A lesão renal aguda (LRA) é uma séria complicação dos pacientes hospitalizados, causada principalmente pela isquemia/reperfusão (I/R). Ela é definida como um abrupto declínio da função renal baseada em alterações agudas da creatinina sérica e débito urinário. Porém, alterações na creatinina sérica são tardias e variam com o gênero, idade, massa muscular, metabolismo e hidratação do indivíduo. Novos biomarcadores para um diagnóstico mais preciso e precoce da doença são necessários. No entanto, devido em humanos a LRA ser uma doença, em sua maioria, secundária a outras doenças, o desenvolvimento de modelos animais com resposta similar aos humanos é de extrema importância. Assim, o presente estudo tem como objetivo o desenvolvimento e caracterização de um modelo suíno de I/R renal, seguido da identificação de alterações nos perfis metabólicos séricos durante à I/R renal aguda. Além de colaborar com o melhor entendimento da fisiopatologia da doença, pode prover novos biomarcadores com potencial uso no diagnóstico e prognóstico através do monitoramento dos pacientes hospitalizados. Primeiramente, foi desenvolvido um modelo controlado e percutâneo, com único insulto de I/R renal, sem nefrectomia contralateral usando suínos como modelo. A isquemia foi induzida por um cateter-balão inflado por 120min na artéria renal direita seguida de 24 horas de reperfusão. Amostras seriadas de soro e urina foram coletadas. A caracterização do modelo foi feita por análises histológicas e bioquímicas, e a identificação de novos biomarcadores, através da ressonância magnética nuclear (600MHz) seguida da análise por PLS-DA e biologia de sistemas. A necrose tubular aguda foi identificada em todos os animais, porém apenas dois deles apresentaram níveis de creatinina sérica acima de 150% dos seus valores basais. Como esperado, a I/R elevou os níveis de uréia e creatinina e ainda modulou a excreção de Na+, K+, Cl-, bicarbonato e glicose. A NGAL e as proteínas nitradas séricas apresentaram dois perfis: diminuíram com a isquemia e aumentaram com a reperfusão. Este declínio foi associado com o aumento da excreção de proteínas durante a isquemia e início da reperfusão. A partir deste modelo de I/R renal desenvolvido, selecionamos 8 marcadores metabólicos: L-glutamato, L-serina, N-isovaleroilglicina, L-metionina, L-prolina, 2-aminobutirato, colina e creatinina. Estes metabólitos foram capazes de distinguir indivíduos saudáveis e isquêmicos, restaurando seus valores após 11 horas da reperfusão. Através da análise de biologia de sistemas, estes metabólitos se mostraram altamente representativos da via dos aminoácidos, se relacionaram com alterações no transporte iônico e foram associados às vias do fator nuclear kappa B (NF?B), huntingtina (HTT) e pró-insulina. Assim, foi possível desenvolver um modelo de I/R renal percutâneo em modelo suíno, capaz de permitir o desenvolvimento de estudos para explorar respostas fisiopatológicas e novos biomarcadores isquêmicos renais. A partir dele, com ferramentas metabolômicas, foi possível elaborar um painel metabólico que contribui para o estudo da fisiopatologia da isquemia e pode tornar-se uma ferramenta promissora para a identificação precoce de pacientes com LRA geradas pela I/R renal / Acute kidney injury (AKI) is a serious complication in hospitalized patients mainly caused by ischemia/reperfusion. AKI is defined as the abrupt decrease in kidney function based on acute alterations in serum creatinine or urine output. Nevertheless, changes in serum creatinine are late and vary with muscular mass, age, gender, metabolism and hydration of individuals. In this sense, new biomarkers for the accurate and early diagnosis are needed. In humans LRA is a secondary disease, related to the progress of other diseases. Thus, the development of animal models with similar response to humans is extremely important. This study aimed to develop and characterize a swine model of renal ischemia/reperfusion (I/R), followed by the identification of changes in serum metabolic profiles during acute renal I/R. In addition to collaborating with a better understanding of the physiopathology of the disease, these findings may provide new biomarkers with potential use in diagnosis and prognosis through the monitoring hospitalized patients. Here we report the development of a controlled, single-insult model of unilateral renal I/R without contralateral nephrectomy, using a suitable model, the pig. Animals underwent renal ischemia by balloon catheter placed and inflated into the right renal artery for 120 minutes and reperfusion over 24 hours. Serial serum and urine were sampled. The characterization of the renal I/R model was made by histological and biochemical analyzes. Identification of new biomarkers was performed by nuclear magnetic resonance (600MHz) followed by PLS-DA analysis and systems biology. Acute tubular necrosis (ATN) was identified in every animal, but only two animals showed levels of serum creatinine above 150% of baseline values. As expected, I/R increased serum creatinine and BUN. Fractional sodium, potassium, chloride, bicarbonate and glucose excretion were modulated during ischemia. Serum nitrated proteins and NGAL presented two profiles: decreased with ischemia and increased after reperfusion. This decline was associated with increased protein excretion during ischemia and early reperfusion. From this renal I/R model developed, eight metabolites were selected: L-glutamate, L-serine, N-isovaleroylglicine, L-methionine, L-proline, 2-aminobutyrated, choline and creatinine. PLS-DA analysis for these metabolites resulted in an accurate separation between pre ischemia and ischemia groups. All selected metabolites recovered to baseline conditions after 11 hours of reperfusion. Through network analysis we found changes in H+, Na+ and Cl- ion transport pathways and association with Nuclear Factor-KappaB (NF?B), Huntingtin (HTT) and proinsulin (insulin) pathways. Thus, it was possible to develop a percutaneous model of renal I/R in swine model, allowing the development of studies to explore physiopathology responses and new renal ischemic biomarkers. With this model and metabolomic tools, it was possible to develop a metabolic panel that contributes to the study of ischemia physiopathology and may become a promising tool for the early identification of patients with AKI generated by renal I/R

Made available in DSpace on 2016-01-26T12:51:24Z (GMT). No. of bitstreams: 1 fernandonestor_tese.pdf: 1042593 bytes, checksum: af0a555c2adb2f553fd7214a6ca2774b (MD5) Previous issue date: 2006-03-14 / The aim of the present study was to investigate the effects of the use of the anti-inflammatory protein annexin 1 (Anx-A1), which is found in most cells. It is characterized by its ability in binding to calcium and phospholipids, conferring protection against the initial effects of ischemia-reperfusion injury. Right nephrectomy was performed on 48 adult males Wistar rat, with sizes ranging between 250-300 g, maintained on a diet normosodic , normoprotein and with water ad libitum. The animals was divided into 3 groups: Annexin-1/Ischemia (Anx-A1-I/R) (n=16), vehicle (PBS40)-Ischemia (Vehicle-I/R) (n=16) and Sham Group (n=16). The endovenous administration of Anx-A1 was made 30 minutes before ischemia of the left renal artery. The animals of each group were divided and studied at 2 and 7 days post-reperfusion, in respect to the glomerular, tubular and renal structure functions. The results showed that there was a reduction in the glomerular filtration rate (GFR) in the Vehicle-I/R Groups at 2 and 7 days post-reperfusion (0.42 ± 0.02 mL/min-100g and 0.48 ± 0.05 mL/min-100g, respectively). There was a significantly greater filtration rate in the Anx-A1-I/R Groups compared to the Vehicle-I/R Groups (0.86 ± 0.05 mL/min-100g and 0.73 ± 0.04 mL/min-100g, respectively). A significant difference between the Anx-A1-I/R and Sham Groups (p-value < 0.01) was also observed (7days). The fractional sodium excretion (FeNa) was significantly higher in the Vehicle-I/R Groups when compared to the Anx-A1-I/R and Sham Groups on the 2nd and 7th post-perfusion days. On the 2nd day of the study, the fractional sodium excretion was 0.17 ± 0.01% for the Anx-A1-I/R, 0.42 ± 0.03% for the Vehicle-I/R and 0.21 ± 0.01% for the Sham groups (p-value < 0.001). On the 7th day, the values were 0.27 ± 0.03%, 0.52 ± 0.03% and 0.29 ± 0.01%, respectively (p-value < 0.001). The potassium excretion fraction (FeK) on the 2nd and 7th post-perfusion days did not differentiate between the Anx-A1-I/R and Sham Groups, but it was significantly higher in the Vehicle-I/R Groups. The urinary-plasmatic osmolality ratio (U/Posm) showed a significant reduction in the Vehicle-I/R Groups after 2 and 7 days when compared with the Anx-A1-I/R and Sham Groups. A histopathologic evaluation of renal cortex samples, taken on the 2nd and 7th post-perfusion days, revealed a significant increase in the intravascular and transmigrated neutrophils in ischemic areas of the Vehicle-I/R Groups. Additionally, high rates of transmigrated neutrophils were identified in the ischemia-reperfusion areas of samples of renal medulla from the Vehicle-I/R Group taken on the 2nd and 7th days. There was a significant reduction of the neutrophil transmigration in samples of renal medulla on the 2nd and 7th post-perfusion days in the Anx-A1-I/R Groups, as well as a lower intravascular neutrophil rate. On the 2nd and 7th post-perfusion days, the Sham Group presented with structures of distal and proximal convoluted tubules and well-preserved brush-border structures in the renal cortex and medulla samples as seen by light microscopy. Similar results were evidenced in the Anx-A1-I/R Groups with preserved structures in the tubules, basal membrane and glomeruli. In the Vehicle-IR Groups, numerous monocytes, cellular debris inside proximal convoluted tubules, dilated capillaries and alterations in the basal membrane structure were seen. These results suggest that the administration of annexin-1 thirty minutes before renal ischemia in rat , prevents the transmigration of neutrophils and confers protection against the initial effects of ischemia-reperfusion injury, as well as providing protection to the glomerular, tubular and renal structure functions. / O presente estudo objetivou investigar os efeitos do uso da anexina 1 (Anx-A1), considerada proteína antiinflamatória e que está presente na maioria das células. Caracteriza-se pela sua habilidade em ligar-se ao cálcio e fosfolipídeos, conferindo proteção contra os efeitos iniciais da lesão por isquemia e reperfusão. Realizou-se nefrectomia à direita em 48 ratos (Wistar-adultos-machos), pesando entre 250-300 gramas, mantidos com dieta normosódica , normoprotéica e água ad libitum. Os animais foram divididos em 3 grupos: Anexina 1-Isquemia (Anx-A1-I/R) (n=16), Veículo(PBS-40)-Isquemia (Veic-I/R) (n=16) e grupo Sham (n=16). A administração de anexina1 endovenosa foi realizada 30 minutos antes do clampeamento da artéria renal esquerda. Após reperfusão, os animais de cada grupo foram divididos e estudados com 2 e 7 dias, quanto às funções glomerulares , tubulares e à estrutura renal. Os resultados mostraram que houve redução da taxa de filtração glomerular (RFG) nos grupos veículo-I/R com 2 e 7 dias de experimento (0,42 ± 0,02 ml-min-100g e 0,48 ± 0,05 ml-min-100g, respectivamente) e verificamos aumento significativo da taxa de filtração glomerular nos grupos Anx-A1-I/R comparados aos grupos veículo-I/R (0,86 ± 0,05ml-min-100g e 0,73 ± 0,04ml-min-100g, respectivamente). Observou-se diferença significativa entre os grupos Anx-A1-I/R e Sham com 7 dias (p<0,01). A excreção fracional de sódio (FeNa) apresentou-se significantemente aumentada nos grupos veículo-I/R, comparada aos grupos Anx-A1-I/R e Sham nos 2º e 7º dias de experimento; apresentando assim no 2º dia de estudo,Anx-A1-I/R (0,17 ± 0,01%), Veic-I/R (0,42 ± 0,03%) e Sham (0,21 ± 0,01%) (p<0,001); e no 7º dia, Anx-A1-I/R (0,27 ± 0,03%), Veic-I/R (0,52 ± 0,03%) e Sham (0,29 ± 0,01%) (p<0,001). A fração de excreção de potássio (FeK) com 2 e 7 dias de experimento não diferiram entre os grupos Anx-A1-I/R e Sham, mas a FeK aumentou significativamente nos grupos Veic-IR. A razão das osmolalidades urinário-plasmáticas (U/Posm) mostraram uma redução importante nos grupos Veic-I/R em experimentos com 2 e 7 dias, comparados aos grupos Anx-A1-I/R e Sham. A avaliação histopatológica revelou aumento significativo de neutrófilos intravasculares e transmigrados, em áreas isquêmicas dos grupos Veic-I/R, de amostras avaliadas da porção do córtex renal com 2 e 7 dias. Verificaram-se altas taxas de transmigração de neutrófilos nas áreas de isquemia-reperfusão nos grupos Veic-I/R com 2 e 7 dias, em amostras avaliadas de medula renal. Houve significativa redução do extravasamento de neutrófilos em análise quantitativa, nas amostras de medula renal com 2 e 7 dias de estudo, nos grupos anexina 1-I/R, bem como menor taxa de neutrófilos no espaço intravascular. À microscopia de luz, verificou-se que, em amostras de córtex e medula renal, com 2 e 7 dias, o grupo Sham apresentou estruturas dos túbulos contorcidos proximais, distais e borda em escova bem preservados. Notou-se resultados semelhantes nos grupos de anexina1-I/R, com estruturas preservadas nos túbulos, membrana basal e glomérulos. Nos grupos Veic-I/R, verificou-se a presença de debris celulares no interior de túbulos contorcidos proximais, capilares dilatados e alterações na estrutura da membrana basal. Estes resultados sugerem que a administração da anexina1, trinta minutos antes da isquemia renal em ratos, previne a transmigração de neutrófilos e confere proteção contra os efeitos iniciais da lesão por isquemia e reperfusão, bem como proteção das funções glomerulares, tubulares e da estrutura renal.

A lesão renal aguda (LRA) é uma séria complicação dos pacientes hospitalizados, causada principalmente pela isquemia/reperfusão (I/R). Ela é definida como um abrupto declínio da função renal baseada em alterações agudas da creatinina sérica e débito urinário. Porém, alterações na creatinina sérica são tardias e variam com o gênero, idade, massa muscular, metabolismo e hidratação do indivíduo. Novos biomarcadores para um diagnóstico mais preciso e precoce da doença são necessários. No entanto, devido em humanos a LRA ser uma doença, em sua maioria, secundária a outras doenças, o desenvolvimento de modelos animais com resposta similar aos humanos é de extrema importância. Assim, o presente estudo tem como objetivo o desenvolvimento e caracterização de um modelo suíno de I/R renal, seguido da identificação de alterações nos perfis metabólicos séricos durante à I/R renal aguda. Além de colaborar com o melhor entendimento da fisiopatologia da doença, pode prover novos biomarcadores com potencial uso no diagnóstico e prognóstico através do monitoramento dos pacientes hospitalizados. Primeiramente, foi desenvolvido um modelo controlado e percutâneo, com único insulto de I/R renal, sem nefrectomia contralateral usando suínos como modelo. A isquemia foi induzida por um cateter-balão inflado por 120min na artéria renal direita seguida de 24 horas de reperfusão. Amostras seriadas de soro e urina foram coletadas. A caracterização do modelo foi feita por análises histológicas e bioquímicas, e a identificação de novos biomarcadores, através da ressonância magnética nuclear (600MHz) seguida da análise por PLS-DA e biologia de sistemas. A necrose tubular aguda foi identificada em todos os animais, porém apenas dois deles apresentaram níveis de creatinina sérica acima de 150% dos seus valores basais. Como esperado, a I/R elevou os níveis de uréia e creatinina e ainda modulou a excreção de Na+, K+, Cl-, bicarbonato e glicose. A NGAL e as proteínas nitradas séricas apresentaram dois perfis: diminuíram com a isquemia e aumentaram com a reperfusão. Este declínio foi associado com o aumento da excreção de proteínas durante a isquemia e início da reperfusão. A partir deste modelo de I/R renal desenvolvido, selecionamos 8 marcadores metabólicos: L-glutamato, L-serina, N-isovaleroilglicina, L-metionina, L-prolina, 2-aminobutirato, colina e creatinina. Estes metabólitos foram capazes de distinguir indivíduos saudáveis e isquêmicos, restaurando seus valores após 11 horas da reperfusão. Através da análise de biologia de sistemas, estes metabólitos se mostraram altamente representativos da via dos aminoácidos, se relacionaram com alterações no transporte iônico e foram associados às vias do fator nuclear kappa B (NF?B), huntingtina (HTT) e pró-insulina. Assim, foi possível desenvolver um modelo de I/R renal percutâneo em modelo suíno, capaz de permitir o desenvolvimento de estudos para explorar respostas fisiopatológicas e novos biomarcadores isquêmicos renais. A partir dele, com ferramentas metabolômicas, foi possível elaborar um painel metabólico que contribui para o estudo da fisiopatologia da isquemia e pode tornar-se uma ferramenta promissora para a identificação precoce de pacientes com LRA geradas pela I/R renal / Acute kidney injury (AKI) is a serious complication in hospitalized patients mainly caused by ischemia/reperfusion. AKI is defined as the abrupt decrease in kidney function based on acute alterations in serum creatinine or urine output. Nevertheless, changes in serum creatinine are late and vary with muscular mass, age, gender, metabolism and hydration of individuals. In this sense, new biomarkers for the accurate and early diagnosis are needed. In humans LRA is a secondary disease, related to the progress of other diseases. Thus, the development of animal models with similar response to humans is extremely important. This study aimed to develop and characterize a swine model of renal ischemia/reperfusion (I/R), followed by the identification of changes in serum metabolic profiles during acute renal I/R. In addition to collaborating with a better understanding of the physiopathology of the disease, these findings may provide new biomarkers with potential use in diagnosis and prognosis through the monitoring hospitalized patients. Here we report the development of a controlled, single-insult model of unilateral renal I/R without contralateral nephrectomy, using a suitable model, the pig. Animals underwent renal ischemia by balloon catheter placed and inflated into the right renal artery for 120 minutes and reperfusion over 24 hours. Serial serum and urine were sampled. The characterization of the renal I/R model was made by histological and biochemical analyzes. Identification of new biomarkers was performed by nuclear magnetic resonance (600MHz) followed by PLS-DA analysis and systems biology. Acute tubular necrosis (ATN) was identified in every animal, but only two animals showed levels of serum creatinine above 150% of baseline values. As expected, I/R increased serum creatinine and BUN. Fractional sodium, potassium, chloride, bicarbonate and glucose excretion were modulated during ischemia. Serum nitrated proteins and NGAL presented two profiles: decreased with ischemia and increased after reperfusion. This decline was associated with increased protein excretion during ischemia and early reperfusion. From this renal I/R model developed, eight metabolites were selected: L-glutamate, L-serine, N-isovaleroylglicine, L-methionine, L-proline, 2-aminobutyrated, choline and creatinine. PLS-DA analysis for these metabolites resulted in an accurate separation between pre ischemia and ischemia groups. All selected metabolites recovered to baseline conditions after 11 hours of reperfusion. Through network analysis we found changes in H+, Na+ and Cl- ion transport pathways and association with Nuclear Factor-KappaB (NF?B), Huntingtin (HTT) and proinsulin (insulin) pathways. Thus, it was possible to develop a percutaneous model of renal I/R in swine model, allowing the development of studies to explore physiopathology responses and new renal ischemic biomarkers. With this model and metabolomic tools, it was possible to develop a metabolic panel that contributes to the study of ischemia physiopathology and may become a promising tool for the early identification of patients with AKI generated by renal I/R