Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / Calves born persistently infected (PI) with non-cytopathic bovine viral diarrhea virus (ncpBVDV) frequently develop a fatal gastroenteric illness called mucosal disease (MD). From animals affected by MD, both the original virus (ncpBVDV) and an antigenically identical, yet cytopathic virus (cpBVDV) can be isolated. Cytopathic BVDVs are originated from the ncp counterparts by diverse genetic mechanisms, all leading to the expression of the non-structural polypeptide NS3 as a discrete protein. In contrast, ncpBVDVs express only the large precursor polypeptide, NS2-3, which contains the NS3 sequence within its carboxy-terminal half. The investigation of the mechanism leading to NS3 expression in 41 cpBVDV isolates is reported. An RT-PCR strategy was designed to detect insertions within the NS2-3 gene and/or duplication of the NS3 gene two common mechanisms of expression of NS3. RT-PCR amplification revealed insertions in the NS2-3 gene of three cp isolates, being the inserts similar in size to that present in the cpBVDV NADL strain. Sequencing of one such insert revealed a 296 nucleotide sequence, with a central core of 270 putative aminoacid sequence highly homologous (98%) to the NADL insert, a sequence corresponding to the cellular J-Domain gene. Another cpBVDV isolate contained a duplication of the NS3 gene downstream from the original locus. In contrast, no detectable NS2-3 insertions nor NS3 gene duplications were observed in the genome of 37 cp isolates. These results demonstrate that cleavage of NS2-3 without bulk RNA insertions nor NS3 gene duplications seems to be a frequent mechanism leading to NS3 expression and BVDV cytopathology. / Bezerros nascidos persistentemente infectados (PI) com o biótipo não citopático (ncp) do vírus da Diarréia Viral Bovina (BVDV) freqüentemente desenvolvem uma doença gastroentérica fatal, chamada de Doença das Mucosas (DM). Dos animais afetados pela DM é possível isolar o vírus original não-citopático (BVDVncp) e um vírus antigenicamente idêntico, porém citopático (BVDVcp). Os BVDVcps são gerados a partir do vírus original ncp por diversos mecanismos genéticos, que resultam na expressão da proteína não-estrutural NS3 como uma proteína individual. Em contrapartida, os BVDVncp expressam somente a proteína precursora NS2-3, que contém a seqüência da NS3 no seu terço carboxi-terminal. Este trabalho relata a investigação dos mecanismos genéticos associados com a expressão da NS3 em 41 isolados citopáticos de BVDV. Uma estratégia de RT-PCR foi delineada para detectar inserções no gene da NS2-3 e/ou duplicações no gene da NS3, dois mecanismos freqüentes de expressão da NS3. Amplificação do genoma dos 41 isolados por RT-PCR revelou a presença de inserções no gene da NS2-3 em três isolados, de tamanho similar a inserção presente na cepa de BVDVcp NADL. O seqüenciamento da inserção de um isolado revelou uma seqüência de 296 nucleotídeos, com uma região central de 270 nucleotídeos altamente homóloga (98%) com a inserção da cepa NADL, que corresponde a uma seqüência do gene celular J-Domain. Outro isolado de BVDVcp contém uma duplicação do gene da NS3 na direção 3 da sua posição original. Em 37 isolados cp não foram detectadas inserções na NS2-3 ou duplicações da NS3. Esses resultados demonstram que a clivagem da NS2-3 sem a presença de inserções de RNA ou duplicações do gene da NS3 parecem ser mecanismos frequentes de expressão da proteína NS3 e citopatologia no BVDV.

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:27:16Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2009-02-16Bitstream added on 2014-06-13T19:26:13Z : No. of bitstreams: 1 oliveira_mc_me_jabo.pdf: 308908 bytes, checksum: 64bbc47e580df30ef60b342b4c429d6c (MD5) / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / O Vírus da Diarréia Viral Bovina (BVDV) é um dos patógenos mais importantes na pecuária bovina em todo mundo, principalmente por desencadear manifestações clínicas relacionadas à esfera reprodutiva. A infecção em fêmeas gestantes pode resultar em abortamentos, reabsorções embrionárias, mumificações fetais, má formações e nascimento de bezerros fracos além do aparecimento de animais persistentemente infectados e imunotolerantes ao vírus, que são a principal fonte de infecção e disseminação da doença nos rebanhos. Atualmente, a complexidade do diagnóstico e consequentemente a patogenia, estão relacionados às diferenças genotípicas do agente. Por isso, a presente pesquisa teve como objetivo verificar a ocorrência dos genótipos BVDV-1 (Singer) e BVDV-2 (VS-253) em vacas, e respectivos fetos, abatidas em um frigorífico no Estado de São Paulo por meio da análise do soro sanguineo por meio da técnica de virusneutralização. No contexto geral, 52,51% (115/219) das vacas testadas foram reagentes, mas nenhum feto (0/219) reagiu na virusneutralização. Pela análise cruzada conforme a estirpe viral, observou-se que 42% (92/219) das vacas foram reagentes tanto para o genótipo BVDV-1 como para o genótipo do BVDV-2. Por outro lado 4,10% (9/219) reagiram apenas para o genótipo BVDV-1 e 6,39% (14/219) reagiram apenas para o genótipo do BVDV 2. Notou-se portanto que ambas as estirpes estão disseminadas nas regiões estudadas, fato que justifica o emprego de antígenos diferentes para evitar diagnóstico falso-negativo. Por fim, não foi observado qualquer alteração nos fetos que pudessem ser caracterizada como patologia da enfermidade. / The Bovine viral diarrhea virus (BVDV) is one of the pathogens in bovine livestock worldwide most important mainly triggered by clinical manifestations related to the reproductive sphere. The infection in pregnant females may result in abortions, embryonic resorptions, fetal mummification, poor training, birth of weak calves in addition to persistently infected and virus immunotolerant animals, which are the main source of infection and spread of the disease. Currently, the complexity to diagnosis and consequently to the pathogenesis are related genotypic differences that he presents. Therefore, this research aimed to verify the occurrence of BVDV- 1 (Singer) and BVDV-2 (VS-253) genotypes in cows and their respective fetuses slaughtered in a abattoir at the state of São Paulo by analyzing the blood serum using virusneutralization technique. In the general context, 52.51% (115/219) of cows were reagents, but no fetus (0/219) reacted in virusneutralization. After a cross-examination we observed that 42% (92/219) of cows reacted for both BVDV-1 and BVDV-2 genotype. Furthermore 4,10% (9/219) reacted only to the genotype BVDV-1 and 6,39% (14/219) responded only to the genotype 2 of BVDV. It was noted therefore that both strains are widespread in the regions studied, which also justifies the use of different antigens to avoid false-negative diagnosis. Finally, there was no change in fetuses that could be characterized as a pathology of the disease.

O vírus da diarreia viral bovina (BVDV) causa uma das doenças mais importantes de bovinos em termos de custos econômicos e sociais, uma vez que é largamente disseminado na população de gado leiteiro. Os objetivos do trabalho foram estimar a prevalência em nível de rebanho e investigar fatores associados aos níveis de anticorpos em leite de tanque através de um estudo de caso-controle pareado, bem como discutir estratégias de construção de modelos. Para estimar a prevalência de rebanho, amostras de tanque de leite foram selecionadas aleatoriamente (n = 314) de uma população (N = 1604). A prevalência real de BVDV foi de 24,3% (IC95% = 20,1-29,3%). Para o estudo de caso-controle, rebanhos positivos para BVDV (altos níveis de anticorpos) foram classificados como casos (n = 21) e pareados (n = 63) por produção de leite com rebanhos que apresentaram baixos títulos de anticorpos (razão 1:3). Para análise, três modelos multivariáveis foram construídos: 1) modelo completo, onde todas as 21 variáveis independentes foram oferecidas, e dois modelos foram criados de acordo com conhecimento empírico e similaridades entre as variáveis independentes, 2) modelo de fatores animais e 3) modelo de biossegurança. Um questionário foi aplicado (n = 84) para obtenção de informações a respeito de possíveis fatores de risco para BVDV. O modelo completo (Modelo 1) identificou as seguintes variáveis: idade com critério de eliminação (OR = 0,10; IC95% = 0,02 – 0,39; P < 0,01); propriedades que forneceram leite a outras cooperativas anteriormente (OR = 4,13; IC95% = 1,17 - 14,49; P = 0,02) e a presença de piquete de isolamento para animais doentes (OR = 0,14; IC95% = 0,01 – 0,26; P = 0,02). O modelo de biossegurança (Modelo 3) revelou uma associação significativa com o uso de monta natural (OR = 9,03; IC95% = 2,14 – 38,03; P < 0,01); presença de piquete de isolamento para animais doentes (OR = 0,06; IC95% = 0,05 – 0,83; P = 0,03); anos fornecendo leite para a mesma cooperativa (OR = 0,94; IC95% = 0,91 – 0,97; P < 0,01) e contato direto pela cerca entre bovinos de propriedades vizinhas (OR = 5,78; IC95% = 1,41 – 23,67; P = 0,04). O modelo de biossegurança pode ser considerado o “melhor”, pois obteve AIC = 43,880 e BIC = 48,058 menores quando comparado com o modelo completo que obteve AIC = 50,445 e BIC = 53,779. Esta dissertação tem a intenção de promover a discussão sobre as estratégias de construção de modelos especialmente quando se trata de saúde animal. Recomenda-se a aplicação de agrupamento de variáveis independentes como uma boa alternativa na construção de modelos, uma vez que este processo pode levar a uma melhor compreensão a respeito da associação entre cause e efeito de doenças. / Bovine viral diarrhea virus (BVDV) causes one of the most important diseases of cattle in terms of economic costs and welfare, since it is widespread in the dairy cattle population. The aims were to estimate herd prevalence and investigate factors associated with antibodies in bulk tank milk (BTM) in dairy herds through a matched case-control design as well as discuss model-building strategies. To estimate herd prevalence, BTM samples were randomly selected (n = 314) from a population (N = 1604). The true prevalence of BVDV was 24.3% (CI95% = 20.1 - 29.3%). For the case-control study, BVDV antibody-positive herds (high antibody titers) were classified as cases (n = 21) and matched (n = 63) by milk production with herds presenting low antibody titers (ratio of 1:3). For analysis, three multivariable models were built: 1) full model, holding all 21 independent variables; and two models divided according to empirical knowledge and similarity among independent variables, i.e., 2) animal factor model and 3) biosecurity model. A questionnaire was applied (n = 84) to get information about possible BVDV risk factors. The full model (model 1) identified the following variables: age as a culling criteria (OR = 0.10; IC95% = 0.02 – 0.39; P < 0.01); farms that provided milk to other industries previously (OR = 4.13; IC95% = 1.17 – 14.49; P = 0.02); and isolation paddocks for ill animals (OR = 0.14; IC95% = 0.01 – 0.26; P = 0.02). The biosecurity model (model 3) revealed a significant association with the use of natural mating (OR = 9.03; IC95% = 2.14 – 38.03; P < 0.01); isolation paddocks for ill animals (OR = 0.06; IC95% = 0.05 – 0.83; P = 0.03); years providing milk for the same industry (OR = 0.94; CI95% = 0.89 - 0.99; P = 0.02); and direct contact over fences among cattle of neighboring farms (OR = 5.78; IC95% = 1.41 – 23.67; P = 0.04). The biosecurity model could be considered the “best” since AIC = 43,880 and BIC = 48,058 when compared with the full model where AIC = 50,445 and BIC = 53,579. This paper intends to promote discussion about the model-building strategy when animal-health-modeling is on the line. We recommend the application of grouping predictors as a good choice for model building since it could lead to a better understanding of disease-exposure associations.

O Brasil é um grande produtor de alimentos e a bovinocultura tem grande importância econômica e social. Doenças virais podem ter grande impacto na pecuária e, por isso, a identificação do agente, o conhecimento de sua epidemiologia e o desenvolvimento de técnicas eficientes para seu diagnóstico são medidas extremamente importantes no seu controle. A diarréia viral bovina (“bovine viral diarrhea”- BVD) é uma enfermidade difundida nos rebanhos bovinos ocasionando grandes perdas econômicas em rebanhos de corte e leite em todo mundo. A identificação de animais persistentemente infectados (PI) pelo vírus da BVD (BVDV) é essencial em um programa de controle desta doença. No presente estudo, foi estabelecida uma transcrição reversa seguida da reação em cadeia da polimerase quantitativa (RT-qPCR) específica para identificação e quantificação dos diversos genótipos de pestivírus. Foi utilizado o teste de imunoperoxidase (IPX) como referência, além de outros testes de diagnóstico, como transcrição reversa seguida da reação em cadeia da polimerase (RTPCR), isolamento viral (IV), ELISA de captura de antígeno (ECA) e imunohistoquímica (IHQ). Os valores usados como base para quantificação foram pré-determinados pelo resultado da IPX de uma amostra padrão. A sensibilidade da RT-qPCR foi de 103,9 TCID50/mL, apresentando valor de coeficiente de correlação de 0,978 que permite identificar 95% das infecções com até 450,66 partículas virais/mL de soro. O coeficiente de variação da reprodutibilidade variou de 4 a 9%. Foram analisadas 72 amostras de soro sanguíneo de animais suspeitos de apresentarem infecção persistente pelo BVDV. Os títulos obtidos através da IPX a partir de soro de animais PI variaram de 105,55 a 107,3 TCID50/mL, enquanto que os títulos das amostras testadas pela RTqPCR variaram de 106,2 a 107,6 TCID50/mL. Os diferentes métodos laboratoriais utilizados para detectar o BVDV em rebanhos apresentaram a mesma eficiência entretanto, a utilização comparativa destes métodos aliada a uma nova estratégia permitiu que se estabelecesse uma RT-qPCR específica para detecção e quantificação do BVDV em amostras de soro de animais PI que poderá ser utilizada como uma importante ferramenta para o diagnóstico de pestivírus com diferentes características genéticas. Além disso, o presente trabalho poderá servir como base para a quantificação do agente em diferentes órgãos dos animais PI, o que contribuirá para o entendimento da patogenia do BVDV. / Brazil is an important food producer and cattle production has great economical and social importance. Viral diseases are constant problems and the identification of the agent, the knowledge of the disease´s epidemiology and the development of efficient diagnostic techniques are extremely important for its control. Bovine viral diarrhea (BVD) is a widespread disease causing great economical losses around the world. The identification of persistently infected animals (PI) in bovine herds is essential to the implementation of control programs. In the present study, a reverse transcription followed by quantitative polymerase chain reaction (RT-qPCR) was established to the identification and quantification of pestivirus. Immunoperoxidase (IPX) was used as the reference test, in addition with reverse transcription followed by the polymerase chain reaction (RT-PCR), virus isolation (VI), antigen-capture ELISA (ACE) and Immunohistochemistry (IHC). The values used as standard to quantification were predetermined by the result from the IPX using a reference strain. The sensitivity of RTqPCR was 103.9 TCID50/mL, showing 0.978 of coefficient correlation, what allowed to detect 95% of infections with up to 450.66 viral particles/mL. The reproducibility of the coefficient of varied from 4 to 9%. Seventy-two samples of blood serum from animals suspected of presenting persistent infection of BVDV were analyzed. The titers obtained through the IPX from the serum of PI animals varied from 105.55 to 107.3 TCID50/mL, while the titers from the tested samples by the RT-qPCR varied from 106.2 to 107.6TCID50/mL. The different laboratory methods tested were capable of detecting the BVDV with equal efficiency, The comparative utilization of these methods allied with a new strategy allowed the establishment of a specific RT-qPCR protocol to quantify and detect the BDVD in PI sera which can be used as an important tool to the detection and quantification of the pestivirus different genetic backgrounds. Beyond this, the present protocol can be used to quantify the virus in different organs of PI animals and will contribute for the understanding of BVDV patogenicity.

O vírus da diarreia viral bovina (BVDV) é responsável por diferentes síndromes que afetam principalmente bovinos em todo o mundo, causando grandes perdas econômicas. A principal medida de controle desta infecção é a detecção e retirada dos animais persistentemente infectados (PI) do rebanho. O presente trabalho analisou a infecção persistente por este vírus em um rebanho bovino de gado de corte, vacinado com vacina inativada contra BVDV tipo 1 e localizado no Município de Viamão, Rio Grande do Sul, de novembro de 2007 a maio de 2009. Para a triagem de animais PI, amostras de soro, sangue com EDTA e fragmentos de orelhas foram coletadas principalmente de animais com idade entre 2-3 meses. Os testes utilizados compreenderam o isolamento viral, a transcrição reversa seguida da reação em cadeia da polimerase (RT-PCR), a imuno-histoquímica (IHQ) e a sorologia pelo ensaio imunoenzimático (ELISA). De 1300 animais da propriedade, coletou-se 179 amostras e em 6 se identificou a infecção persistente pelo BVDV tipo 2 não citopático (ncp). Os principais sinais clínicos verificados na propriedade englobavam nascimento de bezerros fracos, grande número de animais com retardo no crescimento e catarata congênita uni e bilateral. As principais lesões observadas em 5 animais necropsiados consistiam de aumento dos linfonodos mesentéricos, evidenciação das placas de Peyer e em um animal verificou-se pododermatite com lesões crostosas no plano nasal e na região periocular. Os achados microscópicos caracterizavam-se principalmente por infiltrado mononuclear na lâmina própria do intestino delgado e rarefação linfoide com infiltrado histiocitário nos centrofoliculares de linfonodos e nas placas de Peyer. A demonstração do antígeno viral nos 5 animais avaliados ocorreu principalmente em: queratinócitos da epiderme , no epitélio de folículos pilosos e células dendríticas da derme de orelhas e pele; histiócitos e em linfócitos dos linfonodos; células foliculares da tireoide; no citoplasma de neurônios e em menor escala, em células da micróglia no córtex cerebral e no hipocampo. A análise de pools de soro de animais suspeitos pelo RT-PCR em conjunto com a avaliação imuno-histoquímica de biópsia de orelhas mostraram bons resultados e podem ser úteis como método de triagem de infecções persistentes em rebanhos, inclusive em animais menores de 6 meses de idade por não sofrerem interferência de anticorpos maternos. A retirada e eliminação dos animais PI surtiram efeitos positivos na propriedade, entretanto novas coletas devem ser realizadas em 2010. / Bovine viral diarrhea virus (BVDV) is responsible for different syndromes that affect mainly cattle worldwide, causing important economic losses. The main control measure for this infection is the detection and removal of all persistently animals infected (PI) from the herd. This study examined the persistent infection for this virus in a beef cattle herd, vaccinated with killed vaccine against BVDV type 1, located in the county of Viamão, Rio Grande do Sul, southern Brazil, from november 2007 to may 2009. For the screening of PI animals, serum, blood with EDTA and fragments of ears were collected mainly from animals aged between 2-3 months. Tests used were viral isolation, reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR), immunohistochemistry (IHC) and serology by enzyme linked immunosorbent assay (ELISA). From 1300 animals, 179 samples were collected and 6 were identified as persistent infected for BVDV type 2 non-cytopathic (ncp). The most important clinical signs observed on the farm were birth of weak calves, many animals with growth retardation and unilateral or bilateral cataract. The main gross lesions observed at the necropsy of 5 animals were enlargement of mesenteric lymph nodes and Peyer's patches, and in one case, pododermatitis with crusted lesions on nasal planum and periocular region. The microscopic findings were characterized mostly by mononuclear infiltrate in the lamina propria primarily in small intestine and lymphoid depletion with histiocytic infiltrate in follicular centers of lymph nodes and Peyer's patches. In 5 animals evaluated the viral antigen was more frequently demonstrated in epidermal keratinocytes, epithelium of hair follicles and dendritic cells of the dermis of the ears and skin, histiocytes and lymphocytes in lymph nodes, thyroid follicular cells, in the cytoplasm of neurons and to a lesser extent, in glial cells in the cerebral cortex and hippocampus. The analysis of pools of serum from animals suspected by RT-PCR together with immunohistochemical analysis of ears biopsy showed good results and can be useful as screening method for persistent infections in cattle, including animals under 6 months age, because they not suffer interference from maternal antibodies. The removal and elimination of PI animals had positive effects on the property, however new collection should be carried out in 2010.

Os materiais de origem animal utilizados na produção in vitro (PIV) de bovinos podem apresentar-se contaminados pelo vírus da diarréia viral bovina (BVDV) quando provenientes de animais infectados. Tendo isso em vista é importante realizar estudos aplicados para minimizar a transmissão de patógenos via biotécnicas de reprodução. Os objetivos desse trabalho foram avaliar a capacidade dos métodos de processamento seminal, Swim up, gradiente de Percoll e a combinação Swim up/Percoll em reduzir ou eliminar o BVDV de amostras de sêmen experimentalmente infectadas (Experimento 1), e também, avaliar o efeito do BVDV durante a maturação in vitro (MIV) de complexos cumuli-oophorus bovinos (CCOs), assim como, no seu posterior desenvolvimento embrionário. Foi avaliada também a produção de antígenos nas células do cumulus (CC) em cultivo em comparação com as células MDBK (Experimento2). No Experimento 1 foram obtidas as seguintes faixas de títulos virais após processamento, 100.87 – 102.3 TCID/50/mL no Percoll, 101.87 – 103.3 TCID/50/mL no Swim up e no grupo combinado Swim up/Percoll não foi possível detectar vírus nas amostras. E a PIV produziu taxas de blastulação semelhantes nos grupos de diferentes processamentos seminais avaliados. Os dados mostraram que a combinação Swim up/Percoll reduziu/eliminou significativamente o número de partículas virais nas amostras de sêmen, sem causar danos aos espermatozóides, e também, possibilitou a PIV. No Experimento 2 nossos dados mostraram que os grupos controle (C) e infectado (V) apresentaram padrões diferentes de expansão das CC. A taxa de MIV do grupo C foi significativamente maior do que no grupo V, assim como as taxas de blastulação. Títulos virais mais altos foram obtidos nas CC em comparação com as células MDBK. Os resultados mostraram que a presença do BVDV na MIV infecta as CC, afeta o padrão de expansão das CC e reduz as taxas de maturação e blastulação. Dessa forma conclui-se que os dados obtidos nesse trabalho são extremamente importantes para auxiliar no desenvolvimento de protocolos de lavagem de sêmen a fim de eliminar os microorganismos presentes e possibilitar a produção de embriões livres de patógenos. / The materials of animal origin used in cattle to produce in vitro embryos (IVP) have been shown to contain BVDV when originate from infected animals. Considering that it is important to perform applicable studies to minimize transmission of pathogens via these assisted reproductive techniques. The aim of the study were evaluate the capacity of sperm separation procedures Percoll gradient, Swim-up, and a combination of Swim-up/Percoll, to reduce/eliminate BVDV from experimentally infected semen samples (Experiment 1), and to evaluate BVDV experimentally infection during in vitro maturation (IVM) of bovine cumuli oophorus complexes (COCs) and also BVDV effect on the COCs posterior embryo development. It was also evaluated the production of BVDV antigens through cumulus cells (CC) culture in comparison to MDBK cell culture (Experiment 2). At experiment 1 the virus titration presented a titer range among 100.87 - 102.3 TCID50/mL in Percoll; 101.87 - 103.3 TCID50/mL in Swim up; and undetected for all samples in the Swim up/Percoll. And the PIV produced similar blastocyst rates among the groups. The data showed that the combination of Swim up/Percoll promoted a significant reduction/elimination in the number of viral particles in the semen, without promotion of damage in spermatozoa cells and allow IVP with similar blastocyst rates among the different groups. From experiment 2 our data showed that control (C) and infected (V) groups presented different CC expansion patterns. The IVM rate for C group was higher than V group. Embryo development rate to blastocyst stage was significantly higher in C group than in V group. The highest virus titers were obtained in CC in comparison with MDBK cells. Our findings showed that BVDV presence during IVM infected CC and this affects their expansion pattern, which may be related to the observed reduced nuclear maturation and blastocyst development rates. Therefore it is possible to conclude that our data are extremely important as a help to develop semen washing protocols to eliminate microorganisms and allow the embryo production free of pathogens.

A bovinocultura de leite é importante para o abastecimento do mercado interno brasileiro, tendo o Estado do Rio Grande do Sul como o segundo maior produtor. Doenças virais ocasionam diversos prejuízos na cadeia de produção bovina. Com o objetivo de manter e aprimorar o nível de produção, torna-se importante estabelecer programas sanitários que permitam o controle de doenças que possam resultar em grandes perdas econômicas. Para o sucesso de tais programas, é importante levar em consideração o conhecimento da epidemiologia da doença em conjunto com técnicas laboratoriais adequadas, além de buscar fatores associados à permanência do vírus no rebanho Os objetivos desse estudo foram o de avaliar a prevalência e fatores de risco do vírus da diarreia viral bovina (BVDV) e herpervirus bovino tipo 1 (BoHV-1) em rebanhos leiteiros não vacinados de uma cooperativa de produtores de leite no Estado do Rio Grande do Sul, Brasil. Amostras de tanques de leite de 281 rebanhos leiteiros selecionados de forma aleatória simples foram testados para anticorpos contra o BVDV utilizando um kit comercial de ELISA e contra glicoproteína B do BoHV-1 através de um kit comercial de ELISA de bloqueio. Em cada propriedade avaliada, aplicou-se um questionário epidemiológico para investigar os fatores de risco para estas doenças. Uma prevalência de rebanho de 42,70% (120/281; IC 95%: 36% - 48%) para infecção pelo BVDV e de 27,88% (75/269; IC 95%: 22% - 33%) para infecção pelo BoHV-1 foram encontradas na população estudada. Dentre os fatores de risco avaliados, a utilização de inseminação artificial foi considerado como fator de risco para infecção pelo vírus da diarreia viral bovina e possuir suínos na propriedade foi considerado como fator de proteção para infecção pelo herpesvirus bovino tipo 1. O presente estudo identificou 10,3% de rebanhos com infecção ativa de BVDV e uma prevalência moderada para ambas as doenças em uma população de pequenos rebanhos leiteiros criados em sistemas semi-intensivos de produção que não utilizam medidas específicas de controle de infecção. / The dairy cattle is important to supply the Brazilian market, with the state of Rio Grande do Sul as the second largest producer. Viral diseases cause several damages in the bovine production. In order to maintain and improve the level of production, it becomes important to establish health programs that allow the control of diseases that can result in large economic losses. For the success of such programs, it is important to take into account the knowledge of the epidemiology of the disease in conjunction with appropriate laboratory techniques, and risk factors associated with persistence of the virus in the herd. The objectives of this study were to assess the prevalence and risk factors for the bovine viral diarrhea virus (BVDV) and bovine herpesvirus type 1 (BoHV-1) in unvaccinated dairy herds of a cooperative of milk producers in the state of Rio Grande do Sul, Brazil. Bulk tank milk samples from 281 dairy herds selected by simple random sampling were tested for BVDV antibodies using a commercial ELISA kit and against the glycoprotein B of BoHV-1 using a commercial ELISA kit of blocking. In each assessed property, we applied an epidemiological questionnaire to investigate risk factors for these diseases. A herd prevalence of 42.70% (120/281, 95% CI: 36% - 48%) for BVDV infection and 27.88% (75/269, 95% CI: 22% - 33%) for BoHV-1 were observed in the studied population. Among the risk factors evaluated, the use of artificial insemination was considered as a risk factor for infection with bovine viral diarrhea virus and pigs on the property have been considered as a protective factor for infection by bovine herpesvirus type 1. The present study identified 10.3% of herds with active BVDV infection and a moderate prevalence for both diseases in a population of small dairy herds reared in semi-intensive systems of production which do not use specific measures to control infection.

O vírus da diarreia viral bovina (BVDV) causa uma das doenças mais importantes de bovinos em termos de custos econômicos e sociais, uma vez que é largamente disseminado na população de gado leiteiro. Os objetivos do trabalho foram estimar a prevalência em nível de rebanho e investigar fatores associados aos níveis de anticorpos em leite de tanque através de um estudo de caso-controle pareado, bem como discutir estratégias de construção de modelos. Para estimar a prevalência de rebanho, amostras de tanque de leite foram selecionadas aleatoriamente (n = 314) de uma população (N = 1604). A prevalência real de BVDV foi de 24,3% (IC95% = 20,1-29,3%). Para o estudo de caso-controle, rebanhos positivos para BVDV (altos níveis de anticorpos) foram classificados como casos (n = 21) e pareados (n = 63) por produção de leite com rebanhos que apresentaram baixos títulos de anticorpos (razão 1:3). Para análise, três modelos multivariáveis foram construídos: 1) modelo completo, onde todas as 21 variáveis independentes foram oferecidas, e dois modelos foram criados de acordo com conhecimento empírico e similaridades entre as variáveis independentes, 2) modelo de fatores animais e 3) modelo de biossegurança. Um questionário foi aplicado (n = 84) para obtenção de informações a respeito de possíveis fatores de risco para BVDV. O modelo completo (Modelo 1) identificou as seguintes variáveis: idade com critério de eliminação (OR = 0,10; IC95% = 0,02 – 0,39; P < 0,01); propriedades que forneceram leite a outras cooperativas anteriormente (OR = 4,13; IC95% = 1,17 - 14,49; P = 0,02) e a presença de piquete de isolamento para animais doentes (OR = 0,14; IC95% = 0,01 – 0,26; P = 0,02). O modelo de biossegurança (Modelo 3) revelou uma associação significativa com o uso de monta natural (OR = 9,03; IC95% = 2,14 – 38,03; P < 0,01); presença de piquete de isolamento para animais doentes (OR = 0,06; IC95% = 0,05 – 0,83; P = 0,03); anos fornecendo leite para a mesma cooperativa (OR = 0,94; IC95% = 0,91 – 0,97; P < 0,01) e contato direto pela cerca entre bovinos de propriedades vizinhas (OR = 5,78; IC95% = 1,41 – 23,67; P = 0,04). O modelo de biossegurança pode ser considerado o “melhor”, pois obteve AIC = 43,880 e BIC = 48,058 menores quando comparado com o modelo completo que obteve AIC = 50,445 e BIC = 53,779. Esta dissertação tem a intenção de promover a discussão sobre as estratégias de construção de modelos especialmente quando se trata de saúde animal. Recomenda-se a aplicação de agrupamento de variáveis independentes como uma boa alternativa na construção de modelos, uma vez que este processo pode levar a uma melhor compreensão a respeito da associação entre cause e efeito de doenças. / Bovine viral diarrhea virus (BVDV) causes one of the most important diseases of cattle in terms of economic costs and welfare, since it is widespread in the dairy cattle population. The aims were to estimate herd prevalence and investigate factors associated with antibodies in bulk tank milk (BTM) in dairy herds through a matched case-control design as well as discuss model-building strategies. To estimate herd prevalence, BTM samples were randomly selected (n = 314) from a population (N = 1604). The true prevalence of BVDV was 24.3% (CI95% = 20.1 - 29.3%). For the case-control study, BVDV antibody-positive herds (high antibody titers) were classified as cases (n = 21) and matched (n = 63) by milk production with herds presenting low antibody titers (ratio of 1:3). For analysis, three multivariable models were built: 1) full model, holding all 21 independent variables; and two models divided according to empirical knowledge and similarity among independent variables, i.e., 2) animal factor model and 3) biosecurity model. A questionnaire was applied (n = 84) to get information about possible BVDV risk factors. The full model (model 1) identified the following variables: age as a culling criteria (OR = 0.10; IC95% = 0.02 – 0.39; P < 0.01); farms that provided milk to other industries previously (OR = 4.13; IC95% = 1.17 – 14.49; P = 0.02); and isolation paddocks for ill animals (OR = 0.14; IC95% = 0.01 – 0.26; P = 0.02). The biosecurity model (model 3) revealed a significant association with the use of natural mating (OR = 9.03; IC95% = 2.14 – 38.03; P < 0.01); isolation paddocks for ill animals (OR = 0.06; IC95% = 0.05 – 0.83; P = 0.03); years providing milk for the same industry (OR = 0.94; CI95% = 0.89 - 0.99; P = 0.02); and direct contact over fences among cattle of neighboring farms (OR = 5.78; IC95% = 1.41 – 23.67; P = 0.04). The biosecurity model could be considered the “best” since AIC = 43,880 and BIC = 48,058 when compared with the full model where AIC = 50,445 and BIC = 53,579. This paper intends to promote discussion about the model-building strategy when animal-health-modeling is on the line. We recommend the application of grouping predictors as a good choice for model building since it could lead to a better understanding of disease-exposure associations.

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / The essential oils obtained from plants used as condiments are an important source of compounds with pharmacologic activity. In the present study, the antiviral activity of the essential oil of Ocimum basilicum L. (basil) and from the monoterpens camphor, 1,8-cineol and timol was tested against the bovine viral diarrhea virus (BVDV), while the essential oil of Rosmarinus officinalis L. (rosemary), Lippia graveolens HBK. (mexican oregano) and Thymus vulgaris L. (thyme) were tested against the feline calicivirus (FCV). The colorimetric test MTT ([3- (4.5-dimetilazol-2-il)-2.5-brometo of difeniltetrazolium]) was applied for the measurement of cytotoxicity, and the antiviral tests were performed by the plaque reduction assay. Three different protocols were applied: a) the virus was incubated with the essential oils or compounds before the inoculation into cells (virucidal assay); b) the cells were treated with the essential oils or compounds prior to virus inoculation; or, c) essential oils and compounds were added to the cells after virus inoculation and maintained for 72 hours. The results were expressed as CC50 (cytotoxic concentration to 50% of the cell culture), IC50 (inhibitory concentration to 50%) and SI (selectivity index = CC50/IC50). The best results were evidenced for the monoterpens camphor (SI=13.88) and the 1,8-cineol (IS=9.05) against BVDV. These results were obtained from the virucidal protocol and these compounds showed also the lower toxicicity towards the bovine kidney cells culture (Madin-Darby bovine kidney cells = MDBK) (CC50 = 4420.12 μg/mL and 2996.10 μg/mL, respectively). Regarding to the tests with FCV, the thyme essential oil showed the best results with SI=8.57 for c treatment. The basil essential oil had a moderate action in the a protocol (SI=6.54) and also for the c protocol (SI=6.86). In addition, the basil essential oil exhibited low levels of cytotoxicity towards the Crandel-Reese feline kidney cells (CRFK), with CC50 of 1300.21 μg/mL. In conclusion, the essential oils and monoterpens examined showed different levels of inhibitory activity on diverse moments of the viral infection. The antiviral activity demonstrated by the essential oils and compounds on BVDV and FCV may suggest a possible action on the hepatitis C virus (HCV) and norovirus (NoVs), respectively; since BVDV ande FCV shows several structural and replicative similarities to HCV and NoVs. / Óleos essenciais obtidos de plantas utilizadas como condimentos constituem uma fonte de compostos com promissoras atividades farmacológicas. No presente estudo, a atividade antiviral do óleo essencial de Ocimum basilicum L. (manjericão) e dos monoterpenos cânfora, 1,8-cineol e timol foi testada frente ao vírus da diarréia viral bovina (BVDV), enquanto que os óleos essenciais de Rosmarinus officinalis L. (alecrim), Lippia graveolens HBK. (orégano mexicano) e Thymus vulgaris L. (tomilho) foram testados frente ao calicivírus felino (FCV). O teste colorimétrico com MTT ([3- (4,5-dimetilazol-2-il)-2,5-brometo de difeniltetrazolium]) foi aplicado para a detecção de citotoxicidade, já os testes de atividade antiviral foram realizados através da metodologia de ensaio de redução de placas. Para este, três diferentes protocolos foram aplicados: o vírus foi incubado com os óleos essenciais ou compostos antes da infecção viral (ensaio virucida); as células foram pré tratadas com os óleos essenciais ou compostos antes da inoculação do vírus; ou as células infectadas foram incubadas com esses após as 2 horas de adsorção viral. Os resultados foram expressos como CC50 (concentração citotóxica para 50% do cultivo celular), CI50 (concentração inibitória para 50%) e IS (índice de seletividade = CC50/CI50). Os resultados de atividade frente ao BVDV evidenciaram, no geral, uma boa ação antiviral exercida pelos monoterpenos, sendo que a cânfora (IS=13,88) seguida do 1,8-cineol (IS=9,05) foram os compostos que apresentaram os mais elevados índices de seletividade obtidos no ensaio virucida, bem como a menor toxicidade frente às células de linhagem de rim bovino (Madin-Darby bovine kidney cells = MDBK) (CC50 = 4420,12 μg/ml e 2996,10 μg/ml, respectivamente). Em relação aos testes com FCV, o óleo essencial de tomilho mostrou os melhores resultados, com índice de 8,57 para o tratamento no qual os óleos essenciais foram adicionados às células antes da inoculação viral. Já o óleo essencial de alecrim, além de apresentar uma moderada ação nos ensaios virucida (IS=6,54) e de pós-tratamento (IS=6,86), exibiu baixos níveis de toxicidade em relação às células de linhagem de rim felino (Crandell-Reese feline kidney = CRFK), com CC50 de 1300,21 μg/ml. Dessa forma, conclui-se que os óleos essenciais e monoterpenos em estudo apresentaram algum nível de atividade inibitória em diferentes momentos da infecção viral.

O Brasil é um grande produtor de alimentos e a bovinocultura tem grande importância econômica e social. Doenças virais podem ter grande impacto na pecuária e, por isso, a identificação do agente, o conhecimento de sua epidemiologia e o desenvolvimento de técnicas eficientes para seu diagnóstico são medidas extremamente importantes no seu controle. A diarréia viral bovina (“bovine viral diarrhea”- BVD) é uma enfermidade difundida nos rebanhos bovinos ocasionando grandes perdas econômicas em rebanhos de corte e leite em todo mundo. A identificação de animais persistentemente infectados (PI) pelo vírus da BVD (BVDV) é essencial em um programa de controle desta doença. No presente estudo, foi estabelecida uma transcrição reversa seguida da reação em cadeia da polimerase quantitativa (RT-qPCR) específica para identificação e quantificação dos diversos genótipos de pestivírus. Foi utilizado o teste de imunoperoxidase (IPX) como referência, além de outros testes de diagnóstico, como transcrição reversa seguida da reação em cadeia da polimerase (RTPCR), isolamento viral (IV), ELISA de captura de antígeno (ECA) e imunohistoquímica (IHQ). Os valores usados como base para quantificação foram pré-determinados pelo resultado da IPX de uma amostra padrão. A sensibilidade da RT-qPCR foi de 103,9 TCID50/mL, apresentando valor de coeficiente de correlação de 0,978 que permite identificar 95% das infecções com até 450,66 partículas virais/mL de soro. O coeficiente de variação da reprodutibilidade variou de 4 a 9%. Foram analisadas 72 amostras de soro sanguíneo de animais suspeitos de apresentarem infecção persistente pelo BVDV. Os títulos obtidos através da IPX a partir de soro de animais PI variaram de 105,55 a 107,3 TCID50/mL, enquanto que os títulos das amostras testadas pela RTqPCR variaram de 106,2 a 107,6 TCID50/mL. Os diferentes métodos laboratoriais utilizados para detectar o BVDV em rebanhos apresentaram a mesma eficiência entretanto, a utilização comparativa destes métodos aliada a uma nova estratégia permitiu que se estabelecesse uma RT-qPCR específica para detecção e quantificação do BVDV em amostras de soro de animais PI que poderá ser utilizada como uma importante ferramenta para o diagnóstico de pestivírus com diferentes características genéticas. Além disso, o presente trabalho poderá servir como base para a quantificação do agente em diferentes órgãos dos animais PI, o que contribuirá para o entendimento da patogenia do BVDV. / Brazil is an important food producer and cattle production has great economical and social importance. Viral diseases are constant problems and the identification of the agent, the knowledge of the disease´s epidemiology and the development of efficient diagnostic techniques are extremely important for its control. Bovine viral diarrhea (BVD) is a widespread disease causing great economical losses around the world. The identification of persistently infected animals (PI) in bovine herds is essential to the implementation of control programs. In the present study, a reverse transcription followed by quantitative polymerase chain reaction (RT-qPCR) was established to the identification and quantification of pestivirus. Immunoperoxidase (IPX) was used as the reference test, in addition with reverse transcription followed by the polymerase chain reaction (RT-PCR), virus isolation (VI), antigen-capture ELISA (ACE) and Immunohistochemistry (IHC). The values used as standard to quantification were predetermined by the result from the IPX using a reference strain. The sensitivity of RTqPCR was 103.9 TCID50/mL, showing 0.978 of coefficient correlation, what allowed to detect 95% of infections with up to 450.66 viral particles/mL. The reproducibility of the coefficient of varied from 4 to 9%. Seventy-two samples of blood serum from animals suspected of presenting persistent infection of BVDV were analyzed. The titers obtained through the IPX from the serum of PI animals varied from 105.55 to 107.3 TCID50/mL, while the titers from the tested samples by the RT-qPCR varied from 106.2 to 107.6TCID50/mL. The different laboratory methods tested were capable of detecting the BVDV with equal efficiency, The comparative utilization of these methods allied with a new strategy allowed the establishment of a specific RT-qPCR protocol to quantify and detect the BDVD in PI sera which can be used as an important tool to the detection and quantification of the pestivirus different genetic backgrounds. Beyond this, the present protocol can be used to quantify the virus in different organs of PI animals and will contribute for the understanding of BVDV patogenicity.