Este trabalho apresenta o desenvolvimento de biossensores de pH, ureia e glicose, utilizando óxidos como plataforma para a parte seletiva. Os filmes finos de óxidos condutores foram produzidos por diferentes técnicas de deposição, como spin-coat, dip-coat, spray-pyrolysis e casting. Os materiais fabricados foram AZO e TiO2, ambos depositados sobre substratos de FTO, ITO ou vidro hidroflilizado. O número de camadas foi variado para cada técnica e as caracterizações morfológicas e estruturais foram feitas por MEV, DRX e FTIR. As caracterizações elétricas foram feitas por EGFET e voltametria cíclica. Os filmes foram testados como sensores de pHs na faixa de 2 a 8. O filme depositado com AZO em substrato de FTO pela técnica de spray-pyrolysis apresentou melhor resposta, com sensibilidade de 31,7 mV/pH entre toda a faixa de pHs do 2 ao 8. Já para os filmes de TiO2, o filme produzido por dip-coat com 5 camadas em substrato de FTO apresentou sensibilidade de 37,8 mV/pH entre a faixa de pHs de 2 a 8. Paralelamente, os filmes tiveram suas superfícies funcionalizadas com proteínas como urease ou glicose oxidase. Neste caso, os dispositivos foram testados entre as concentrações de 5 a 200 mg/dL de ureia e glicose. Como biossensor de ureia, o filme de TiO2 depositado por spin-coat com 5 camadas em substrato de FTO apresentou a maior sensibilidade, com valor 3,32 mV/(mg/dL) entre as concentrações de 5 a 120 mg/dL. Para os filmes estudados como biossensores de glicose, o melhor resultado também foi obtido pelo filme de TiO2 depositado por spin-coat com 5 camadas em substrato de FTO, apresentando sensibilidade em torno de 6,18 mV/(mg/dL) entre as concentrações de 5 a 200 mg/dL. Alguns resultados encontrados foram iguais ou melhores aos encontrados na literatura vigente, mesmo que os dispositivos ainda são passíveis de otimização. / This study presents the development of pH, urea and glucose biosensors, by the use of oxides as the base of the sensing membrane. Conducting oxide thin films were prepared by different deposition techniques, such as spin-coat, dip-coat, spray-pyrolysis, and casting. AZO and TiO2 were produced and coated onto FTO, ITO and glass substrates. The number of layers were changed for each deposition technique, and the surface characterizations were made by SEM, XRD and FTIR, while the electrical characterizations were performed with an EGFET device and cyclic voltammetry. The samples were used as pH sensors in the pH range from 2 to 8. The AZO thin film onto FTO substrate deposited by spray-pyrolysis deposition technique presented sensitivity as 31.7 mV/pH for the total pH range from 2 to 8. TiO2 thin films, produced by dip-coat deposition technique with 5 layers onto FTO substrate presented 37.8 mV/pH as sensitivity, for the same pH range. All the films have their surfaces immobilized with proteins as urease or glucose oxidase. In this case, the samples were performed in different concentrations of urea or glucose, respectively, from 5 to 200 mg/dL, for both. Urea biosensors presented good results for measurements performed with the same sample as well as performed with individuals samples, for all the concentrations range. Spin-coated TiO2 thin films with 5 layers onto FTO substrates presented 3.32 mV/(mg/dL) as sensitivity from 5 to 120 mg/dL urea concentrations, while for glucose biosensors presented 6.18 mV/(mg/dL) for the same film between the glucose concentration range from 5 to 20 mg/dL. Some results were equal or better than the results in current literature, even the films are still capable of optimization.

doença metabólica hereditária bioquimicamente caracterizada pelo acúmulo de ornitina (Orn), homocitrulina (Hcit), amônia e ácido orótico (Oro) no sangue e outros tecidos dos pacientes afetados. Os sintomas neurológicos desse distúrbio são comuns, incluindo retardo mental, convulsões e ataxia, porém os mecanismos que levam ao dano cerebral são praticamente desconhecidos. O presente estudo teve o objetivo de avaliar o efeito dos metabólitos acumulados nesta doença sobre a homeostase energética e redox em cérebro de ratos, bem como sobre o desempenho de animais submetidos à hiperornitinemia em tarefas comportamentais. Inicialmente avaliamos o efeito in vitro da Orn, Hcit e Oro sobre parâmetros do metabolismo energético em cérebro de ratos jovens. Verificamos que a Orn e a Hcit inibem o ciclo dos ácidos tricarboxílicos, (inibição da produção de CO2 a partir de acetato e das enzimas aconitase e α-cetoglutarato desidrogenase), bem como a via glicolítica aeróbica (redução na síntese de CO2 a partir de glicose), além de comprometer o fluxo de elétrons pela cadeia respiratória (inibição do complexo I-III). A Hcit, mas não a Orn, também foi capaz de inibir a atividade da enzima creatina quinase, sendo que essa inibição foi prevenida por GSH, sugerindo um possível papel de espécies reativas oxidando grupamentos tióis, essenciais para a atividade desta enzima. Em contraste, a atividade das outras enzimas do ciclo dos ácidos tricarboxílicos e da cadeia respiratória, bem como a Na+,K+- ATPase não foram alteradas in vitro pela Orn e pela Hcit nas doses testadas (0,1 a 5 mM). Do mesmo modo, o Oro não interferiu em nenhum dos parâmetros testados. O próximo passo deste estudo foi avaliar o efeito in vivo da administração intracerebroventricular (ICV) de Orn e Hcit sobre parâmetros de estresse oxidativo e metabolismo energético em córtex cerebral de ratos jovens. A Orn e a Hcit aumentaram os níveis de substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico (TBA-RS) e a formação de grupamentos carbonilas, indicativos de peroxidação lipídica e dano oxidativo a proteínas, respectivamente. Além do mais, a N-acetilcisteína e a combinação de ácido ascórbico mais α-tocoferol atenuaram a oxidação lipídica e preveniram totalmente o dano oxidativo protéico provocado pela Orn e pela Hcit, sugerindo que espécies reativas estejam envolvidas nestes efeitos. A administração ICV de Hcit, mas não de Orn, também diminuiu os níveis de glutationa reduzida (GSH), bem como a atividade das enzimas catalase e glutationa peroxidase, indicando que a Hcit provoca uma redução nas defesas antioxidantes cerebrais. Quanto aos parâmetros de metabolismo energético avaliados após a administração ICV de Orn e Hcit, verificamos que a Orn e a Hcit inibem o funcionamento do ciclo dos ácidos tricarboxílicos (inibição da síntese de CO2 a partir de acetato), a via glicolítica (redução na produção de CO2 a partir de glicose) e a atividade do complexo I-III da cadeia respiratória. A Hcit in vivo também inibiu a atividade da aconitase, uma enzima muito susceptível ao ataque de radicais livres. Investigamos também os efeitos da administração ICV de Orn e Hcit na presença ou ausência de hiperamonemia, induzida pela administração intraperitoneal de urease, sobre parâmetros de estresse oxidativo em córtex cerebral de ratos jovens. A Orn aumentou os níveis de TBA-RS e a formação de carbonilas, sem alterar o conteúdo de grupamentos sulfidrilas e os níveis de GSH. Além disso, a combinação de hiperamonemia com Orn resultou em uma diminuição no conteúdo de sulfidrilas e GSH, indicando um efeito sinérgico da Orn com a amônia. Além disso, a Hcit causou um aumento nos valores de TBA-RS e da formação de carbonilas, bem como uma diminuição na concentração de GSH sem alterar o conteúdo de sulfidrilas. Em relação ao tratamento com urease, a indução de hiperamonemia pela urease foi capaz de aumentar os níveis de TBA-RS, indicando que hiperamonemia causa dano oxidativo a lipídeos. Finalmente, produzimos um modelo animal quimicamente induzido de hiperornitinemia através da administração subcutânea de Orn (2-5 μmol/g de peso corporal). Altas concentrações cerebrais de Orn foram alcançadas nesse modelo, indicando que a Orn é permeável a barreira hemato-encefálica. Investigamos, então, o efeito da administração crônica de Orn do 5° ao 28° dia pós-natal sobre o desenvolvimento físico, motor e sobre o desempenho dos ratos adultos nas tarefas de campo aberto e no labirinto aquático de Morris. A administração crônica de Orn não afetou o aparecimento de pelos, a abertura dos olhos, a erupção dos incisivos e o reflexo de queda livre, sugerindo que o desenvolvimento físico e neuromotor não foram comprometidos pela administração crônica de Orn. Similarmente, o desempenho dos ratos no labirinto aquático de Morris na idade adulta não foi alterado pelo tratamento crônico dos mesmos com Orn, indicando que a memória espacial não foi afetada. Entretanto, os animais tratados com Orn não apresentaram habituação ao campo aberto, sugerindo um déficit de aprendizado/memória nesta tarefa. A atividade motora, avaliada pelo número de cruzamentos na tarefa do campo aberto, e pela velocidade de natação no labirinto aquático de Morris foram similares para os animais injetados com Orn e salina, indicando que os animais com hiperornitinemia não apresentaram déficit na atividade locomotora que pudesse atrapalhar seu desempenho nos testes de comportamento. De maneira similar, o número de bolos fecais, o número de grooming e o tempo gasto na área central na tarefa de campo aberto foram iguais em ambos os grupos, indicando que não houve alteração na ansiedade dos animais com o tratamento com Orn. A presente investigação demonstrou pela primeira vez que a Orn e especialmente a Hcit comprometem a homeostase energética e redox celular e que hiperornitinemia crônica durante o período pós-natal prejudica o desempenho de animais adultos na tarefa de campo aberto. É provável, portanto, que as concentrações cerebrais aumentadas de Orn tenham provocado um dano cerebral, possivelmente através do comprometimento do metabolismo energético e da indução de dano oxidativo, alterando vias do metabolismo necessárias para um aprendizado/memória normais. Concluindo, postulamos que alterações na bioenergética e no estado redox cerebral induzido pelos metabólitos acumulados na síndrome HHH, como demonstrado in vitro e in vivo na presente investigação, possam representar mecanismos patogênicos, contribuindo, ao menos em parte, para os sintomas neurológicos dos pacientes afetados por este transtorno. / Tissue accumulation of ornithine (Orn), homocitrulline (Hcit), ammonia and orotic acid (Oro) is the biochemical hallmark of patients affected by hyperornithinemia–hyperammonemia– homocitrullinuria (HHH) syndrome, a disorder clinically characterized by neurological symptoms, whose pathophysiology is practically unknown. The aim of this study was to evaluate the effect of the accumulating metabolite in the HHH syndrome on energetic and redox homeostasis in brain of rats, as well as the rat performance in behavioural tasks when submitted to hiperornithinemia. We first investigated the in vitro effect of Orn, Hcit and Oro on parameters of energy metabolism in brain of young rats. We verified that Orn and Hcit inhibited the citric acid cycle (inhibition of CO2 synthesis from acetate, as well as aconitase and α- ketoglutarate dehydrogenase activities), the aerobic glycolytic pathway (reduced CO2 production from glucose) and moderately the electron transfer flow (inhibitory effect on complex I–III). Hcit, but not Orn, was also able to inhibit the mitochondrial creatine kinase activity. Furthermore, this inhibition was prevented by glutathione, suggesting a possible role of reactive species oxidizing critical thiol groups of the enzyme. In contrast, the other enzyme activities of the citric acid cycle and of the electron transfer chain, as well as synaptic Na+,K+-ATPase were not altered by either Orn or Hcit at concentrations as high as 5.0 mM. Similarly, Oro did not interfere with any of the tested parameters. The next step of this study was to investigate the in vivo effects of intracerebroventricular (ICV) administration of Orn and Hcit on parameters of oxidative stress and energy metabolism in cerebral cortex from young rats. Orn and Hcit increased thiobarbituric acid-reactive substances values and carbonyl formation, indicators of lipid and protein oxidative damage, respectively. Furthermore, N-acetylcysteine and the combination of ascorbic acid plus α- tocopherol attenuated the lipid oxidation and totally prevented the protein oxidative damage provoked by Orn and Hcit, suggesting that reactive species were involved in these effects. The ICV Hcit administration, but not Orn administration, also decreased reduced glutathione (GSH) concentrations, as well as the activity of catalase and glutathione peroxidase, indicating that Hcit provokes a reduction of brain antioxidant defenses. As regards to the parameters of energy metabolism, we verified that Orn and Hcit inhibited the citric acid cycle function (inhibition of CO2 synthesis from acetate), the aerobic glycolytic pathway (reduced CO2 production from glucose) and complex I–III activity of the respiratory chain. Hcit also inhibited the activity of aconitase, an enzyme very susceptible to free radical attack. We also investigated the in vivo effects of ICV administration of Orn and Hcit in the presence or absence of hyperammonemia induced by intraperitoneal urease treatment on important parameters of oxidative stress in cerebral cortex from young. Orn increased thiobarbituric acid-reactive substances levels and carbonyl formation, without altering sulfhydryl content and GSH levels. We also observed that the combination of hyperammonemia with Orn resulted in a decrease of sulfhydryl levels and GSH concentrations, highlighting a synergistic effect of ornithine and ammonia. Furthermore, homocitrulline caused increases of thiobarbituric acid-reactive substances values and carbonyl formation, as well as a decrease of GSH concentrations without altering sulfhydryl content. We also observed that urease treatment per se was able to enhance thiobarbituric acid-reactive substances levels indicating that hiperamonemia induce lipid peroxidation. Finally, we produced a chemical animal model of hiperornithinemia induced by a subcutaneous injection of saline-buffered Orn (2-5 μmol/g body weight) to rats. High brain Orn concentrations were achieved, indicating that Orn is permeable to the blood brain barrier. We then investigated the effect of early chronic postnatal administration of Orn (from the 5th to the 28th day of life) on physical and motor development and on the performance of adult rats in the open field and in the Morris water maze tasks. Chronic postnatal Orn treatment had no effect on the appearance of coat, eye opening or upper incisor eruption, nor on the free-fall righting task, suggesting that physical and motor development were not changed by Orn. However, Orn-treated rats did not habituate to the open field apparatus, implying a deficit of learning/memory. Motor activity was the same for Orn- and saline- injected animals. Motor activity, evaluated by the number of crossings in the open field and by the swimming speed in the Morris water maze, was the same for Orn- and saline- injected animals, indicating no deficit of locomotor activity in rats injected with Orn. Similarly, the number of fecal boli and grooming and the time spent in the central area in the open field task were the same in both groups, implying no alteration of emotionality. The current investigation shows for the first time that Orn and especially Hcit compromise energetic and redox homeostasis and that chronic hyperornithinemia during postnatal period impairs the adult rat performance in the open field task, where the animals did not habituate to the apparatus. It is possible, however, that high sustained cerebral Orn level could provoke a brain damage, possibly through induction of oxidative stress and/or compromising energy metabolism, altering some metabolic pathways essential for normal learning/memory. In conclusion, we postulate that alterations in the cerebral bioenergetic and redox state induced by metabolites accumulated in HHH syndrome, as demonstrated in vitro and in vivo in the present study, may represent pathogenic mechanisms contributing, at least in part, to the neurological symptoms of patients affected by this disorder.

Orientador: Sandra Cristina dos Santos Rocha / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia Quimica / Made available in DSpace on 2018-07-23T10:59:38Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Ayub_GamelSaidEduardo_D.pdf: 13298136 bytes, checksum: d75e85245d726627df495c822beb4227 (MD5) Previous issue date: 1997 / Resumo: Neste trabalho objetivou-se o desenvolvimento de uma unidade experimental para revestimento de uréia com enxofre. Verificou-se quantitativamente a relação entre a qualidade do produto e as principais variáveis de operação tais como: temperatura do ar de jorro, vazão de enxofre e vazão do ar de atomização. Avaliou-se a cinética de crescimento da uréia e a eficiência do processo. Analisou-se a qualidade do produto, em termos de D25% e através de microscopia eletrônica. As partículas recobertas foram grânulos de uréia, com formato quase esférico. Como material de recobrimento foi utilizado o enxofre elementar, de uso agronômico e encontrado no mercado. O leito de jorro bidimensional foi projetado e construí do em acrílico, para que se pudesse visualizar o fenômeno. Os experimentos foram realizados com ângulo de base de 60°, nas seguintes condições de operação: temperatura de ar de jorro de 69,0°C e 82,5°C, vazão de enxofre de 26,8g/min. e 33,9g/min. e vazão de ar de atomização de 1,Om3fh e 1,4m3fh. Um atomizador de duplo fluido com mistura interna foi instalado na base do leito, e o enxofre liquefeito foi atomizado em concorrente com o ar de jorro. Para a realização dos experimentos utilizou-se o planejamento fatorial completo em dois níveis. Determinou-se que a vazão de enxofre é significante estatisticamente para o crescimento cinético, já para D25% a temperatura do ar de jorro e a vazão do ar de atomização, revelaram ser significantes estatisticamente. Os valores obtidos para a eficiência do processo foram satisfatórios, estando na faixa de 80,34% - 88,93%. A melhor qualidade do produto, em termos de D25%, foi obtido no nível mais elevado de temperatura de ar de jorro, vazão de enxofre e de ar de atomização. A microscopia revelou a presença de crateras nas partículas inertes, o que favoreceu a rápida difusão da uréia, pois estas aumentaram à medida que transcorria o recobrimento. Operando-se ao menor nível de temperatura não houve uma XVIII diferença significativa na qualidade do produto para os dois níveis de vazão de enxofre e de ar de atomização. Observou-se, ainda, que a superfície das partículas recobertas são irregulares e a irregularidade se mantém e até aumenta ao longo do processo. Ao maior nível de temperatura a superfície das partículas recobertas apresentaram ainda irregularidades, porém, menos acentuadas, além das fendas existentes começarem a ser obstruídas levando a uma menor difusividade da uréia e conseqüente melhora na qualidade do produto. Quanto aos cristais depositados nas partículas de uréia durante o recobrimento notou-se que para o menor nível de temperatura formaram-se cristais pequenos, grupamentos irregulares e defeitos na superfície. Já para o maior nível de temperatura os cristais formados são maiores, melhor agrupados e proporcionando um revestimento mais regular, oferecendo uma maior resistência à difusão da uréia / Abstract: The main objective of this work was the development of an experimental apparatus for coating of urea with sulphur. The experimental results allowed to quantify the relation between the quality of the product obtained and the process variables: spout air temperature, sulphur mass flowrate and mass flowrate of atomization air. The quality of the coated urea was evaluated by the dissolution rate of urea through the sulphur, D25%, and by electronic microscopy. The growth of the partic1e and process efficiency were also evaluated. The particles of urea utilized have a quasi-spherical shape. The two dimensional spouted bed was proper1y designed to provi de an adequate solids circulation, with a slanted base angle of 60°. It was built in plexyglass so the flow inside the bed could be observed. The following process conditions were specified for the experiments: inlet air temperature maintained at 69.0°C and 82.5°C, liquid sulphur mass flowrates of 26.8g1min and 33.9g1min and atomization air mass flowrates of 1.0m3 Ih and 1. 4m3 Ih. A double-fluid atomizer was installed in the bottom of the bed and the liquid sulphur was sprayed co-current1y with the air inlet. A factorial planning was the guide for the number of experiments needed. The results showed that the liquid sulphur mass flowrate significatively influences the growth ofthe urea partic1es and the variables that influences the coating quality, in terms of the dissolution rate are the inlet air temperature and the flowrate of atomizing air. The values obtained for the coating efficiency were satisfactory, in the range of 80.34% - 88.93%. The microscopic analysis showed that the inert particles of urea presented holes in their surface and these holes were not totally filled after the coating process. This defect on the surface provided the high urea dissolution rates obtained. It was observed that for the higher leveI of inlet air temperature used, the surface of the coated partic1e showed less defects, and the holes were partially or totally covered leading to a lower urea dissolution rate or better product quality. The sulphur crystals formed during the coating process were smaller, not regular for the lower air inlet temperature, while for the higher temperature of the inlet air the crystals are larger and better grouped together leading to a regular coated surface / Doutorado / Engenharia de Processos / Doutor em Engenharia Química

Sensores são dispositivos capazes de captar um determinado sinal físico -químico do meio e converte-lo num sinal elétrico mensurável por meio de um transdutor. Biossensor é um sensor que tem como parte funcional um receptor biológico específico a determinado analito alvo. Os sinais físico-químicos experimentados por estes dispositivos são convertidos em sinais elétricos de magnitude proporcional à concentração de um ou mais compostos químicos. Neste trabalho, foi construído um sensor de pH utilizando filmes finos comerciais de óxido de estanho dopado com flúor (FTO) como receptor a íons. O sensor foi feito ligando-se amostras de FTO ao terminal de porta de um transistor de efeito de campo do tipo MOS (Metal Oxide Semiconductor). Quando colocado em solução, os íons presentes interagem com a amostra sendo adsorvidos na superfície do filme de FTO. O potencial gerado pelos íons adsorvidos modulam a tensão na porta do transistor e, desta maneira, pode -se determinar a concentração dos íons presentes na solução de acordo com a magnitude da resposta do transistor. A este tipo de dispositivo dá -se o nome de EGFET (Extended Gate Field Effect Transistor). O EGFET construído apresentou responsividade de 55 mV/pH e resposta linear em soluções de pH 2 ao 12. Através de técnicas de imobilização enzimática foi possível ligar covalentemente proteínas urease sobre a superfície dos filmes de FTO, convertendo o sensor de pH em biossensor de ureia. Soluções tampão com diferentes pHs e concentrações foram testadas e determinou -se que as condições ideais para o uso deste biossensor de ureia são soluções tampão com pH = 6 e concentração de 10mM. Nessas condições, o biossensor apresentou uma responsividade de 114,5 mV/p(ureia) e linearidade no intervalo de concentrações de ureia entre 3,2.10 -4 e 3,2.10 -2 mol/L. / Sensors are devices capable of capturing a certain physical-chemical signal from environment and convert it into a measurable electrical signal by a transducer. Biosensor is a sensor which has a biological sensing element as receptor specific to a particular target analyte. The physical-chemical signals experienced by these devices are converted into electrical signals with magnitude proportional to the concentration of one or more chemical compounds. In this work, we built a pH-sensor using commercial thin films of tin oxide doped with fluorine (FTO) as ions receptor. The sensor was made by linking FTO samples to the gate of a field effect transistor MOS type. In solution, the ions interact with the sample being adsorbed on the surface of FTO film. The potential generated by the ions adsorbed on film\'s surface modulate the gate voltage of the transistor and, in this way, we can determine the concentration of ions present in solution correlated with the magnitude of the transistor response. This kind of device is given the name of EGFET (Extended Gate Field Effect Transistor). The EGFET built exhibits sensitivity of 55 mV/pH and linear response in the range of pH 2 to 12. Through enzyme immobilization techniques we could covalently bind urease proteins on the surface of FTO film, changing the pH-sensor in urea biosensor. Buffer solutions with differents pHs and concentrations were tested and was determined that optimal environment conditions for this urea biosensor is buffer solutions with pH = 6 and 10mM of concentration. Under these conditions, the biosensor showed sensitivity of 114.5 mV/p(urea) and linear response in the range of 3,2.10 -4 to 3,2.10 -2 mol/L

A hemoglobina de Glossoscolex paulistus (HbGp) é caracterizada por uma massa molecular de 3,6 MDa, alta estabilidade oligomérica, resistência a auto-oxidação, e alta afinidade em ligar oxigênio. A estrutura quaternária desta macromolécula apresenta 144 cadeias com grupo heme (globinas) e 36 cadeias sem grupo heme (linkers), dispostos em duas camadas hexagonais. No presente trabalho estudos de caracterização das subunidades da HbGp, bem como da estabilidade da HbGp em diferentes formas, em função do pH, e em diferentes concentrações de ureia, por diferentes técnicas biofísicas, foram realizados. Os estudos de caracterização por eletroforese SDS-PAGE, MALDI-TOF-MS e ultracentrifugação analítica (AUC) das subunidades isoladas mostraram que apenas o monômero d obtido da cromatografia de exclusão por tamanho (SEC) tem alto grau de pureza. Para as demais frações mais de uma contribuição foi observada em solução. Assim, para a fração trimérica, duas espécies estão presentes em solução, a espécie predominante (87 %) é atribuída ao trímero abc e a outra espécie (13 %) pode ser associada ao complexo (abc + L). Os dados espectroscópicos e de AUC mostraram que a estabilidade da HbGp depende fortemente do estado de oxidação do heme, do ligante coordenado no centro metálico e da concentração de proteína. Assim, a forma oxidada, a meta-HbGp, mostrou-se menos estável em meio alcalino e na presença de ureia, seguida pelas formas oxi- e cianometa-HbGp. Desta forma, no pH 8,0, a meta-HbGp está totalmente dissociada em trímero abc e monômero d, enquanto a oxi-HbGp está apenas parcialmente dissociada com uma contribuição de 88 % de proteína íntegra em solução e a cianometa-HbGp não sofre dissociação oligomérica. Os valores de coeficiente de sedimentação s20,w e massa molecular (MM) determinados para as espécies em solução são similares aos observados para as correspondentes espécies isoladas por SEC. Na presença de ureia a mesma tendência foi observada para as três formas da HbGp. Porém, para uma caracterização melhor de processo de desnaturação, os dados espectroscópicos foram analisados usando modelos de dois e três estados para obter informações sobre os parâmetros termodinâmicos do sistema. Assim, bons ajustes foram obtidos usando ambos os modelos, no entanto, o modelo de três estados foi mais adequado para descrever o processo. Por este modelo o processo de desnaturação da HbGp pode ser descrito por duas etapas. A primeira etapa, na faixa de 1,0 - 3,0 mol/L de ureia, está associada a transição do estado nativo para o estado intermediário (N → I), e é caracterizada pela dissociação do oligômero nas diferentes subunidades da HbGp. O estado intermediário apresenta propriedades físico-químicas similares ao estado nativo, sugerindo que o processo de dissociação oligomérica não induz mudanças significativas na estrutura secundária e na região do grupo heme da proteína. Os parâmetros termodinâmicos associados à primeira transição apresentaram erros consideráveis, que podem ser atribuídos à complexidade do estado intermediário com diferentes espécies em solução bem como à semelhança ao estado nativo. A segunda etapa (I → U) com transição bem definida entre 4,5 - 5,0 mol/L de desnaturante é caracterizada pela desnaturação das subunidades dissociadas. Os dados de AUC e SAXS são consistentes com os dados obtidos por espectroscopia, onde a primeira etapa do processo foi caracterizada pela dissociação oligomérica do oligômero em dodecâmero (abcd)3, tetrâmero abcd, trímero abc e monômero d. Para concentrações acima de 4,0 e 5,0 mol/L de ureia, para oxi-HbGp e cianometa-HbGp, respectivamente, aumentos significativos nos valores de I(0), Dmax e Rg sugerem que as subunidades da HbGp estão desnaturadas em solução. As massas moleculares (MM) obtidas por espectrometria de massas e AUC, e os coeficientes de sedimentação s20,w são consistentes com outros resultados reportados para hemoglobinas ortólogas. Além disso, os resultados aqui apresentados representam um avanço importante na caracterização do processo de desnaturação de proteínas oligoméricas complexas. / Glossoscolex paulistus hemoglobin (HbGp) is characterized by a molecular mass of 3.6 MDa, a high oligomeric stability, a high resistance to oxidation and a high affinity to oxygen. The quaternary structure of this macromolecule consists of 144 globin chains, and 36 additional chains lacking the heme group, named linkers, organized in a double-layered hexagonal structure. In this current work the characterization of the HbGp subunits and the effect of pH and urea upon the oligomeric stability were studied by several biophysical techniques. Our results obtained by electrophoresis SDS-PAGE, MALDI-TOF-MS and analytical ultracentrifugation (AUC) showed that only the monomer d isolated by size exclusion chromatography (SEC) presented high purity. For the other fractions various species were observed in the solution. Thus, for the trimeric fraction, two species are present in the equilibrium, the main species with percentage contribution of 87 % is assigned to the trimer abc and the species with 13 % in the solution is associated to the complex (abc + L). Additionally, the data obtained by several spectroscopic techniques and AUC show clearly that the oligomeric stability of HbGp depends on the iron oxidation state, the specific ligand coordinated to the iron and the protein concentration. Therefore, our results show that the met-HbGp form is the less stable one in the alkaline medium and in the presence of urea, followed by the oxy- and cyanomet- forms. In this way, at pH 8.0, the met- form is fully dissociated into smaller subunits, such as, trimer abc and monomer d, while the oxy-HbGp is partially dissociated with a significant percentage contribution (88 %) of undissociated protein, and the cyanomet-HbGp does not undergo oligomeric dissociation. The sedimentation coefficients (s20,w) and molecular masses (MM) values for species present in the solution, at different pH, are very close to the values obtained for isolated species. In the presence of urea the same behavior was observed for the three HbGp forms as compared to the alkaline medium. However, for a full characterization of the unfolding process the thermodynamic parameters were obtained by spectroscopic data analysis using models of two and three states. Adequate fits were obtained for both models, but the three states model was very appropriate to describe the HbGp denaturation process. Thus, the denaturation process of HbGp is defined by two phases. The first phase between 1.0 and 3.0 mol/L, of urea is assigned to the transition of native state to an intermediate state (N → I), and is characterized by dissociation of the oligomer in several subunits. The strong similarity of the intermediate state to the native one suggests that oligomeric dissociation induces little changes in the secondary structure and the region of heme group of the protein. As a consequence, the thermodynamic parameters associated to the first transition have large errors due to the complexity of the intermediate state with different species in the solution, as well as its great similarity to the native state. The second phase (I → U), associated with a cooperative transition at 4,5 - 5,0 mol/L of denaturant agent, is attributed to the unfolding of the dissociated subunits. Our AUC and SAXS data are very consistent with spectroscopic data. Thus, in the first phase the oligomeric dissociation of whole protein in dodecamer (abcd)3, tetramer abcd, trimer abc and monomer d was observed. For urea concentrations above 4.0 - 5,0 mol/L, for oxy-HbGp and cyanomet-HbGp, respectively, the significant increase in I(0), Dmax and Rg values suggests that the HbGp subunits are denatured in the solution. The molecular masses values (MM) obtained by mass spectrometry and AUC, and the sedimentation coefficients (s20,w) are consistent with others results reported in the literature for orthologous hemoglobins. In addition, the results of this work correspond to an important advance in the characterization of the denaturation process of this complex oligomeric protein.

Orientadores: Luiz Henrique Antunes Rodrigues, Fabio Cesar da Silva / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia Agricola / Made available in DSpace on 2018-08-03T17:13:33Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Bergamasco_AlessandraFabiola_M.pdf: 1640078 bytes, checksum: 2a52450426509110caa5f1baa1bf044e (MD5) Previous issue date: 2003 / Mestrado

This thesis was developed with the objective of evaluating the effect of supplementation with 10% crude glycerin in the total dry matter (DM) of the diet for lactating cattle in a annual ryegrass (Lolium multiflorum) pasture production system on the metabolic profile, milk composition and production. The experiment was conducted at the Regional Rural Development Institute in Augusto Pestana, RS, Brazil, with 18 Holstein cattle, in a block design (according to lactation days) in a simple cross-over procedure, during three periods of 14 days. The diets were composed of annual ryegrass grazing and supplementation with corn silage and concentrate, with or without addition of 10% crude glycerin based on total dry matter. Samples of diet, urine, milk and blood were collected and evaluated. It were evaluated too milk production and leftover food in the trough. The data were submitted to analysis of variance and the treatment effect compared by the T test through the SAS statistical program. Values of P<0.05 were considered significant and tendency were considered when P<0.10. It was verified that the inclusion of 10% of crude glycerin in diet DM of lactating cows reduces the elimination of urea through milk and increases blood glucose levels, and does not have a deleterious effect on milk production and cows’ feed consumption. The addition of 10% DM of glycerin to the diet hasn’t effect on milk production and composition of Holstein cows in different lactation periods with different levels of protein in the diet. It was concluded that the inclusion of 10% crude glycerin in diet DM of lactating cows on annual ryegrass pasture reduces the level of milk nitrogen urea. This could be due to the decrease in urea blood levels by the increase of nutritional efficiency, provided by glycerin energy supply, for its energy and potential contribution in increasing blood glucose levels, without interfering in the productive performance and composition of the milk. / Esta tese foi desenvolvida com o objetivo de avaliar o efeito da suplementação com 10% de glicerina bruta na matéria seca (MS) total da dieta, para vacas em lactação, mantidas em sistema de produção em pastagem de azevém (Lolium multiflorum), sobre o perfil metabólico, composição e produção do leite. O experimento foi conduzido no Instituto Regional de Desenvolvimento Rural, em Augusto Pestana, RS, Brasil, com 18 vacas da raça holandesa, em um delineamento com blocos (conforme o perfil da lactação) em esquema de reversão simples dos animais (Cross-over), em três períodos de 14 dias. As dietas foram constituídas de pastejo em azevém e suplementação com silagem de milho e concentrado, acrescido ou não da adição de 10% de glicerina bruta com base na matéria seca (MS) total. Foram coletadas e analisadas amostras de alimentos, urina, leite e sangue. Foram avaliadas também sobras de alimento no cocho e produção de leite. Os dados foram submetidos à análise de variância e o efeito de tratamento comparado pelo teste T através do programa estatístico SAS. Valores de P<0.05 foram considerados significativos e como tendência quando P<0.10. Verificou-se que a inclusão de 10% de glicerina bruta na MS da dieta reduz à eliminação de ureia via leite e aumenta os níveis sanguíneos de glicose, não tendo efeito deletério sobre a produção de leite e consumo de alimento dos animais. A adição de 10% da MS de glicerina a dieta não apresenta efeito sobre a produção e composição do leite de vacas da raça holandesa, em diferentes períodos de lactação. Conclui-se que a inclusão de 10% de glicerina bruta na MS da dieta de vacas em lactação, em pastejo de azevém, diminui o nível de nitrogênio ureico no leite em função da melhora da eficiência nutricional, pelo seu aporte energético e potencial em aumentar os níveis de glicose sanguínea, sem interferir no desempenho produtivo e na composição do leite.

Made available in DSpace on 2016-05-02T13:54:21Z (GMT). No. of bitstreams: 1 AndreVilelaPortugal-dissertacao.pdf: 317174 bytes, checksum: 65c3cef9f280c4503fc3dcc6e9c97aa0 (MD5) Previous issue date: 2012-10-23 / In corn crop, nitrogen is the nutrient most required, which further affects their productivity and which further onerous the cost of production. The purpose of this study was to evaluate sources of nitrogen in corn growth in tillage system. The experiment was conducted at the Vitoria farm, located in the city of Alfenas - MG, in a area of the first year of tillage system. For this, it was used the transgenic corn hybrid Impact of Syngenta, and it was employed random blocks design experimental, with7 treatments and 4 replications, totaling 28 plots. The treatments applied consisted: Control (without nitrogen in coverage); 100 Kg ha-1 of nitrogen in coverage, with ammonium nitrate, without incorporation; 100 Kg ha-1 of nitrogen in coverage, with urea, without incorporation; 100 Kg ha-1 of nitrogen in coverage, with urea and incorporation; 100 Kg ha-1 of nitrogen in coverage, with ammonium sulfate, without incorporation; 100 Kg ha-1 of nitrogen in seeding, with controlled release fertilizer, without incorporation; 50 Kg ha-1 of nitrogen in seeding, with controlled release fertilizer, without incorporation. The assessments of the experiment were performed, after 154 days, according to the parameters: grains productivity, number of grain rows per cob, weight of 1,000 grains, number of grains/row in each cob and number of grains per cob. With this study it can conclude that: the common urea, ammonium sulfate and ammonium nitrate showed similar performance and economic returns in corn crop tillage system; the incorporation of urea did not improve grain productivity and components production in corn growth in tillage system, the controlled release fertilizer is not feasible from an economic standpoint in corn growth in tillage system. / Na cultura do milho, o nitrogênio é o nutriente mais exigido, que mais afeta sua produtividade e o que mais onera o custo de produção. Objetivou-se com o presente trabalho avaliar fontes de nitrogênio no cultivo de milho em sistema plantio direto. O experimento foi realizado na fazenda Vitória, situada no município de Alfenas MG, em uma área de primeiro ano de plantio direto. Para tanto, utilizou-se o híbrido de milho transgênico Impacto da Syngenta, e empregou-se delineamento experimental em blocos ao acaso, com 7 tratamentos e 4 repetições, totalizando 28 parcelas. Os tratamentos empregados foram constituídos por: Testemunha (ausência de N em cobertura); 100 Kg ha-1 de N em cobertura, com nitrato de amônio, sem incorporação; 100 Kg ha-1 de N em cobertura, com ureia, sem incorporação; 100 Kg ha-1 de N em cobertura, com ureia, com incorporação; 100 Kg ha-1 de N em cobertura, com sulfato de amônio, sem incorporação; 100 Kg ha-1 de N na semeadura, com fertilizante de liberação controlada, sem incorporação; 50 Kg ha-1 de N na semeadura, com fertilizante de liberação controlada, sem incorporação. As avaliações do experimento foram realizadas, após 154 dias, de acordo com os seguintes parâmetros: produtividade de grãos, número de fileira de grãos por espiga; peso de 1.000 grãos, número de grãos/fileira em cada espiga e número de grãos por espiga. Com o presente trabalho podemos concluir que: a ureia comum, o sulfato de amônio e nitrato de amônio apresentaram desempenho e retorno econômico semelhantes na cultura de milho em sistema plantio direto; a incorporação da ureia não favoreceu a produtividade de grãos e os componentes de produção no cultivo de milho em sistema plantio direto; o fertilizante de liberação controlada não é viável do ponto de vista econômico no cultivo de milho em sistema plantio direto.

O nitrogênio desempenha função essencial na fisiologia das leveduras e em fermentações com alta concentração de açúcares propicia maior rendimento, eficiência e produtividade, além de proteger as células de levedura dos estresses osmóticos provocados pelas altas concentrações de açúcar e de etanol. Com o objetivo de verificar a influência da suplementação nitrogenada nos parâmetros fermentativos, mostos contendo caldo de cana concentrado a 25, 30 ou 35° Brix e suplementados ou não com ureia (16 mM) ou fosfato de amônio (24 mM), foram fermentados a 30°C por leveduras Saccharomyces cerevisiae (linhagens PE-2 ou CAT-1) em 6 ciclos consecutivos de 24h. Ao final de cada ciclo, foram analisados: a massa úmida (biomassa) por pesagem após a centrifugação; a viabilidade celular pelo método de coloração com eritrosina e a concentração de etanol em densímetro digital (Anton Paar DMA 4500), após destilação das amostras por arraste de vapor em destilador Tecnal TE-012 e açúcar por cromatografia líquida (HPLC). A concentração de nitrogênio total utilizável foi determinada pelo método da ninidrina, utilizando glicina como padrão. Em mosto contendo 30°Brix, a linhagem CAT-1, produziu teores de etanol, em média, de 12,9, 17,1 e 14,4% (v/v), respectivamente, nos tratamentos controle (T1) ou suplementado com ureia (T2) ou fosfato (T3). Nesta condição, a linhagem PE-2, produziu 14,9 (T1), 15,8 (T2) e T3 15,8% (v/v) e a massa úmida da CAT-1 aumentou de 7% para 16%, na presença de fosfato. Na fermentação do mosto 35°Brix, pelas duas linhagens, a suplementação com fosfato (T3) propiciou maior produção de etanol, aumento de massa úmida e manutenção da viabilidade celular. A levedura CAT-1, no tratamento com 30° Brix, produziu mais glicerol no tratamento com fosfato de amônio sendo quase 1g de glicerol por cada 1g de biomassa produzida. A suplementação com ureia teve efeitos benéficos na fermentação VHG possibilitando uma produção maior de etanol, e uma produção menor de glicerol face às outras suplementações nitrogenadas. / Nitrogen plays an essential role in the physiology of yeast and fermentation of high concentration sugars. It provides higher yield, efficiency and productivity, as well as protects yeast cells from osmotic stress caused by high concentrations of sugar and ethanol. To evaluate the influence of nitrogen supplementation on fermentative parameters, must containing concentrated sugarcane juice to 25, 30 or 35°Brix and supplemented or not with 16 mM urea or 24 mM ammonium phosphate were fermented at 30°C by PE-2 or CAT-1 yeast strains of Saccharomyces cerevisiae into 6 consecutive cycles of 24h. At the end of each cycle, cell viability by staining with erythrosine method, wet mass (biomass) by weighing; and the ethanol concentration in digital densitometer, after samples distillation were analyzed. The concentration of total usable nitrogen was determined by the ninhydrin using glycine as standard. In 30°Brix wort, CAT-1 strain produced averaged 12.9, 17.1 and 14.4% (v/v) of ethanol concentration, respectively, in the (T1) control or with (T2) urea or (T3) phosphate supplemented treatments. In this condition, the PE-2 strain produced 14.9 (T1), 15.8 (T2) and T3 15.8% (v / v) and the wet weight of CAT-1 increased from 7% to 16%, in the presence of phosphate. In the fermentation of the must 35°Brix by the two strains, supplementation with phosphate (T3) led to increased ethanol production, increased wet weight and maintenance of cell viability. CAT-1 strain, in 30°Brix, produced more glycerol upon treatment with ammonium phosphate being about 1 g glycerol per 1 g of biomass produced. Supplementation with urea had beneficial effects on VHG fermentation enabling increased production of ethanol, and a lower production of glycerol against other nitrogen supplementation.

Orientador: Mara Cristina Pessôa da Cruz / Coorientador: Edson Luiz Mendes Coutinho / Banca: Felipe Batistella Filho / Banca: Flávia Fernanda Simili / Banca: José carlos Barbosa / Banca: Itamar Andrioli / Resumo: A intensificação da produção dos animais em sistemas confinados gera uma alta produção de esterco bovino que pode contribuir para o fornecimento de nutrientes. Além de proporcionar melhorias em atributos químicos e físicos do solo. Diante deste contexto trabalhou-se com a hipótese de que o esterco bovino pode substituir total ou parcialmente o fertilizante nitrogenado industrial na adubação do capim-tifton 85. Assim, o objetivo com o presente trabalho foi avaliar o efeito da combinação nitrogênio x esterco da produção de capim-tifton 85 e em atributos químicos e físicos do solo. O experimento foi instalado durante os anos agrícolas 2013-2014 e 2014-2015. Os tratamentos consistiram de cinco doses de nitrogênio (N): 0, 50, 100, 200 e 300 kg ha-1, e cinco doses de esterco (E): 0, 10, 20, 40 e 60 Mg ha-1 combinadas em esquema fatorial. As doses de 300 kg ha-1 de N e 40 Mg ha-1 de E proporcionaram a maior produção de massa seca (10.469 kg ha-1) e altura (75,10 cm) em 2013-14. A associação das maiores doses de esterco e nitrogênio resultaram em melhor desempenho da forrageira em relação a produção de massa seca total (13.305 kg ha-1). Houve aumento de 71 e 88% de acúmulo de nitrogênio no capim-tifton 85 no ano agrícola 2013-14 e, aumento de 126 e 163 em 2014-15, com o uso de esterco e de N-ureia, respectivamente. A recuperação aparente de N com o uso de esterco foi maior no segundo ano de avaliação. Com o uso de N-ureia não houve variação nos teores de carbono orgânico do solo e na... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Intensified production of animals in confined systems generates a high production of cattle manure that can contribute to the nutrient supply. In addition to providing improvements in soil chemical and physical attributes. In this context, we worked with the hypothesis that bovine manure can totally or partially replace industrial nitrogen fertilizer in fertilization of tifton grass 85. Thus, the objective with the present work was to evaluate the effect of the nitrogen and manure combination of tifton 85 grass production and on soil chemical and physical attributes. The experiment was installed during the agricultural years 2013-2014 and 2014-2015. The treatments consisted of five doses of nitrogen (N): 0, 50, 100, 200 and 300 kg ha-1, and five manure doses (E): 0, 10, 20, 40 and 60 Mg ha-1 combined in factorial scheme. The doses of 300 kg ha-1 of N and 40 Mg ha-1 of E provided the highest dry mass production (10,469 kg ha-1) and height (75,10 cm) in 2013-14. The association of the highest doses of manure and nitrogen resulted in better forage performance in relation to the production of total dry mass (13,305 kg ha-1). There was an increase of 71 and 88% of nitrogen accumulation in Tifton 85 grass in the agricultural year 2013-14 and, increased 126 and 163 in 2014-15, respectively. The apparent recovery of N with use of manure was greater in the second year of evaluation. With the use of N-urea, there was no change in soil organic carbon and forms of carbon associated with minerals and particulate. The use of 60 Mg ha-1 of manure for two consecutive years increased the stability (94.96%) and the weighted average diameter of the aggregates (4.86 mm) and decreased soil resistance to penetration (0.99 MPa) due to the 35% increase in soil carbon content. / Doutor