Objetivos del trabajo: 1) Conocer el efecto de la isquemia-reperfusión sobre la concentración de diferentes marcadores de injuria hepática. 2) Establecer el efecto de la isquemia-reperfusión sobre las diferentes poblaciones celulares del hígado de rata. 3) Investigar el efecto de la Lidocaína administrándola a los animales en estudio, evaluar si su efecto protector frente a la isquemia-reperfusión planteado por diferentes equipos de trabajo a nivel miocárdico y cerebral, se cumple en el hígado de rata.

Doctor en Farmacología / En Chile, la patología cardiovascular tiene una elevada prevalencia y constituye la primera causa de muerte del país. Esta realidad ha provocado un aumento significativo de la morbimortalidad perioperatoria, por lo que se recomienda el uso de fármacos cardioprotectores (bloqueadores β-adrenérgicos, estatinas y agonistas α2-adrenérgicos) durante este período. La dexmedetomidina (DEX) es un agonista α2-adrenérgico de uso frecuente en anestesia, con potenciales efectos cardioprotectores. Recientemente, se ha sugerido que produciría un precondicionamiento isquémico al estimular receptores α2-adrenérgicos postsinápticos. Sin embargo, hasta este momento se desconocen los mecanismos moleculares asociados a la potencial cardioprotección inducida por dexmedetomidina. Para responder a esta interrogante, se utilizó un modelo in vivo y un modelo ex vivo de ratas Sprague Dawley, machos, cuyos corazones se sometieron a 30 min de isquemia miocárdica regional y 120 min de reperfusión. Se determinaron los niveles de fosforilación de ERK 1/2, Akt y eNOS, previo a la isquemia y los tamaños de infartos y la recuperación de la función ventricular, al final del periodo de reperfusión. Se estudió la relación entre la activación de kinasas de sobrevida y el efecto precondicionante del fármaco, mediante la inhibición de PI3K. Finalmente, se determinó la presencia y localización de los potenciales subtipos de receptores α2-adrenérgicos involucrados en la cardioprotección inducida por DEX. Los resultados mostraron que en ambos modelos, el precondicionamento con DEX aumentó significativamente los niveles de fosforilación de ERK 1/2, Akt y eNOS, previo a la I/R y redujo significativamente los tamaños de infarto en el área de riesgo, propiciando una mejor recuperación de la función ventricular, al término de la reperfusión. La administración de yohimbina y la inhibición de PI3K, revirtieron la reducción de los tamaños de infarto y la recuperación de la función ventricular inducida por DEX. Además, se demostró la existencia de receptores α2-adrenérgicos en los cardiomiocitos. Los resultados sugieren que el precondicionamiento con DEX produce cardioprotección frente a eventos de isquemia y reperfusión miocárdica regional, muy probablemente al producir activación de la kinasas relacionadas con sobrevida, posterior al estímulo de receptores α2-adrenérgicos ubicados en los cardiomiocitos. Estos hallazgos pueden ser relevantes en el manejo anestésico del perioperatorio de pacientes de alto riesgo cardiovascular / In Chile, cardiovascular disease is highly prevalent and is the leading cause of death in the country. This fact has caused a significant increase in perioperative cardiovascular morbidity and mortality; therefore, the use of cardioprotective drugs (β-adrenergic blockers, statins and α2-adrenergic agonists) during the perioperative period is recommended. Dexmedetomidine (DEX) is an α2-adrenergic agonist commonly used in anesthesia, with potential cardioprotective effects. Recently, it has been suggested that DEX produces ischemic preconditioning by means of postsynaptic α2-adrenergic receptors stimulation. However, molecular mechanisms associated with the potential cardioprotection induced by dexmedetomidine still remains unknown. In order to answer this question, an in vivo and an ex vivo models of male Sprague Dawley rats, whose hearts were subjected to 30 min regional myocardial ischemia and 120 min of reperfusion, were developed. Levels The phosphorylated levels of ERK1/2, Akt and eNOS before ischemia and infarct size and ventricular function recovery at the end of reperfusion period, were determined. The relationship between activation of survival kinases and preconditioning effect of the drug, it was studied by specific PI3K inhibition. Finally, we investigated the presence and location of α2-adrenergic receptor subtypes potentially involved in DEX induced cardioprotection. The results showed that in both modelsDEX preconditioning significantly increased the phosphorylated levels of ERK 1/2, Akt and eNOS, prior to the I/R and significantly reduce infarct size in the area of risk, leading to a better ventricular function recovery at the end of reperfusion. The administration of yohimbine and PI3K inhibition, reversed the reduction of infarct size and ventricular function recovery induced by DEX. Furthermore, the existence of α2-adrenergic receptors in cardiomyocytes, was demonstrated. The results suggest that DEX preconditioning produces cardioprotection against regional myocardial ischemia and reperfusion events, by means of survival kinases activation after stimulation of α2-adrenergic receptors located in cardiomyocytes. These findings may be relevant in the perioperative anesthetic management of patients at high cardiovascular risk

La información respecto a la respuesta del corazón aislado de ratas hipertensas espontáneas (SHR) a la isquemia-reperfusión y a los mecanismos de protección descriptos para ratas normotensas [pre y postacondicionamiento isquémicos (PI y PCI, respectivamente) y farmacológicos], es escasa. Por lo tanto, la participación de la vía PI3K/Akt/GSK-3β y del poro de permeabilidad transitoria de la mitocondria (PPTM) en los mecanismos responsables de la muerte ó la sobrevida de los cardiomiocitos de SHR, no están debidamente aclarados. El objetivo general de este trabajo de tesis fue estudiar en corazones de SHR aislados y perfundidos con la técnica de Langendorff los efectos de la isquemia global (IG, 45 min)-reperfusión (R, 60 min), del PI y PCI y del tratamiento con ClLi e IMI (inhibidores de GSK-3β) sobre el tamaño del infarto, el daño oxidativo, la sensibilidad del PPTM al Ca2+, la liberación de citocromo c al citosol y la ultraestructura mitocondrial. El protocolo de IG-R produjo un tamaño del infarto de aproximadamente 50% del área de riesgo y daño oxidativo, evidenciado por un aumento de la peroxidación lipídica (TBARS), una disminución marcada del contenido de GSH y un aumento de la actividad de SODT y SODMn. El contenido de P-GSK-3β y P-Akt y la sensibilidad del PPTM al Ca2+ disminuyeron, mientras que la expresión de citocromo c en el citosol aumentó. La microscopia electrónica reveló que la mayor parte de las mitocondrias estaban dañadas, con edema y destrucción de sus crestas. Las intervenciones PI y PCI y el tratamiento con los inhibidores de GSK-3β protegieron a los corazones de SHR de los daños antes mencionados. Por lo tanto, en los corazones intervenidos y tratados se observó una disminución del tamaño del infarto y del daño oxidativo evidenciado por la disminución de la peroxidación lipídica (TBARS), preservación parcial del contenido de GSH y disminución de la actividad de SODT y SODMn. La expresión de P-GSK3β y de P-Akt y de la sensibilidad del PPTM al Ca2+ aumentó mientras que el contenido de citocromo c en el citosol disminuyó. Por microscopia electrónica fue posible encontrar en estos grupos la presencia de algunas mitocondrias con ultraestructura conservada. Los efectos beneficiosos del PI y PCI fueron anulados cuando la vía de señalización de PI3K/Akt fue inhibida con wortmanina. Las variables mencionadas retornaron a los valores observados en los corazones isquémicos no tratados. De las relaciones examinadas surge que: a- el tamaño del infarto es mayor cuando la peroxidación lipídica aumenta y el contenido de GSH disminuye. En estas condiciones la sensibilidad del PPTM al Ca2+ es menor. La situación opuesta se da en presencia de intervenciones cardiorpotectoras. Por lo tanto, en ellas el tamaño del infarto es menor cuando la peroxidación lipídica disminuye y el contenido de GSH aumenta. En estas condiciones la sensibilidad del PPTM al Ca2+ tiende a recuperarse. En base a los datos obtenidos se concluye que las alteraciones de la formación y/ó apertura del PPTM, participan y determinan la muerte ó la sobrevida celular en el corazón hipertrófico de SHR sometido a isquemia-reperfusión. Así, la disminución del tamaño del infarto obtenida con las intervenciones y/ó tratamientos utilizados fue el resultado de la disminución del daño oxidativo íntimamente asociada a la recuperación parcial de la integridad mitocondrial -menor apertura del PPTM- vía P-Akt/P-GSK-3β. Otro hallazgo interesante fue que la protección por el tratamiento con ClLi (fármaco ampliamente utilizado en psiquiatría) fue similar a la obtenida con las intervenciones de acondicionamiento isquémico (PI y PCI). Por lo tanto, esta droga podría ser una posible herramienta terapéutica para atenuar la injuria por isquemia y reperfusión. / Information regarding to the response to ischemia-reperfusion in isolated hearts from spontaneously hypertensive rats (SHR) as well as the effect of the protective mechanisms described in normotensive rats (ischemic and pharmacological pre and postconditioning, IP and IPC), is scarce. Therefore, the participation of PI3K/Akt/GSK-3β pathway and the mitochondrial permeability transition pore (mPTP) in the mechanisms responsible for cardiomyocyte death or survival are not properly clarified. The objective of this investigation was to study in isolated hearts from SHR the effects of global ischemia (GI, 45 min) and reperfusion (R, 60 min), and the actions of IP, IPC, treatments with LiCl and IMI (GSK-3β inhibitors) on infarct size, oxidative damage, mPTP Ca2+ sensitivity, cytochrome c release to the cytosol and mitochondrial ultrastructure. The protocol of GI-R produced an infarct size of approximately 50%, increased oxidative damage as evidenced by an increase of lipid peroxidation (TBARS), a decrease of GSH content and an increase of Total SOD and MnSOD activity. The content of P-GSK-3β and P-Akt and the mPTP Ca2+ sensitivity decreased while the expression of cytochrome c in the cytosol increased. Electron microscopy showed that most of the mitochondria were damaged, presenting edema and destruction of the cristae. IP, IPC and pharmacologic treatments with both GSK-3β inhibitors protected the hearts against reperfusion injury. Therefore, in the hearts treated we observed a smaller infarct size and reduced oxidative damage (decreased lipid peroxidation (TBARS), partial preservation of GSH and decreased Total SOD and MnSOD activity) compared to non-treated ischemic hearts. The P-GSK-3β and P-Akt expression and mPTP Ca2+ sensitivity increased while the cytosolic cytochrome c content decreased. By electron microscopy it was possible to find some mitochondria with normal ultrastructure. The beneficial effects of IP and IPC were canceled when the PI3K/Akt was inhibited with wortmannin. All the parameters examined returned to the values observed in non-treated ischemic hearts. Analyzing the relationships: Infarct size vs. TBARS and GSH, and mPTP Ca2+ sensitivity vs. Infarct size and TBARS, it arises that: the Infarct size increased when lipid peroxidation increased and GSH content decreased. Under these conditions the mPTP Ca2+ sensitivity decreased. The opposite situation occurs in the presence of the cardioprotective interventions. Therefore, the infarct size decreased when lipid peroxidation decreased and GSH content increased. Under these conditions the mPTP Ca2+ sensitivity tended to recover. Based on the data obtained, we suggest that the alterations of formation and/or opening of the mPTP participate and determine cell death or survival in the hypertrophic heart of SHR subjected to ischemia-reperfusion. Thus, the reduction in infarct size obtained with the ischemic interventions and /or treatments derived from the decreased oxidative damage intimately linked to a partial recovery of mitochondrial integrity- less mPTP opening- via P-Akt/P-GSK-3β. Another interesting finding was that the protection by the treatment with LiCl (drug widely used in psychiatry) was similar to that obtained with ischemic interventions (IP and IPC). Therefore, this drug emerges as a potential therapeutic tool in reducing the post-ischemic changes.

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Introduction: Severe ischemia-reperfusion injury (IRI) after liver transplantation are correlated with lower early and late graft and patient survival, higher infection rates, appearance of acute and chronic rejections and other complications. In this field, it has been demonstrated that the prostaglandin E1 (PGE1) presents cytoprotective, anti-inflammatory and vasodilator effects. Therefore, the PGE1 assembles most of the requirements necessary to prevent the development of the ischemia-reperfusion injury, especially if it is administered through via portal vein at full doses in the moment of graft reperfusion.Materials and methods: Female Largewhite-Landrace pigs (body weight between 30-35 kg) were used. The orthotopic liver transplantation were performed in 18 pairs of pigs. The study was divided into three groups as follows: Control group, 4 experiments of orthotopic liver transplantation with a cold preservation time of 3 hours in Wisconsin solution; Groups A and B, 7 experiments with 24 hours of cold preservation time in each group. Concerning intraportal infusion of medication, the Group B was infused with prostaglandin E1 at a dose of 0.15 ug/kg/min (Alprostadil 500ug) for 90 minutes in the portal reperfusion of the graft; and Group A was infused with saline solution for 90 minutes in the same time period. In the recipient surgery, biochemical (GOT, GPT, LDH, B-Galactosidase, Hialuronic Acid), hemodynamic and histological studies were carried out to evaluate the ischemia-reperfusion injury (IRI).Results: Survival rate in control group was 100 % and it presented a lower level of sinusoidal-hepatocellular injury and leukocyte activation than the groups A and B. From the beginning of the surgery until the moment of the PGE1 administration, both the group A and the group B were similar in relation to the histology, hepatocellular, endothelial and inflammatory damage markers. After the infusion of the medication (PGE1), the group B developed an increase of the total hepatic flow and a lower alteration of all the parameters of hepatocyte-sinusoidal injury and hepatic function, with an statistical significance in the great majority of them. The portal PGE1 infusion at full doses did not generate hemodynamic instability. Conclusions: The liver transplantation in pigs with 24 hours of cold ischemia of the graft produced a severe IRI that caused the death of all the animals in the groups A and B due to primary graft nonfunction. Nevertheless, with the intraportal PGE1infusion, the group B presented an increase of the total hepatic flow and a lower alteration of all the parameters of hepatocellular injury, sinusoidal damage and hepatic function. The portal PGE1 perfusion at full doses was well tolerated at hemodynamic level.

Memoria para optar al Titulo Profesional de Médico Veterinario / La exposición de un órgano a situaciones de citotoxicidad moderada o transitoria le otorga protección frente a una nueva exposición citotóxica, lo que ha permitido el desarrollo del preacondicionamiento, proceso biológico que atenúa o elimina el daño inducido en dicho órgano por una acción citotóxica agresiva posterior. En el hígado existen situaciones clínicas, en particular la cirugía hepática bajo exclusión vascular, que involucran la Isquemia/Reperfusión (I/R), fenómeno que gatilla mecanismos que llevan a la injuria hepática, entre ellos el estrés oxidativo. Si bien niveles altos de especies pro-oxidantes derivadas del oxígeno (ROS) o del nitrógeno son deletéreas y generan daño celular, concentraciones moderadas y transitorias de ROS desempeñan un importante papel citoprotector al gatillar vías de señalización intracelular, mediadas por factores de transcripción redox-sensibles que regulan la expresión de proteínas citoprotectoras, permitiendo así reestablecer la homeostasis redox. En consecuencia, condiciones que generen en el hígado un bajo nivel de ROS (estrés oxidativo moderado) pueden gatillar procesos clave en la hepatoprotección contra el daño derivado de la I/R. Al respecto, la hormona tiroídea (L-3,3,,5-triyodotironina, T3) gatilla estrés oxidativo hepático moderado y transitorio, al ser aplicada en protocolos moderados, condición que puede preacondicionar al hígado frente a la I/R, mediante la activación de HSF-1, factor de transcripción redox-sensible que regula la expresión de Hsp-70, proteína citoprotectora. 9 Esta propuesta evaluó el preacondicionamiento hepático, otorgado por la administración de T3 (PHT), en el daño inducido por la I/R. El estudio consideró evaluar la vía de señales regulada por HSF-1 y la expresión de Hsp-70, como mecanismo hepatoprotector, utilizando ratas Sprague- Dawley tratadas con una dosis única de T3 (0.1 mg/Kg. de peso, i.p.) o volúmenes equivalentes de su vehículo (NaOH 0.1 N), y luego sometidas (48 hrs. post-T3 o NaOH) a I/R o a cirugía simulada (Sham). La I/R consistió en 60 minutos de isquemia (oclusión de la tríada hepática), seguido de 20 horas de reperfusión. En todos los grupos se evaluó (a) índices de daño hepático, (histología y niveles séricos de LDH y transaminasas GOT y GPT), (b) parámetros de estrés oxidativo hepático [contenidos totales de equivalentes de glutatión reducido (GSH) y proteínas oxidadas], (c) unión a DNA (actividad) de HSF-1 y (d) expresión de Hsp-70. La I/R no precedida de PHT (NaOH/IR), gatilló incrementos significativos en las actividades séricas de GOT, GPT y LDH, en concomitancia con marcadas alteraciones de la histología hepática (distorsión de la arquitectura, presencia de necrosis e infiltración de neutrófilos) e inducción de estrés oxidativo hepático (aumento del contenido de proteínas oxidadas y disminución del contenido total de GSH). Respecto a este grupo, la injuria hepatocelular gatillada por la I/R, disminuyó en los animales preacondicionados con T3, con normalizaciones de la histología hepática, actividades séricas de LDH y transaminasas y del estado redox hepático, señalando así el papel preacondicionante de T3 frente a la injuria hepática inducida por la I/R. 10 La I/R incrementó significativamente la actividad de HSF-1 y la expresión de Hsp70. Sin embargo, no se observó diferencias significativas entre estos 2 grupos experimentales, por lo cual se concluye que la vía de señalización celular regulada por HSF-1 no participa en la protección hepática conferida por el PHT

La relevancia de la investigación de Ilex brasiliensis (Spreng.) Loes. (Aquifoliaceae) se justifica en la proximidad filogenética y biogeográfica con Ilex paraguariensis (yerba mate), en su uso popular como sustituto o adulterante de la yerba mate y en la escasa información respecto a sus propiedades biológicas. Esta tesis estudia el órgano foliar que es la materia prima de uso popular para preparar las infusiones y se propone establecer características farmacognósticas, evaluar la actividad antioxidante y los efectos en la fisiopatología del daño miocárdico inducido por isquemia y reperfusión. En el análisis micrográfico se distinguen caracteres morfoanatómicos diferenciales con I. paraguariensis, en particular: los tipos de estomas, la estructura del haz vascular y la vaina de esclerénquima de la vena media foliar. El estudio de I. brasiliensis utilizando HPLC-PDA-UV demuestra dos características fitoquímicas diferenciales respecto I. paraguariensis: la ausencia total de cafeína y la mayor riqueza en isoquercitrina. El análisis con HPLC-ESI-MS pone en evidencia que I. brasiliensis posee una mayor variedad de flavonoides derivados de quercetina y kaempferol. Los métodos colorimétricos determinan una mayor concentración de fenoles totales y ácido ascórbico. I. brasiliensis posee una elevada actividad antioxidante in vitro como atrapador de radicales libres estables (DPPH y ABTS) y de especies reactivas derivadas del oxígeno y del nitrógeno (superóxido y peroxinitrito). También, la capacidad para inhibir la peroxidación lipídica enzimática y no enzimática de microsomas hepáticos de rata y proteger a las LDL de la peroxidación lipídica inducida por cobre. En comparación a I. paraguariensis, el extracto acuoso de I. brasiliensis tiene una mayor actividad antioxidante como atrapador de ABTS•+ y peroxinitrito y como reductor de Fe+3. Estos hallazgos se atribuyen a su mayor contenido de ácido ascórbico. Los resultados alcanzados demuestran, por primera vez, que un extracto acuoso de hojas de I. brasiliensis disminuye las alteraciones post-isquémicas de la función miocárdica y el daño oxidativo producidos como consecuencia del proceso de isquemia y reperfusión. Asimismo, que el mecanismo cardioprotector es dependiente de la NOS. Efectos similares se observan después del tratamiento con I. paraguariensis. Se postula que las acciones cardioprotectoras de I. brasiliensis no son simplemente debidas a sus propiedades redox; sino más bien, a la capacidad de algunos de sus constituyentes para unirse a proteínas dianas.

Memoria para optar al título de Químico Farmacéutico / El daño ocasionado por la ocurrencia de un infarto cardíaco es complejo, generando la muerte celular cardíaca entre otros efectos deletéreos tanto en el periodo isquémico de falta de oxígeno y nutrientes, así como también en la posterior reperfusión sanguínea. Frente a esta condición patológica los fibroblastos cardíacos son capaces de reaccionar, secretando y renovando la matriz extracelular; lo que los convierte en elementos celulares claves en la cicatrización y remodelado del tejido cardiaco dañado post-infarto al miocardio. Esto hace necesario el intentar preservar la viabilidad de estas células para una correcta cicatrización y mantención de la función cardíaca. En relación a esto se ha reportado el uso de factores de crecimiento como elementos cardioprotectores frente al daño ocasionado por I/R, entre los cuales destaca el factor de crecimiento análogo a insulina de tipo I (IGF-1); cuyas propiedades cardioprotectoras han sido reportadas frente a I/R. Sin embargo, estos efectos citoprotectores en corazón, otorgados por IGF-1 solo han sido estudiados en cardiomiocitos, por lo que sus efectos en fibroblastos cardíacos son aun desconocidos. Nuestro trabajo estudió la capacidad de IGF-1 de proteger a los fibroblastos cardíacos de ratas neonatas sometidos a un modelo in vitro de I/R e indagó en las vías de transducción implicadas con esta protección. El tratamiento con IGF-1 (10 ng/mL) previno la pérdida de viabilidad y apoptosis de fibroblastos cardiacos ocasionado por el daño por I/R. Más aun, esta protección se observó al incubar con IGF-1 durante el momento de reperfusión e I/R, pero no así en el período isquémico, lo que sugiere que la muerte de los fibroblastos cardiacos es causada principalmente por el daño por reperfusión. Akt fue rápidamente fosforilado por IGF-1 tanto en isquemia como en reperfusión, mientras que ERK 1/2 sólo se fosforiló en el momento de reperfusión. La utilización de los inhibidores LY29002 y PD98059, neutralizó la protección conferida por IGF-1. Por lo que nuestros resultados demuestran que el tratamiento con IGF-1 durante la reperfusión previene la muerte de los fibroblastos cardiacos sometidos a I/R mediante la activación de las vías PI3K/Akt y MEK-ERK 1/2 / Myocardial infarction causes complex injury, involving cell death among other detrimental effects in both ischemia and reperfusion periods. To face this pathological condition, cardiac fibroblasts are key cellular elements, capable of extracellular matrix secretion and renewal, allowing the healing and remodeling of damaged heart tissue post-myocardial infarction. It necessary then, to preserve the viability of these cells for a proper healing and maintenance of cardiac function. In regards to this, it has been demonstrated the use of several growth factors to protect cardiac cells from the effects of acute ischemia/reperfusión. Among these, insulin-like growth factor (IGF-1) has showed several cardioprotective properties in hearts exposed to ischemia/reperfusion. However these cytoprotective effects granted by IGF-1 have been studied only in cardiomyocytes, while their effects on cardiac fibroblasts remain unknown. In this study we have determined the ability of IGF-1 to protect cardiac fibroblasts against simulated in vitro I/R injury and investigated the potential mechanisms underlying this protection. Treatment with IGF-1 (10 ng/mL) promoted a increase in cell survival against I/R dependent cell death and a decrease in apoptosis induced by this injury. Furthermore, the IGF-1 induced protection was observed with treatment at the time of reperfusion but not with IGF-1 at the time of ischemia, suggesting that cardiac fibroblast death is induced by reperfusion injury. Akt was rapidly phosphorylated by IGF-1 at both ischemia and reperfusion, but ERK 1/2 was only phosphorylated by IGF-1 at the onset of reperfusion. IGF-1 induced protection was abolished when LY294002 and PD98059 were used, suggesting that the protection is mediated via a Akt and ERK 1/2 dependent pathways. Thus, the results suggest that IGF-1 treatment at reperfusion prevents cardiac fibroblast death induced by simulated in vitro I/R via the activation of PI3K/Akt and MEK-ERK 1/2 pathways

Grado de magíster en fisiopatología / Las enfermedades cardiovasculares corresponden a una de las mayores causas de muerte en el mundo, donde el infarto agudo del miocardio es responsable de la mayoría de ellas. Diferentes vías confluyen en el daño y muerte del tejido cardiaco durante el infarto. Sin embargo las principales corresponden al aumento descontrolado tanto de especies reactivas de oxígeno (EROS), como de iones calcio (Ca2+) citoplasmáticos. A pesar de esto se desconoce la totalidad de mecanismos implicados durante este tipo de patología. La policistina-1 (PC1) es una proteína transmembrana, producto del gen PKD1, clave en la función cardiaca en condiciones fisiológicas, lo cual podría estar relacionado al hecho de que regula los niveles proteicos de los canales de Ca2+ sensibles a voltaje tipo-L en la membrana de los cardiomiocitos. Además, se ha reportado que la PC1 regula las concentraciones de Ca2+ y de ROS citoplasmáticos y que su ausencia aumenta el daño posterior a la isquemia reperfusión renal. A pesar de lo anterior, se desconoce el papel de la PC1 en condiciones de isquemia-reperfusión (IR) cardiaca. En esta tesis se evaluó la hipótesis que la ausencia de la PC1 en los cardiomiocitos aumenta el estrés oxidativo y el daño producido por la IR cardiaca. Utilizamos un modelo ex vivo de IR en corazones de ratones controles (PC1F/F) y knockout para la PC1 en los cardiomiocitos (PC1 KO). Los resultados indican que los corazones de los ratones PC1 KO sometidos a IR, en comparación a los PC1F/F, presentan un mayor tamaño de infarto y cantidad de LDH, dando cuenta de una mayor muerte del miocardio posterior a una IR. Sin embargo, al comparar los parámetros hemodinámicos, no existieron diferencias entre ambos grupos. En cuanto a los EROS, los corazones PC1 KO sometidos a IR, presentaron niveles mayores de proteínas carboniladas y nitradas que los ratones PC1F/F. En su conjunto, nuestros resultados sugieren que la PC1 es una proteína que evita un mayor daño durante la IR cardiaca, lo cual podría estar asociado con su capacidad para evitar un aumento del estrés oxidativo durante la IR. / Cardiovascular diseases are one of the most important causes of death world wide, and acute myocardial infarction is responsible for the most of them. Different mechanisms are involved in the injury and death of the myocardium during an infarct. However, the main mechanisms are the uncontrolled increase of reactive oxygen species (ROS) and citoplasmatic calcium (Ca2+). Nevertheless, many of the mechanisms implicated in this pathology are still unknown. Polycistin-1 (PC1) is a transmembrane protein product of the translation of PKD1 gene, which plays a key role in the cardiac function in physiological conditions; this could be related to the fact that PC1 regulates the voltage-dependent Ca2+ channels in the membrane of the cardiomyocites. It has been reported that PC1 regulates the concentrations of Ca2+ and ROS in the cytoplasm, and that the absence of PC1 increases the damage after renal ischemia-reperfusion. In spite of this, the role of PC1 under myocardial ischemia reperfusion (IR) is uncleared. The hypothesis that the absence of PC1 in the cardiomyocites increases the oxidative stress and the damage produced by myocardial IR was evaluated in this thesis. An ex vivo model of myocardial IR, in control mouse hearts (PC1F/F) and knockout for PC1 mouse hearts (PC1 KO) was used for this purpose. The results show that the PC1 KO hearts submitted to IR presented bigger infarct size and higher amount of LDH in comparison with PC1F/F, indicating more death of the myocardium after IR, although they did not show differences in hemodynamic parameters. In relation to the levels of ROS after IR, PC1 KO hearts showed higher levels of protein carbonilation and nitrotyrosination in comparison with PCF/F. The results of this investigation suggest that PC1 is a protein that prevents the damage during myocardial IR, and this could be associated to its role in preventing the increase of ROS during IR.

[ES] La lesión por isquemia-reperfusión (I/R) hepática (IRI) es una causa importante de mortalidad y morbilidad en la resección hepática y el trasplante de hígado. Durante la hipoxia, el hígado permanece sin oxígeno, cambiando su metabolismo y parando la síntesis de ATP. Paradójicamente, el restablecimiento del flujo de oxígeno causa más daño, activando el sistema inmunitario que generará una gran cantidad de especies reactivas de oxígeno (ROS) causando daño celular y tisular. La ciclooxigenasa-2 (COX-2) es una enzima clave en la biosíntesis de prostaglandinas y su importancia en la IRI es controvertida. La PGE2, prostaglandina E2, es el principal producto de la COX-2, y participa en la mediación de procesos patológicos como la inflamación, la fiebre y el dolor. El uso de AINEs, inhibidores específicos de la COX, apunta a un efecto beneficioso en la resolución del proceso inflamatorio, pero cada vez más estudios apoyan el papel antiinflamatorio de la COX-2. De hecho, estudios previos han demostrado que la sobreexpresión de COX-2 en hepatocitos protege a los ratones de la apoptosis y el estrés celular, además de reducir la respuesta inflamatoria en diferentes modelos de enfermedad hepática. En esta tesis doctoral, se utilizó un ratón transgénico que sobreexpresa COX-2 en los hepatocitos (h-COX-2 Tg) para dilucidar el papel y la implicación de la COX-2 en la IRI. Los animales de tipo silvestre (Wt) y h-COX-2 Tg fueron sometidos a 90 min de isquemia, seguidos de 4 o 24 h de reperfusión. Comparando los animales h-COX-2 Tg con sus hermanos Wt, el daño celular y tisular se atenúa tras la IRI. Entre las distintas vías modificadas, la cascada inflamatoria está menos activada, con menor liberación de citoquinas pro-inflamatorias, menor reclutamiento hepático, e infiltración de neutrófilos. Las vías de necrosis y apoptosis también se atenúan así como se reduce del estrés del retículo endoplásmico, y aumenta la autofagia. La respuesta antioxidante se potencia en el contexto de la sobreexpresión de COX-2 y la producción total de ROS es menor, lo que contribuye a un menor daño tisular. Cuando los animales Wt se someten un pre-condicionamiento (PC), la COX-2 endógena se induce a niveles más altos que sin PC, mostrando menos daño, una inflamación atenuada, y una respuesta antioxidante mejorada. Además, se muestra que el papel de la COX-2 en esta protección es específico, ya que su inhibición con DFU revierte los efectos observados e iguala el daño causado a los animales Wt. Las mitocondrias son actores centrales en la fisiopatología de la IRI. En este sentido, la función mitocondrial está preservada en los hígados que sobreexpresan COX-2, con un potencial de membrana mitocondrial conservado y una tasa respiratoria preservada. Estos efectos pueden explicarse por una estabilización de las crestas mitocondriales, invaginaciones de la membrana mitocondrial interna (IMM) que se mantienen mediante interacciones de varias isoformas de la proteína OPA1. Su procesamiento está mediado por proteasas, como OMA1. En ratones h-COX-2 Tg hay un menor procesamiento de OPA1, que se correlaciona con una actividad atenuada de OMA1. Por otro lado, se realizó un estudio retrospectivo en pacientes que habían sido sometidos a un trasplante hepático. Se analizaron los niveles de PGE2 y se correlacionaron con las funciones hepáticas tras el trasplante. Este análisis muestra que la presencia de PGE2 en el plasma de los pacientes receptores se correlaciona con un mejor pronóstico, mientras que unos niveles más bajos de PGE2 se asocian con una disfunción precoz del injerto. Todos estos resultados presentan a la COX-2 como un nuevo actor en la protección del hígado tras I/R, mostrando un papel antiinflamatorio y antioxidante, así como reduciendo el daño mitocondrial, el estrés celular y la muerte celular. Además, se demuestra cómo las prostaglandinas derivadas de la COX-2 en condiciones fisiológicas pueden desempeñar un papel protector en casos de trasplante hepático. / [CA] La lesió per isquèmia-reperfusió (I/R) hepàtica (IRI) és una causa important de mortalitat i morbiditat en la resecció hepàtica i el trasplantament de fetge. Durant la hipòxia, el fetge roman sense oxigen, canviant el seu metabolisme i aturant la síntesi d'ATP. Paradoxalment, el restabliment del flux d'oxigen causa més danys, activant el sistema immunitari que genera una gran quantitat d'espècies reactives d'oxigen (ROS) causant dany cel·lular i tissular. La ciclooxigenasa-2 (COX-2) és un enzim clau en la biosíntesi de prostaglandines i la seva importància a l'IRI és controvertida. La PGE2, prostaglandina E2, és el principal producte de la COX-2, i participa en la mediació de processos patològics com la inflamació i la febre. Mentre que l'ús d'AINEs, inhibidors específics de la COX-2, apunta a un efecte beneficiós en la resolució del procés inflamatori, cada cop més estudis donen suport a un paper antiinflamatori de la COX-2. De fet, estudis previs han demostrat que la sobreexpressió de COX-2 en hepatòcits protegeix els ratolins de l'apoptosi i l'estrès cel·lular, a més de reduir la resposta inflamatòria, en diferents models de malaltia hepàtica. En aquesta tesi, s'ha utilitzat un ratolí transgènic que sobreexpressa la COX-2 en els hepatòcits (h-COX-2 Tg) per dilucidar el paper i la implicació de la COX-2 a l'IRI. Els animals de tipus silvestre (Wt) i h-COX-2 Tg van ser sotmesos a 90 min d'isquèmia, seguits de 4 o 24 h de reperfusió. Comparant els animals h-COX-2 Tg amb els seus germans Wt, el dany cel·lular i tissular s'atenua després de l'IRI. Entre les diferents vies modificades, la cascada inflamatòria està menys activada, s'alliberen menys citocines proinflamatòries , hi ha un menor reclutament hepàtic i menor infiltració de neutròfils. Les vies de necrosi i apoptosi també s'atenuen, així com es redueix l'estrès del reticle endoplasmàtic, i l'autofàgia augmenta. La resposta antioxidant es potencia i la producció total de ROS també és menor, fet que contribueix a un menor dany tissular. Quan els animals Wt se sotmeten a un precondicionament (PC), la COX-2 endògena s'indueix a nivells més alts que sense PC, i aquests fetges mostren menys dany, una inflamació atenuada i una resposta antioxidant millorada. A més, es mostra que el paper de la COX-2 en aquesta protecció és específic, ja que la seva inhibició amb DFU, reverteix els efectes observats i iguala el dany causat als animals Wt. Els mitocondris són actors centrals en la fisiopatologia de l'IRI. En aquest sentit, la funció mitocondrial és preservada als fetges que sobreexpressen COX-2, com es pot demostrar per un potencial de membrana mitocondrial conservat i una taxa respiratòria preservada. Aquests efectes es poden explicar per una estabilització de les crestes mitocondrials, invaginacions de la membrana mitocondrial interna (IMM) que es mantenen mitjançant interaccions de diverses isoformes d'OPA1, una proteïna de la IMM. El seu processament està mediat per proteasas, com OMA1. En ratolins h-COX-2 Tg hi ha un menor processament d'OPA1, que es correlaciona amb una activitat atenuada d'OMA1, mostrant una estabilització de les crestes. D'altra banda, es va fer un estudi retrospectiu amb pacients que havien estat sotmesos a un trasplantament hepàtic. Es van analitzar els nivells de PGE2 i es van correlacionar amb les funcions hepàtiques després del trasplantament. Aquesta anàlisi mostra que la presència de PGE2 en el plasma dels pacients receptors es correlaciona amb un millor pronòstic, mentre que uns nivells més baixos de PGE2 s'associen amb una disfunció precoç de l'empelt. Tots aquests resultats presenten a la COX-2 com un nou actor en la protecció del fetge després d'I/R, mostrant un paper antiinflamatori i antioxidant, així com reduint la lesió mitocondrial, l'estrès cel·lular i la mort cel·lular. A més, es demostra com les prostaglandines derivades de la COX-2 en condicions fisiològiques poden exercir un paper protector en casos de trasplantament hepàtic. / [EN] Hepatic ischemia-reperfusion (I/R) injury (IRI) is a major cause of mortality and morbidity in liver resection and liver transplantation. During the hypoxia, the liver remains without oxygen supply, shifting its metabolism and stopping the ATP synthesis. Paradoxically, the restoration of oxygen flow causes the most damage with an activation of the immune system that will generate a burst of reactive species of oxygen (ROS) that will cause cell and tissue damage. Cyclooxygenase-2 (COX-2) is a key enzyme in prostaglandin biosynthesis and its importance in IRI is controversial. PGE2, prostaglandin E2, is the main product of COX-2, and is mainly involved in mediating pathological processes such as inflammation, fever and pain. While the use of NSAIDs, specific COX inhibitors, points to a beneficial effect in the resolution of the inflammatory process, several studies support the idea of an anti-inflammatory role of COX-2. In fact, previous studies have shown that COX-2 overexpression in hepatocytes protects mice from apoptosis and cellular stress, as well as reducing the inflammatory response, in different liver disease models. In this PhD thesis, a hepatocyte-specific COX-2 transgenic mouse (h-COX-2 Tg) was used to elucidate the role and involvement of COX-2 in IRI. Wild type (Wt) and h-COX-2 Tg animals were subjected to 90 min of ischemia, followed by 4 or 24 h of reperfusion. Comparing h-COX-2 Tg animals with their Wt littermates, cellular and tissue damage resulting from IRI is attenuated. Among these pathways, the inflammatory cascade is less activated, with less pro-inflammatory cytokine release, less hepatic recruitment and neutrophil infiltration. Necrosis and apoptosis pathways are also attenuated such as reduced endoplasmic reticulum stress, and increased autophagy. The antioxidant response appears to be enhanced in the context of COX-2 overexpression and total ROS production is also lower, contributing to less tissue damage. When Wt animals are subjected to preconditioning (PC), endogenous COX-2 is induced at higher levels than without PC, and these livers show less damage, attenuated inflammation, and an enhanced antioxidant response. Furthermore, the role of COX-2 in this observed protection has been shown to be specific, as its inhibition with DFU, reverses the observed effects, and matched the damage caused to Wt animals. Mitochondria are central players in the pathophysiology of IRI. In this regard, mitochondrial function is preserved in COX-2-overexpressing livers, as can be demonstrated by a conserved mitochondrial membrane potential and a preserved respiratory rate. These results can be explained by a stabilisation of mitochondrial cristae, invaginations of the inner mitochondrial membrane (IMM) that maintained through interactions of various isoforms of OPA1. Its processing is mediated by proteases, such as OMA1, which acts under certain stimuli. In h-COX-2 Tg mice, there is a reduced OPA1 processing that correlates with attenuated OMA1 activity, showing a stabilisation of cristae in the context of COX-2 overexpression after I/R. On the other hand, a retrospective study was conducted in patients who had undergone liver transplantation. In this part of the study, PGE2 levels were analysed and correlated with liver functions after transplantation. This analysis shows that the presence of PGE2 in the plasma of recipients correlates with a better prognosis, while lower PGE2 levels are associated with early graft dysfunction. All these results present COX-2 as a new player in liver protection after I/R, showing an anti-inflammatory and antioxidant role, as well as reducing mitochondrial damage, cell stress and cell death. Furthermore, it is shown how COX-2-derived prostaglandins under physiological conditions can play a protective role in cases of liver transplant. / This work has been carried out with the financial support of the Spanish Ministry of Science and Innovation (SAF2016-75004R and PID2019-108977RB-100), the CIBERehd (Centro de Investigaciones Biomédicas En Red de Enfermedades Hepáticas y Digestivas) and the COST Action (CA15203 - Mitochondrial mapping: Evolution - Age - Gender - Lifestyle - Environment (MITOEAGLE)). Marina Fuertes Agudo benefited from a pre-doctoral FPI contract (BES-2017- 081928) associated with the SAF2016-75004R project. She spent 3 months in the laboratory of Dr. Pau Sancho Bru at the Institut d’Investigacions Biomèdiques August Pi I Sunyer (IDIBAPS, Barcelona, Spain) funded by a short stay grant awarded by the CIBERehd and 3 months in the laboratory of Dr. Anne Dubart Kupperschmitt and Dr. Jean Charles Duclos Vallée at the Institut Nationale de la Santé et la Recherche Médicale (INSERM, Villejuif, France) funded by a short stay grant awarded by the European Molecular Biology Organisation (EMBO, SEG_9771). / Fuertes Agudo, M. (2023). Role of Cyclooxygenase-2 in Ischemia-Reperfusion Injury in the Liver [Tesis doctoral]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/196602