O nosso grupo está explorando como alternativa para a identificação de novas estratégias de tratamento o reposicionamento de drogas. Nesse contexto, nosso laboratório mostrou que memantina, um antagonista de receptores de glutamato NMDA, apresenta uma atividade tripanocida no ciclo de vida do T. cruzi, in vitro. Com base nessas informações, avaliamos o efeito da memantina em animais infectados com a cepa Y. O tratamento apresentou uma redução da parasitemia (40%) no 8º dpi e redução da carga parasitária no tecido cardíaco no 15º dpi. Uma vez que a cepa Y invade preferencialmente macrófagos, avaliamos o efeito de memantina em células RAW 264.7. Memantina diminuiu a produção de NO por células estimuladas com LPS, diminuiu o Ca2+i, e não houve uma redução de EROs. Memantina também interferiu no ciclo intracelular do parasita, reduzindo o número de células infectadas. Nossos resultados sugerem que o tratamento com memantina pode direcionar o sistema imune de modo a modular os receptores de tipo NMDA, através de um efeito direto ou indireto produzido pelo tratamento. / The search for new therapeutic targets has been of extreme importance for the specific treatment of Chagas disease. Our group is exploring as an alternative, a strategy for drug repurposing. In this context, our laboratory showed that memantine, an antagonistic of NMDA glutamate receptors, has a trypanocidal activity along the life cycle of T. cruzi, in vitro. Based on this information, we evaluated the effect of memantine in animals infected with Y strain. The treatment showed a reduction of parasitemia (40%) in 8th dpi and reduced parasitic load in cardiac tissues at 15th dpi. As the Y strain preferably invades macrophages, we evaluated the effect of memantine in RAW 264.7 cells. Memantine decreased NO production by cells stimulated with LPS, decreased Ca2+i, and did not cause a reduction in ROS. Memantine also interfere with the intracellular parasite cycle, reducing the number of infected cells. Our results suggest that treatment with memantine can target the immune system to modulate the NMDA receptor, through direct or indirect effect caused by the treatment.

A excisão de sequencias intrônicas dos precursores de mRNAs é um passo crítico durante a expressão gênica eucariótica. Essa reação é catalisada pelo complexo macromolecular denominado spliceossomo, composto por partículas ribonucleoproteicas nucleares (U1, U2, U4/U6, U5 snRNPs), além de inúmeros fatores associados. Em tripanossomatídeos, os genes são transcritos em longas unidades policistrônicas e a reação de SL trans-splicing é requerida para geração de transcritos monocistrônicos maduros. O spliceossomo é uma maquinaria altamente dinâmica e parte das mudanças conformacionais ocorridas neste complexo é mediada por RNA helicases. A RNA helicase/ATPásica Sub2 (em mamífero, UAP56), cujas homólogas foram descritas como membros do complexo TREX (transcrição/exportação do RNA), é essencial na montagem do pré-spliceossomo, além de estudos sugerirem sua participação em outras etapas de montagem desse complexo. Em tripanossomatídeos, a função desta proteína no transporte de mRNA entre núcleo e citoplasma já foi descrita, entretanto, seu envolvimento na reação de splicing permanece indefinido. Neste trabalho, buscou-se estudar esse envolvimento através de técnicas de purificação em tandem e RNA de interferência. A purificação dos parceiros de interação da proteína somada à identificação por espectrometria de massas mostrou que TbSub2 co-purifica com proteínas envolvidas em múltiplas vias do metabolismo do parasito, incluindo proteínas e fatores relacionados ao processamento de mRNA. Além disso, essa proteína é essencial para os parasitos na forma procíclica e sanguínea e apresenta localização nuclear em ambas as linhagens. Análises por qPCR em tempo real e RT-PCR mostraram que o silenciamento de TbSub2 causa defeito na maquinaria de SL trans-splicing mas seu efeito no cis-splicing não é claro. Por fim, foi possível realizar a expressão heteróloga e purificação da proteína TbSub2 recombinante, bem como estudos para avaliar seu estado oligomérico e estabilidade. Dessa forma, foi constatado que essa proteína é estável em diferentes tampões e apresenta estados oligoméricos distintos nas técnicas empregadas nesse trabalho. O estudo aqui apresentado trouxe evidências da participação da proteína TbSub2 na reação de SL trans-splicing em ambas as linhagens, bem como em múltiplas vias do metabolismo do parasito na forma procíclica, contribuindo para uma elucidação das funções dessa proteína em tripanossomatídeos. / The excision of intronic sequences from precursor mRNAs is a critical step during eukaryotic gene expression. This reaction is catalyzed by the macromolecular complex called spliceosome, composed of nuclear ribonucleoprotein particles (U1, U2, U4 / U6, U5 snRNPs), besides numerous associated factors. In trypanosomatids, genes are transcribed in long polycistronic units and the SL trans-splicing reaction is required for the generation of mature monocistronic transcripts. The spliceosome is a highly dynamic machinery and part of this complex\'s conformational changes is regulated by RNA helicases. The RNA helicase / ATPase Sub2 UAP56, in mammalian), whose homologous proteins have been described as members of the TREX complex (transcription / RNA export), is essential in the pre-spliceosome assembly, besides its participation in other assembly steps of this complex, as suggested by other studies. In trypanosomatids, the role of this protein in the nucleus/cytoplasm mRNA transport has already been described, however its involvement in the splicing reaction remains unknown. In this work, we studied this involvement through tandem affinity purification and RNA interference. The purification of this proteins binding partners added to the identification by mass spectrometry showed that TbSub2 co-purifies with proteins involved in multiple metabolism pathways of the parasite, including proteins and factors related to mRNA processing. In addition, this protein is essencial for the parasites in procyclic and bloodstream forms and localizes in the nucleus in both strains. qPCR and RT-PCR analysis showed that the silencing of TbSub2 causes defect in the SL trans-splicing machinery but its effect on cis-splicing is unclear. Finally, it was possible to perform the heterologous expression and purification of recombinant TbSub2 protein, as well as studies to evaluate its oligomeric state and stability. Thus, it was found that this protein is stable in different buffers and presents different oligomeric states in the techniques employed in this work. This study has provided evidence of this helicases participation in the SL trans-splicing reaction in booth strains, as well as in several metabolism pathways of the parasite in prociclic form, contributing to the elucidation of the protein functions in trypanosomatids.

La Trypanosomose Humaine Africaine (THA) ou maladie du sommeil est une infection provoquée par un protozoaire du genre Trypanosoma. La recherche de nouvelles cibles thérapeutiques est nécessaire afin d’améliorer l’efficacité et la tolérance des traitements. Dans un premier travail, nous avons étudié l’importance de CYP51 (stérol 14α-déméthylase), une cible potentielle, par la technique d’interférence à ARN (RNAi). Nous avons démontré le caractère essentiel de cette enzyme pour le parasite, ainsi que les conséquences de sa déplétion sur la cytodiérèse. De plus, la survie de souris infectées par la souche CYP51RNAi induite était prolongée, montrant l’implication de CYP51 dans la virulence. La combinaison du posaconazole, un dérivé triazolé inhibant CYP51, à l’éflornithine a montré un effet similaire à la combinaison nifurtimox-éflornithine dans un modèle murin. Nos résultats soulignent l’intérêt potentiel d’un traitement ciblant CYP51 dans la trypanosomose. Du fait de l’importance de l’immunodépression dans la THA et de la capacité du trypanosome à échapper au système immunitaire de l’hôte, nous avons étudié, dans un deuxième travail, l’effet de T. gambiense et de son sécrétome (protéines excrétées/sécrétées) sur des cellules dendritiques humaines (DCs) in vitro. Nous avons ainsi montré une altération de la maturation des DCs induite par le LPS en présence du sécrétome. Nous avons également montré qu’une des protéines de ce sécrétome, TbKHC1, est exprimée par différentes espèces de trypanosomes. Elle est impliquée dans l’induction de l’arginase macrophagique chez la souris, un mécanisme d’échappement au système immunitaire. Ces travaux apportent des éléments pour une meilleure compréhension des phénomènes immunopathologiques rencontrés, dans la perspective de thérapeutiques ciblées et d’une approche vaccinale. / Trypanosoma brucei gambiense, an extracellular eukaryotic flagellate parasite, is the main causative agent of Human African Trypanosomiasis (HAT), also known as sleeping sickness. Trypanosomes have developped efficient mechanisms to escape the host immune response. New therapeutic options are needed for patients with HAT. Sterol 14α-demethylase (CYP51) is a potential drug target but its essentiality has not been studied in T. brucei. In a first study, we demonstrated its essentiality by RNA interference (CYP51RNAi) in vitro. CYP51RNAi induction caused morphological defects with multiflagellated cells, suggesting cytokinesis dysfunction. Additionally, the survival of CYP51RNAi infected-mice was improved, showing CYP51 RNAi effect on trypanosomal virulence. During infection with virulent strains, posaconazole-eflornithine and nifurtimox-eflornithine combinations showed similar improvement in mice survival. Thus, our results provide support for a CYP51 targeting based treatment in HAT. In a second work, we studied the innate host immune system characteristics in trypanosomiasis, as a severe immune dysregulation is present in HAT. To analyse the potential immunomodulatory activity of T. gambiense in human settings, we assess the effect of its secretome on dendritic cells (DCs) in vitro, using human monocyte-derived DCs. A significant inhibition of the LPS-induced maturation of DCs was observed with secretome. In line with this impairment, secretome down regulated cytokines production by LPS-activated DCs. TbKHC1, a kinesin heavy chain, is a component of the parasite secretome. We confirmed its role in parasitic escape to immune system by inducing arginase activity, in a murine model. Our results provide new information about the immune system characteristics during trypanosomiasis, which may help to uncover new therapeutic approachs in HAT.

Doenças tropicais negligenciadas compartilham características que permitem que elas persistam nas condições de pobreza, onde se aglomeram e se sobrepõe frequentemente. Mais de um bilhão de pessoas sofrem de uma ou mais doenças tropicais negligenciadas. Entre estas está a doença de Chagas, resultante da infecção pelo protozoário parasito hemoflagelado Trypanosoma cruzi, tendo insetos triatomíneos como vetores. Topoisomerases são enzimas envolvidas na regulação do superespiralamento do DNA resolvendo problemas topológicos associados com replicação, transcrição, recombinação e reparo. As topoisomerases do tipo II são essenciais para tripanossomatídeos por atuarem na replicação e organização do DNA contido em uma região especializada da mitocôndria denominada cinetoplasto. O estudo da Topoisomerase II Mitocondrial (TcTopoIImit) foi realizado através de análises sequenciais e estruturais de outras topoisomerases para a determinação de construções para a clonagem. As construções para o domínio N-terminal foram clonadas no vetor pTZ57R/T e subclonadas em vetores do sistema pET para expressão proteica em E. coli. Experimentos de expressão foram realizados em diferentes cepas, vetores, soluções tampão e outros parâmetros variáveis visando a obtenção dos produtos recombinantes na forma solúvel, porém, tais resultados não foram obtidos. A flavoproteína Old Yellow Enzyme de Trypanosoma cruzi (TcOYE) é uma oxidoredutase que usa NAD(P)H como cofator. Esta enzima é clinicamente relevante devido ao seu papel no mecanismo de ação de alguns agentes tripanocidas, utilizados no tratamento da doença de Chagas, por produzirem espécies reativas de oxigênio. Neste trabalho, a enzima recombinante TcOYE foi produzida, purificada, cristalizada pelo método de difusão de vapor e sua estrutura cristalográfica, resolvida por substituição molecular e refinada. A TcOYE foi cristalizada nas formas cristalinas P212121 e P21 e os dados de difração foram coletados para o máximo de resolução de 1,27 e 2,00 Å, respectivamente. As coordenadas atômicas e fatores de estrutura das estruturas da TcOYE nas formas cristalinas P212121 e P21 foram depositados no Banco de Dados de Proteínas com os códigos de acesso 4E2B e 4E2D, respectivamente. A TcOYE apresenta um enovelamento canônico em um barril (α/β)8 com o grupo prostético localizado na cavidade maior do sítio ativo. Após a obtenção dos modelos cristalográficos análises sequenciais e estruturais foram realizadas para a TcOYE e outras OYEs. A região 141-156 do subdomínio capping em TcOYE, assim como em outras OYEs, é intrinsecamente desestruturada exibindo altos valores de fatores B. A região mais divergente entre as OYEs é o loop estendido (289-297), que pode variar em comprimento e composição mudando o volume e a acessibilidade ao sítio ativo. / Neglected tropical diseases share features that allow them to persist in conditions of poverty, which clump together and frequently overlap. More than 1 billion people suffer from one or more neglected tropical diseases. Among them is the Chagas disease is an important parasitic disease resulting from infection by the flagellate protozoan parasite Trypanosoma cruzi, with triatomine insects as vectors. Topoisomerases are ubiquitous enzymes involved in the regulation of DNA supercoiling and overcoming topological barriers during replication, transcription, recombination and repair. The type II topoisomerases are essential for trypanosomatids since, in addition to their role in nuclear DNA metabolism, these enzymes might also play an important role in the replication and organization of the DNA contained in the specialized region of the mitochondrion known as the kinetoplast. The study of Mitochondrial Topoisomerase II from T. cruzi (TcTopoIImit) was performed by sequence and structural analyses into topos members for determination of domains constructions for cloning. Constructions for the N-domain were then cloned in pTZ57R/T vector and subcloned into pET system vectors for protein expression in E. coli. The protein expression experiments were performed by different strain cells, vectors, buffers solutions and others adjustable parameters for improve the solubility but recombinant products in soluble form were not obtained. The flavoprotein Old Yellow Enzyme from Trypanosoma cruzi (TcOYE) is an oxidoreductase that uses NAD(P)H as cofactor. This enzyme is clinically relevant due to its role in the action mechanism of some trypanocidal drugs used in the treatment of Chagas disease by producing reactive oxygen species. In this work, the recombinant enzyme TcOYE was produced, purified, crystallized by the vapour diffusion method and its crystallography structure was solved for molecular replacement and refined. TcOYE was crystallized in two crystalline forms, P212121 and P21 and diffraction data were collected to a maximum resolution of 1.27 and 2.00 Å, respectively. The atomic coordinates and structure factors of the TcOYE structure in P212121 and P21 crystalline forms have been deposited in the Protein Data Bank with the accession codes 4E2B and 4E2D, respectively. TcOYE displays a canonical (α/β)8-barrel fold with a FMN prosthetic group located at the large active-site cavity. Afterwards, sequential and structural analyses were carried out for TcOYE and others OYEs. The region 141-156 of the capping subdomain in TcOYE as well as in others OYEs is intrinsically flexible exhibiting high B-factor values. The most divergent region among these OYEs is the extended loop (289-297), which can vary in length and composition changing the volume and accessibility to the active site.

Lic.-avh. (sammanfattning) Stockholm : Karolinska institutet, 2006. / Härtill 2 uppsatser.

Thesis--Université de Bordeaux, 1936. / Includes bibliographical references (p. [125]-143).

Estudos prévios mostram que tanto a melatonina (MEL) como a Dehidroepiandrosterona (DHEA) aumentaram a resposta imune contra distintos parasitas. O presente estudo investigou a atividade in vitro da MEL e DHEA associados em um período de 24 horas e in vivo durante o curso da infecção por T. cruzi. A atividade in vitro da MEL e DHEA sozinhos, bem como juntos foram testados sobre formas tripomastigotas (doses variando de 0.5, 8, 20, 32, 40 to 128 µM). In vitro, tanto MEL como DHEA sozinhos não mostraram qualquer atividade contras formas tripomastigotas, embora quando utilizadas em concentrações mais elevadas, a associação de MEL e DHEA mostrou-se ativa contra formas tripomastigotas do parasita. Entretanto, para estas altas concentrações, verificou-se alta toxicidade sobre os macrófagos peritoneais. Para avaliação in vivo, ratos machos Wistar foram infectados com a cepa Y de T. cruzi. Os animais foram oralmente tratados com 5 mg/kg peso corpóreo/dia de MEL e de forma subcutânea com 40mg/kg peso corpóreo/dia de DHEA. Tratamento com MEL, DHEA e associado mostrou uma redução significante no número de tripomastigotas sangüíneos durante a fase aguda da infecção quando comparado aos animais não trados (P<0.05). Um significante aumento no número de macrófagos e concentração de óxido nítrico (NO) foram observados durante o pico da parasitemia apenas com MEL ou combinado com DHEA. Entretanto, observou-se que o DHEA sozinho aumentou a concentração de NO (P<0.05), bem como os níveis de TNF-alfa durante a infecção (P<0.05). Estes resultados mostram que a MEL, DHEA ou a associação de ambos reduz a parasitemia durante a fase aguda de infecção. A ação combinada de ambos os hormônios não exerceu uma ação sinérgica sobre a magnitude da resposta imune do hospedeiro, ficando o DHEA como a substância que induziu a resposta imune mais eficiente. / Previous studies show that melatonin (MEL) and dehydroepiandrosterone (DHEA) enhances the immune response against parasitic pathogens. The present study investigated the in vitro activity of MEL and DHEA association in a period of 24 hours and in vivo during the course of T. cruzi infection. The in vitro activity of MEL and DHEA alone, as well as together, were tested for the trypomastigote forms (doses ranging from 0.5, 8, 20, 32, 40 to 128µM). In vitro, nor MEL nor DHEA alone did not show any activity against trypomastigote forms, although when the highest concentration of MEL and DHEA association was used, it was active against the trypomastigote forms of the parasite. However, for this concentration, a quite toxicity on peritoneal macrophages was observed. For in vivo evaluation, male Wistar rats were infected with the Y strain of T. cruzi. They were orally treated with 5mg/kg body weight/day of MEL and subcutaneously with 40mg/kg body weight/day of DHEA. Treatment with MEL, DHEA and the association showed a significant reduction in the number of blood trypomastigotes during the acute phase of infection as compared to untreated animals (P<0.05). A significant increase in the number of macrophages and nitric oxide (NO) concentrations were observed during the peak of parasitemia with MEL alone or combined with DHEA. However, with DHEA alone, the highest concentration of NO was observed (P<0.05). Moreover, DHEA treatment increased TNF-alpha levels during infection (P<0.05). These results show that MEL, DHEA or the association of both reduces parasitemia during the acute phase of infection. The combined action of both hormones did not exert a synergic action on the hosts ability to fight infection, and it seems that among all treatments DHEA induces a more efficient immune response.

Orientador: João Aristeu da Rosa / Coorientador: Sergio de Albuquerque / Banca: Mara Cristina Pinto / Banca: Carlos Eugenio Cavasini / Banca: Ana Amélia Carraro Abrahão / Banca: Maria Tercilia Vilela Azeredo de Oliveira / Resumo: A atividade de 92 extratos etanólicos de espécies de Annonaceae, Apiaceae, Cucurbitaceae, Lauraceae, Moraceae, Nyctaginaceae, e Verbenaceae foi avaliada sobre formas epimastigotas das cepas Y e Bolívia de Trypanosoma cruzi, nas concentrações de 500, 350, 250 e 100 µg/ml. Quinze extratos de Lippia salviaefolia, L. sidoides, L. laciocalycina, L. lupulina, L. balansae, L. velutina e suas frações hexânicas, de acetato de etila, n-butanólicas e aquosas foram avaliados sobre formas epimastigotas do clone B5 da cepa CL Brener de T. cruzi, nas concentrações de 32, 8, 2 e 0,5 µg/ml. Adicionalmente, as amostras mais promissoras de Lippia sp foram avaliadas, in vitro, sobre as formas tripomastigotas e amastigotas de T. cruzi e, in vivo, em camundongos BALB/c. A citotoxicidade foi avaliada em fibroblastos da linhagem LLCMK2 e o benzonidazol foi utilizado como controle positivo. Todos os 92 extratos etanólicos, testados sobre as formas epimastigotas da cepa Y de T. cruzi, foram inativos. Os melhores resultados entre as 92 amostras avaliadas foram obtidos com o extrato etanólico de Ocotea paranapiacabensis, por apresentar atividade tripanocida sobre as formas epimastigotas da cepa Bolívia e toxicidade moderada, e com o extrato de Aegiphilla lhotzkyana, que demonstrou atividade tripanocida moderada sobre a cepa Bolívia e moderada citotoxicidade. Dentre os extratos etanólicos de Lippia sp avaliados, o de folhas de L. velutina apresentou a maior atividade tripanocida sobre as formas epimastigotas e toxicidade moderada, mas foi inativo contra as formas tripomastigotas e amastigotas de T. cruzi. Os melhores resultados foram obtidos da sua fração de acetato de etila que apresentou atividade, sobre formas epimastigotas, 42 vezes maior do que o benzonidazol, com Índice de Seletividade (IS) de 371,0, além de atividade moderada sobre as formas tripomastigotas. Esta amostra foi inativa contra... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Trypanocidal activity of 92 ethanol extracts of species of Annonaceae, Apiaceae, Cucurbitaceae, Lauraceae, Moraceae, Nyctaginaceae, and Verbenaceae was evaluated using the epimastigote forms of the Y and Bolivia strains of Trypanosoma cruzi at a concentration of 500, 350, 250, and 100 µg/ml. Fifteen extracts of Lippia salviaefolia, L. sidoides, L. laciocalycina, L. lupulina, L. balansae, L. velutina, their liquid-liquid extraction fractions of hexane, ethyl acetate, n-butanol and water were evaluated using the epimastigote forms of B5 clone of CL Brener strain of T. cruzi at a concentration of 32, 8, 2, 0.5 µg/ml. Additionally, samples of the most promising of Lippia sp were evaluated, in vitro, using trypomastigote and amastigote forms of T. cruzi and, in vivo, in BALB/c. The cytotoxic activity was evaluated on fibroblasts of lineage LLCMK2 and benznidazole was used as positive control. All the 92 ethanol extracts tested against epimastigote forms of the Y strain of T. cruzi are inactive. The best results among the 92 samples evaluated were obtained with ethanol extracts of Ocotea paranapiacabensis, for showing trypanocidal activity against epimastigote forms of the Bolivia strain and being moderately toxic, and the extracts of Aegiphilla lhotzkyana, which showed moderate trypanocidal activity against the Bolivia strain and moderate toxicity. Among the 15 ethanol extracts of Lippia sp assayed, the one from of leaves of L. velutina showed the highest trypanocidal activity on epimastigote forms and moderate toxicity, but was inactive against trypomastigote and amastigote forms of T. cruzi. Best results were obtained for its ethyl acetate fraction, which showed activity in epimastigote forms, 42 times more than benznidazole, with Selectivity Index (SI) of 371.0 and moderate activity on trypomastigote forms. This sample was inactive against the amastigote forms of the parasite... (Complete abstract click electronic access below) / Doutor

Submitted by Ana Maria Fiscina Sampaio (fiscina@bahia.fiocruz.br) on 2013-11-06T19:03:45Z No. of bitstreams: 1 Daniel Huber Pessina Análise imuno fenotípica de animais nod estudo da proteção ao diabetes..pdf: 2399319 bytes, checksum: 3fc4e57719b71c97883626a074b31ce3 (MD5) / Made available in DSpace on 2013-11-06T19:03:45Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Daniel Huber Pessina Análise imuno fenotípica de animais nod estudo da proteção ao diabetes..pdf: 2399319 bytes, checksum: 3fc4e57719b71c97883626a074b31ce3 (MD5) Previous issue date: 2013 / Universidade Federal da Bahia. Faculdade de Medicina da Bahia. Salvador, BA, Brasil / Fundação Oswaldo Cruz. Centro de Pesquisas Gonçalo Moniz. Salvador, BA, Brasil / Os animais NOD representam o principal modelo experimental de estudo do diabetes autoimune. Apesar do progressivo número de estudos realizados, muitos aspectos imunes da promoção e regulação desta doença continuam obscuros. Utilizando o modelo (pela primeira vez aqui descrito) de proteção induzida pelo T. cruzi, bem como o modelo de aceleração pela ciclofosfamida, fizemos um estudo imuno-fenotípico em animais NOD com o objetivo de elucidar mecanismos imunes responsáveis pela regulação do diabetes tipo I. Demonstramos que a infecção de camundongos NOD com o T. cruzi os protege do desenvolvimento do diabetes. Estes animais desenvolvem uma resposta ao parasita caracterizada por uma pobre expansão de células T CD8 efetoras, bem como uma menor migração destas para os sítios parasitários. Estudo do perfil de citocinas mostraram ainda uma reduzida produção inicial de IFN no baço, mas elevada produção tardia nos tecidos inflamados, comparado a animais BALB/c. Estes dados, associados a uma maior produção inicial de IL-10 por esplenócitos, justificam a maior susceptibilidade à infecção observada nos animais NOD. O estudo de populações celulares com atividade regulatória mostrou que há aumento de Treg no início da infecção. Contudo a proteção ao diabetes desencadeada pelo T. cruzi não se correlaciona ao número de células Treg, pois há uma redução destas ao longo da infecção. Este fato, associado à observação de que a ciclofosfamida é incapaz de induzir diabetes nos animais infectados, apontaram para um papel limitado destas células na proteção ao diabetes pelo T. cruzi. Entretanto, houve aumento de células Gr1+, e a depleção destas reverte a proteção ao diabetes causada pela infecção, além de induzir a expansão de células T CD8+ efetoras e sua produção de IFN. Verificamos ainda, que níveis aumentados da expressão de PD-L1 relacionaram-se com a proteção ao diabetes proporcionado pelo T. cruzi, enquanto níveis reduzidos se relacionaram ao seu desenvolvimento espontâneo. Contudo, o tratamento com ciclofosfamida não reduz a expressão de PD-L1 em linfócitos, mas induz rapidamente o diabetes em animais NOD não infectados e leva a uma drástica diminuição de células Tregs CD25+ esplênicas. Os resultados, aqui tomados em conjunto, apontam para um complexo mecanismo de controle do diabetes, que envolve diferentes populações celulares que atuam de maneira variada com o modelo estudado. / The NOD mice are the most used experimental model for the study of autoimmune diabetes. Despite progressive number of studies, many aspects about the immune regulation and disease onset remains unclear. Using our model (described here for the first time) of diabetes protection induced by T. cruzi, as well as cyclophosphamide acceleration, we performed a immunophenotypic analysis of NOD animals, aiming to elucidate the immune mechanisms responsible for regulation of type I diabetes. We demonstrated that infection of NOD mice with T. cruzi protects them from diabetes onset. These mice develop a poor expansion of effector CD8 T cells in response to parasite, and have lower percentage of those lymphocytes in inflammatory sites, when compared to BALB/c mice. Cytokine profile's analysis also revealed a reduced initial production of IFN in spleen, but high late production in inflamed tissues. Those data associated to an elevated production of IL-10 by spleen cells could explain the increased susceptibility observed in infected NOD mice. Further analysis showed an increased Treg cells rates early after infection, followed by a progressive reduction thereof along infection. This fact, coupled with the observation that cyclophosphamide is unable to induce diabetes in infected mice, indicates a limited role for these cells in diabetes protection by T. cruzi. However, increased Gr1 + cells numbers was also found in infected mice, and its depletion reverses the protection of diabetes related to infection. That reversion was associated to an expansion of effector CD8 + T cells and their production of IFN. We also found that increased expression of PD-L1 were also related to diabetes protection provided by T. cruzi infection, while low levels were related to spontaneous diabetes development. Treatment with cyclophosphamide however did not reduce PD-L1 expression on lymphocytes, despites rapidly set diabetes in NOD uninfected animals. On the other hand, cyclophosphamide leads to a drastic decrease of CD25 + Treg cells in the spleen of NOD mice. These results, taken together, point to a complex mechanism of diabetes control, which involves different cell populations acting variously with the model.

Submitted by Ana Maria Fiscina Sampaio (fiscina@bahia.fiocruz.br) on 2012-11-27T18:57:05Z No. of bitstreams: 2 Edson Luiz Paes Camandaroba Analise fenotipica... - 2005.pdf: 74751980 bytes, checksum: 1112ab65fa142319f7431dbedeb97651 (MD5) Edson Luiz Paes Camandaroba Analise fenotipica... - 2005.pdf: 74751980 bytes, checksum: 1112ab65fa142319f7431dbedeb97651 (MD5) / Made available in DSpace on 2012-11-27T18:57:05Z (GMT). No. of bitstreams: 2 Edson Luiz Paes Camandaroba Analise fenotipica... - 2005.pdf: 74751980 bytes, checksum: 1112ab65fa142319f7431dbedeb97651 (MD5) Edson Luiz Paes Camandaroba Analise fenotipica... - 2005.pdf: 74751980 bytes, checksum: 1112ab65fa142319f7431dbedeb97651 (MD5) Previous issue date: 2005 / Fundação Oswaldo Cruz. Centro de Pesquisas Gonçalo Moniz. Salvador, Bahia, Brasil / As cepas do Trypanosoma cruzi são constituídas por populações multiclonais, heterogêneas, diplóides e apresentam polimorfismo nos fragmentos de restrição no minicirculo do kDNA e nos cromossomos do nDNA. Esta variabilidade genética intraespecífica das cepas é correlacionada ao seu comportamento biológico, tropismo tissular e à resposta aos quimioterápicos. A cepa Colombiana do T. cruzi, protótipo do Biodema Tipo III, Zimodema Z1, classificada como T. cruzi I é altamente resistente ao benzonidazol e ao nifurtimox, No presente estudo, investigou-se a composição clonal desta cepa. Foram estudadas em camundongos o comportamento biológico, o histotropismo, caracteres bioquímicos e genéticos e a resposta ao benzonidazol de 12 clones. Foram isolados sete clones no 30° dia de infecção, no pico da parasitemia (fase aguda avançada) e cinco clones no 10° dia de infecção (fase aguda precoce). Os clones isolados foram submetidos a passagens sucessivas em camundongos albinos Suíços para a obtenção do inóculo de 1x10® tripomastigotas, para infecção dos animais dos grupos experimentais. O comportamento biológico foi avaliado pela parasitemia, estudo morfológico dos parasitos e mortalidade dos animais infectados. Os padrões isoenzimáticos para os diversos clones foram obtidos pelas enzimas ALAT, ASAT, PGM e GPI. Os animais infectados com cada clone e com a cepa parental foram submetidos ao tratamento com benzonidazol durante 90 dias na dose de 100 mg/kg/dia. O estudo genéíco foi realizado pela amplificação por POR de fragmentos de 330 pares de bases das porções variáveis do minicirculo do kDNA e por RFLP. Os fragmentos foram digeridos com as enzimas de restrição Rsa I, Eco RI e Hinfl No geral o estudo biológico mostrou homogeneidade entre os clones e entre os clones e a cepa parental. Houve variação na parasitemia sendo que foi mais elevada em quatro dos sete clones isolados no 30° dia da infecção e em três dos cinco clones isolados no 10° dia. A caracterização isoenzimática incluiu os clones no mesmo Zimodema Z1, idêntico á cepa Colombiana parental. O estudo genético mostrou que os clones e a cepa parental apresentaram idêntico padrão de bandas nos fragmentos de restrição gerados pelas enzimas de restrição. O histotropismo dos clones foi ubiquitário e não restritivo, foram mais encontrados no músculo esquelético e miocárdio, seguido pela presença de parasitos na parede intestinal, células de Kupffer e macrófagos do baço, plexo de Auerbach e adipócitos, Todos os clones apresentaram-se altamente resistente ao benzonidazol com índices de cura de 0% a 16, 7% (para os clones isolados no 30° dia) e de 0% a 36,3% (para os clones isolados no 10° dia). A cepa Colombiana do T. cruzi apresenta uma grande homogeneidade populacional, sugerindo a predominância de um clone principal responsável pelas características da cepa. / Strains of T. cruzi are heterogeneous multiclonal, diploid populations, presenting high polymorphic restriction fragments of the kDNA minicircles and nDNA chromosomes. This intra-specific genetic variability is correlated with the biological behavior, tissue tropism and responses to chemotherapy. The Colombian strain of T. cruzi, prototype of Type III biodeme and Z1 zimodeme , classified as T. cruzi I. is highly esistant to benznidazole and nifurtimox. In the present study it was investigated the clonal composition of this strain to identify whether there are an homogeneity or heterogeneity of the isolated clones, considering different aspects: biological, biochemical and genetic, and the clonal histotropism, as well as the susceptibility to chemotherapy with benznidazole. The Clones have been isolated in two different phases of the acute infection in mice; seven clones on the 30‘^ day of infection, corresponding to the parasitemic peaks (advanced acute phase) and five clones on the 10**^ day of infection (early acute phase) and inoculated into newborn mice. Successive passages into Swiss albino mice were done, to obtain the inoculum of 1 x 10® trypomastigotes for the infection of the experimental groups of mice. Biological behavior was evaluated by the parasitemic profiles, morphology of parasites in the blood and mortality indices. Isoenzymic profiles of ALAT, ASAT, PGM and GPI were established for the several clones. Treatment with Benznidazole was performed in experimental groups infected with each clone and the parental strain, in the dose of 250mg/kg/day, during 90 days. Genetic characterization was performed by the analyses of the kinetoplast DNA (kDNA) of parental strain and the clones. Schizodeme was established by comparative study of the 330-bp fragments amplified by polymerase chain reaction (PCR) from the variable regions of the minicircles and by RFLP. Fragments have been digested by restriction endonucleases Rsa I, Hinf I and Eco Rl. In general, bological characterization showed an homogeneity of the several clones and amongst the clones and the parental strain, although with variations in the parasitemia that was higher for four of the seven clones isolated in the 30*^ day and for three of five clones isolated in the 10*^ day. Isoenzymic characterization, confirms the clones into the zymodeme Z1, identical to the Colombian parental strain. Genetic characterization demonstrated an homology of the bands profiles of the restriction fragments from the minicircles of kDNA (RFLP) between the parental strain and the 12 clones. Histotropism of the several clones was ubiquitous and not restrictive, predominant for the skeletal muscles and myocardium also present in the intestinal wall, Kupffer cells, macrophages of the spleen, cells of the Auerbach' plexus and adipocytes. All the clones were highly resistant to chemotherapy with benznidazole with cure indices of 0% to 16% (for the isolated in the 30*^ day) and 0% to 36,3% (for the isolated in the 10*^ day) .The overall analyses of the several parameters (genetic, biological, biochemical and response to chemotherapy) have shown phenotypic and genotypic homogeneity, of the Colombian strain and its clones, suggesting the predominance of a “principal clone” responsible for these characteristics.