Les peptides pénétrants (CPP) se caractérisent par deux propriétés : ils pénètrent dans l'espace intracellulaire et favorisent l'internalisation de cargaisons moléculaires auxquelles ils sont associés. Si les CPP sont très utilisés comme vecteurs en recherche fondamentale, la méconnaissance des mécanismes de pénétration et de leurs distributions intracellulaires limite leur utilisation thérapeutique. Il est admis que les CPP et leurs cargaisons sont internalisés par transport actif (endocytose) et par transport passif (translocation directe). J'ai étudié la translocation directe à l'échelle moléculaire en utilisant des membranes modèles. Les CPP usuels sont internalisés et permettent l'accumulation de cargaisons dans des vésicules unilamellaires. J'ai alors démontré que la translocation directe se déroule via la formation de complexes neutres et hydrophobes CPP-phospholipides.La pénétration intracellulaire des CPP est le plus souvent étudiée par microscopie confocale. J'ai démontré que des fortes concentrations locales de CPP induit une auto-inhibition de leur fluorophore. Cet artefact a conduit à des erreurs d'interprétation dans la littérature quant à la localisation des CPP. Un protocole permettant de révéler la fluorescence éteinte a été proposé et conduit à réévaluer la localisation subcellulaire des CPP ainsi que l'importance relative des mécanismes d'internalisation.Ces résultats ont permis de développer rationnellement de nouveaux vecteurs pénétrants : les oligoarginines acylées par des chaînes grasses dont des insaturations sont de stéréochimie cis. Leur internalisation passive particulièrement importante conduit à la libération de la cargaison dans le cytosol. / Cell penetrating peptides (CPPs) are short cationic sequences capable of shuttling bioactive cargoes into eukaryotic cells. If CPPs are common delivery tools in basic research, their therapeutic use is currently limited because their internalization mechanisms and intracellular distributions remain to be elucidated. In living cells there is evidence for both endocytosis of the CPPs and for “direct translocation”, an energy-independent uptake pathway. I analyzed the direct translocation phenomenon at the molecular level with model membranes. CPPs are internalized into large unilamellar vesicles and trigger the internalization of various cargoes. I then demonstrated that direct translocation occurs through membranes via the formation of a neutral and hydrophobic CPP-anionic phospholipids complex. CPPs internalization is mostly analyzed by confocal microscopy. I demonstrated that fluorescence self-quenching occurs if fluorescently labeled CPPs are locally too concentrated. This severe artifact led to misinterpretation of the subcellular distribution of CPPs. I developed a reliable procedure to avoid this artifact and ranked subcellular regions of living cells depending on their CPP concentration. As a result, I was able to rationalize the subcellular distribution of CPPs and to deduce their penetration mechanisms. The studies that I performed provided valuable information that I used to design a new family of delivery vectors: minimalist oligoarginines peptides acylated by unsaturated fatty acids (cis unsaturations). The direct translocation of these lipopeptides is particularly important yielding to an efficient delivery of a cargo inside the cytosol of living cells.

Les vésicules hybrides polymère/lipides sont des structures récemment développées dans la littérature. Idéalement, celles-ci peuvent présenter la biocompatibilité et la biofonctionnalité des liposomes, ainsi que la robustesse, la faible perméabilité et la versatilité de fonctionnalisation chimique conférées par les chaînes de copolymères. Cependant, à ce jour, les facteurs régissant la séparation des phases dans ces membranes hybrides ne sont pas bien compris. Dans ce travail, nous avons étudié en détail la formation et la séparation de phases dans les membranes de vésicules géantes (GHUVs) et de taille nanométriques(100nm) (LHUVs) constituées de phospholipides en phase fluide ou gel et de copolymères à base de poly (diméthylsiloxane) et de poly (éthylène glycol). Différentes architectures(greffée, tribloc) et masses molaires ont été utilisées. La séparation de phase a été étudiée sur les vésicules géantes à l’échelle micrométrique et nanométrique respectivement par microscopie confocale et imagerie de fluorescence résolue en temps (FLIM), tandis que pour les LHUVs, différentes techniques comme la diffusion de neutrons, la Cryo-microscopie et la spectroscopie de fluorescence résolue dans le temps ont été combinées. Nous avons pu montrer que la fraction lipide/polymère, l'état physique du lipide et la tension de la ligne aux interfaces lipide/polymère modulable par la masse molaire et l'architecture du copolymère sont les facteurs importants régissant la formation et la structuration des vésicules hybrides. Enfin, nous avons montré que les propriétés élastiques de la membrane peuvent être modulées via la composition polymère lipide. / Hybrid copolymer/lipid vesicle are recently developed self-assembled structures that could present biocompatibility and biofunctionality of liposomes, as well as robustness, low permeability and functionality variability conferred by the copolymer chains. However, to date, physical and molecular parameters governing copolymer/lipid phase separation in these hybrid membranes are not well understood. In this work, we studied in detail the formation and phase separation in the membranes of both Giant Unilamellar Hybrid Vesicles(GHUVs) and Large Unilamellar Hybrid Vesicles (LHUVs) obtained from the mixture of phospholipids in the fluid (liquid disordered) or gel state (solid ordered) with various copolymers based on poly(dimethylsiloxane) (PDMS) and poly(ethylene glycol) (PEO) with different architectures (grafted, triblock) and molar masses. For GHUVs, phase separation at the micron scale and nanoscale was evaluated through confocal microscopy, and Fluorescence lifetime imaging microscopy technique (FLIM) respectively, where as acombination of Small angle neutron scattering (SANS), Cryo-transmission electron microscopy (Cryo-TEM) and Time-resolved Förster resonance energy transfer (TR-FRET) techniques was used for LHUVs. We demonstrate that the lipid/polymer fraction, lipid physical state, and the line tension at lipid polymer/lipid boundaries which can be finely modulated by the molar mass and architecture of the copolymer are important factors that govern the formation and structuration of hybrid vesicles. We also evidence that elasticity ofthe hybrid membrane can be modulated via the lipid polymer composition, through the use of micropipettes techniques.

Le psoriasis est une maladie de peau auto-immune et chronique. Le rhumatisme psoriasique est une de ses principales complications qui est très invalidante pour les patients. Cette pathologie reste encore incurable à ce jour. L'usage des médicaments disponibles actuellement dans le psoriasis est limité par leurs effets secondaires dépendant de la dose et de la durée d'utilisation. Le but de ce travail était de développer des nanovecteurs médicamenteux à base de lipides pour un usage topique, en particulier ciblant l'épiderme viable qui est le site principal de la physiopathologie du psoriasis, mais aussi le derme et au-delà pour atteindre les articulations endommagées. Grâce à une nouvelle technique que nous avons développé et optimisé, le double déplacement de solvants, basée sur une organisation des phospholipides en deux temps, nous avons préparé des vésicules lipidiques encapsulant du diclofénac d'une part et de la ciclosporine A 'autre part. Ensuite, nous avons évalué leur aptitude à traverser la peau et cibler les régions d'intérêt. Après une étude systématique permettant d'optimiser les paramètres de préparation, les vésicules lipidiques encapsulant le diclofénac et la cyclosporine A ont montré une efficacité d'encapsulation (EE%) comprise entre 50% et 90% respectivement, selon la concentration en phospholipides. Après réalisation des études in vitro sur peau de cochon, nous avons observé que la formulation contenant une concentration basse en phospholipides (8,5 mg / mL) permettait d'encapsuler plus de 80% du diclofénac et de cibler le derme et au-delà. La formulation de vésicules lipidiques chargées de cyclosporine A qui encapsule la quantité la plus élevée (environ 80%) était également celle contenant la concentration basse de phospholipides. Contrairement au diclofénac, cette formulation n'était pas la meilleure pour cibler une couche profonde de la peau comme l'épiderme viable, alors que c'était le cas pour la formulation avec une concentration élevée de phospholipides (15 mg / mL), bien que l'EE% était d'environ 55%. Le double déplacement de solvant est une technique très prometteuse de préparation de vésicules lipidiques, capable de produire une population monodisperse d'échelle nanométrique. Cette méthode n'est que légèrement impactée lors d'une transposition d'échelle et serait donc facile à mettre en oeuvre à l'échelle industrielle. Cette méthode a été conçue dès le début pour utiliser des solvants favorisant la pénétration cutanée mais l'étendue de ces applications reste à explorer / Psoriasis is an auto-immune and chronic skin disease. Psoriatic arthritis is the main complication which is very disabling for patients. This pathology still remains incurable to date. The currently psoriasis indicated medicines use is limited by their side effects which are dose and use duration dependent. The aim of this work was to develop lipid based nanocarriers for skin targeting, especially the viable epidermis which is the main site of psoriasis physiopathology but also the dermis and beyond in order to reach the damaged articulations. Thanks to a new technique we developed and optimized called the double solvent displacement, based on a two-step phospholipid organization, we prepared diclofenac and cyclosporine A loaded lipid vesicles. Then, we evaluated their potential to cross the skin and target the skin layers of interest. After a systematic study to optimize preparation parameters, diclofenac and cyclosporine A loaded lipid vesicles displayed an encapsulation efficiency (EE %) between 50% and 90% respectively, according to the phospholipid concentration. After in vitro skin studies, we observed that the formulation containing the lower phospholipid concentration (8.5 mg/mL) allowed to encapsulate more than 80% of diclofenac and also to target the dermis and beyond. The formulation of cyclosporine A loaded lipid vesicles which encapsulates the higher amount (around 80%) is also the one containing the lower phospholipid concentration. Unlike to diclofenac, this formulation was not the better to target the viable epidermis whereas the formulation with the higher phospholipid concentration (15 mg/mL) was even though the EE% was of around 55%. The double solvent displacement is a very promising technique of lipid vesicle preparation, capable to produce monodisperse population of nanoscale carriers. This method is hardly impacted during scale-up and would be easy to implement at an industrial scale. This method was designed from the beginning to use skin penetration enhancer solvents but the scope of its applications still remains to be explored

Les vésicules sont des bicouches fermées de molécules tensioactives, remplies de liquide, à l'intérieur d'un autre liquide. Leur taille peut être comprise entre dix et 100 microns : elles sont alors dites géantes. Nous nous intéressons à la dynamique de deux de ces objets dans un cisaillement simple, c'est à dire l'écoulement d'un liquide situé entre deux plaques planes se translatant l'une par rapport à l'autre à vitesse et distance constante. Nous commençons par une étude asymptotique, pour des vésicules quasi-sphériques en interaction lointaine. Nous utilisons ensuite un code de calcul basé sur la méthode des éléments de frontière pour étudier le cas de vésicules moins sphériques et plus proches, et comparons les résultats obtenus avec des expériences. Nous présentons enfin comment cette étude peut être utilisée pour prédire certaines propriétés de diffusion d'une suspension de vésicules, dans le régime semi-dilué, où seul le détail des interactions à deux corps est considéré.

Blood is a complex suspension of deformable particles, red blood cells, which exhibits a sophisticated dynamics when flowing in the microvasculature. Most of these complex phenomena, non-linear rheology, structuration of the suspension, heterogeneities of the hematocrit distribution, are directly connected to the rich microscopic dynamics of individual red blood cells, and their hydrodynamics interactions. We investigate a few aspects of the dynamics of red blood cells and giant vesicles - a simple model for RBCs. A study on the dynamics of very deflated vesicles, with shapes similar to those of red blood cells, shows that these objects which haven't received a lot of attention so far can exhibit richer than expected dynamics. We then mainly focus on the still unexplored problem of hydrodynamic interactions between vesicles or red blood cells and their consequences at the scale of the suspension. An experimental study of the interaction of two identical vesicles in shear flow shows that there is a net repulsion between the cells that leads to an increase of the distance between vesicles in a suspension. Scaling arguments are proposed for this interaction and a comparison with numerical results is performed and a quantitative estimation of a shear induced diffusion coefficient obtained by averaging the results for pair interactions is found. Finally, we investigate the diffusion of a cloud of red blood cells in Poiseuille flow in order to directly determine diffusion coefficients. The experiment shows that the cloud widens when traveling along the channel with a power law behaviour indicating sub-diffusion. This effect is confirmed by a theoretical analysis of a few limit cases. / Blood is a complex suspension of deformable particles, red blood cells, which exhibits a sophisticated dynamics when flowing in the microvasculature. Most of these complex phenomena, non-linear rheology, structuration of the suspension, heterogeneities of the hematocrit distribution, are directly connected to the rich microscopic dynamics of individual red blood cells, and their hydrodynamics interactions. We investigate a few aspects of the dynamics of red blood cells and giant vesicles - a simple model for RBCs. A study on the dynamics of very deflated vesicles, with shapes similar to those of red blood cells, shows that these objects which haven't received a lot of attention so far can exhibit richer than expected dynamics. We then mainly focus on the still unexplored problem of hydrodynamic interactions between vesicles or red blood cells and their consequences at the scale of the suspension. An experimental study of the interaction of two identical vesicles in shear flow shows that there is a net repulsion between the cells that leads to an increase of the distance between vesicles in a suspension. Scaling arguments are proposed for this interaction and a comparison with numerical results is performed and a quantitative estimation of a shear induced diffusion coefficient obtained by averaging the results for pair interactions is found. Finally, we investigate the diffusion of a cloud of red blood cells in Poiseuille flow in order to directly determine diffusion coefficients. The experiment shows that the cloud widens when traveling along the channel with a power law behaviour indicating sub-diffusion. This effect is confirmed by a theoretical analysis of a few limit cases.

Les vésicules sont des bicouches fermées de molécules tensioactives, remplies de liquide, à l'intérieur d'un autre liquide. Leur taille peut être comprise entre dix et 100 microns : elles sont alors dites géantes. Nous nous intéressons à la dynamique de deux de ces objets dans un cisaillement simple, c'est à dire l'écoulement d'un liquide situé entre deux plaques planes se translatant l'une par rapport à l'autre à vitesse et distance constante. Nous commençons par une étude asymptotique, pour des vésicules quasi-sphériques en interaction lointaine. Nous utilisons ensuite un code de calcul basé sur la méthode des éléments de frontière pour étudier le cas de vésicules moins sphériques et plus proches, et comparons les résultats obtenus avec des expériences. Nous présentons enfin comment cette étude peut être utilisée pour prédire certaines propriétés de diffusion d'une suspension de vésicules, dans le régime semi-dilué, où seul le détail des interactions à deux corps est considéré. / Vesicles are closed bilayers of tensioactive molecules, filled with liquid, inside another liquid. Their size can be between 10 and 100 microns : in this case, they are called giant vesicles. We study the dynamic of two of these objects in a simple shear flow, which is the one of a liquid sheared between two walls translating with respect to each other at a constant speed and distance. We begin by an asymptotic study, for quasispherical vesicles in the far field interacting regime. We then use a numerical code based on the boundary element method to study the case of less spherical and closer vesicles, and compare our results with experiments. We finish by presenting how this study can be used to predict some diffusing properties of a sheared suspension of vesicles, in the semidilute regime, where only the details of two body interactions are considered.

Les vésicules sont gouttes de rayon de quelques dizaines de micromètres, limitées par une membrane lipidique imperméable d'environ 4 nm d'épaisseur, et immergées dans un fluide visqueux externe. Les propriétés spécifiques de la membrane de la vésicule rendent le système très déformable et très contraint dans le même temps. Les vésicules représentent également un modèle simplifié intéressant pour les globules rouges, car ils partagent aussi certains comportements mécaniques similaires.Ce manuscrit s’intéresse à la modélisation d'une vésicule soumise à des contraintes externes d'origine hydrodynamique, dans le régime Stokes et dans des domaines confinés. À partir d'un modèle BEM déjà existant pour des fluides infinis, des méthodes numériques originales sont développés pour faire face au calcul des interactions entre la membrane de la vésicule et les frontières solides. Une attention particulière est accordée à la situation d'une vésicule qui sédimente vers un mur horizontal et une vésicule soumise à un écoulement de Poiseuille dans un capillaire étroit. / Vesicles are drops of radius of a few tens micrometers, bounded by an impermeable lipid membrane of approximately 4 nm thickness, and embedded in an external viscous fluid. The specific properties of the vesicle membrane make the system very deformable and very constrained at the same time. Vesicles represent also an interesting simplified model for red blood cells, since they also share some similar mechanical behaviours.This manuscript deals with the modeling of a vesicle subjected to external stresses of hydrodynamical origin, in the Stokes regime and in confined domains. Starting from an existing BEM model for free space flows, original numerical methods are developed to deal with the computation of interactions between the vesicle membrane and solid boundaries. A particular attention is paid to the situation of a vesicle sedimenting towards a planar wall and a vesicle submitted to a Poiseuille flow in a narrow capillary.

Salmonella enterica sérovar Typhi est une bactérie à Gram négatif qui cause la maladie systémique nommée fièvre typhoïde. Cette maladie affecte environ 9 millions de personnes par année et se propage par la voie fécale-orale par ingestion d’aliments ou d’eau contaminés. Ainsi, la fièvre typhoïde est particulièrement problématique dans les pays ayant des systèmes d’assainissement peu efficaces. Elle peut être traitée par des antibiotiques, mais comme pour de nombreuses bactéries, la résistance est de plus en plus commune. À la suite d’une infection aiguë, environ 5% des patients deviennent porteurs chroniques asymptomatiques grâce à la formation de biofilms dans la vésicule biliaire et excrètent la bactérie dans leurs selles continuellement. Étant le seul réservoir connu de S. Typhi, cet état constitue une source importante de persistance et de propagation de la maladie. L’état de porteur est intraitable par antibiotiques en raison de la haute tolérance aux stress des biofilms et une chirurgie pour enlever la vésicule biliaire est souvent la solution la plus efficace. Il est connu que les biofilms de Salmonella contiennent principalement de la cellulose, des fimbriae curli, de l'acide colanique et des protéines BapA. Cependant, S. Typhi a accumulé de nombreux pseudogènes au cours de son évolution humain-spécifique, dont certains sont impliqués dans la biosynthèse de composants communs de biofilm chez Salmonella, comme la cellulose et l'acide colanique. Il est également proposé que l'expression de curli soit dysfonctionnelle chez S. Typhi. La production de biofilms chez cette souche n'a jamais été caractérisée dans des conditions in vitro optimisées. Par conséquent, nous supposons que les biofilms de S. Typhi soient uniques dans leur production et leur composition. Cette étude caractérise la composition et la structure d’un biofilm de S. Typhi in vitro. Nous déterminons qu’aucun composant de biofilm communément identifié chez Salmonella ne joue un rôle majeur dans les biofilms de S. Typhi. Nous identifions un rôle important pour l’ADN extracellulaire et l’intégrité des LPS. / Salmonella enterica serovar Typhi is a Gram-negative rod-shaped bacterium that causes the systemic disease of typhoid fever. This disease affects about 9 million people per year and is spread through the fecal-oral route by ingestion of contaminated food or water. Thus, typhoid fever is particularly problematic in countries with poor sanitation systems. It is currently treatable by antibiotics but as with many other bacteria, resistance is becoming more and more common. Following acute infection, ~5% of patients become chronic asymptomatic carriers through biofilm formation in the gallbladder and continuously shed the bacteria in their feces. Being the only known reservoir of S. Typhi, this is an important source of persistence of the disease in endemic areas and propagation to new areas. The carrier state is untreatable by antibiotics due to the high stress tolerance of biofilms. Gallbladder-removal surgery is often the most efficient solution. Salmonella biofilms are known to primarily contain cellulose, curli fimbriae, colanic acid and BapA proteins. However, S. Typhi evolved to be human-specific over time and has accumulated many pseudogenes in the process, some of which are genes in the biosynthetic pathways of biofilm-related components of Salmonella, such as cellulose and colanic acid. It is also proposed that curli expression is dysfunctional in S. Typhi. Biofilm production in this strain has never been characterized in optimized in vitro conditions. Therefore, we hypothesized that S. Typhi biofilms are unique in their production and composition. This study characterizes S. Typhi biofilm composition and structure in vitro. We determine that no biofilm components commonly identified in other bacteria play a major role in S. Typhi biofilms. We identify an important role for extracellular DNA and lipopolysaccharide-layer integrity.

La rétinogésèse des vertébrés est la culmination de processus biologiques complexes parfaitement exécutés. Cette délicate orchestration est principalement contrôlée par les facteurs de transcription qui permettent aux progéniteurs rétiniens de proliférer, de s’auto-renouveler et de se différencier de façon appropriée. Les facteurs de transcription à homéodomaine sont les protéines qui sont responsables de la démarcation du site du primordium optique et participeront même à la différenciation tardive des différents types cellulaires de la rétine. Le contrôle génétique concernant l‘activation de l’expression de facteurs de transcription est peu connu. Nous avons étudié les séquences génomique avoisinant le gène Six6 afin d’identifier et mieux comprendre son promoteur. Des expériences d’immunoprécipitation de chromatine et des essais luciférases ont confirmé la liaison et la transactivation synergique du promoteur potentiel de Six6 par Lhx2 et Pax6 in vitro. Cette présente étude confirme et précise également le rôle de Lhx2 au niveau du développement précoce de l’oeil. La compréhension détaillée des réseaux génétiques régulant les progéniteurs rétiniens à former une rétine fonctionnelle est essentielle. En effet, lorsque ces connaissances seront acquises, nous serons en mesure d’appliquer les thérapies cellulaires pour rétablir les fonctions rétiniennes lors de pathologies dégénératives. / Vertebrate eye developement is the result of multiple perfectly executed biological process. This tight orchestration is principaly controled by transcription factors. Homeobox-containing transcription factors are expressed in the presumptive eye field and are required to initiate eye development and for final retinal cell differenciation. The genetic control of these transcription factors are poorly understood. We analysed Six6’s nearby genomic sequence to caracterise potential promoter regions. Chromatin immunoprecipitations and luciferase assays confirmed the binding and the in vitro synergic trans-activation of Six6 potential promoter by Lhx2 and Pax6. This study also demonstrate the contribution of Lhx2 for the establishment of presumptive retina field at the neural plate stage. The detailed knowledge of genetic networks regulating the formation of a fonctional retina by retinal progenitor is crucial. Indeed, when these mecanisms will be eluciated, we will be able to establish regenerative retinal cell therapy.

La rétinogésèse des vertébrés est la culmination de processus biologiques complexes parfaitement exécutés. Cette délicate orchestration est principalement contrôlée par les facteurs de transcription qui permettent aux progéniteurs rétiniens de proliférer, de s’auto-renouveler et de se différencier de façon appropriée. Les facteurs de transcription à homéodomaine sont les protéines qui sont responsables de la démarcation du site du primordium optique et participeront même à la différenciation tardive des différents types cellulaires de la rétine. Le contrôle génétique concernant l‘activation de l’expression de facteurs de transcription est peu connu. Nous avons étudié les séquences génomique avoisinant le gène Six6 afin d’identifier et mieux comprendre son promoteur. Des expériences d’immunoprécipitation de chromatine et des essais luciférases ont confirmé la liaison et la transactivation synergique du promoteur potentiel de Six6 par Lhx2 et Pax6 in vitro. Cette présente étude confirme et précise également le rôle de Lhx2 au niveau du développement précoce de l’oeil. La compréhension détaillée des réseaux génétiques régulant les progéniteurs rétiniens à former une rétine fonctionnelle est essentielle. En effet, lorsque ces connaissances seront acquises, nous serons en mesure d’appliquer les thérapies cellulaires pour rétablir les fonctions rétiniennes lors de pathologies dégénératives. / Vertebrate eye developement is the result of multiple perfectly executed biological process. This tight orchestration is principaly controled by transcription factors. Homeobox-containing transcription factors are expressed in the presumptive eye field and are required to initiate eye development and for final retinal cell differenciation. The genetic control of these transcription factors are poorly understood. We analysed Six6’s nearby genomic sequence to caracterise potential promoter regions. Chromatin immunoprecipitations and luciferase assays confirmed the binding and the in vitro synergic trans-activation of Six6 potential promoter by Lhx2 and Pax6. This study also demonstrate the contribution of Lhx2 for the establishment of presumptive retina field at the neural plate stage. The detailed knowledge of genetic networks regulating the formation of a fonctional retina by retinal progenitor is crucial. Indeed, when these mecanisms will be eluciated, we will be able to establish regenerative retinal cell therapy.