Le système ubiquitine-protéasome joue un rôle central dans le contrôle de la progression du cycle cellulaire par la dégradation régulée de nombreuses protéines. Dans ce système, Fbw7 (aussi appelée Fbxw7, hCdc4, hAgo, Sel-10), est l'une des protéines F-box qui sert d'adaptateur de substrats pour l'une des plus importantes familles d'ubiquitine ligases : les complexes SCF (Skp1/Cullin/ F-box). Fbw7 assure la dégradation de plusieurs régulateurs positifs du cycle cellulaire : la cycline E, cMyc, c-Jun, Notch, Aurora A, mTOR, MCL1. En conséquence, l'altération des fonctions de Fbw7 conduit à des défauts de prolifération cellulaire, de différenciation et à de l'instabilité génomique. La mutation de Fbw7 dans les cancers entraîne une dérégulation de l'expression périodique cycline E qui n'est alors plus restreinte à la transition G1/S du cycle cellulaire. Nos résultats montrent qu'une isoforme, Fbw7, est exprimée dans les œufs de xénope matures arrêtés en métaphase II mais n'est pas fonctionnelle, expliquant la présence de grande quantité de cycline E dans les œufs à cette phase mitotique. Nous montrons que Fbw7 est maintenue inactive sous forme poly-ubiquitylée suite à sa phosphorylation par une PKC jusqu'à la fin des cycles embryonnaires rapides, au moment où la cycline E est brutalement dégradée. Nous montrons que la régulation négative de Fbw7 par PKC est conservée au cours des cycles cellulaires somatiques des cellules humaines, et contribue à l'expression périodique de la cycline E. Ces résultats mettent en évidence un nouveau mécanisme critique pour la régulation de Fbw7 au cours du cycle cellulaire et suggèrent que les fonctions de Fbw7 peuvent être altérées par une dérégulation de PKC, un phénomène observé dans de nombreux types de tumeurs humaines. / The ubiquitin-proteasome system plays a central role in the control of cell cycle progression through the regulated degradation of numerous critical proteins. In this process, one key family of ubiquitin ligases are the SCF (Skp1/Cul-1/F-box) complexes, in which F-box-bearing proteins act as substrate-recruiting factors. Fbw7 (also known as Fbxw7, hCdc4, hAgo, Sel-10) is one such F-box protein. It controls the stability and thus the levels of several positive regulators of the cell cycle, including cyclin E, cMyc, c-Jun, Notch, Aurora A, mTOR, Mcl1. As a consequence of its biological roles, alterations of the functions of Fbw7 lead to defects in cellular proliferation, differentiation and genetic instability. As seen in cancers, mutation of Fbw7 leads to deregulation of cyclin E expression, which is no more restricted to the G1-S phase boundary of the cell cycle. Here we report that Fbw7, although expressed in mature Xenopus eggs arrested in metaphase II, is not functional, explaining why cyclin E can be stockpiled in this mitotic-like phase. We found that, in these eggs as well as in early Xenopus embryos, Fbw7 is maintained under a PKC-dependent poly-ubiquitylated state until the end of the early rapid cleavage cycles where cyclin E is abruptly degraded. Importantly, we show that this PKC-dependent negative regulation of Fbw7 is conserved during human somatic cell cycles, resulting into the periodic expression of cyclin E. These findings reveal a novel mechanism critical for the temporal regulation of Fbw7 and suggest that the key functions of Fbw7 can be altered by PKC dysregulation, a mechanism known to occur in many types of human tumours.

Arkadia participa do processo de amplificação da sinalização de TGF-b mediada por Smads, via degradação do I-Smad. O objetivo desse estudo foi caracterizar e investigar a influência de Arkadia em linhagens celulares de cânceres de tiróide. A expressão gênica de Arkadia em linhagens celulares de carcinomas papílifero (NPA), folicular (WRO) e anaplásico (ARO), foi avaliada por PCR quantitativo. Em ARO, que apresenta a maior expressão de Arkadia, foram identificados subclones (ARO_1 e ARO_2) com expressão diferencial de Arkadia, ARO_2>ARO_1. A expressão gênica de SMAD2, 3, 4, 7 e de genes do ciclo celular modulados por TGF-b, foi maior em ARO_2. Os subclones respondem ao tratamento com peptídeo de TGF-b1 e activina A. O crescimento in vivo (xenotransplante) mostra que ARO_2 desenvolve um tumor de menor volume. Recentemente a origem de ARO foi questionada e comprovamos sua origem por análises de expressão gênica e morfologias. Desta maneira, observamos que a expressão diferencial de Arkadia indica que ela está envolvida na modulação inibitória da via de TGF-b. / Arkadia is involved in the process of amplification of the TGF-b signaling mediated by Smads, by degradation of I-Smad. The aim of this study was to characterize and investigate the influence of Arkadia in thyroid cancers cell lines. Arkadia gene expression in the papillary (NPA), follicular (WRO) and anaplastic carcinoma cell lines (ARO) was evaluated by quantitative PCR. In ARO, which presents the highest Arkadia expression, we identified subclones (ARO_1 and ARO_2) with differential Arkadia expression ARO_2> ARO_1. The expression of SMAD2, 3, 4, 7 and the cell cycle genes modulated by TGF-b, was also higher in ARO_2. However both the subclones responded to treatment with peptide of TGF-b1 and activin A. The in vivo growth (evaluated by xenotransplant), showed that ARO_2 developed tumors of lower volume. Recently the ARO origin was questioned and we proved its origin by gene expression and morphological analysis. This way, the differential Arkadia expression indicates that it is involved in modulation of the inhibitory TGF-b pathway.

In Eukaryoten werden sekretorische Proteine an zytoplasmatischen Ribosomen synthetisiert und in das endoplasmatische Retikulum (ER) transportiert, wo sie ihre biologisch aktive Struktur erhalten. Defekte Proteine, die durch Fehler in diesem Reifungsprozess entstehen, werden über den Prozess der „ER-assoziierten Protein Degradation“ (ERAD) abgebaut. Eine zentrale Komponente dieses Abbauweges ist die HRD‑Ligase, ein membranständiger Proteinkomplex, der das E3‑Enzym Hrd1 enthält. Einige publizierte Arbeiten lassen eine Beteiligung der Transmembrandomäne von Hrd1 an einem neuartigen Transportsystem für den Export von fehlgefalteten Proteinen aus dem ER vermuten. Im Rahmen dieser Arbeit konnten neue Erkenntnisse über die Bedeutung der Transmembranregion von Hrd1 für den Abbau von ERAD‑Substraten in dem Modellorganismus Saccharomyces cerevisiae gewonnen werden. Die Substitution von zwei Aminosäuren in der dritten Transmembranhelix von Hrd1 (Hrd1E84L, H101L) hemmt spezifisch den Abbau von fehlgefalteten ER-luminalen Proteinen, während die Prozessierung membrangebundener Hrd1-Substrate weitestgehend unbeeinflusst blieb. Daher zeigt die Hrd1‑Variante wahrscheinlich eine Störung im Transport von luminalen ERAD‑Substraten durch die ER Membran. Biochemische Analysen zeigen keine starken Veränderungen bei der Zusammensetzung der HRD-Ligase durch die Hrd1‑Variante. Allerdings ließen sich bei Anwendung von zielgerichtetem in vivo photocrosslinking deutliche Veränderungen in der räumlichen Orientierung der Ligaseuntereinheit Der1 zu Hrd1E84L, H101L beobachten. Da Der1 ausschließlich für den Abbau ER-luminaler ERAD-Substrate benötigt wird ist anzunehmen, dass die korrekte Ausrichtung von Der1 zu Hrd1 innerhalb der ER-Membran eine Voraussetzung für den Transport von ERAD‑Substraten in das Zytoplasma ist. Die Ergebnisse dieser Arbeit zeigen erstmals einen direkten Einfluss der Transmembranregion von Hrd1 auf den Abbau luminaler ERAD‑Zielproteine. / In eukaryotes, secretory proteins are synthesized on cytoplasmic ribosomes and transported into the endoplasmic reticulum (ER), where they obtain their biologically active structure. Defect proteins that arise from errors in this maturation process are degraded by the “ER-associated protein degradation” (ERAD) pathway. A central component of ERAD is the HRD-ligase, a membrane-bound protein complex that contains the ubiquitin ligase Hrd1. Some published work raised speculations on an involvement of this trans-membrane domain in a novel transport system for the export of misfolded proteins from the ER. In the course of this work new insights for the importance of the transmembrane domain of Hrd1 for the degradation of ERAD substrates in the model organism Saccharomyces cerevisiae were obtained. The substitution of two amino acids in the third trans-membrane helix of Hrd1 (Hrd1E84L, H101L) specifically impairs the turnover of misfolded ER-luminal proteins whereas the processing of membrane-bound Hrd1 substrates remained largely unaffected. The Hrd1 variant therefore displays most likely a defect in the transport of luminal ERAD substrates through the ER membrane. No major changes in the assembly of the HRD-ligase by the Hrd1 variant were detected. Still, in site specific in vivo photo-crosslinking assays substantial changes in the spatial orientation of the ligase subunit Der1 towards Hrd1E84L, H101L were detected. Der1 is exclusively required for the degradation of ER-luminal ERAD substrates. This implies that the proper alignment of Hrd1 and Der1 within the ER membrane is a prerequisite for the transport of ERAD substrates into the cytoplasm. This work shows for the first time a direct involvement of the trans-membrane region of Hrd1 in the degradation of luminal ERAD client proteins.

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BRCA1 est un suppresseur de tumeur majeur jouant un rôle dans la transcription, la réparation de l’ADN et le maintien de la stabilité génomique. En effet, des mutations dans le gène BRCA1 augmentent considerablement le risque de cancers du sein et de l’ovaire. BRCA1 a été en majorité caractérisé pour son rôle dans la réparation de l’ADN par la voie de recombinaison homologue (HR) en présence de bris double brins, par example, induits par l’irradiation gamma (IR). Cependant, la fonction de BRCA1 dans d’autres voies de réparation de l’ADN, comme la réparation par excision de nucléotides (NER) ou par excision de base (BER), demeurent toutefois obscures. Il est donc important de comprendre la régulation de BRCA1 en présence d’agents génotoxiques comme le méthyle méthanesulfonate (MMS) ou l’UV, qui promouvoient le BER et le NER respectivement. Nos observations suggèrent que BRCA1 est dégradée par le protéasome après traitement avec le MMS ou les UV, et non avec l’IR. Par ailleurs, cette dégradation semble compromettre le recrutement de Rad51, suggérant que la voie de HR est inhibée. Nos résultats suggèrent que la HR est inhibée afin d’éviter l’activation simultanée de multiples voies de réparation. Nous avons aussi observé que la dégradation BRCA1 est réversible et que la restauration des niveaux de BRCA1 coïncide avec le recrutement de Rad51 aux sites de dommages. Cela suggère que la HR est réactivée tardivement par les bris double brins générés suite à l’effondrement des fourches de réplication. Ayant observé que BRCA1 est hautement régulé par l’ubiquitination et est ciblé par le protéasome pour dégradation, nous avons émis une hypothèse que BRCA1 est régulé par des déubiquitinases. Cela amène à caractériser plus en profondeur par un criblage en déplétant les déubiquitinases individuellement par RNAi et en observant leur effet sur le recrutement de BRCA1 et des protéines reliées à cette voie. Un criblage préliminaire nous a permi d’identifié candidats potentiels tel que BAP1, CXORF53, DUB3, OTUB1 et USP36. / BRCA1 is a tumour suppressor involved in transcription, DNA repair and maintenance of genomic stability. Indeed, BRCA1 mutation carriers have an exceptionally higher risk of breast and ovarian cancers. BRCA1 is mainly known for its role in homologous recombination repair (HR) by recruiting HR proteins to chromatin upon double strand break (DSBs) formation, e.g., following treatment with ionizing irradiation (IR). However, the function of BRCA1 in other DNA repair pathways such as nucleotide excision repair (NER) or base excision repair (BER) is still obscure. It is thus of fundamental and clinical importance to investigate BRCA1 function following exposure to diverse genotoxic agents. Using human cultured cell, we observed that BRCA1 is downregulated by the proteasome upon treatment with MMS or UV, but not with IR. Moreover, this downregulation prevents Rad51 recruitment to chromatin following exposure to MMS. Given that DNA damage induced by UV and MMS trigger NER and BER pathways respectively, this implies that HR could be inhibited in order to prevent competition between independent DNA repair pathways. We also found that BRCA1 downregulation is reversible and the recovery of BRCA1 levels correlates with the reappearance of BRCA1 and Rad51 on chromatin. This implies that the HR has been reactivated at the late stage of DNA damage for the repair of double strand breaks generated by replication fork collapse. Since BRCA1 stability is highly regulated by ubiquitination and is downregulated following MMS treatment, one would expect that a deubiquitinase is responsible for relieving this downregulation to promote the reactivation of the HR pathway. To characterize this aspect further, we conducted DUB RNAi screens in which a particular DUB is depleted and the localization of BRCA1 and other related proteins were observed. According to a preliminary screen, a few DUBs (BAP1, CXORF53, DUB3, OTUB1, and USP36) were identified as potential regulators of the stability and localization of BRCA1 and proteins involved in homologous recombination.

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La protéine kinase activée par AMP (AMPK) est un senseur et régulateur central de l'état énergétique cellulaire, mais ces voies de signalisation ne sont pour le moment que partiellement comprises. Deux criblages non-biaisés pour la recherche de partenaires d'interaction et de substrats d'AMPK ont précédemment été réalisés dans le laboratoire. Ces derniers ont permis l'identification de plusieurs candidats (protéines), mais leur rôle fonctionnel et physiologique n'était pas encore établi. Ici nous avons caractérisé la fonction de la relation entre AMPK et quatre partenaires d'interaction : gluthation S-transferases (GSTP1 and GSTM1), fumarate hydratase (FH), l'E3 ubiquitine-ligase (NRDP1), et les protéines associées à la membrane (VAMP2 and VAMP3). Chacune de ces interactions parait avoir un rôle différent dans la signalisation AMPK, agissant en amont ou en aval de la protéine AMPK. GSTP1 et GSTM1 contribueraient à l'activation d'AMPK en facilitant la S-glutathionylation d'AMPK en conditions oxydatives moyennes. Cette régulation non-canonique suggère que l'AMPK peut être un senseur de l'état redox cellulaire. FH mitochondrial est l'unique substrat AMPK clairement identifié. Etonnamment le site de phosphorylation se trouve dans le peptide signal mitochondrial, ce qui pourrait affecter l'import mitochondrial. NRDP1, protéine pour laquelle nous avons pour la première fois développé un protocole de production de la protéine soluble, est faiblement phosphorylée par l'AMPK. L'interaction ne sert pas à l'ubiquitination d'AMPK, mais affecte le renouvellement de NRDP1. Finalement, l'interaction de VAMP2/3 avec AMPK n'implique pas d'évènement de phosphorylation ou d'activation d'un des partenaires. Nous proposons un mécanisme de recrutement d'AMPK par VAMP2/3 (" scaffold ") au niveau des vésicules en exocytose. Ce recrutement favoriserait la phosphorylation de substrats de l'AMPK à la surface des vésicules en exocytoses. Une fois mis en commun, nos résultats enrichissent les connaissances sur les voies de signalisation AMPK, et suggèrent une grande complexité de ces dernières. Plus que les kinases en amont et des substrats en aval, la régulation de la signalisation d'AMPK se fait via des modifications secondaires autres que la phosphorylation, via des effets sur le renouvellement de protéines, et probablement via un recrutement spécifique de l'AMPK dans certains compartiments cellulaires.

BRCA1 est un suppresseur de tumeur majeur jouant un rôle dans la transcription, la réparation de l’ADN et le maintien de la stabilité génomique. En effet, des mutations dans le gène BRCA1 augmentent considerablement le risque de cancers du sein et de l’ovaire. BRCA1 a été en majorité caractérisé pour son rôle dans la réparation de l’ADN par la voie de recombinaison homologue (HR) en présence de bris double brins, par example, induits par l’irradiation gamma (IR). Cependant, la fonction de BRCA1 dans d’autres voies de réparation de l’ADN, comme la réparation par excision de nucléotides (NER) ou par excision de base (BER), demeurent toutefois obscures. Il est donc important de comprendre la régulation de BRCA1 en présence d’agents génotoxiques comme le méthyle méthanesulfonate (MMS) ou l’UV, qui promouvoient le BER et le NER respectivement. Nos observations suggèrent que BRCA1 est dégradée par le protéasome après traitement avec le MMS ou les UV, et non avec l’IR. Par ailleurs, cette dégradation semble compromettre le recrutement de Rad51, suggérant que la voie de HR est inhibée. Nos résultats suggèrent que la HR est inhibée afin d’éviter l’activation simultanée de multiples voies de réparation. Nous avons aussi observé que la dégradation BRCA1 est réversible et que la restauration des niveaux de BRCA1 coïncide avec le recrutement de Rad51 aux sites de dommages. Cela suggère que la HR est réactivée tardivement par les bris double brins générés suite à l’effondrement des fourches de réplication. Ayant observé que BRCA1 est hautement régulé par l’ubiquitination et est ciblé par le protéasome pour dégradation, nous avons émis une hypothèse que BRCA1 est régulé par des déubiquitinases. Cela amène à caractériser plus en profondeur par un criblage en déplétant les déubiquitinases individuellement par RNAi et en observant leur effet sur le recrutement de BRCA1 et des protéines reliées à cette voie. Un criblage préliminaire nous a permi d’identifié candidats potentiels tel que BAP1, CXORF53, DUB3, OTUB1 et USP36. / BRCA1 is a tumour suppressor involved in transcription, DNA repair and maintenance of genomic stability. Indeed, BRCA1 mutation carriers have an exceptionally higher risk of breast and ovarian cancers. BRCA1 is mainly known for its role in homologous recombination repair (HR) by recruiting HR proteins to chromatin upon double strand break (DSBs) formation, e.g., following treatment with ionizing irradiation (IR). However, the function of BRCA1 in other DNA repair pathways such as nucleotide excision repair (NER) or base excision repair (BER) is still obscure. It is thus of fundamental and clinical importance to investigate BRCA1 function following exposure to diverse genotoxic agents. Using human cultured cell, we observed that BRCA1 is downregulated by the proteasome upon treatment with MMS or UV, but not with IR. Moreover, this downregulation prevents Rad51 recruitment to chromatin following exposure to MMS. Given that DNA damage induced by UV and MMS trigger NER and BER pathways respectively, this implies that HR could be inhibited in order to prevent competition between independent DNA repair pathways. We also found that BRCA1 downregulation is reversible and the recovery of BRCA1 levels correlates with the reappearance of BRCA1 and Rad51 on chromatin. This implies that the HR has been reactivated at the late stage of DNA damage for the repair of double strand breaks generated by replication fork collapse. Since BRCA1 stability is highly regulated by ubiquitination and is downregulated following MMS treatment, one would expect that a deubiquitinase is responsible for relieving this downregulation to promote the reactivation of the HR pathway. To characterize this aspect further, we conducted DUB RNAi screens in which a particular DUB is depleted and the localization of BRCA1 and other related proteins were observed. According to a preliminary screen, a few DUBs (BAP1, CXORF53, DUB3, OTUB1, and USP36) were identified as potential regulators of the stability and localization of BRCA1 and proteins involved in homologous recombination.

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