Uric acid excretion disorders are the most common cause of primary dysuricemia. The kidneys eliminate two-thirds of uric acid production and the other third is eliminated in the gastrointestinal tract. Renal reabsorption and secretion occur through the polarised epithelial cells in the proximal tubules. Uric acid transporters are expressed on these cell membranes. Reabsorption deficiency leads to hypouricemia and elevated fraction excretion associated with urolithiasis, nephrolithiasis or acute renal injury. Decreased uric acid secretion in the kidneys and small intestine leads to hyperuricemia, which develops into gout in 10% of individuals. Genome wide association studies detected a strong effect of SLC22A12 (URAT1), SLC2A9 (GLUT9) reabsorbing transporters and ABCG2 (ABCG2) secreting transporter on uric acid serum concentration variability. This thesis aimed to map out urate transporter allelic variants in a cohort of primary dysuricemia patients and identification of the variants causing defective uric acid excretion. Six non-synonymous variants were described in SLC22A12 (URAT1) and SLC2A9 (GLUT9) genes in hypouricemic individuals, which had not been identified previously in any population studies. Significant decreases in uric acid transport have been demonstrated experimentally in vitro,...

Uric acid excretion disorders are the most common cause of primary dysuricemia. The kidneys eliminate two-thirds of uric acid production and the other third is eliminated in the gastrointestinal tract. Renal reabsorption and secretion occur through the polarised epithelial cells in the proximal tubules. Uric acid transporters are expressed on these cell membranes. Reabsorption deficiency leads to hypouricemia and elevated fraction excretion associated with urolithiasis, nephrolithiasis or acute renal injury. Decreased uric acid secretion in the kidneys and small intestine leads to hyperuricemia, which develops into gout in 10% of individuals. Genome wide association studies detected a strong effect of SLC22A12 (URAT1), SLC2A9 (GLUT9) reabsorbing transporters and ABCG2 (ABCG2) secreting transporter on uric acid serum concentration variability. This thesis aimed to map out urate transporter allelic variants in a cohort of primary dysuricemia patients and identification of the variants causing defective uric acid excretion. Six non-synonymous variants were described in SLC22A12 (URAT1) and SLC2A9 (GLUT9) genes in hypouricemic individuals, which had not been identified previously in any population studies. Significant decreases in uric acid transport have been demonstrated experimentally in vitro,...

Katecholamine (Dopamin, Adrenalin, Noradrenalin) und Serotonin sind wichtige Monoamin-Neurotransmitter im menschlichen zentralen Nervensystem, deren quantitative Bestimmung von großem medizinischen Interesse ist, weil damit Aussagen zum Verlauf von Nervenkrankheiten und zur Tumorgefährdung des sympathoadrenalen bzw. neuroendokrinen Systems möglich sind. Ascorbinsäure und Harnsäure finden sich in vielen Körperflüssigkeiten. Ihre Bestimmung ist klinisch ebenfalls bedeutend, da deren Konzentration als Indikatoren bekannter Krankheitsbilder dienen. Etablierte Standardmethoden, wie die Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (HPLC) und immunologische Nachweisverfahren (ELISA) werden im klinischen Bereich zur Bestimmung der Neurotransmitter genutzt. Diese sind kostenintensiv und zeitaufwändig und daher für die Anwendung in den Arztpraxen, vor allem in Entwicklungsländern nicht geeignet. Elektrochemische Verfahren, insbesondere voltammetrische Messmethode haben den Vorteil, solche Bestimmungen in einfacher Weise zu ermöglichen. In der Literatur finden sich Angaben zu eingesetzten Elektroden auf Kohlenstoffbasis mit hoher Sensitivität für die Katecholamine. Allerdings wurden diese Elektroden meist einzeln hergestellt. Der kommerzielle Durchbruch ist deshalb bisher, hauptsächlich infolge der mangelnden Reproduzierbarkeit der Elektrodeneigenschaften und der Verfügbarkeit einfacher elektronischer Geräte ausgeblieben. Es war daher Ziel dieser Arbeit, durch industrienahe Herstellungsverfahren Graphitelektroden mit reproduzierbaren Eigenschaften zu entwickeln und diese auf ihre Eignung für den quantitativen Nachweis bioaktiver Stoffe zu erproben. Dazu waren Verfahrensschritte zu optimieren, die es erlauben, diese siebgedruckten Graphitelektroden reproduzierbar und kostengünstig zu fertigen und sie auf verschiedene Weise, z.B. durch halbleitende Polymere und nanoskalige Metalle zu modifizieren. Neben den Neurotransmittern enthalten Körperflüssigkeiten unter anderem Ascorbinsäure und Harnsäure in hohen Konzentrationen. Daher waren zunächst Modellanalyten unter Verwendung dieser Stoffe herzustellen. Die voltammetrischen Methoden, wie die zyklische Voltammetrie (CV), die Differentielle Puls-Voltammetrie (DPV) und die Square-Wave-Voltammetrie (SWV) sollten auf ihre Eignung zum Nachweis der bioaktiven Substanzen erprobt werden. Schließlich waren die Elektroden in realen Analyten zu testen. Insgesamt konnte in der vorliegenden Arbeit gezeigt werden, dass ausgewählte Neurotransmitter, Ascorbinsäure und Harnsäure sich mit differentiellen voltammetrischen Verfahren an industrienah hergestellten modifizierten Dickschichtelektroden bestimmen lassen. Es ist erstmalig gelungen, eine modifizierte Dickschichtelektrode zu entwickeln, mit der es möglich ist, Katecholamine unabhängig von Ascorbinsäure (3 mM) und Harnsäure (2 mM) quantitativ nachzuweisen. Damit eröffnen sich neue Wege für den Einsatz von elektrochemischen Sensoren für die einfache Bestimmung der Neurotransmitter vor Ort. Die beschriebenen modifizierten Dickschichtelektroden sind ohne Verlust an elektrochemischer Aktivität an der Luft oder im Grundelektrolyten monatelang lagerfähig. Die Elektroden lassen sich im Gegensatz zu den in der Literatur beschriebenen Elektroden mit Einzelfertigung kostengünstig in großer Stückzahl mit hoher Reproduzierbarkeit herstellen.:Inhaltsverzeichnis I Abkürzungen V 1 Einleitung und Zielsetzung der Arbeit 1 2 Theoretischer Teil 5 2.1 Elektrochemische Verfahren in der Analytik 5 Klassifizierung elektroanalytischer Methoden 5 2.1.1 Voltammetrie 5 Cyclovoltammetrie (CV) 6 Differential-Puls-Voltammetrie (DPV) 9 Square-Wave-Voltammetrie (SWV) 10 2.1.2 Chronocoulometrie (ChrC) 11 2.1.3 Impedanzmessung (EIS) 12 2.1.4 Elektrochemische Quarzmikrowaage (EQCM) 14 2.2 Poly-3,4-Ethylendioxythiophen, ein leitfähiges Polymer 19 2.2.1 Leitfähige Polymere 19 2.2.2 Das Poly-3,4-ethylendioxythiophen 20 Elektrochemische Synthese und Dotierung 20 2.3 Bioaktive Stoffe 24 2.3.1 Katecholamine 24 Dopamin 25 Noradrenalin und Adrenalin 25 Abnorme Konzentration der Katecholamine 25 2.3.2 Serotonin 26 2.3.3 Interaktion von Katecholaminen und Serotonin 26 2.3.4 Ascorbinsäure und Harnsäure 27 2.3.5 Elektrochemisches Verhalten der bioaktiven Stoffe 28 Katecholamine 28 Serotonin 30 Ascorbinsäure 30 Harnsäure 30 3 Experimenteller Teil 32 3.1 Chemikalien 32 3.2 Lösungen 33 3.2.1 Ausgangslösungen 33 Grundelektrolyte 33 Lösungen der bioaktiven Stoffe 33 3.2.2 Lösungen für Elektrodenmodifizierungen 33 EDOT-haltige Lösungen 33 Neurotransmitter-Lösungen 34 HAuCl4-Lösungen 34 Goldkolloide 34 Eisenhexacyanoferrat(II)-Goldsäurehaltige Lösung 35 3.3 Elektrochemische Messmethoden 35 3.3.1 Voltammetrie, Chronocoulometrie und Impedanz 35 3.3.2 Elektrochemische Quarzmikrowaage 38 3.4 Elektroden und Präparation der Elektroden 39 3.4.1 Untersuchte Elektroden, deren Aktivierung und Konditionierung 39 3.4.3 Modifizierungen der Elektroden 41 Poly-3,4-Ethylendioxythiophen (PEDOT) 41 Goldnanopartikel 41 Komposite aus Goldnanopartikeln und Preußisch Blau (Au/PB) 42 Polymerfilme aus Monoamin-Neurotransmittern 42 3.5 Präparation der UP für Untersuchungen in realen Medien 43 3.6 Spektroskopische Methoden 43 4 Ergebnisse und Diskussion 45 4.1 Unmodifizierte Elektrodenoberflächen 45 4.1.1 Einfluss der Aktivierung der Elektrodenoberflächen auf das Messverhalten 45 4.1.2 Bestimmung bioaktiver Stoffe an unmodifizierten Elektroden 48 Ermittlung des Peakpotenzials 48 Messeffekte an Gold- und Graphitelektroden in Neurotransmitter-Lösungen hoher Konzentrationen 50 Bestimmung bioaktiver Stoffe im Gemisch 52 4.2 Au- und Au/PB-modifizierte Elektroden 54 4.2.1 Abscheidung 54 4.2.2 Untersuchungen bioaktiver Stoffe an Au-modifizierten Elektroden 56 4.3 PEDOT-modifizierte Elektroden 58 4.3.1 Abscheidungen der PEDOT-Schichten 58 CV-Abscheidungen der PEDOT-Schichten 59 ChrC-Abscheidungen der PEDOT-Schichten 62 4.3.2 Voruntersuchungen an PEDOT-modifizierten Elektroden 66 Ermittlung des optimalen Potenzialbereiches für voltammetrische Messungen an PEDOT-modifizierten Elektroden 66 Ermittlung der optimale PEDOT-Schichten für die Bestimmung bioaktiver Stoffe 68 Peakpotenziale bioaktiver Stoffe 71 Einfluss des pH-Wertes des Elektrolyten und der Scangeschwindigkeit auf voltammetrische Messsignale bioaktiver Stoffe 72 Einfluss der Messmethoden auf die Messsignale bioaktiver Stoffe an PEDOT-modifizierten Elektroden 74 4.3.3 Bestimmung bioaktiver Stoffe an PEDOT-modifizierten Elektroden 78 Bestimmung der Neurotransmitter (Dopamin, Adrenalin, Noradrenalin und Serotonin) 78 Bestimmung von Ascorbinsäure und Harnsäure 81 Bestimmung der Neurotransmitter mit Zusatz von Ascorbinsäure und Harnsäure 82 Stabiltität der PEDOT-modifizierten Elektroden 83 Vergleich der Ergebnisse an PEDOT-Elektroden mit Literaturangaben 84 4.3.4 Spektroskopische Untersuchungen der PEDOT-Oberflächen 85 4.3.5 Zusammenfassung der Ergebnisse an PEDOT-Elektroden 87 4.4 Au-PEDOT-modifizierte Elektroden 88 4.4.1 Abscheidungen der Goldnanopartikel auf PEDOT-Oberflächen 88 Abscheidung der Goldnanopartikel durch Adsorption aus Goldkolloiden 88 Abscheidung der Goldnanopartikel auf PEDOT-modifizierten Elektroden mittels Cyclovoltammetrie 92 4.4.2 Bestimmung bioaktiver Stoffe an Au-PEDOT-Elektroden 94 Peakpotenziale bioaktiver Stoffe an Au-PEDOT-Elektroden 94 Bestimmung von Neurotransmittern in 0,1 M Phosphatpufferlösungen 96 Bestimmung von Neurotransmittern mit Zusatz von Ascorbinsäure und Harnsäure 98 Bestimmung von Ascorbinsäure und Harnsäure 99 Stabilität der Sensitivitäten und Reproduzierbarkeit der Elektrodenherstellung 102 Vergleich der Ergebnisse an Au-PEDOT-Elektroden mit Literaturangaben 102 4.4.3 Zusammenfassung der Ergebnisse an Au-PEDOT-Elektroden 104 4.5 Polymonoamin-modifizierte Elektroden bzw. PEDOT-Elektroden 105 4.5.1 Abscheidungen der Polymerschichten aus Monoaminen an Graphitelektroden 106 4.5.2 Abscheidungen der Polymerschichten aus Monoaminen an PEDOT-Elektroden 106 CV-Abscheidung 106 SWV-Abscheidung 108 4.5.3 Bestimmung bioaktiver Stoffe an Polyserotonin-modifizierte PEDOT-Elektroden 111 Peakpotenziale bioaktiver Stoffe 111 Bestimmung der Neurotransmitter 112 Bestimmung von Ascorbinsäure und Harnsäure 114 Bestimmung der Neurotransmitter mit Zusatz von AS und HS 114 Bestimmung von Harnsäure in Gegenwart von Dopamin 116 4.5.4 Möglicher Einsatz der 5-HT-PEDOT-Elektroden als pH-Elektroden 117 4.5.5 Zusammenfassung der Ergebnisse an Polyserotonin-PEDOT-Elektroden 118 4.6 Bestimmung bioaktiver Stoffe in UM 119 4.6.1 Bestimmung von Harnsäure 119 Bestimmung von Harnsäure im Modellanalyten 119 Bestimmung von Harnsäure in präparierten UP 119 4.6.2 Bestimmung von Dopamin 120 DA-Bestimmung im Modellanalyten 120 Bestimmung von Dopamin in präparierten UP 121 5 Zusammenfassung und Ausblick 123 Zusammenfassung 123 Ausblick 126 Tabellenverzeichnis 127 Abbildungsverzeichnis 130 Anhang 138 Literaturverzeichnis 152 VERSICHERUNG 157

Uric acid is a main metabolite of purine degradation in humans and in higher primates. Its increased plasmatic level is called hyperuricemia and may be the cause of gout and many other similar diseases. Uricemia is controlled by many transporters, which are located in proximal tubule of human kidney. When some transporter have abnormal function, the physiological plasmatic level of uric acid may be impaired. In genome wide association study (GWAS) it was discovered that some hyperuricemia or gout patients have ABCG2 protein damaged. This protein carries out uric acid from epithelial cell to the urine. The goal of this diploma thesis is the determination of transport capacity of ABCG2 allelic variants found via GWAS (Institute of Rheumatology of 1st medical faculty UK in Prague) in vitro with Xenopus laevis oocyte expression system. Uric acid secretion was compared with wild type variant. Keywords: Uric acid, GWAS study, Xenopus laevis, membrane transport protein, ABCG2

Background: Periodontal disease has been associated with gestational complications and both conditions have a high prevalence in rural populations from developing regions. A cross-sectional study was carried out to explore the relationship between periodontal inflamed surface area (PISA), blood pressure (BP), and, serum uric acid levels (UA) in a group of rural North Chinese pregnant women in the third trimester of pregnancy. Methods: Three hundred and thirty-five rural women aged 20–34 years, with normal body mass index (BMI) were examined in a cross-sectional study during their third trimester of gestation. Exclusion criteria were history of pregnancy complications,multiple pregnancy, smoking habits, diabetes, hypertension or any known infectious disease. Socio-demographic variables, including age and socioeconomic status (SES), systolic blood pressure (SBP) and diastolic blood pressure (DBP) readings, serum UA levels, and PISA values were recorded. A structural equation model was implemented with two constructed latent variables including “Dem” (comprising of age and SES category to represent unobserved demographic variables) and, “BP” (comprising of SBP and DBP to account for measurement error and lack of multiple BP readings). The model accounted for co-variance of BP and UA, and implemented simultaneous regressions for BP and UA as outcomes, upon Dem and PISA values as exogenous variables. Results: The median PISA score was 1,081.7 (IQR = 835.01), reflecting high levels of periodontal inflammation in the sample. SEM showed a significant association of PISA with BP (estimate = 0.011, 95%CI = 0.009–0.012 p < 0.001) and UA (estimate = 0.001, 95% CI = 0.001–0.001, p < 0.001). Conclusion: Higher PISA values were significantly associated with higher blood pressure and uric acid levels among rural pregnant women in a cross-sectional sample from a center in North China after accounting for a latent demographic construct derived from age and SES.

A oxidação do ácido úrico (7,9-diidro-1H-purina-2,6,8(3H)-triona) pela mieloperoxidase (MPO) gera o radical de urato que, em presença do radical ânion superóxido combinam para formar o hidroperóxido de urato (HOOU). Considerando os altos níveis de MPO, ácido úrico e superóxido na placa de ateroma espera-se que o ácido úrico seja oxidado a HOOU neste microambiente inflamatório. O HOOU é um oxidante mais forte que o peróxido de hidrogênio e pode oxidar grupos tiólicos de proteínas como a proteína dissulfeto isomerase (PDI). Como consequência à oxidação da PDI, ocorre uma modulação positiva sobre a NADPH oxidase (Nox) com aumento da produção de superóxido por neutrófilos. Sendo assim, a formação do HOOU no leito vascular poderia elucidar os mecanismos moleculares pelos quais o urato colabora para a progressão da aterosclerose em pacientes com hiperuricemia. Para investigar a interação do HOOU com a PDI, padronizou-se a síntese química do HOOU através de um sistema de fotooxidação do tipo I, utilizando urato, riboflavina (fotossensibilizador) e luz UVA. Inicialmente padronizou-se o tipo de irradiação e tempo de reação com o melhor rendimento para a síntese do HOOU. O HOOU formado e seu produto de redução o álcool 5-hidroxiisourato foram separados, identificados e caracterizados através de cromatografia liquida acoplada à espectrometria de massa (LC/MS). Após a purificação, determinou-se o coeficiente de absortividade molar em 308 nm (&#949;308 = 6537 &#177; 377 M-1.cm-1) e o tempo de meia-vida, aproximadamente 41 minutos à 22&#176;C do HOOU. O HOOU foi capaz de reagir seletivamente com o aminoácido metionina e com o tripeptídeo glutationa. Além disso, o HOOU não forma adutos estáveis com a glutationa, sendo que toda glutationa consumida foi transformada em glutationa dissulfeto. Quando incubado com a PDI (10 &#181;M), cerca de 70 e 100% do total de HOOU (3 &#181;M) foi consumido após 30 e 120 segundos, respectivamente, enquanto que a PDI (23 &#181;M) teve seus grupos tiólicos oxidados após a incubação com 140 &#181;M HOOU por 30 min a 22&#176;C. O HOOU oxidou os resíduos de cisteína dos dois sítios catalíticos da PDI com uma constante de velocidade da reação de 1,5 &#177; 0,04 x 103 M-1.s-1, demonstrando uma interação favorável com essa proteína no meio biológico e um possível papel modulatório do HOOU sobre a via PDI-Nox. Interessantemente, o ácido úrico aumentou a produção de superóxido e o consumo de oxigênio de células HL-60 diferenciadas em neutrófilos (dHL-60) e ativadas com acetato de miristato de forbol (PMA). Essa regulação poderia ser mediada através da formação do HOOU durante o \"burst\" oxidativo dos neutrófilos que oxidaria a enzima PDI induzindo um consequente aumento da atividade da Nox. / The oxidation of the uric acid (7,9-dihidro-1H-purine-2,6,8(3H)-trione) by myeloperoxidase (MPO) generates the urate radical. In inflammatory conditions the superoxide reacts with urate radical to form the urate hydroperoxide (HOOU). Taking into account the high amount of MPO, urate and superoxide in the atheroma plaque, it is likely that HOOU is being formed in this inflammatory environment. The HOOU is a strong oxidizing agent and can react with thiol groups from proteins, like the protein disulfide isomerase (PDI). As a consequence of its oxidation, PDI positively modulates NADPH oxidase (Nox) and increases superoxide production by neutrophils. Therefore, the formation of HOOU in the vascular sheet would contribute to tissue damage and would explain the positive correlation between hyperuricemia and the risk for cardiovascular disease. To investigate the interaction of HOOU with PDI, we performed the chemical synthesis of the compound by the Type I photooxidation, using UVA irradiation and riboflavin as a photosensitizer. Initially, we standardized the irradiation light and the time of the reaction that produced the highest income. The HOOU and its reduced product 5-hydroxiisourate were separate, identified and characterized by liquid chromatography coupled to mass spectrometry (LC/MS). We also determine the molar extinction coefficient of HOOU at 308 nm (&#949;308 = 6537 &#177; 377 M-1.cm-1). The half-life of the compound was 41 min at 22&#176;C. The HOOU selectively oxidized methionine and glutathione. The reaction of HOOU with glutathione did not form any stable adducts. Thus, all consumed glutathione generated glutathione disulfide. When incubated with PDI (10 &#181;M), 70 and 100% of the total amount of HOOU (3 &#181;M) was consumed within 30 and 120 seconds, respectively. Besides, the PDI (23 &#181;M) had its thiol groups oxidized after incubation with 140 &#181;M HOOU for 30 min at 22&#176;C. The HOOU oxidized the cysteine residues from the catalytical sites of PDI with a second order rate constant of 1.5 &#177; 0.04 x 103 M-1.s-1. This result suggests a favorable interaction of HOOU with this protein in the biological system, as well as a possible modulatory role of HOOU on the PDI-Nox pathway. Interestingly, urate increased superoxide production and oxygen consumption by neutrophil-like cells (differentiated HL-60 cells). This effect could be mediated by the formation of HOOU during the neutrophil oxidative burst, followed by the oxidation of PDI, a positive regulation of Nox and an increase in superoxide production.

A nefropatia diabética (ND) é uma das complicações microvasculares do diabetes e consiste no dano ao parênquima renal por consequência de uma série de fatores hemodinâmicos e moleculares. A ocorrência de ND e de outras complicações mesmo em indivíduos sob adequado controle glicêmico tem sido associada a um fenômeno conhecido como memória metabólica. Neste trabalho foram investigadas vias bioquímicas e moleculares persistentemente alteradas no rim de animais diabéticos tratados após um período inicial de hiperglicemia, com o propósito de entender os mecanismos envolvidos na memória metabólica. Para tanto, ratos com diabetes induzida por estreptozotocina foram mantidos hiperglicêmicos durante 4 semanas (período curto) ou 12 semanas (período longo) e posteriormente tratados com insulina isoladamente ou combinada com metformina (100mg/kg/dia) durante as 4 (período curto) ou 12 (período longo) semanas seguintes. Todos os animais tratados tiveram os seus níveis glicêmicos e função renal normalizados. Os tratamentos também foram capazes de normalizar os níveis elevados de malonaldeído no rim, bem como a excreção aumentada dos adutos de DNA 8-oxo-2\'-desoxiguanosina (8-oxodG) e N2-carboxietil-2\'- desoxiguanosina (CEdG) na urina observados nos animais diabéticos. Níveis aumentados de 8-oxodG foram detectados em DNA mitocondrial (mtDNA), mas não em DNA nuclear, de animais diabéticos apenas no período curto de estudo e também foram normalizados após o controle glicêmico. Nós identificamos uma via gradualmente alterada durante o curso do diabetes que permanece persistentemente alterada após o controle glicêmico tardio. Essa via compreende um declínio precoce do clearance de ácido úrico e expressão da pAMPK, seguida pelo acúmulo de fumarato, expressão aumentada de TGF-&#946;, expressão reduzida de PGC-1&#945; e redução da metilação e hidroximetilação do mtDNA. A redução persistente do clearance de ácido úrico em animais diabéticos tratados pode sustentar as alterações bioquímicas renais prolongadas observadas após o controle glicêmico, e essa regulação é provavelmente mediada pela redução sustentada da expressão de pAMPK e pela indução de inflamação. Este trabalho propõe a primeira consideração do possível papel da hiperuricemia e das alterações bioquímicas subjacentes como parte da memória metabólica na nefropatia diabética. / Diabetic nephropathy is one of the diabetes microvascular complications, and it consists on the damage to the renal parenchyma due to several hemodynamic and molecular factors. The occurrence of diabetic nephropathy and other complications even in those individuals under tight glycemic control has been associated to a phenomenon known as metabolic memory. Here we investigated biochemical and molecular pathways persistently altered in the kidney of diabetic animals treated after a previous period of hyperglycemia, aiming to understand underlying mechanisms in metabolic memory. Streptozotocin-induced diabetic rats were maintained hyperglycemic during 4 (short period) or 12 weeks (long period), and then they were treated with insulin alone or combined with metformin (100 mg/kg/day) for the following 4 or 12 weeks, respectively. All the treated animals had them glycemic levels and renal function normalized. The treatments were also able to control enhanced kidney malondialdehyde levels, as well as the increased urine excretion of the DNA adducts 8-oxo-2\'- deoxyguanosine (8-oxodG) and N2-carboxyethyl-2\'-deoxyguanosine seen in diabetic animals. Increased levels of 8-oxodG were detected in mitochondrial DNA, but not in nuclear DNA of diabetic animals in the short period, and were also recovered after glycemic control. We have identified a kidney pathway that is gradually altered during the course of diabetes and remains persistently changed after late glycemic control. This pathway comprises an early decline of uric acid clearance and pAMPK expression followed by fumarate accumulation, increased TGF-&#946; expression, reduced PGC-1&#945; expression, and downregulation of methylation and hydroxymethylation of mitochondrial DNA. The sustained decrease of uric acid clearance in treated diabetes may support the prolonged kidney biochemical alterations observed after tight glycemic control, and this regulation is likely mediated by the sustained decrease of AMPK activity and the induction of inflammation. This work proposes the first consideration of the possible role of hyperuricemia and the underlying biochemical changes as part of metabolic memory in diabetic nephropathy.

O hidroperóxido de urato (HOOU) é o produto da oxidação do ácido úrico por peroxidases. Sua produção é favorecida durante a inflamação e hiperuricemia, uma vez que há grande quantidade de ácido úrico, peroxidases inflamatórias e superóxido. Neste sentido, o objetivo deste estudo foi avaliar o efeito do hidroperóxido de urato sobre proteínas sensíveis à modulação redox em um ambiente inflamatório asséptico e outro que imita infecção. Assim, nesta tese comparou-se a estrutura química do HOOU obtido fotoquimicamente daquele obtido através da catálise enzimática pela mieloperoxidase. A obtenção do HOOU por foto-oxidação permitiu o melhor isolamento do composto. Este oxidante foi capaz de reagir especificamente com os aminoácidos contendo enxofre (metionina e cisteína). Neste sentido, foi investigada sua reatividade com tiol-peroxidases detoxificadoras de peróxido, a peroxiredoxina 1 e 2 (Prx1 e Prx2). O HOOU apresentou cinética rápida de reação com a Prx1, k = 4,9 × 105 M-1s-1 e Prx2, k = 2,3 × 106 M-1s-1, o que as torna um provável alvo celular, além disso, foi capaz de oxidar a Prx2 de eritrócitos humanos, mostrando ser capaz de atravessar a membrana plasmática. Além das Prxs, a albumina do soro também desempenha papel importante na homeostase redox. O HOOU foi capaz de oxidar a albumina com constante de velocidade de 0,2 × 102 M-1s- 1. Outra tiol-proteína com importante função na homeostase e sinalização redox é a tioredoxina (Trx). A Trx foi oxidada pelo HOOU com constante de reação de 2,8 × 102 M-1s-1 e foi liberada juntamente com a Prx1 e Prx2 das células de macrófagos humanos (linhagem THP-1) quando estas células foram incubadas com HOOU. A liberação dessas proteínas é reconhecidamente um sinal de estresse celular. Assim o HOOU pode estar envolvido na exacerbação do estresse oxidativo em ambiente inflamatório. Quando neutrófilos (linhagem HL- 60) e macrófagos humanos (linhagem THP-1) foram incubados na presença de ácido úrico e Pseudomonas aeruginosa houve uma diminuição na produção de ácido hipocloroso (HOCl). Isto se deveu à competição entre ácido úrico e cloreto pela mieloperoxidase e resultou em menor atividade microbicida pelas células, demonstrando que a formação do HOOU não contribui e, ao contrário, prejudica a atividade microbicida das células inflamatórias. Dessa forma, a oxidação do ácido úrico e formação do hidroperóxido de urato tanto altera a atividade microbicida das células inflamtárias, quanto leva à oxidação de tiósproteínas importantes para manutenção da homeostase redox. Assim, o HOOU pode ser o responsável pelos efeitos pró-oxidantes e pró-inflamatórios do ácido úrico solúvel, e isso indica que o papel antioxidante do ácido úrico deve ser revisto em situações de inflamação. / Urate hydroperoxide (HOOU) is the product of the oxidation of uric acid by peroxidases. The formation of HOOU is favored during inflammation and in hyperuricemia, where there is plenty amount of uric acid, inflammatory peroxidases and superoxide. Therefore, the aim of the present study was to evaluate the effect of urate hydroperoxide on redox sensitive proteins in an inflammatory environment and another that mimics infection. In this thesis the chemical structure of the HOOU produced by photo-oxidation was compared to that obtained by myeloperoxidase catalysis. The chemical production of HOOU allowed a better purification of the compound. This oxidant was able to specifically react with sulfur containing amino acids (methionine and cysteine). In this sense, its reactivity with peroxiredoxins (Prx1 and Prx2) was investigated. HOOU reacted fast with Prx1 k = 4.9 × 105 M-1s-1 and Prx2 k = 2.3 × 106 M-1s-1. In addition, HOOU was able to oxidize Prx2 from intact erythrocytes at the same extend as does hydrogen peroxide. Albumin is an important thiol-containing protein to redox homeostasis in plasma. HOOU was able to oxidize albumin with a rate constant of 0.2 × 102 M-1s-1. Another protein with important function in redox homeostasis is thioredoxin (Trx). Trx was oxidized by HOOU with a rate constant of 2.8 × 102 M-1s-1 and was released together with Prx1 and Prx2 from human macrophages cells (THP-1 cell line) that were incubated with HOOU. The release of these proteins is a signal of cellular stress. Thus, HOOU may be involved in the exacerbation of oxidative stress in inflammatory environments. When neutrophil (HL-60 cell line) and macrophages (THP-1 cell line) were incubated with uric acid and Pseudomonas aeruginosa there was a decrease in hypochlorous acid (HOCl) production because of the competition between chloride and uric acid by myeloperoxidase. It decreased HOCl and impaired the microbicidal activity of the cells, showing that HOOU does not contribute in bacteria clearance. Therefore, the oxidation of uric acid to urate hydroperoxide impairs microbicidal activity and oxidizes thiol-proteins in inflammatory cells contributing to a pro-oxidant status. In this context, the antioxidant role of uric acid in inflammatory response should be reviwed.

O hidroperóxido de urato (HOOU) é o produto da oxidação do ácido úrico por peroxidases. Sua produção é favorecida durante a inflamação e hiperuricemia, uma vez que há grande quantidade de ácido úrico, peroxidases inflamatórias e superóxido. Neste sentido, o objetivo deste estudo foi avaliar o efeito do hidroperóxido de urato sobre proteínas sensíveis à modulação redox em um ambiente inflamatório asséptico e outro que imita infecção. Assim, nesta tese comparou-se a estrutura química do HOOU obtido fotoquimicamente daquele obtido através da catálise enzimática pela mieloperoxidase. A obtenção do HOOU por foto-oxidação permitiu o melhor isolamento do composto. Este oxidante foi capaz de reagir especificamente com os aminoácidos contendo enxofre (metionina e cisteína). Neste sentido, foi investigada sua reatividade com tiol-peroxidases detoxificadoras de peróxido, a peroxiredoxina 1 e 2 (Prx1 e Prx2). O HOOU apresentou cinética rápida de reação com a Prx1, k = 4,9 × 105 M-1s-1 e Prx2, k = 2,3 × 106 M-1s-1, o que as torna um provável alvo celular, além disso, foi capaz de oxidar a Prx2 de eritrócitos humanos, mostrando ser capaz de atravessar a membrana plasmática. Além das Prxs, a albumina do soro também desempenha papel importante na homeostase redox. O HOOU foi capaz de oxidar a albumina com constante de velocidade de 0,2 × 102 M-1s- 1. Outra tiol-proteína com importante função na homeostase e sinalização redox é a tioredoxina (Trx). A Trx foi oxidada pelo HOOU com constante de reação de 2,8 × 102 M-1s-1 e foi liberada juntamente com a Prx1 e Prx2 das células de macrófagos humanos (linhagem THP-1) quando estas células foram incubadas com HOOU. A liberação dessas proteínas é reconhecidamente um sinal de estresse celular. Assim o HOOU pode estar envolvido na exacerbação do estresse oxidativo em ambiente inflamatório. Quando neutrófilos (linhagem HL- 60) e macrófagos humanos (linhagem THP-1) foram incubados na presença de ácido úrico e Pseudomonas aeruginosa houve uma diminuição na produção de ácido hipocloroso (HOCl). Isto se deveu à competição entre ácido úrico e cloreto pela mieloperoxidase e resultou em menor atividade microbicida pelas células, demonstrando que a formação do HOOU não contribui e, ao contrário, prejudica a atividade microbicida das células inflamatórias. Dessa forma, a oxidação do ácido úrico e formação do hidroperóxido de urato tanto altera a atividade microbicida das células inflamtárias, quanto leva à oxidação de tiósproteínas importantes para manutenção da homeostase redox. Assim, o HOOU pode ser o responsável pelos efeitos pró-oxidantes e pró-inflamatórios do ácido úrico solúvel, e isso indica que o papel antioxidante do ácido úrico deve ser revisto em situações de inflamação. / Urate hydroperoxide (HOOU) is the product of the oxidation of uric acid by peroxidases. The formation of HOOU is favored during inflammation and in hyperuricemia, where there is plenty amount of uric acid, inflammatory peroxidases and superoxide. Therefore, the aim of the present study was to evaluate the effect of urate hydroperoxide on redox sensitive proteins in an inflammatory environment and another that mimics infection. In this thesis the chemical structure of the HOOU produced by photo-oxidation was compared to that obtained by myeloperoxidase catalysis. The chemical production of HOOU allowed a better purification of the compound. This oxidant was able to specifically react with sulfur containing amino acids (methionine and cysteine). In this sense, its reactivity with peroxiredoxins (Prx1 and Prx2) was investigated. HOOU reacted fast with Prx1 k = 4.9 × 105 M-1s-1 and Prx2 k = 2.3 × 106 M-1s-1. In addition, HOOU was able to oxidize Prx2 from intact erythrocytes at the same extend as does hydrogen peroxide. Albumin is an important thiol-containing protein to redox homeostasis in plasma. HOOU was able to oxidize albumin with a rate constant of 0.2 × 102 M-1s-1. Another protein with important function in redox homeostasis is thioredoxin (Trx). Trx was oxidized by HOOU with a rate constant of 2.8 × 102 M-1s-1 and was released together with Prx1 and Prx2 from human macrophages cells (THP-1 cell line) that were incubated with HOOU. The release of these proteins is a signal of cellular stress. Thus, HOOU may be involved in the exacerbation of oxidative stress in inflammatory environments. When neutrophil (HL-60 cell line) and macrophages (THP-1 cell line) were incubated with uric acid and Pseudomonas aeruginosa there was a decrease in hypochlorous acid (HOCl) production because of the competition between chloride and uric acid by myeloperoxidase. It decreased HOCl and impaired the microbicidal activity of the cells, showing that HOOU does not contribute in bacteria clearance. Therefore, the oxidation of uric acid to urate hydroperoxide impairs microbicidal activity and oxidizes thiol-proteins in inflammatory cells contributing to a pro-oxidant status. In this context, the antioxidant role of uric acid in inflammatory response should be reviwed.

A nefropatia diabética (ND) é uma das complicações microvasculares do diabetes e consiste no dano ao parênquima renal por consequência de uma série de fatores hemodinâmicos e moleculares. A ocorrência de ND e de outras complicações mesmo em indivíduos sob adequado controle glicêmico tem sido associada a um fenômeno conhecido como memória metabólica. Neste trabalho foram investigadas vias bioquímicas e moleculares persistentemente alteradas no rim de animais diabéticos tratados após um período inicial de hiperglicemia, com o propósito de entender os mecanismos envolvidos na memória metabólica. Para tanto, ratos com diabetes induzida por estreptozotocina foram mantidos hiperglicêmicos durante 4 semanas (período curto) ou 12 semanas (período longo) e posteriormente tratados com insulina isoladamente ou combinada com metformina (100mg/kg/dia) durante as 4 (período curto) ou 12 (período longo) semanas seguintes. Todos os animais tratados tiveram os seus níveis glicêmicos e função renal normalizados. Os tratamentos também foram capazes de normalizar os níveis elevados de malonaldeído no rim, bem como a excreção aumentada dos adutos de DNA 8-oxo-2\'-desoxiguanosina (8-oxodG) e N2-carboxietil-2\'- desoxiguanosina (CEdG) na urina observados nos animais diabéticos. Níveis aumentados de 8-oxodG foram detectados em DNA mitocondrial (mtDNA), mas não em DNA nuclear, de animais diabéticos apenas no período curto de estudo e também foram normalizados após o controle glicêmico. Nós identificamos uma via gradualmente alterada durante o curso do diabetes que permanece persistentemente alterada após o controle glicêmico tardio. Essa via compreende um declínio precoce do clearance de ácido úrico e expressão da pAMPK, seguida pelo acúmulo de fumarato, expressão aumentada de TGF-&#946;, expressão reduzida de PGC-1&#945; e redução da metilação e hidroximetilação do mtDNA. A redução persistente do clearance de ácido úrico em animais diabéticos tratados pode sustentar as alterações bioquímicas renais prolongadas observadas após o controle glicêmico, e essa regulação é provavelmente mediada pela redução sustentada da expressão de pAMPK e pela indução de inflamação. Este trabalho propõe a primeira consideração do possível papel da hiperuricemia e das alterações bioquímicas subjacentes como parte da memória metabólica na nefropatia diabética. / Diabetic nephropathy is one of the diabetes microvascular complications, and it consists on the damage to the renal parenchyma due to several hemodynamic and molecular factors. The occurrence of diabetic nephropathy and other complications even in those individuals under tight glycemic control has been associated to a phenomenon known as metabolic memory. Here we investigated biochemical and molecular pathways persistently altered in the kidney of diabetic animals treated after a previous period of hyperglycemia, aiming to understand underlying mechanisms in metabolic memory. Streptozotocin-induced diabetic rats were maintained hyperglycemic during 4 (short period) or 12 weeks (long period), and then they were treated with insulin alone or combined with metformin (100 mg/kg/day) for the following 4 or 12 weeks, respectively. All the treated animals had them glycemic levels and renal function normalized. The treatments were also able to control enhanced kidney malondialdehyde levels, as well as the increased urine excretion of the DNA adducts 8-oxo-2\'- deoxyguanosine (8-oxodG) and N2-carboxyethyl-2\'-deoxyguanosine seen in diabetic animals. Increased levels of 8-oxodG were detected in mitochondrial DNA, but not in nuclear DNA of diabetic animals in the short period, and were also recovered after glycemic control. We have identified a kidney pathway that is gradually altered during the course of diabetes and remains persistently changed after late glycemic control. This pathway comprises an early decline of uric acid clearance and pAMPK expression followed by fumarate accumulation, increased TGF-&#946; expression, reduced PGC-1&#945; expression, and downregulation of methylation and hydroxymethylation of mitochondrial DNA. The sustained decrease of uric acid clearance in treated diabetes may support the prolonged kidney biochemical alterations observed after tight glycemic control, and this regulation is likely mediated by the sustained decrease of AMPK activity and the induction of inflammation. This work proposes the first consideration of the possible role of hyperuricemia and the underlying biochemical changes as part of metabolic memory in diabetic nephropathy.