seguida do ELISA-I (k=0,5), recELISA (k=0,2) e ELISA-II (k=0,2). O FC-TRIPLEX-IgG1 foi capaz de realizar o diagnóstico diferencial e também se mostrou útil na monitoração sorológica de indivíduos com antecedente de não negatividade na triagem para doença de Chagas, com 98,0% de concordância em amostras ELISA-RIFI- e 94,0% de concordância em amostras ELISA+RIFI+. Os resultados deste estudo sugerem que o FC- TRIPLEX-IgG1 é uma ferramenta promissora, de alta especificidade e desempenho, que pode ser aplicada em hemocentros para auxiliar no esclarecimento diagnóstico de resultados indeterminados/inconclusivos na triagem sorológica para doença de Chagas e na monitoração sorológica periódica de indivíduos com precedente de não negatividade, visando sua exclusão ou reinclusão como possível doador / The serological screening for Chagas' disease in blood banks, mandatory in Brazil since 1969, together with the development of methods for detection of anti-Trypanosoma cruzi antibodies increasingly sensitive, allowed the reduction of transfusion transmission of this disease. However, non-negative results (positive or indeterminate) and the discrepancy between tests increased considerably, and now represent a big challenge for blood banks. Another challenge is related to the re-inclusion of non-negative individuals in previous trials as potential donors. False-positive and inconclusive results further unnecessary disposal of blood bags, and label healthy people as having a serious illness. Thus, there is a need to develop methods capable of reliably distinguish true and false positive results, solving indeterminate results too. In this context, the FC-TRIPLEX-IgG1 presents itself as an innovative confirmatory method for the differential diagnosis of Chagas disease, visceral leishmaniasis and cutaneous leishmaniasis in a single platform, using flow cytometry. The aim of this study was to verify the performance of this new method to clarify the diagnosis of non-negative (n = 91) samples and to serological monitoring of individuals with a history of non-negativity (n = 100) in screening for disease testing Chagas performed in three major Brazilian blood centers. The samples were screened by the methods ELISA (I and II) and IFI and then the confirmatory methods recELISA and FC-TRIPLEX-IgG1 were performed. The results showed high discordance between screening tests (78.0%) and large number of indeterminate reactions. In positive samples in all screening tests, the FC-TRIPLEX-IgG1 and recELISA showed similar performance in confirmation of the results. However, the performance of the methods in diagnostic clarification of discordant samples was different (p=0.001). The FC-TRIPLEX-IgG1 was positive in many samples positive in ELISA-I and indeterminate in IFI, suggesting its applicability in confirmation of results and in clarifying the diagnosis of non-negative samples. Already recELISA was positive in many negative samples in all other tests, which showed a low specificity in this study. The test for a greater agreement with the FC-TRIPLEX-IgG1 was IFI (k=0.5), then the I-ELISA (k=0.5), recELISA (k=0.2) and ELISA-II (k=0.2). The FC-TRIPLEX-IgG1 was able to perform the differential diagnosis and also proved useful in the serological monitoring of individuals with a history of non-negativity in screening for Chagas disease, with 98.0% agreement in RIFI-ELISA- samples and 94.0% of agreement in ELISA+IFI+ samples. The results of this study suggest that FC-TRIPLEX-IgG1 is a promising tool, that has high specificity and performance, which can be applied to blood banks to assist in diagnosis clarifying indeterminate results in serological screening for Chagas disease and in periodic serological monitoring individuals with precedent of non-negativity, for their re-inclusion or exclusion as a possible donor

Submitted by Nuzia Santos (nuzia@cpqrr.fiocruz.br) on 2015-04-14T14:03:09Z No. of bitstreams: 1 Roberta Carvalho Ferreira - Avaliação da colonização de Trypanosoma cruzi e Trypanosoma rangeli no trato intestinal de Rhodnius prolixus - 2014.pdf: 1324987 bytes, checksum: b6cd417c99954e8fdca43e7c13cf5538 (MD5) / Approved for entry into archive by Nuzia Santos (nuzia@cpqrr.fiocruz.br) on 2015-04-14T14:03:19Z (GMT) No. of bitstreams: 1 Roberta Carvalho Ferreira - Avaliação da colonização de Trypanosoma cruzi e Trypanosoma rangeli no trato intestinal de Rhodnius prolixus - 2014.pdf: 1324987 bytes, checksum: b6cd417c99954e8fdca43e7c13cf5538 (MD5) / Approved for entry into archive by Nuzia Santos (nuzia@cpqrr.fiocruz.br) on 2015-04-14T14:03:30Z (GMT) No. of bitstreams: 1 Roberta Carvalho Ferreira - Avaliação da colonização de Trypanosoma cruzi e Trypanosoma rangeli no trato intestinal de Rhodnius prolixus - 2014.pdf: 1324987 bytes, checksum: b6cd417c99954e8fdca43e7c13cf5538 (MD5) / Made available in DSpace on 2015-04-14T14:03:30Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Roberta Carvalho Ferreira - Avaliação da colonização de Trypanosoma cruzi e Trypanosoma rangeli no trato intestinal de Rhodnius prolixus - 2014.pdf: 1324987 bytes, checksum: b6cd417c99954e8fdca43e7c13cf5538 (MD5) Previous issue date: 2014 / Fundação Oswaldo Cruz. Centro de Pesquisa René Rachou. Belo Horizonte, MG, Brasil / Os parasitos Trypanosoma rangeli e Trypanosoma cruzi entram no tubo digestivo do vetor através do repasto sanguíneo e o intestino médio anterior (IMA) é o local onde se dão as primeiras interações parasito-hospedeiro. Sendo assim, a colonização do IMA de Rhodnius prolixus por T. cruzi (cepa CL) e T. rangeli (cepa CHOACHI) foi avaliada no presente estudo. Inicialmente, o estabelecimento da infecção em ninfas infectadas com epimastigotas de cultura ou tripomastigotas sanguíneas foi comparativamente avaliado. A avaliação de diferentes parâmetros mostrou que a dinâmica de colonização foi diferente dependendo da forma do parasito utilizada para a infecção em ambas as espécies. Dessa forma, a avaliação da dinâmica de colonização dos parasitos no intestino de insetos infectados foi realizada com tripomastigotas sanguíneas, as formas naturalmente presentes no hospedeiro vertebrado. Além disso, a porção do trato intestinal onde ocorre a diferenciação das formas tripomastigotas para epimastigotas foi determinada para as duas espécies. Para infecções por T. rangeli, a diminuição gradativa no número de tripomastigotas no IMA e o concomitante aparecimento de formas intermediárias e epimastigotas a partir do primeiro dia pós-infecção (pi) indicaram que a sua diferenciação acontece nessa porção do intestino. No caso de infecções por T. cruzi, a presença de apenas formas tripomastigotas e intermediárias no IMA e a presença de formas intermediárias e epimastigotas no intestino médio posterior (IMP) dos insetos sugere que a sua diferenciação ocorre no IMP do vetor. A quantificação dos parasitos mostrou uma redução de mais de 80% nas populações de T. cruzi nas primeiras 24 horas pi. A primeira hipótese para avaliar esta redução seria a de que os parasitos estariam cruzando rapidamente o IMA e estabelecendo a infecção no IMP dos insetos. Entretanto, o reduzido número de parasitos encontrado no IMP não corroborou a hipótese. Na segunda hipótese, os parasitos poderiam estar aderidos ao epitélio do IMA e por essa razão não teriam sido quantificados nas contagens a fresco. A ausência de parasitos no IMA através da quantificação por qPCR, associada a análise do epitélio intestinal em miscroscópio, sugerem fortemente que o parasito não se adere ao epitélio intestinal do IMA. Finalmente, a possibilidade dos parasitos estarem sendo eliminados do IMA nestas primeiras horas pi foi avaliada. A significativa redução no número de parasitos incubados com diferentes tecidos de R. prolixus, particularmente com o IMA de insetos recém-alimentados, sugere que uma parte significativa da população de T. cruzi que entra no vetor juntamente com o repasto é eliminada por fatores presentes no IMA do inseto. Em conclusão, o presente estudo mostrou que embora T. cruzi e T. rangeli apresentem formas infectivas similares, os parasitos utilizam diferentes estratégias para iniciar a infecção nos seus hospedeiros invertebrados. / Trypanosoma rangeli and Trypanosoma cruzi enter the vector’s intestinal tract together with the bloodmeal and the anterior midgut is the first compartment they interact with. Therefore, in the present study, the colonization of Rhodnius prolixus anterior midgut by T. cruzi (CL strain) and T. rangeli (CHOACHI strain) was evaluated. Initially, the parasite establishment was compared in the anterior midgut of nymphs infected with culture epimastigotes versus blood trypomastigotes. The evaluation of different parameters showed that the colonization dynamics was different according to the parasite development stage used in the infection, for both species. Thereby, the next objective was to evaluate the anterior midgut colonization in insects infected with blood trypomastigotes, which are the forms naturally present in the vertebrate host. Additionally, the midgut portion where trypomastigotes differentiate into epimastigotes was determined for both flagellates. In T. rangeli infections, the gradual decrease in trypomastigote numbers and the finding of intermediate and epimastigote forms 24 hours (pi) in the anterior midgut indicates that the differentiation of the parasite occurs in this portion of the midgut. During T. cruzi infections, only trypomastigote and intermediate forms were observed in the anterior midgut, and the finding of intermediate and epimastigote forms in the posterior midgut suggests that its differentiation occurs in the insect’s posterior midgut. The parasite quantification showed that T. cruzi populations in the anterior midgut were reduced in about 80% during the first 24 hours pi. The first hypothesis to be tested evaluated wheter parasites rapidly crossed the anterior midgut and established infection in the posterior midgut. However, the low amount of parasites in the posterior midgut did not confirm this hypothesis. The other hypothesis suggests that parasites could be attached to the anterior midgut epithelium and, therefore, could not be quantified by the fresh counts. However, absence of parasites in the anterior midgut by qPCR and the analysis of the intestinal epithelium in the microscope showed that no parasites were attached to the anterior midgut at that period time point. Finally, the third hypothesis evaluated the possibility that parasites could have been killed in the anterior midgut during the first 24 hours pi. The reduction in number of parasites incubated with different tissues of R. prolixus, particularly with anterior midguts from blood fed insects indicates that a significant part of the T. cruzi population ingested with the blood meal is eliminated by factors present in the vector’s anterior midgut. In conclusion, this study showed that although T. cruzi and T. rangeli present similar infective forms, the parasites present different strategies to initiate the infection on their invertebrate hosts.

Made available in DSpace on 2015-10-23T12:45:32Z (GMT). No. of bitstreams: 2 roberto_ferreira_ioc_mest_2014.pdf: 2709079 bytes, checksum: e93a9ead39b05b47e7d6166d6417e363 (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2015-04-14 / Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Oswaldo Cruz. Rio de Janeiro, RJ, Brasil / Estudos desenvolvidos pelo grupo nos últimos anos demonstram o envolvimento do fator transformador de crescimento beta (TGF-\F062) na cardiopatia chagásica, com exacerbação dos seus níveis plasmáticos e da ativação da sua via de sinalização celular como aspectos desenvolvidos por pacientes nos estágios mais avançados da doença, associado também a níveis elevados de fibrose. Pacientes que apresentavam altos níveis de TGF-\F062 circulantes, após 10 anos de acompanhamento, evoluíram com pior prognóstico da doença. Recentemente, o polimorfismo no códon 10 do gene que codifica o TGF-\F0621 foi descrito por influenciar na produção desta citocina. Também foi observado que, em populações da Colômbia e do Peru, o mesmo polimorfismo pode estar envolvido na susceptibilidade à infecção pelo T. cruzi. O presente trabalho avaliou o polimorfismo dos alelos do gene do TGF-\F0621 em pacientes na fase crônica da doença de Chagas; incluindo a forma indeterminada e os diversos estágios da forma cardíaca e correlacionou a expressão dos diferentes alelos do TGF-\03B21 com os níveis séricos desta citocina e a manifestação clínica da doença de Chagas. Para isso, 181 indivíduos entre pacientes com forma indeterminada ou cardíaca e indivíduos controle foram convidados a participar do trabalho Foram realizadas análises de cinco polimorfismos de base única (-800 G>A, -509C>T, +10T>C, +25G>C e +263C>T) por PCR e sequenciamento das regiões de interesse. Além disso, os níveis séricos desta molécula e do peptídeo natriurético cerebral (BNP) foram dosados por ELISA. Ao analisar a frequência genotípica nos diferentes polimorfismos, observamos que a frequência do polimorfismo na posição -509 e no códon 10 eram maiores em pacientes portadores da doença que em indivíduos controle. Além disso, os genótipos CT e TT na posição -509 estão associados com altos níveis séricos do TGF-\F0621. Observamos que pacientes nos estágios mais graves apresentam maiores níveis circulantes de BNP, mas, não observamos qualquer relação entre os níveis de TGF-\F062 e BNP. Desta forma, nossos resultados sugerem que os polimorfismos genéticos na posição -509 e no códon 10 do gene TGF-\F0621 podem estar envolvidos na susceptibilidade à infecção pelo T. cruzi na doença de Chagas / Studies developed by our group have shown the involvement of TGF -  in Chagas heart disease, with exacerbation of their plasma levels and the activation of its cell signaling pathway, as aspects develop ed by patients in later stages of the disease, also associated with high levels of fibrosis. Patients with high er levels of circulating TGF -  , after 10 years of follow up , progressed with worse prognosis. Recently, the polymorphism at codon 10 in the TGF -  1 gene has been described to influence the production of this cytokine. It was also noted that in populations from Colombia and Peru, the same polymorphism may be involved in susceptibility to T. cruzi infection. Th e present study assessed the polymorphism of the alleles of the TGF -  1 gene in patients with chronic Chagas disease: indeterminate and the different stages of cardiac form s, correlating the expression of different alleles of TGF - β 1, serum levels of this cytokines and the clinical outcome of Chagas disease. For this, 181 co ntrol and patients of different stage s in the chronic phase of Chagas disease were invited to participate in the study. We investigated, five single nucleotide polymorphisms ( - 800 G> A, - 509C> T + 10T> C + 25G> C and + 263C> T) by PCR and sequencing of fra gments were performed. In addition, serum levels of TGF -  1 and BNP were measured by ELISA. We observed a significant difference in the frequency at positions - 509 and codon 10. These genotypes represent a risk for susceptibility to the development of Chagas disease. Furthermore, CT and TT genotypes at position - 509 are associated with high er serum levels of TGF -  1. W e found a significant association between circulating levels of BNP with the stage of CCC, but, no relationship between the levels of TGF -  and BNP was observed . Thus, our results suggest that geneti c polymorphisms at position - 509 and codon 10 of the TGF -  1 gene may be involved in the susceptibility to the development of Chagas disease

Made available in DSpace on 2016-02-26T13:34:39Z (GMT). No. of bitstreams: 2 leandro_neto_ioc_mest_2013.pdf: 1062337 bytes, checksum: 9883a46c5550a2fd2408f865ac3622e1 (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2016-02-23 / Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Oswaldo Cruz. Rio de Janeiro, RJ, Brasil / O Tripanosoma cruzi, agente etiológico da doença de Chagas, constitui um grave problema de saúde pública que afeta 18 milhões de pessoas na América latina. Para produzir a infecção formas tripomastigotas metacíclica de T. cruzi , liberadas durante a picada do inseto vetor, precisam evadir o sistema imune inato do hospedeiro vertebrado para infectar as células. O sistema complemento, devido à sua capacidade para rapidamente reconhecer e eliminar microrganismos constitui a principal linha de defesa do sistema imune inato. O sistema do complemento é composto por várias proteínas, ativadas em cascata por serino proteases, que culmina com a formação do complexo de ataque a membrana e lise do patógeno. Todavia, muitos organismos patogênicos desenvolveram formas de escapar do ataque do sistema do complemento por meio de diversos mecanismos. Visando à melhor caracterização dos fatores de virulência do T. cruzi, o grupo foi verificar se os sobrenadantes de formas metacíclicas apresentam atividade inibitória de complemento. Devido às vias do complemento serem ativadas por serino proteases, foi realizada uma busca no banco genômico de T. cruzi atrás de motivos de SERPINAS (inibidores de serino protease) que o parasito poderia estar liberando no primeiro contato parasito-hospedeiro. Foram realizados experimentos de lise mediada pelo complemento com sobrenadantes das formas metacíclicas de T. cruzi. Observou-se, ainda, que os sobrenadantes das formas metacíclicas do T. cruzi são capazes de inibir a lise mediada pelo complemento de formas epimastigotas / The Try panosoma cruzi, etiologic agent of Chagas disease, is a serious public health concernthat affects 18 million people in Latin America. To produce the infection, metacyclic trypomastigotes de T cruzi released during the bite of the insect vector must evade the innate immune system of the vertebrate host to infect cells. The complement system, due to its ability to rapidly recognize and eliminate microorganisms is the major line of innate immune system defense. The complement system is composed of various proteins, activated by serine proteases cascade that culminates in the formation of the membrane attack complex and lysis of the pathogen. However, many pathogens have developed ways to evade the attack of the complement system through several mechanisms. Aiming to better characterize the virulence factors of T. cruzi, the team was to verify whether the supernatants of metacyclic forms exhibit inhibitory activity of complement. Due to the complement pathways are activated by serine proteases, we seek in genomic library of T. cruzi motifs related t o serpin (serine protease inhibitors) , a protein that the parasite could be releasing at the first parasite - host contact . Experiments were carried out to complement - mediated lysis with supernatants of metacyclic forms of T. cruzi . F urthermore , i t was ob served, that the supernatants of metacyclic forms of T. cruzi are capable of inhibiting the complement mediated lysis of epimastigotes