Thesis (Ph. D.)--University of Missouri--Columbia, 2002. / "December 2002." Typescript. Vita. Includes bibliographical references (leaves 143-155). Also available on the Internet.

Pseudomonas aeruginosa est une bactérie à Gram négatif ubiquitaire, pathogène opportuniste. Elle est la 3ème cause d’infections nosocomiales, notamment chez les immunodéprimés et les grands brûlés. Elle est aussi responsable de la mort de nombreux patients atteints de la mucoviscidose. Sa virulence est largement due à son aptitude à sécréter de nombreuses enzymes dégradatives et toxines, parmi lesquelles la protéine ExoU, sécrétée par le Système de Sécrétion de Type III. ExoU est une phospholipase, de la famille des « patatin-like proteins », dont l’activité est portée par une dyade catalytique Ser-Asp.Mon travail de thèse a permis d’identifier 4 homologues d’ExoU (PlpA, PlpB, PlpC et PlpD) dans le protéome de la souche PAO1 de P. aeruginosa (qui est dépourvu de cette protéine). En étudiant le mode de sécrétion de PlpD, nous avons découvert une nouvelle branche du Système de Sécrétion de Type V (SST5), le SST5d. La protéine représentant ce nouveau système possède un domaine C-terminal transporteur de type TpsB (SST5b), fusionné à un domaine N-terminal patatine sécrété dans le milieu extracellulaire (à l’image d’un autotransporteur, ou SST5a). Ce mode de sécrétion serait un mode dédié à la sécrétion de « patatin-like proteins », comme le suggèrent nos analyses phylogénétiques, à Nous avons en outre démontré que PlpD possède une activité lipase.L’autre protéine étudiée, PlpA, est également sécrétée, bien que nous n’ayons pu établir avec certitude sa voie de transport. Nous avons évalué le rôle de cette protéine lors de l’interaction de P. aeruginosa avec des cellules hôtes de type macrophages et cellules épithéliales. Nous avons observé que cette protéine confère une protection temporaire aux cellules infectées par P. aeruginosa. Ce retard semble être directement imputable à l’activité de la protéine, puisqu’il est dépendant de l’intégrité de la dyade catalytique putative de PlpA / Pseudomonas aeruginosa is an ubiquitous Gram negative bacteria, and efficient opportunistic pathogen. It is the third most common cause of nosocomial infections, most particularly within immunocompromized or burn patients. This pathogen is responsible for the death of numerous cystic fibrosis patients. Its virulence is due mainly to its capacity to secrete numerous degradative enzymes and toxins, among them, ExoU which is secreted via the Type III Secretion System. ExoU is a phospholipase of the patatin-like protein family, and its activity is based on a Ser-Asp catalytic dyad.During my thesis, we identify 4 ExoU homologs (PlpA, PlpB, PlpC, and PlpD) in the proteome of the P. aeruginosa PAO1 strain (this strain does not possess ExoU). Results obtained studying PlpD secretion led us to discover a new branch of the Type V Secretion System (T5SS), the T5dSS. PlpD is composed of a C-terminal TpsB-like transporter domain (like T5bSS), fused to a N-terminal patatin domain which is secreted into the extracellular medium (like autotransporters, or T5aSS). Our phylogenetic analysis suggests that this secretion pathway may be dedicated to the secretion of PLPs, like T5cSS, which secretes only adhesins. Moreover, we demonstrated that PlpD is a lipase.The other studied protein, PlpA, is also a secreted protein, but we still do not know which secretion system is involved in its secretion. We tested the role of PlpA during interaction of P. aeruginosa with host cells by carrying out infections of murin macrophages and epithelial cells. We observed a transitory protection of cells infected with P. aeruginosa. This protection seems to require an active PlpA protein as it is dependent on a intact catalytic dyad in this protein

A Osteogênese Imperfeita (OI) é uma doença genética do tecido conjuntivo caracterizada por fragilidade óssea e susceptibilidade à fratura sob mínimo ou nenhum trauma. O objetivo deste trabalho foi estudar características clínicas e moleculares de crianças e adultos com Osteogênese Imperfeita e analisar o efeito do tratamento medicamentoso com bifosfonados em relação aos biomarcadores metabólicos e ósseos em pacientes adultos. Esta tese se dividiu em dois capítulos onde 1) foi realizado um estudo retrospectivo sobre as características clínicas no momento do diagnóstico de OI, com ênfase nas características clínicas, especialmente em relação às fraturas ósseas; 2) avaliação clínica e análise da mutação c.-14C>T no gene IFITM5 foi estuda em uma população com características sugestivas de OI tipo V; e 3) estudo retrospectivo em adultos com OI divididos em 2 grupos tratados com bifosfonados e não tratados. Em relação ao tratamento com bifosfonados foram avaliados os seguintes parâmetros: tipo de droga e duração do tratamento, valores de biomarcadores metabólicos e ósseos por um período de 5 anos, incidência de fraturas num de período de 5 ou 10 anos e densidade mineral óssea da coluna lombar, quadril total e colo femural no início e no final do tratamento. Nossos resultados mostraram que 1) no momento do diagnósico de OI características como escleras azuladas, dentinogênese imperfeita, ossos wormianos e fraturas de membros inferiores e superiores podem ser observadas. Pacientes com formas mais graves de OI foram diagnosticados mais precocemente quando comparados com pacientes com formas leves. Nenhuma criança com OI apresentou fraturas posteromediais das costelas, fratura de escápula ou lesões metafisárias. Essas informações associadas a história da saúde da criança são relevantes para a realização do diagnóstico diferencial. 2) OI tipo V correspondeu a 4% dos casos de OI atendidos no Centro de Referência para OI do HCPA. Indivíduos com OI V associada a mutação c.-14C> T no gene IFITM5 apresentaram características clínicas distintas como formação de calo hiperplásico, calcificação das membranas interósseas, deslocamento da cabeça radial e deformidade de coluna, porém a expressão da doença é variável. 3) Observamos que o tratamento de adultos com OI a longo prazo não foi associado com redução na incidência das fraturas e não se refletiu de forma significativa nos níveis de biomarcadores metabólicos e ósseos, porém houve uma melhora significativa na densidade mineral óssea da coluna lombar associada à terapia. Por ser uma doença rara com prevalência variável e ampla variabilidade fenotípica e genotípica, estudos clínicos e moleculares bem como estudos sobre o efeito do tratamento medicamentoso são imprescindíveis, contribuindo no melhor entendimento da doença, aconselhamento genético acurado e propiciando melhores estratégias de prevenção e tratamento para esta população. / Osteogenesis Imperfecta (OI) is a genetic connective tissue disease characterized by bone fragility and susceptibility to fracture under minimal or no trauma. The aim of this study was to evaluate clinical and molecular features of children and adults with OI and analyze the effect of the drug treatment with bisphosphonates in regarding to metabolic and bone biomarkers in adult patients. This thesis was divided by two chapters: 1) a retrospective study was performed where the clinical characteristic at the moment of diagnosis of OI, the clinical characteristics specially related to bone fractures was evaluated; 2) clinical evaluation and mutation analysis of c.-14C>T in the IFITM5gene was studied in a population with clinical charcteristics suggestive of OI type V; and 3) retrospective study in adults with OI divided in two groups treated with biphosphonates and not treated. Bisphosphonate treatment was evaluated according to the parameters: type of drug and duration of treatment, metabolic and bone biomarkers values for a period of 5 years, incidence of fractures in a period of 5 or 10 years and bone mineral density of the lumbar spine, total hip and femoral neck at baseline and at the end of treatment. Our results showed that 1) at the time of OI diagnosis features such as bluish slerae, dentinogenis imperfecta, wormian bones, and fractures of upper and lower limbs can be observed. Patients with more severe forms of OI were diagnosed earlier when compared with patients with mild forms. No OI children presented posteromedial fractures of the ribs, scapula fracture or metaphyseal lesions. This information associated with the child's health history are relevant for carrying out the differential diagnosis. This information is relevant for carrying out the differential diagnosis. 2) OI type V corresponds to 4% of OI cases at the Reference Center for OI at HCPA. Subjects with OI V associated to the mutation c.-14C> T in the IFITM5 gene presented distinctives clinical features as hyperplastic callus formation, calcification of interosseous membranes, dislocation of the radial head and spinal deformity, but the expression of the disease is variable. 3) We observed that long-term treatment with bisphosphonates (BP) for adults with OI was not associated with reduced incidence of fractures and was not reflected significantly in the levels of metabolic and bone biomarkers, but there was a significant improvement in bone mineral density of the lumbar spine associated to the therapy. Because it is a rare disease with a prevalence variable and wide phenotypic and genotypic variability, clinical and molecular studies and studies of the effect of drug treatment are essential, contributing to the better understanding of the disease, accurate genetic counseling and providing better strategies for prevention and treatment for this population.

A Osteogênese Imperfeita (OI) é uma doença genética do tecido conjuntivo caracterizada por fragilidade óssea e susceptibilidade à fratura sob mínimo ou nenhum trauma. O objetivo deste trabalho foi estudar características clínicas e moleculares de crianças e adultos com Osteogênese Imperfeita e analisar o efeito do tratamento medicamentoso com bifosfonados em relação aos biomarcadores metabólicos e ósseos em pacientes adultos. Esta tese se dividiu em dois capítulos onde 1) foi realizado um estudo retrospectivo sobre as características clínicas no momento do diagnóstico de OI, com ênfase nas características clínicas, especialmente em relação às fraturas ósseas; 2) avaliação clínica e análise da mutação c.-14C>T no gene IFITM5 foi estuda em uma população com características sugestivas de OI tipo V; e 3) estudo retrospectivo em adultos com OI divididos em 2 grupos tratados com bifosfonados e não tratados. Em relação ao tratamento com bifosfonados foram avaliados os seguintes parâmetros: tipo de droga e duração do tratamento, valores de biomarcadores metabólicos e ósseos por um período de 5 anos, incidência de fraturas num de período de 5 ou 10 anos e densidade mineral óssea da coluna lombar, quadril total e colo femural no início e no final do tratamento. Nossos resultados mostraram que 1) no momento do diagnósico de OI características como escleras azuladas, dentinogênese imperfeita, ossos wormianos e fraturas de membros inferiores e superiores podem ser observadas. Pacientes com formas mais graves de OI foram diagnosticados mais precocemente quando comparados com pacientes com formas leves. Nenhuma criança com OI apresentou fraturas posteromediais das costelas, fratura de escápula ou lesões metafisárias. Essas informações associadas a história da saúde da criança são relevantes para a realização do diagnóstico diferencial. 2) OI tipo V correspondeu a 4% dos casos de OI atendidos no Centro de Referência para OI do HCPA. Indivíduos com OI V associada a mutação c.-14C> T no gene IFITM5 apresentaram características clínicas distintas como formação de calo hiperplásico, calcificação das membranas interósseas, deslocamento da cabeça radial e deformidade de coluna, porém a expressão da doença é variável. 3) Observamos que o tratamento de adultos com OI a longo prazo não foi associado com redução na incidência das fraturas e não se refletiu de forma significativa nos níveis de biomarcadores metabólicos e ósseos, porém houve uma melhora significativa na densidade mineral óssea da coluna lombar associada à terapia. Por ser uma doença rara com prevalência variável e ampla variabilidade fenotípica e genotípica, estudos clínicos e moleculares bem como estudos sobre o efeito do tratamento medicamentoso são imprescindíveis, contribuindo no melhor entendimento da doença, aconselhamento genético acurado e propiciando melhores estratégias de prevenção e tratamento para esta população. / Osteogenesis Imperfecta (OI) is a genetic connective tissue disease characterized by bone fragility and susceptibility to fracture under minimal or no trauma. The aim of this study was to evaluate clinical and molecular features of children and adults with OI and analyze the effect of the drug treatment with bisphosphonates in regarding to metabolic and bone biomarkers in adult patients. This thesis was divided by two chapters: 1) a retrospective study was performed where the clinical characteristic at the moment of diagnosis of OI, the clinical characteristics specially related to bone fractures was evaluated; 2) clinical evaluation and mutation analysis of c.-14C>T in the IFITM5gene was studied in a population with clinical charcteristics suggestive of OI type V; and 3) retrospective study in adults with OI divided in two groups treated with biphosphonates and not treated. Bisphosphonate treatment was evaluated according to the parameters: type of drug and duration of treatment, metabolic and bone biomarkers values for a period of 5 years, incidence of fractures in a period of 5 or 10 years and bone mineral density of the lumbar spine, total hip and femoral neck at baseline and at the end of treatment. Our results showed that 1) at the time of OI diagnosis features such as bluish slerae, dentinogenis imperfecta, wormian bones, and fractures of upper and lower limbs can be observed. Patients with more severe forms of OI were diagnosed earlier when compared with patients with mild forms. No OI children presented posteromedial fractures of the ribs, scapula fracture or metaphyseal lesions. This information associated with the child's health history are relevant for carrying out the differential diagnosis. This information is relevant for carrying out the differential diagnosis. 2) OI type V corresponds to 4% of OI cases at the Reference Center for OI at HCPA. Subjects with OI V associated to the mutation c.-14C> T in the IFITM5 gene presented distinctives clinical features as hyperplastic callus formation, calcification of interosseous membranes, dislocation of the radial head and spinal deformity, but the expression of the disease is variable. 3) We observed that long-term treatment with bisphosphonates (BP) for adults with OI was not associated with reduced incidence of fractures and was not reflected significantly in the levels of metabolic and bone biomarkers, but there was a significant improvement in bone mineral density of the lumbar spine associated to the therapy. Because it is a rare disease with a prevalence variable and wide phenotypic and genotypic variability, clinical and molecular studies and studies of the effect of drug treatment are essential, contributing to the better understanding of the disease, accurate genetic counseling and providing better strategies for prevention and treatment for this population.

A Osteogênese Imperfeita (OI) é uma doença genética do tecido conjuntivo caracterizada por fragilidade óssea e susceptibilidade à fratura sob mínimo ou nenhum trauma. O objetivo deste trabalho foi estudar características clínicas e moleculares de crianças e adultos com Osteogênese Imperfeita e analisar o efeito do tratamento medicamentoso com bifosfonados em relação aos biomarcadores metabólicos e ósseos em pacientes adultos. Esta tese se dividiu em dois capítulos onde 1) foi realizado um estudo retrospectivo sobre as características clínicas no momento do diagnóstico de OI, com ênfase nas características clínicas, especialmente em relação às fraturas ósseas; 2) avaliação clínica e análise da mutação c.-14C>T no gene IFITM5 foi estuda em uma população com características sugestivas de OI tipo V; e 3) estudo retrospectivo em adultos com OI divididos em 2 grupos tratados com bifosfonados e não tratados. Em relação ao tratamento com bifosfonados foram avaliados os seguintes parâmetros: tipo de droga e duração do tratamento, valores de biomarcadores metabólicos e ósseos por um período de 5 anos, incidência de fraturas num de período de 5 ou 10 anos e densidade mineral óssea da coluna lombar, quadril total e colo femural no início e no final do tratamento. Nossos resultados mostraram que 1) no momento do diagnósico de OI características como escleras azuladas, dentinogênese imperfeita, ossos wormianos e fraturas de membros inferiores e superiores podem ser observadas. Pacientes com formas mais graves de OI foram diagnosticados mais precocemente quando comparados com pacientes com formas leves. Nenhuma criança com OI apresentou fraturas posteromediais das costelas, fratura de escápula ou lesões metafisárias. Essas informações associadas a história da saúde da criança são relevantes para a realização do diagnóstico diferencial. 2) OI tipo V correspondeu a 4% dos casos de OI atendidos no Centro de Referência para OI do HCPA. Indivíduos com OI V associada a mutação c.-14C> T no gene IFITM5 apresentaram características clínicas distintas como formação de calo hiperplásico, calcificação das membranas interósseas, deslocamento da cabeça radial e deformidade de coluna, porém a expressão da doença é variável. 3) Observamos que o tratamento de adultos com OI a longo prazo não foi associado com redução na incidência das fraturas e não se refletiu de forma significativa nos níveis de biomarcadores metabólicos e ósseos, porém houve uma melhora significativa na densidade mineral óssea da coluna lombar associada à terapia. Por ser uma doença rara com prevalência variável e ampla variabilidade fenotípica e genotípica, estudos clínicos e moleculares bem como estudos sobre o efeito do tratamento medicamentoso são imprescindíveis, contribuindo no melhor entendimento da doença, aconselhamento genético acurado e propiciando melhores estratégias de prevenção e tratamento para esta população. / Osteogenesis Imperfecta (OI) is a genetic connective tissue disease characterized by bone fragility and susceptibility to fracture under minimal or no trauma. The aim of this study was to evaluate clinical and molecular features of children and adults with OI and analyze the effect of the drug treatment with bisphosphonates in regarding to metabolic and bone biomarkers in adult patients. This thesis was divided by two chapters: 1) a retrospective study was performed where the clinical characteristic at the moment of diagnosis of OI, the clinical characteristics specially related to bone fractures was evaluated; 2) clinical evaluation and mutation analysis of c.-14C>T in the IFITM5gene was studied in a population with clinical charcteristics suggestive of OI type V; and 3) retrospective study in adults with OI divided in two groups treated with biphosphonates and not treated. Bisphosphonate treatment was evaluated according to the parameters: type of drug and duration of treatment, metabolic and bone biomarkers values for a period of 5 years, incidence of fractures in a period of 5 or 10 years and bone mineral density of the lumbar spine, total hip and femoral neck at baseline and at the end of treatment. Our results showed that 1) at the time of OI diagnosis features such as bluish slerae, dentinogenis imperfecta, wormian bones, and fractures of upper and lower limbs can be observed. Patients with more severe forms of OI were diagnosed earlier when compared with patients with mild forms. No OI children presented posteromedial fractures of the ribs, scapula fracture or metaphyseal lesions. This information associated with the child's health history are relevant for carrying out the differential diagnosis. This information is relevant for carrying out the differential diagnosis. 2) OI type V corresponds to 4% of OI cases at the Reference Center for OI at HCPA. Subjects with OI V associated to the mutation c.-14C> T in the IFITM5 gene presented distinctives clinical features as hyperplastic callus formation, calcification of interosseous membranes, dislocation of the radial head and spinal deformity, but the expression of the disease is variable. 3) We observed that long-term treatment with bisphosphonates (BP) for adults with OI was not associated with reduced incidence of fractures and was not reflected significantly in the levels of metabolic and bone biomarkers, but there was a significant improvement in bone mineral density of the lumbar spine associated to the therapy. Because it is a rare disease with a prevalence variable and wide phenotypic and genotypic variability, clinical and molecular studies and studies of the effect of drug treatment are essential, contributing to the better understanding of the disease, accurate genetic counseling and providing better strategies for prevention and treatment for this population.

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Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

A esclerodermia sistêmica (ES) é caracterizada por fibrose da pele e órgãos internos, ativação imunológica e vasculopatia. Os modelos animais de ES sofrem com a falta de uma prova definitiva para o envolvimento vascular observado na doença humana. Um novo modelo induzido por colágeno do tipo V (COLV) reproduz muitas características da ES como fibrose e fenômenos imunológicos. No entanto, o estudo da vasculopatia ainda não foi abordado. O objetivo desse estudo foi investigar as alterações estruturais e funcionais das células endoteliais das artérias pulmonares do modelo de ES induzido pelo COLV, assim como determinar a doença pulmonar com ênfase especial no depósito de colágeno e síntese de RNAm de colágenos. Coelhos fêmeas Nova Zelândia (n = 8) foram imunizados com COLV humano emulsificado em adjuvante de Freund ou apenas com adjuvante de Freund (controle; n = 8). Após 7, 75 e 210 dias, os animais foram sacrificados e os pulmões foram analisados por microscopia eletrônica, hematoxilina e eosina, e marcações especiais incluindo imunomarcação para neovascularização (CD31), apoptose de células endoteliais (induzida pela caspase-3) e atividade endotelial (endotelina-1 e VEGF). A resposta vascular a acetilcolina (Ach) foi estudada em anéis de artéria pulmonar isolada. Para determinar o conteúdo de colágeno, expressão RNAm dos colágenos I, III e V e quantidade de colágeno (hidroxiprolina aminoácido específico), os pulmões foram submetidos a imunofluorescência, PCR em tempo real e análise bioquímica. Foi observado que os coelhos imunizados com COLV apresentaram um aumento progressivo de apoptose e atividade das células endoteliais a partir de 7 dias quando comparados aos coelhos controle (p 0,01). Em contrapartida, apenas aos 210 dias os coelhos imunizados com COLV apresentaram aumento significativo na neovascularização quando comparados com o grupo controle (p < 0,001). Coincidente com esses achados, a microscopia eletrônica mostrou alterações das células endoteliais caracterizada por apoptose, alterações degenerativas das organelas e tumefação citoplasmática. As células endoteliais pareciam estar destacadas da membrana basal. Os coelhos imunizados com COLV de 210 dias necessitaram de uma dose maior de Ach do que os controles para alcançar o relaxamento máximo de 50% (EC50) dos anéis de artéria pulmonar (p = 0,02). Por fim, foi observado que os coelhos de 210 dias imunizados com COLV apresentaram uma intensa expressão de COLV no interstício broncovascular, acompanhado de um aumento na expressão do RNAm (p < 0,001) quando comparado ao grupo controle. Os coelhos imunizados com COLV apresentaram uma maior quantidade de conteúdo de colágeno, quando comparados com os controles, nos diferentes tempos estudados (p < 0,01). Este estudo fornece evidência para a disfunção pulmonar do endotélio vascular em coelhos com ES induzida pelo COLV. As alterações observadas, nesse estudo, reforçam o papel do endotélio como evento patogênico primário na ES. Desta forma, o modelo ES induzido pelo COLV pode fornecer informações importantes sobre a patogênese da doença humana / The hallmarks of systemic sclerosis (SSc) are fibrosis of skin and internal organs, immune activity and vasculopathy. Animal models of SSc suffer from lack of a definitive evidence for vascular involvement observed in human disease. A novel model induced by collagen type V (COLV) reproduces many features of SSc, however vascular study has not been addressed. The aim of the present study was therefore evaluate pulmonary arteries for structural and functional alterations in endothelial cells in the COLV-induced SSc model, as well as determine the lung disease with special emphasis on collagen deposition and mRNA collagen synthesis. Female New Zealand rabbits (n = 8) were immunized with human COLV/Freund´s adjuvant or Freund´s adjuvant alone (control; n = 8). After 7, 75 and 210 days, the animals were sacrificed and the lungs were examined by electron microscopy, hematoxylin&eosin and special stains including immunostaining for neovascularization (CD31), endothelial cells apoptosis (caspase-3 induced) and endothelial activity (endothelin-1 and VEGF). Vascular response to acetylcholine (Ach) on isolated pulmonary artery rings was evaluated. To determine collagen content, mRNA expressions of COL I, III and V, and the quantity of collagen-specific amino acid hydroxyproline, the lungs were submitted to immunofluorescence, real-time qPCR and biochemical examination. The COLV rabbits demonstrated an endothelial cells apoptosis and activity compared to control rabbits starting at day-7 (p 0.01). A significant increase in neovascularization was observed only in the COLV-rabbits at day-210 (p < 0,001). Coincident with these findings, the electron microscopy revealed extensive endothelial cells abnormalities characterized by apoptosis, degenerative organelle changes and cytoplasmic tumefaction. Endothelial cells appeared to be detached from the basement membrane. Ach dose required to achieve 50% maximum relaxation (EC50) of pulmonary artery rings was increased in COLV rabbits at day-210 (p = 0.02). The content of hydroxyproline was increased in COLV rabbits compared with that observed in control rabbits, at the different days studied (p < 0,01). Ultimately, the COLV rabbits at 210-day showed an intense expression of COLV in the bronchovascular interstitium, followed by a markedly up-regulation of COLV mRNA (p < 0.001) as compared to controls. This study provides evidence for pulmonary vascular endothelial cell dysfunction in rabbits with COLV-induced SSc. The findings of this study reinforce the role of endothelial cells as a primary pathogenic event in SSc. The COLV model may provide insight into the pathogenesis of human disease

A esclerodermia sistêmica (ES) é caracterizada por fibrose da pele e órgãos internos, ativação imunológica e vasculopatia. Os modelos animais de ES sofrem com a falta de uma prova definitiva para o envolvimento vascular observado na doença humana. Um novo modelo induzido por colágeno do tipo V (COLV) reproduz muitas características da ES como fibrose e fenômenos imunológicos. No entanto, o estudo da vasculopatia ainda não foi abordado. O objetivo desse estudo foi investigar as alterações estruturais e funcionais das células endoteliais das artérias pulmonares do modelo de ES induzido pelo COLV, assim como determinar a doença pulmonar com ênfase especial no depósito de colágeno e síntese de RNAm de colágenos. Coelhos fêmeas Nova Zelândia (n = 8) foram imunizados com COLV humano emulsificado em adjuvante de Freund ou apenas com adjuvante de Freund (controle; n = 8). Após 7, 75 e 210 dias, os animais foram sacrificados e os pulmões foram analisados por microscopia eletrônica, hematoxilina e eosina, e marcações especiais incluindo imunomarcação para neovascularização (CD31), apoptose de células endoteliais (induzida pela caspase-3) e atividade endotelial (endotelina-1 e VEGF). A resposta vascular a acetilcolina (Ach) foi estudada em anéis de artéria pulmonar isolada. Para determinar o conteúdo de colágeno, expressão RNAm dos colágenos I, III e V e quantidade de colágeno (hidroxiprolina aminoácido específico), os pulmões foram submetidos a imunofluorescência, PCR em tempo real e análise bioquímica. Foi observado que os coelhos imunizados com COLV apresentaram um aumento progressivo de apoptose e atividade das células endoteliais a partir de 7 dias quando comparados aos coelhos controle (p 0,01). Em contrapartida, apenas aos 210 dias os coelhos imunizados com COLV apresentaram aumento significativo na neovascularização quando comparados com o grupo controle (p < 0,001). Coincidente com esses achados, a microscopia eletrônica mostrou alterações das células endoteliais caracterizada por apoptose, alterações degenerativas das organelas e tumefação citoplasmática. As células endoteliais pareciam estar destacadas da membrana basal. Os coelhos imunizados com COLV de 210 dias necessitaram de uma dose maior de Ach do que os controles para alcançar o relaxamento máximo de 50% (EC50) dos anéis de artéria pulmonar (p = 0,02). Por fim, foi observado que os coelhos de 210 dias imunizados com COLV apresentaram uma intensa expressão de COLV no interstício broncovascular, acompanhado de um aumento na expressão do RNAm (p < 0,001) quando comparado ao grupo controle. Os coelhos imunizados com COLV apresentaram uma maior quantidade de conteúdo de colágeno, quando comparados com os controles, nos diferentes tempos estudados (p < 0,01). Este estudo fornece evidência para a disfunção pulmonar do endotélio vascular em coelhos com ES induzida pelo COLV. As alterações observadas, nesse estudo, reforçam o papel do endotélio como evento patogênico primário na ES. Desta forma, o modelo ES induzido pelo COLV pode fornecer informações importantes sobre a patogênese da doença humana / The hallmarks of systemic sclerosis (SSc) are fibrosis of skin and internal organs, immune activity and vasculopathy. Animal models of SSc suffer from lack of a definitive evidence for vascular involvement observed in human disease. A novel model induced by collagen type V (COLV) reproduces many features of SSc, however vascular study has not been addressed. The aim of the present study was therefore evaluate pulmonary arteries for structural and functional alterations in endothelial cells in the COLV-induced SSc model, as well as determine the lung disease with special emphasis on collagen deposition and mRNA collagen synthesis. Female New Zealand rabbits (n = 8) were immunized with human COLV/Freund´s adjuvant or Freund´s adjuvant alone (control; n = 8). After 7, 75 and 210 days, the animals were sacrificed and the lungs were examined by electron microscopy, hematoxylin&eosin and special stains including immunostaining for neovascularization (CD31), endothelial cells apoptosis (caspase-3 induced) and endothelial activity (endothelin-1 and VEGF). Vascular response to acetylcholine (Ach) on isolated pulmonary artery rings was evaluated. To determine collagen content, mRNA expressions of COL I, III and V, and the quantity of collagen-specific amino acid hydroxyproline, the lungs were submitted to immunofluorescence, real-time qPCR and biochemical examination. The COLV rabbits demonstrated an endothelial cells apoptosis and activity compared to control rabbits starting at day-7 (p 0.01). A significant increase in neovascularization was observed only in the COLV-rabbits at day-210 (p < 0,001). Coincident with these findings, the electron microscopy revealed extensive endothelial cells abnormalities characterized by apoptosis, degenerative organelle changes and cytoplasmic tumefaction. Endothelial cells appeared to be detached from the basement membrane. Ach dose required to achieve 50% maximum relaxation (EC50) of pulmonary artery rings was increased in COLV rabbits at day-210 (p = 0.02). The content of hydroxyproline was increased in COLV rabbits compared with that observed in control rabbits, at the different days studied (p < 0,01). Ultimately, the COLV rabbits at 210-day showed an intense expression of COLV in the bronchovascular interstitium, followed by a markedly up-regulation of COLV mRNA (p < 0.001) as compared to controls. This study provides evidence for pulmonary vascular endothelial cell dysfunction in rabbits with COLV-induced SSc. The findings of this study reinforce the role of endothelial cells as a primary pathogenic event in SSc. The COLV model may provide insight into the pathogenesis of human disease

Thesis (Ph. D.)--University of Missouri--Columbia, 2002. / Typescript. Vita. Includes bibliographical references (leaves 143-155). Also available on the Internet.