<p>  </p> <p>PhoQP is a two-component system that regulates the transcription of ~5% of the genes of <em>Salmonella enterica</em>. The membrane-bound PhoQ protein is phosphorylated in response to low extracellular Mg²⁺ concentration, acid pH, and a number of antimicrobial peptides. The inorganic phosphate bound to PhoQ is transferred to PhoP, which according to the classical model, acts as a typical transcriptional activator of its target genes. However, Will et al. (doi.org/10.1038/ncomms6270) proposed an alternate “counter-silencing” model, according to which genes in the PhoP regulon that were acquired by <em>Salmonella</em> via horizontal transfer are repressed by the generalized DNA-binding protein H-NS at high [Mg²⁺] and are induced at low [Mg²⁺] because the phosphorylated PhoP displaces the H-NS from the promoters and lifts repression. We evaluated this model by examining the transcriptional regulation of the <em>mgtCBRU-cigR </em>operon, which encodes the virulence protein MgtC and the Mg²⁺ transport protein MgtB and is in the SPI-3 pathogenesis island that has been acquired by <em>Salmonella</em> via horizontal transfer. Our main finding was that in the non-pathogenic strain of <em>S</em>. Typhimurium (LT2), induction of the <em>mgtCBRU-cigR</em> operon by Mg²⁺ limitation requires a functional PhoP protein, regardless of the presence or absence of H-NS. Interestingly, the pathogenic strain of <em>S</em>. Typhimurium (ATCC 14028s) revealed PhoP-independent transcription in the absence of H-NS, but only under inducing conditions. Thus, our results do not support the counter-silencing model and are consistent with the canonical view that PhoP is needed as a transcriptional activator of genes in the PhoP regulon.</p>

<p>Mast cells (MCs) are increasingly recognized as powerful sentinel cells responsible for modulating the early immune responses to a wide range of infectious agents. This protective role is attributable in part to their preponderance at the host-environment interface and their innate capacity to rapidly release modulators of immune cell trafficking which promotes the early recruitment of pathogen-clearing immune cells from the blood. However, host-adapted pathogens had been a critical threat to human for a long time because they have evolved mechanisms directed at overcoming protective immunity. </p><p>In this work, we outline <italic>Salmonella enterica</italic> serovar Typhimurium has evolved a novel mechanism to inactivate peripheral MCs resulting in limited neutrophil responses at infection sites in early stage of infection. Because of the delay in bacterial clearance at the point of entry, <italic>Salmonella</italic> are able to multiply and rapidly disseminate to distal sites. Suppression of local MCs' degranulation restricted outflow of vascular contents into infection sites, thus facilitating bacterial spread. </p><p>We discover MC suppression is mediated by the Salmonella Protein Tyrosine Phosphatase (SptP), which shares structural homology with <italic>Yersinia</italic> YopH. Interestingly, SptP, not only shares homology with phosphatases found in MCs, they are also homologous to YopH an effector protein expressed by plague causing <italic>Yersinia pestis</italic>. We show that YopH had MC suppressing abilities as SptP suggesting that this activity is shared among some of the more virulent bacterial pathogens. The functionally relevant domain in SptP is its enzymatic site and that it works by dephosphorylating the vesicle fusion protein N-ethylmalemide-sensitive factor (NSF) and by blocking phosphorylation of Syk, which is located in downstream and upstream of tyrosine phosphorylation signaling pathway in MCs. </p><p>Without SptP, orally challenged <italic>S.</italic> Typhimurium failed to suppress MC degranulation and exhibited limited colonization of the mesenteric lymph nodes. Administration of SptP to sites of Escherichia coli infection markedly enhanced its virulence. Thus, SptP-mediated inactivation of local MCs is a powerful mechanism utilized by <italic>S.</italic> Typhimurium to impede early innate immunity. This finding provides a logical explanation for why previous attempts by others to demonstrate a protective role for MCs against <italic>Salmonella</italic> infections have resulted in equivocal results. </p><p>Taken together, this work highlights an overlooked virulence mechanism possessed by certain host adapted pathogens to avoid the host's innate immune system. Additionally, this innate immune-quelling property of SptP may hold future promise in tempering harmful inflammatory disorders in the body of an immune competent host.</p> / Dissertation

Horizontal gene transfer (HGT) is now indisputably the predominant driving force, if not the sole force, behind speciation and the evolution of novelty in bacteria. Of all mechanisms of horizontal gene transfer (HGT), conjugation, the contact-dependent plasmid-mediated transfer of DNA from a bacterial donor to a recipient cell, is probably the most universal. First observed between bacteria, conjugation also mediates gene transfer from bacteria to yeast, plant and even animal cells. The range of environments in which bacteria naturally exchange DNA has not been extensively explored. The interior of the animal cell represents a novel and potentially medically relevant environment for gene transfer. Since most antibiotics are ineffective inside mammalian cells, our cells may be a niche for the evolution of resistance and virulence in invasive pathogens. Invading bacteria accumulate in vacuoles inside human cells, protected from antibiotics. Herein, I demonstrate the ability of intracellular Salmonella typhimurium to meet and exchange plasmid DNA by conjugation within animal cells, revealing the animal intracellular milieu as a permissive environment for gene exchange. This finding evokes a model for the simultaneous dissemination of virulence and antibiotic resistance within a niche protected from both antibiotics and the immune system and extends the variety of environments in which bacteria are known to exchange genes. Unlike conjugation between bacteria, conjugation between bacteria and eukaryotic cells requires the import of transferred DNA into the nucleus before the transferred genes can be expressed and inherited. Plant-cell nuclear transformation by the conjugation system of the Agrobacterium tumefaciens Ti plasmid is believed to be mediated by nuclear localization sequences (NLSs) carried within the proteins that accompany the T-DNA during transfer. Whether NLSs are equally important for transmission of other conjugative plasmids to eukaryotic cells is unknown. Herein, I demonstrate nuclear localization potential within the putative conjugative escort protein TraI of the IncPa plasmid RP4. In contrast, MobA, the putative escort protein from the IncQ plasmid RSF1010, lacked any clear nuclear localization potential. It is therefore likely that specific nuclear localization signals within conjugative proteins are not essential for nuclear transformation per se, although they may assist in efficient plasmid transmission.

Thesis (Master, Microbiology & Immunology) -- Queen's University, 2013-09-29 21:18:18.966

Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

Memoria para optar al Título Profesional de Médico Veterinario / Los serotipos de Salmonella tradicionalmente se han clasificado mediante métodos serológicos que determinan antígenos somáticos y flagelares específicos. Sin embargo, este método diagnóstico es caro y tarda mucho tiempo en dar un resultado ya que requiere implementar una batería de anticuerpos para detectar los más de 2.500 serotipos de Salmonella enterica que se han identificado. Por otra parte, la identificación molecular de los genes responsables de la expresión de antígenos flagelares son más rápidos y más sensibles que la identificación serológica. Es por esto que, en la presente memoria se implementaron pruebas de PCR para identificar S. enterica serotipos Typhimurium y Hadar, ambas incluidas en un plan nacional de control de Salmonella en establecimientos comerciales de aves. Se analizaron 135 cepas, 50 correspondientes a S. Typhimurium, 50 a S. Hadar y 35 enterobacterias como controles negativos. Estas cepas, previamente serotipificadas en el Instituto de Salud Pública (ISP), fueron sometidas a la prueba de PCR para determinar si existen diferencias de diagnóstico entre ambas técnicas. Del total de cepas analizadas, sólo 46 cepas de S. Typhimurium dieron positivas a la prueba de PCR y cuatro dieron negativas, mientras que las 50 cepas de S. Hadar dieron positivas a las dos pruebas de PCR. Las 35 enterobacterias dieron negativas a las 3 pruebas de PCR. De acuerdo a los resultados obtenidos en el estudio, la detección de antígenos mediante serotipificación y PCR para las cepas de S. Typhimurium fue menor al esperado (92%), a diferencia de lo que ocurrió con las cepas de S. Hadar en que hubo 100% de acuerdo entre ambas técnicas, sugiriendo que esta prueba de detección de Salmonella es posible reemplazarla por los métodos tradicionales de identificación y así poder acelerar el diagnóstico de esta bacteria de gran importancia para la salud pública

Manifiesta que el cuy es una especie de producción que se ve afectada principalmente por Salmonella Typhimurium, la cual expresa factores de virulencia codificados por diferentes genes, que, en conjunto, cumplen funciones coordinadas para llevar a cabo la patogenia y desarrollar la enfermedad. Por ello, el presente estudio evaluó la presencia de 10 genes codificantes de diversos factores de virulencia de importancia biológica de un total de 100 aislados de Salmonella Typhimurium, compuestos por 90 cepas procedentes de cuyes enfermos y 10 cepas procedentes de cuyes aparentemente sanos, confirmados en estudios previos. El ADN de los aislados fue extraído y analizado mediante la técnica de PCR múltiple, para evaluar la presencia de los genes spvB, spiA, cdtB, sipB, tolC, sitC, lpfC, sifA, sopB y pefA, obteniéndose un patrón genético similar, con frecuencias de detección variables mayores al 60%, tanto en aislados de cuyes sanos como enfermos, excepto el gen cdtB, el cual no fue detectado; concluyéndose que no existe diferencia entre los factores de virulencia presentes en cepas de Salmonella Typhimurium aisladas de cuyes enfermos y cuyes aparentemente sanos; sin embargo, debe tenerse en cuenta el potencial peligro que representan los animales portadores dentro de la producción. / Universidad Nacional Mayor de San Marcos (Lima). Vicerrectorado de Investigación y Posgrado Perú. Ministerio de la Producción. Programa Nacional de Innovación para la Competitividad y Productividad (Innóvate Perú) / Tesis

Evalúa la inclusión de probióticos en la dieta sobre el desarrollo de vellosidades intestinales y criptas de Lieberkühn en cuyes de engorde desafiados a Salmonella Typhimurium. Se utilizaron 30 cuyes machos genéticamente mejorados, distribuidos en un sistema completamente al azar de tres tratamientos con 10 repeticiones cada uno. Los tratamientos fueron: Tratamiento T1: Cuyes alimentados con la dieta base y desafiados con Salmonella Typhimurium (control negativo). Tratamiento T2: Cuyes alimentados con la dieta base + antibiótico promotor de crecimiento desafiados con Salmonella Typhimurium (control positivo). Tratamiento 3: Cuyes alimentados con la dieta base suplementados con probiótico y desafiados con Salmonella Typhimurium. Todos los tratamientos fueron desafiados al duodécimo día de iniciada la investigación con dosis infectiva de 2 x 10 6 UFC/ml de 48 horas de incubación de Salmonella Typhimurium, administrados vía oral. Se tomaron muestras de las tres secciones del intestino de cada animal a los 63 días de edad y fueron remitidas para la elaboración de láminas histológicas para mediciones histomorfométricas. El grupo tratado con probiótico y APC mostró un efecto positivo (p<0.05) en la longitud y ancho de las vellosidades intestinales en la sección del íleon a los 63 días de edad con respecto al control. Con estos resultados se concluye que la dieta suplementada con probióticos tiene un efecto positivo sobre la morfometría intestinal en cuyes de engorde desafiados a Salmonella typhimurium llegando a ser estadísticamente significativa en la longitud y ancho de las vellosidades intestinales de íleon. / Tesis

Evalúa el efecto de la suplementación vía oral de una mezcla probiótica sobre los parámetros sanguíneos e índices productivos de cuyes (Cavia porcellus) de engorde desafiados con Salmonella Typhimurium. Los cuyes fueron distribuidos en tres tratamientos con diez (10) repeticiones cada uno. Los tratamientos fueron: Tratamiento T1: Cuyes alimentados con dieta base y desafiados con Salmonella Thyphimurium. Tratamiento T2: Cuyes alimentados con dieta base suplementados con probiótico y desafiados con Salmonella Thyphimurium. Tratamiento 3: Cuyes alimentados con la dieta base + antibiótico promotor de crecimiento desafiados con Salmonella Thyphimurium. Todos los tratamientos fueron desafiados al 12avo día de iniciada la investigación con una dosis infectiva de 2x106 UFC/ml de Salmonella Thyphimurium, administrados vía oral por única vez. Se registraron los datos de parámetros productivos: ganancia de peso, consumo de alimento e índice de conversión alimenticia. El periodo de engorde duró 49 días al término de los cuales se colectaron las muestras de sangre durante el sacrificio. Las muestras fueron remitidas para su posterior análisis. De los datos obtenidos se hizo un análisis de diferencia de medias por medio de la prueba no paramétrica Kruskal Wallis, y se realizó un análisis de pares a partir del método de Tukey para determinar diferencias entre grupos. En la evaluación de los resultados de parámetros productivos y hematológicos no se halló diferencia estadística significativa. / Tesis