Entre as hospedeiras de invasão sistêmica do vírus do mosaico do mamoeiro - estirpe mamoeiro (Papaya ringspot virus type P; PRSV-P) encontram-se espécies de cucurbitáceas, cuja suscetibilidade à transmissão experimental, mecânica e com afídeos, é variável. A literatura nacional e internacional apresenta resultados distintos quanto à recuperação desse vírus a partir de cucurbitáceas presentes próximas ou no interior de plantios de mamoeiros infectados com esse vírus. O presente trabalho teve como objetivo avaliar em casa de vegetação a suscetibilidade de quatro espécies de cucurbitáceas a cinco isolados do PRSV-P obtidos de diferentes regiões do Brasil e inoculados de forma mecânica. Visou também estudar a infecção natural de cucurbitáceas cultivadas nas entrelinhas ou próximas de mamoeiros com mosaico. Para o desenvolvimento do trabalho em casa-de-vegetação os isolados do PRSV-P mantidos em mamoeiros, foram inoculados nos cotilédones de abobrinha de moita cv. Caserta, moranga cv. Exposição, pepino híbrido Primepack Plus e melancia cv. Crimson Sweet. As plantas foram avaliadas com base nos sintomas e indexadas por PTA-ELISA, e recuperação biológica do biótipo P do PRSV através de inoculações em mamoeiro. A confirmação da infecção dos mamoeiros foi realizada da mesma forma, por sintomatologia e indexação por PTA-ELISA. A abobrinha de moita foi a espécie mais suscetível aos cinco isolados do PRSV-P, seguida da melancia e do pepino. Não foi possível transmitir o vírus a moranga cv. Exposição. Para estudar a infecção natural realizou-se um ensaio com plantas de abobrinha de moita em Linhares-ES, três ensaios independentes em Rinópolis-SP e quatro em Piracicaba-SP, incluindo-se nessa última localidade a melancia e o pepino. Depois de aproximadamente 40 a 60 dias de exposição em campo coletaram-se amostras individuais ou compostas (de 3 a 5 plantas) das folhas dos ponteiros das plantas para realizar a recuperação biológica do PRSV-P para mamoeiros em casa de vegetação. A presença de afídeos foi monitorada em Piracicaba durante a execução dos experimentos no campo. No único teste de exposição em Linhares, nenhuma planta de abobrinha cultivada entre mamoeiros com mosaico mostrou-se infectada com esse vírus. O PRSV-P foi recuperado da abobrinha de moita em proporções variáveis em 2 dos 3 testes realizados em Rinópolis, e em 3 dos 4 testes realizados em Piracicaba. Nenhuma planta de melancia e pepino cultivada entre mamoeiros com mosaico foi infectada com o PRSV-P. Não foi possível recuperar o PRSV-P de nenhuma planta de abobrinha cultivada entre 5 e 80 metros de distância dos mamoeiros com mosaico em Piracicaba. Foram capturados afídeos vetores do PRSV-P e foi possível detectar plantas infectadas com os potyvirus PRSV-W e ZYMV, o que demonstra a presença e atividade dos vetores de vírus. Os resultados confirmaram a suscetibilidade variável das espécies de cucurbitáceas ao PRSV-P. Embora a abobrinha de moita fosse a única espécie encontrada naturalmente infectada pelo PRSV-P quando cultivada entre linhas de mamoeiro com mosaico, a presença de cucurbitáceas nos campos de produção de mamoeiro, especialmente quando o controle do mosaico do mamoeiro é feito através do roguing, não é recomendada. / Besides Carica papaya, Papaya ringspot virus type P (PRSV-P) infects systemically only species belonging to the family Cucurbitaceae. Their susceptibility varies according to the species/cultivar, virus isolate and the method of inoculation. Attempts to recovery PRSV-P from naturally infected cucurbit plants grown near to or among diseased papaya trees have shown distinct results worldwide. This study aimed to evaluate the susceptibility of Cucurbita pepo cv. Caserta, Cucurbita maxima cv. Exposiçao, Cucumis sativus hybrid Primepack Plus, and Citrullus lanatus cv. Crimson Sweet to five isolates of PRSV-P obtained from different regions of Brazil. It was also evaluated the natural infection of cucurbit plants grown between rows and in the vicinity of papaya trees infected with PRSV-P. The five PRSV-P isolates were maintained in papaya plants. Cucurbit plants grown in pots under greenhouse conditions were mechanically inoculated with each isolate at the cotiledonary stage. The plants were assessed based on symptoms and infection was confirmed by PTA-ELISA using extracts from the inoculated cotyledons and upper leaves. The same extracts were also mechanically inoculated on papaya plants in order to recover the virus isolate. Inoculated papaya plants were also tested by PTA-ELISA. Zucchini squash was the most susceptible species to PRSV-P, followed by watermelon and cucumber. Pumpkin cv. Exposição was not infected. To study the natural infection of zucchini squash cv. Caserta by PRSV-P, a trial was carried out in Linhares, State of Espírito Santo; three independent trials were carried out in Rinópolis; and four trials were carried out in Piracicaba, both regions located in the State of São Paulo. Watermelon and cucurbit were also included in some trials in Piracicaba. After approximately 40 to 70 days, leaf samples were collected and tested individually or in groups of three to five plants for the presence of PRSV-P by mechanical inoculation on papaya plants under greenhouse conditions. None of the zucchini squash plants grown between rows of infected papaya trees in Linhares was found infected by PRSV-P based on the virus recovery test to papaya plants. The virus was also not recovered from watermelon and cucurbit plants grown between rows of infected papaya trees in Piracicaba. On the other hand, PRSV-P was recovery from zucchini squash plants grown intercalated with diseased papayas in Rinópolis and Piracicaba. The number of infected plants varied among the trial. Several attempts to recover PRSV-P from innumerous zucchini squash plants grown approximately five to 80 meters from diseased papaya trees in Piracicaba failed. Alates of several species of aphids were captured in the field at Piracicaba. Also, innumerous cucurbit plants were found infected by the potyviruses Papaya ringspot virus type W and Zucchini yellow mosaic virus, suggesting aphids activity in the area. The results confirmed the variable susceptibility of cucurbit species to infection with PRSV-P. Although natural infection with PRSV-P was restricted to zucchini squash cv. Caserta grown among infected papaya trees, the presence of cucurbit plants in the vicinity of papaya orchards, especially where disease control is done by systematic rouging of diseased plants, should not be allowed.

O tomateiro (Lycopersicon esculentum) é cultivado em várias regiões durante todo o ano, propiciando assim condições favoráveis ao surgimento de inúmeras doenças incluindo as causadas por vírus. Dentre as viroses consideradas como limitantes a esta cultura destacam-se as causadas por begomovírus, que pertencem à família Geminiviridae. Sua transmissão se dá pelo aleirodídeo Bemisia tabaci biótipo B. A partir da década de 90 tornaram-se freqüentes os relatos da disseminação desse aleirodídeo e de begomovírus causando perdas que variam de 40% a 100%. No Estado de São Paulo, o Tomato yellow vein streak virus (ToYVSV), até 2005, estava predominando nos campos de tomateiro, onde foram constatadas incidências de plantas com sintomas deste begomovírus variando de 58% a 100%. O presente trabalho teve como objetivos estudar a interação do ToYVSV com o vetor Bemisia tabaci biótipo B e identificar hospedeiras alternativas deste vírus. Na relação do vírus com o vetor constatou-se que os períodos de acesso mínimo de aquisição (PAA) e de inoculação (PAI) foram de 30 min e 10 min, respectivamente. A porcentagem de plantas infectadas chegou até cerca de 75% após um PAA e PAI de 24 h. O período de latência do vírus no vetor foi de 16 horas. O ToYVSV foi retido pela B. tabaci 20 dias após a aquisição deste. Não foi detectada a transmissão do vírus para progênie da B. tabaci biótipo B oriundas de insetos virulíferos. Das 34 espécies de plantas testadas como hospedeiras somente C. annuum, C. amaranticolor, C. quinoa, D. stramonium, G. globosa, N. tabacum cv. TNN e N. clevelandii foram suscetíveis à infecção com o ToYVSV, por meio de inoculação com a B. tabaci. As transmissões do ToYVSV por Cuscuta campestris e mecanicamente foram ineficientes. As espécies susceptíveis ao ToYVSV serviram de fonte de inóculo para a transmissão do vírus para tomateiros por meio de B. tabaci biótipo B. / Tomato (Lycopersicon esculentum) has been cultivated in various parts of Brazil almost during the entire year, which provides favorable conditions for the incidence of innumerous diseases, including those caused by viruses. Among the virus diseases responsible for yield losses on tomato crops are those caused by species in the genus Begomovirus, family Geminiviridae. These viruses are transmitted by the whitefly Bemisia tabaci biotype B. Yield losses associated with begomovirus infection varying from 40% to 100% have been frequently reported since early 90's. Tomato yellow vein streak virus (ToYVSV), a putative species of begomovirus, was prevalent on tomato crops in São Paulo State until 2005, causing yield losses varying from 58% to 100%. The objectives of this work were to study the interaction between ToYVSV am its vector B. tabaci biotype B and to identify alternative host for the virus. The results indicated that the minimum acquisition and inoculation access periods of ToYVSV by B. tabaci were 30 min and 10 min, respectively. Seventy five percent of tomato-test plants were infected when the acquisition and inoculation access periods were 24 h. The latent period of the virus in the insect was 16 h. The ToYVSV was retained by B. tabaci for 20 days after acquisition. First generation of adult whiteflies obtained from viruliferous females did not have the virus as shown by PCR analysis and did not transmit the virus to tomato plants. Out of 34 species of test-plants inoculated with ToYVSV by means of B. tabaci biotype B, only C. annuum, C. amaranticolor, C. quinoa, D. stramonium, G. globosa, N. tabacum cv. TNN and N. clevelandii were susceptible to infection. Attempts to transmit ToYVSV to susceptible hosts mechanically and with Cuscuta campestris failed. B. tabaci biotype B was able to acquire the virus from all susceptible species, transmitting it to tomato test-plants.

Orientador: Renate Krause-Sakate / Banca: Jorge Alberto Marques Rezende / Banca: Valdir Atsushi Yuki / Banca: Julio Massaharu Marubayashi / Banca: Marcelo Agenor Pavan / Banca: Edson Lopes Baldin / Resumo: As cultivares de pimentão (Capsicum annuum L.) são geralmente suscetíveis à infecção por vírus, destacando-se no Brasil espécies dos genêros Potyvirus, Begomovirus, Cucumovirus, Tobamovirus e Tospovirus, sendo que deste último gênero predominam as espécies GRSV (Groundnut ring spot virus) e TCSV (Tomato chlorotic spot virus) no Estado de São Paulo. Devido ao amplo número de hospedeiros infectados pelos tospovírus e a ineficiência do controle químico na transmissão do vírus pelo vetor (tripes), é imprescindível o manejo integrado da doença. Diante disso, o objetivo deste trabalho foi avaliar o uso do defensivo químico piraclostrobina + metiram (P +M) como forma alternativa de controle dos tospovírus GRSV e TCSV no híbrido de pimentão Dahra RX, avaliando-se a produção quantitativa e qualitativa da planta e a influência do produto sobre a quantidade relativa de partículas virais do GRSV. Três experimentos foram realizados paralelamente, sendo dois em campo, dos quais um recebeu pré-tratamento pela aplicação de P + M (4 g. l -1) na bandeja. No experimento em estufa, o pré-tratamento consistiu pela aplicação de P + M (4 g. l -1) no transplante em 50% das plantas (total de 120 plantas). Os tratamentos foram constituídos da inoculação do vírus de forma natural no campo e via extrato vegetal em estufa aos 0, 15, 30, 45 dias após o transplantio (DAT) com ou sem aplicação de P + M (4.0 g. l -1) durante o cultivo. A infecção pelos vírus GRSV/TCSV foi confirmada por PTA- ELISA e a concentração viral via qPCR foi avaliada para as plantas cultivadas em estufa. No experimento realizado em estufa obteve-se 98% das plantas infectadas quando inoculadas via extrato vegetal, enquanto 25% das plantas no campo foram infectadas naturalmente por GRSV ou TCSV, porém com predominância do GRSV. A infecção de plantas deste híbrido pelas espécies GRSV e TCSV até os 45 dias ... / Abstract: The cultivars of pepper (Capsicum annuum L.) are usually susceptible to virus infection, especially by the species of the genus Potyvirus, Begomovirus, Cucumovirus, Tobamovirus and Tospovirus in Brazil. GRSV (Groundnut ring spot virus) and TCSV (Tomato chlorotic spot virus) are the main tospovirus species in São Paulo state. Due to the large host circle of tospovirus and inefficient chemical vector control (thrips) in the virus transmission, the integrated management of the disease is essential. Thus, the aim of this study was to evaluate the use of chemical defensive Pyraclostrobin + Metiram (P + M) as an alternative form of control of tospoviruses GRSV and TCSV in the pepper hybrid Dahra RX, assessing the quantitative and qualitative production of the plant and the product's influence on the concentration of viral particles of GRSV. Three experiments were carried out in parallel, two in the field, one which received pre-treatment by applying P + M (4 g. L -1) on the tray. In the greenhouse experiment, the pre-treatment consisted by application of P + M (4 g. L -1) in the transplanting of 50% of the plants (total 120 plants). The treatments consisted of inoculation of the virus naturally in the field and sap transmission in greenhouse at 0, 15, 30, 45 days after transplanting (DAT) with application or not of P + M (4.0 g. L -1) during cultivation. Infection by GRSV / TCSV virus was confirmed by PTA-ELISA and virus concentration was evaluated by qPCR for plants in greenhouse. In the greenhouse experiment was obtained 98% of infected plants sap transmitted, while 25% of the plants in the field were naturally infected by GRSV or TCSV, but with predominance of GRSV. Infection of plants of this hybrid by GRSV and TCSV until 45 days after transplantation caused considerable damage in the quality and quantity of fruits produced. The use of the product during the cultivation of the hybrid did not affect ... / Doutor

Orientador: Marcelo Agenor Pavan / Coorientador: Renate Krause Sakate / Banca: Marcio Martinello Sanches / Banca: Valdir Atsushi Yuki / Banca: Julio Massaharu Marubayashi / Banca: Antonio Carlos Maringoni / Resumo: Espécies de vírus dos gêneros Potyvirus, Carlavirus e Allexivirus são comumente encontradas na cultura do alho (Allium sativum L.) e em decorrência da sua propagação vegetativa, há o acúmulo de vírus de um ciclo para outro, formando um complexo entre espécies dos gêneros citados. Uma das principais causas da redução da produtividade ocorre devido à infecção por vírus, e a termoterapia associada à cultura de tecido pode ser um método eficiente para limpeza clonal e obtenção de alho semente livre de vírus. O estudo da degenerescência do alho livre de vírus é, portanto, importante para se conhecer o número de ciclos em que o alho semente, inicialmente sadio, pode ser multiplicado no campo, sem que ocorra a redução da produtividade. Neste estudo foi verificado que após três anos a produtividade foi 13,75% superior ao alho 100% infectado por vírus. Os bulbilhos aéreos também podem ser utilizados para a multiplicação de sementes e tem como vantagem o baixo custo quando comparado à utilização de bulbos provenientes da cultura de tecido. Entretanto, essa técnica só se torna viável com a utilização de matrizes isentas de vírus, pois a transmissão de vírus para os bulbilhos aéreos, provenientes de matrizes infectadas, podem chegar a 83,33% no caso dos potyvirus, 20% para carlavirus e 70% para allexivirus, segundo dados obtidos neste trabalho. Realizar uma diagnose precisa dos vírus que infectam o alho torna-se essencial para que não ocorram falhas durante a indexação. Pôde-se observar que para a detecção dos potyvirus, utilizando o teste de ELISA indireto, deve-se utilizar folhas novas, entre 21 e 63 dias após o plantio, pois a concentração viral nesse período é a mais elevada. Diferentes técnicas como o DIBA colorimétrico, DIBA quimioluminescente, ELISA e PCR em tempo real foram avaliadas para detecção do LYSV, aos 21 dias após a inoculação ... / Abstract: Virus species of genera Potyvirus, Carlavirus and Allexivirus are commonly infecting garlic plants (Allium sativum L.). Due to the vegetative propagation, the accumulation of viruses might occur from one cycle to another. The infection of viruses might induce yield losses, and the technique of thermotherapy associated with meristem tip culture is an efficient method to obtain virus-free seeds. The study of degeneration of seeds free of virus is important to know the number of cycles in which garlic may be multiplied in the field without reduction of productivity. In this study it was observed that after three years, the productivity increased 13,75% compared to 100% infected seeds. Currently, aerial bulbils may be used for multiplication of seeds with low cost, compared to meristem tip culture. However, this is a viable technique only if the matrix is free of viruses, because the transmission to aerial bulbils, from infected plants can reach 83.33 % for potyviruses, 20% for carlavirus and 65% for allexivirus, data obtained in this work. An accurate diagnosis in viruses that infect garlic is important to avoid mistakes during indexing material. It was 4 observed that the best time to detect potyvirus, through ELISA test is between 21 and 63 days after planting on young leaves, as the virus concentration is higher in this period. Whem using different techniques, such as the colorimetric DIBA, chemiluminescent DIBA, ELISA, and real-time PCR, it was possible to perform the detection of LYSV 21 days after inoculation. ELISA test detected LYSV only at 21 days after inoculation, whereas using real time PCR, in 5 days after inoculation it was possible to detect the virus due to its high sensitivity. The other tests also detected the virus 21 days after infection / Doutor

Orientador: Renate Krause Sakate / Coorientador: Kelly Cristina Gonçales Rocha / Banca: Edson Luiz Lopes Baldin / Banca: Ricardo Gioria / Resumo: A mosca branca Bemisia tabaci MEAM1, (Hem: Aleyrodidae) é considerada uma das pragas mais ameaçadoras em todo o mundo, principalmente por sua capacidade de transmitir vírus, em especial os begomovírus. Diante da importância desse vírus e de seu vetor, o presente trabalho avaliou a ocorrência de begomovírus em áreas de produção de pimentão. Do total de 83 amostras de pimentão analisadas somente 13 (15,66%) foram positivas para begomovírus, sendo encontradas as espécies já relatadas para o estado de São Paulo: Tomato severe rugose virus (ToSRV) e Tomato yellow vein streak virus (ToYVSV). Verificou-se também a presença de Cucumber mosaic virus (CMV) e tospovírus nas plantas analisadas. O trabalho também teve como objetivo avaliar a resposta de 36 genótipos de Capsicum à infecção pelo ToSRV, à atratividade e à preferência para oviposição por moscas brancas em testes de livre escolha. Após esta análise preliminar, foram selecionados os genótipos C. annuum (IAC-1551; IAC-1566; IAC-1579), C. chinense (IAC-1545; IAC-1549) e C. frutescens (IAC-1544) (assintomático ao vírus e não atrativo ao vetor) e C. baccatum (IAC-1357) (sintomático ao ToSRV e atrativo ao vetor), para as etapas subsequentes. Os genótipos IAC-1566, IAC-1544 e IAC-1357 também foram avaliados quanto à dispersão primária e secundária do ToSRV pela mosca-branca. C. annuum (IAC-1551; IAC-1566; IAC-1579), C. chinense (IAC-1545; IAC-1549) e C. frutescens (IAC-1544) mostraram-se assintomáticos ao isolado de ToSRV avaliado durante 80 dias após inoculação e as médias de oviposição e atratividade variaram de 0,33 a 2,66 ovos/genótipo e 0,25 a 3,50 adultos/genótipo respectivamente, em teste com chance de escolha. No teste sem chance de escolha foi observada baixa atratividade e oviposição de adultos de mosca-branca nos genótipos IAC-1544; IAC-1551; 2 IAC-1579; IAC-1545 e IAC-1549 que diferiram ... / Abstract: The Whitefly Bemisia tabaci MEAM1 (Hem: Aleyrodidade) is considered one of the most threatening pests worldwide, mainly because of its ability to transmit viruses, especially begomoviruses. Given the importance of this virus and its vector, the present study evaluated the of occurrence of begomoviruses in production areas of peppers. Of the total of 83 samples analyzed only 13 (15,66%) were positive for begomovirus, and the two species already reported for state of São Paulo Tomato severe rugose virus (ToSRV) and Tomato yellow vein streak virus (ToYVSV) were detected on the plants. Cucumber mosaic virus (CMV) and tospovirus were also detected on the plants analyzed. We also evaluate 36 genotypes of Capsicum for ToSRV infection, for attractiveness and oviposition preference by whiteflies released in choice experiments. 4 After this preliminary analysis, the genotypes C. annuum (IAC-1551, IAC-1566, IAC-1579), C. chinense (IAC-1545, IAC-1549) and C. frutescens (IAC-1544) (assymptomatic for ToSRV and less attractive for the whitefly) and C. baccatum (IAC-1357) (symptomatic for ToSRV and more attractive for the vector) were selected for the subsequent. The genotypes IAC-1566, IAC-1544 and IAC-1357 were also evaluated for the primary and secondary dispersion of ToSRV by the whiteflies. C. annuum (IAC-1551, IAC-1566, IAC-1579), C. chinense (IAC-1545, IAC-1549) and C. frutescens (IAC-1544) were asymptomatic for ToSRV at 80 days after inoculation and the averages of attractiveness and oviposition ranged from 0.33 to 2.66 eggs / genotype and 0.25 to 3.50 adults / genotype, respectively, with whiteflies released in free choice test. In the no choice test, low attractiveness and oviposition of adult whiteflies were observed for genotypes IAC-1544, IAC-1551, IAC-1579, IAC-1545 and IAC-1549 which were statistically different from IAC -1357. The nymphal development for genotype IAC-1357 was 30.25 ... / Mestre

Orientador: Marcelo Agenor Pavan / Banca: Rumy Goto / Banca: Chukichi Kurozawa / Banca: Romulo Fujito Kobori / Banca: Aniello Antonio Cutolo Filho / Resumo: O Pepper yellow mosaic virus (PepYMV) é o mais importante Potyvirus infectando plantas do gênero Capsicum no Brasil. Desordens fisiológicas comprometem folhas e frutos, tornando-os impróprios para a comercialização. Perdas podem chegar a 100% caso a infecção ocorra no início do cultivo. A resistência genética é a principal forma de controle desta virose. Em 2009 um novo isolado denominado PepYMV-Lins foi detectado quebrando a resistência genética das cultivares comerciais. Este trabalho visou buscar fontes de resistência a este novo isolado, estudar a herança da resistência, incorporar em linhas elites e criar novos híbridos de pimentões resistentes e com boa performance agronômica. Dentre os acessos do banco de germoplasma da empresa Sakata, foram encontradas seis pimentas e dois pimentões que portavam resistência conjunta aos isolados PepYMV e PepYMV-Lins. Estes dois últimos foram escolhidos para continuar os trabalhos de introdução de resistência. O estudo de herança apontou que a resistência genética nos dois acessos de pimentões é monogênica e recessiva. Eles foram cruzados com as linhagens elites de pimentões da empresa com o objetivo de criar híbridos comerciais do tipo cônico. Para acelerar o trabalho de melhoramento foi utilizada a técnica de criação e estabilização de linhagens via duplo haploide. As novas linhagens geradas por esta metodologia foram cruzadas para geração de híbridos. Os novos híbridos mostraram-se resistentes aos isolados PepYMV e PepYMV-Lins. Fora... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: The Pepper yellow Mosaic virus (PepYMV) is the most important Potyvirus infecting plants of Capsicum genus in Brazil. Physiological disorders compromise leaves and fruits, making them unfit for commercialization. Losses can reach 100% if the infection occurs at the beginning of the crop. Genetic resistance is the main way to control this virus. In 2009 a new isolate called PepYMV-Lins was detected breaking the genetic resistance of the commercial varieties. This work aimed to look for sources of resistance to this new isolate, to study the inheritance of resistance, to incorporate in elite inbred lines and to create new hybrids of resistant peppers with good agronomic performance. Among the accessions of the germplasm bank of the company Sakata were six hot peppers and two sweet peppers that carried resistance to PepYMV and PepYMV-Lins isolates. The latter two were chosen to continue the work of introducing resistance. The genetic inheritance study indicated that the genetic resistance in the two accessions of sweet peppers is monogenic and recessive. They were crossed with the company's elite inbred lines with the aim of creating commercial varieties of the conic type. To accelerate the breeding work, the technique of creation and stabilization of double-haploid lines was used. The new inbred lines generated by this methodology were crossed for generation of hybrids. The newly created hybrids were resistant to PepYMV and PepYMV-Lins isolates. They were also evaluated under f... (Complete abstract click electronic access below) / Doutor

Orientador: José Osmar Gaspar / Banca: Júlio César Borges / Banca: Jorge Alberto Marques Rezende / Banca: Marinônio Lopez Cornelio / Banca: Roberto da Silva / Resumo: A expressão de proteínas recombinantes em Escherichia coli produz proteínas que se acumulam como agregados insolúveis conhecidos como corpos de inclusão (CI). As proteínas na forma de CI são biologicamente ativas e com estrutura semelhante à proteína nativa quando a expressão é induzida a baixa temperatura. Estas características e a facilidade em purificar os CIs podem representar uma possibilidade de utilização dos CIs como antígenos para a produção de anticorpos policlonais. O gene da proteína capsidial (CP) do Southern bean mosaic virus (SBMV), um Sobemovirus, foi clonado no vetor pET 28a e a proteína expressa em E. coli a 25 º C. Uma análise comparativa entre a CP recombinante presente na forma de corpos de inclusão e a proteína nativa presente nas partículas virais purificadas foi realizada utilizando a técnica de espectroscopia de infravermelho (FT-IR). Os conteúdos de estruturas secundárias identificados diferiram nos percentuais de folha-β enquanto os percentuais hélices-α foram preservados. Uma estrutura tridimensional foi gerada por modelagem molecular por homologia e comparada com os dados obtidos nas análises de FT-IR. Os percentuais obtidos por FT-IR da CP nativa foram condizentes com os dados gerados por modelagem molecular por homologia. Mesmo com algumas diferenças nos conteúdos de folha- β da CP recombinante foi possível verificar um estado conformacional semelhante à proteína nativa. Os corpos de inclusão contendo a proteína recombinante expressa foram utilizados como antígenos para a imunização de coelhos. O antissoro obtido mostrou ser específico e compatível a um antissoro previamente preparado com partículas virais purificadas do SBMV na detecção do vírus em extratos de feijoeiros infectados utilizando imunoensaios por Western blot, PTA-ELISA, Dot Blot e Tissue Printing... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: The production of recombinant proteins in Escherichia coli yields proteins that accumulate as insoluble aggregates known as inclusion bodies (IBs). Biologically active with native-like structure is trapped inside IBs when the expression is induced at low temperature. These features, and the facility to purify the IBs, can represent a possibility to use the IBs as an antigen for the production of polyclonal antibodies. The coat protein gene of Southern bean mosaic virus, a Sobemovirus, was cloned in the vector pET 28a and expressed in Escherichia coli at 25 ºC. The inclusion bodies containing the recombinant protein were isolated and purified. A comparative analysis between recombinant protein present in the form of inclusion bodies and native coat protein present in the purified virus particles was performed using Fourier transform infrared spectroscopy (FT-IR). The secondary structure contents identified differences in the percentage of β-sheets while α-helices content was much preserved. The three-dimensional structure was generated using molecular modeling and was compared to the data obtained from FT-IR analysis. The percentages obtained from FT-IR analyses of the native CP were consistent with the structure generated through homology molecular modeling. Nevertheless, some differences were present on the content of β-sheets structure of the recombinant CP indicating that the protein conformational state is found in a native like condition. The IBs containing the expressed protein were used as an antigen to immunize rabbits. The antiserum obtained showed to be specific and comparable to one previously prepared with purified SBMV particles, in the virus detection in leaf extracts of infected bean plants using Western blot, PTA-ELISA, Dot Blot and Tissue Printing assays. So, the use of IBs containing recombinant viral proteins to immunize rabbits is a new, easy and very... (Complete abstract click electronic access below) / Doutor

Orientador: Luciana Rossini Pinto / Coorientador: Marcos Cesar Gonçalves / Banca: Janete Apparecida Desidério / Banca: Ricardo Harakava / Resumo: A doença do mosaico da cana-de-açúcar, causada pelo Sugarcane mosaic virus (SCMV), é uma das principais doenças incidentes na cultura. Para compreender a base molecular dessa interação planta-patógeno o presente trabalho objetivou identificar potenciais genes candidatos à resistência ao mosaico através da técnica de cDNA-AFLP utilizando duas variedades contrastantes quanto a resistência ao SCMV (estirpe Rib-1). Plantas das variedades IACSP95-5000 (resistente) e IAC91-1099 (suscetível) obtidas por micromeristemas foram inoculadas com a estirpe Rib-1 em condições controladas de casa de vegetação para a identificação de fragmentos diferencialmente expressos (FDE) nos tempos de 24, 48 e 72 horas após a inoculação (hpi). No total, foram obtidos 772 FDEs, dos quais 392 observados na variedade resistente e 380 na suscetível. As variedades apresentaram comportamento diferencial quanto ao número de FDEs induzidos e reprimidos ao longo dos tempos de amostragens (24, 48 e 72 hpi). A variedade resistente apresentou um número maior de FDEs, correspondentes a prováveis genes induzidos no tempo de 24 hpi em relação a suscetível, diminuindo com o passar do tempo de inoculação, enquanto o número de FDEs correspondentes a prováveis genes induzidos aumentou com o tempo de inoculação na variedade suscetível. Sessenta e seis FDEs foram identificados exclusivamente na variedade resistente, sendo que 9 foram reprimidos e 57 induzidos após a inoculação com o SCMV. Destes 57, 23 foram sequenciados e destes, 10 FDEs mostraram identidade com sequências conhecidas de plantas, sendo a maioria relacionada com mecanismos de defesa da planta contra o patógeno e 3 FDEs não apresentam identidades com sequências descritas e podem exercer papel importante no mecanismo de resistência. A técnica de cDNA-AFLP foi eficiente em revelar alterações do perfil de transcrição dentro ... / Abstract: The sugarcane mosaic disease caused by the Sugarcane Mosaic Virus (SCMV) is a major disease incident in this crop. To understand the molecular basis of the plant pathogen interaction, the present study aimed to identify potential candidate genes for mosaic resistance by cDNA-AFLP technique using two contrasting varieties for SCMV (Rib-1 strain) resistance. Plants of the varieties IACSP95-5000 (resistant) and IAC91-1099 (susceptible) obtained by micro-meristem were inoculated with the Rib-1 strain under greenhouse controlled conditions to the identification of differentially expressed fragments (DEF) at the sampling time points of 24, 48 and 72 hours after inoculation (hpi). In total, 772 DEFs were obtained, of which 392 were observed in the resistant variety and 380 in the susceptible. The varieties showed differential behavior in the number of induced and repressed DEFs during the sampling time points (24, 48 and 72 hpi). The resistant variety produced a higher number of DEFs at 24 hpi (probably corresponding to induced genes) decreasing over the time of inoculation, when compared to the susceptible, in which the number of DEFs increased over the hpi. Sixty-six DEFs were identified exclusively in the resistant variety, of which 9 were repressed and 57 induced after inoculation with SCMV. Of these 57, 23 were sequenced and 10 of them showed identity with known plant sequences, mostly related to mechanisms of plant defense against pathogen, while 3 DFEs have no identities with sequences described in the bank and probably may play an important role in the resistance mechanism. The cDNA-AFLP technique was effective in revealing changes in the transcription profile within and between contrasting varieties when challenged by the mosaic virus. The total set of DFEs can be an important tool in studies to understand the resistance mechanism, as well as for the development of molecular markers to be ... / Mestre

Orientador: Renate Krause Sakate / Coorientador: Laura M. Boykin / Banca: Regiane Cristina Oliveira de Freitas Bueno / Banca: Julio Massaharu Maraubayashi / Banca: Valdir Atsushi Yuki / Banca: Mônika Fecury Moura / Resumo: A mosca-branca, Bemisia tabaci (Gennadius) é uma praga de distribuição global que afeta centenas de diferentes plantas hospedeiras incluindo grandes culturas, olerícolas e ornamentais. B. tabaci causa danos principalmente através da transmissão de vírus de plantas como os begomovirus, crinivirus, ipomovirus, torradovirus e carlavirus. Atualmente, B. tabaci é considerada um complexo de pelo menos 40 espécies crípticas que apresentam diversidade genética, biológica e diferentes composições de bactérias endossimbiontes facultativas. No Brasil, tanto espécies nativas quanto exóticas de mosca-branca são encontradas e ainda há uma escassez de dados genômicos destas populações e das bactérias endossimbiontes. Na África Oriental, altas populações de moscas-brancas estão disseminando diferentes vírus de plantas que causam epidemias na cultura da mandioca (Manihot esculenta) e com perdas na produtividade. A principal forma de manejo desses vírus na África é através da utilização de variedades tolerantes. Portanto, é essencial a identificação de novos genes de resistência para o desenvolvimento de variedades e um manejo eficiente das doenças. O sequenciamento de transcriptomas é uma ferramenta que possibilita uma análise genômica da mosca-branca, dos vírus transmitidos por ela, das bactérias endossimbiontes e das plantas hospedeiras dessa praga. Portanto, os dados genômicos obtidos dão suporte para o desenvolvimento de novas técnicas que podem se tornar futuras alternativas de controle ... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: The whitefly, Bemisia tabaci (Gennadius) is a global pest that affects hundreds of different plant hosts including vegetable, fiber and ornamental crops. B. tabaci causes damage mainly by the transmission of plant viruses such as begomoviruses, criniviruses, ipomoviruses, torradoviruses, and carlaviruses. Currently, B. tabaci is known as a complex of at least 40 putative cryptic species that shows genetic and biological diversity and a different composition of bacterial facultative endosymbionts. In Brazil, both exotic and indigenous species of whiteflies are found and there is still a lack of genomic data available among these populations and also their bacterial endosymbionts. In East Africa, high populations of whiteflies are transmitting different plant viruses that are causing epidemics in cassava crops (Manihot esculenta) and leading to great yield losses. Currently, the management of these viral diseases in Africa is carried out mainly by growing cassava tolerant varieties. Therefore, is essential to identify new target genes for the development of new varieties for an efficient management of viral diseases. Transcriptome sequencing is a tool that allows a genomic analysis of the whitefly, whitefly-transmitted viruses, bacterial endosymbionts and plant hosts. Therefore, the genomic data obtained gives support for the development of new technics that might aid for future management alternatives of whiteflies and their associated viruses. In Chapter 1, transcriptome data were obtained from different B. tabaci species found in Brazil which allowed to obtain complete mitochondrial genomes from different whitefly species and draft genomes of the facultative endosymbiont Hamiltonella. The phylogenetic analysis revealed that the genetic differences among exotic and native populations present in the mtCOI gene extends to the mitochondrial genome and to the facultative endosymbiont Hamiltonella. In ... / Doutor

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, Departamento de Fitopatologia, Programa de Pós-Graduação em Fitopatologia, 2015. / Submitted by Ana Cristina Barbosa da Silva (annabds@hotmail.com) on 2015-05-27T15:15:22Z No. of bitstreams: 1 2015_KarinaNascimentodaSilva.pdf: 2112504 bytes, checksum: 31224eb23b38b4cecca57ec16552a5d9 (MD5) / Approved for entry into archive by Guimaraes Jacqueline(jacqueline.guimaraes@bce.unb.br) on 2015-05-28T14:50:44Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2015_KarinaNascimentodaSilva.pdf: 2112504 bytes, checksum: 31224eb23b38b4cecca57ec16552a5d9 (MD5) / Made available in DSpace on 2015-05-28T14:50:44Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2015_KarinaNascimentodaSilva.pdf: 2112504 bytes, checksum: 31224eb23b38b4cecca57ec16552a5d9 (MD5) / Atualmente o Brasil possui o maior rebanho bovino comercial do mundo, somando 210 milhões de cabeças de gado para a produção de carne, leite e seus derivados. Com isso é o maior exportador de carne do mundo e o 2º maior produtor mundial, representando 16% desse comércio. Considerando a produção de leite, o Brasil ocupa a 3º posição no mercado mundial. Tal produção ocorre em 48% das áreas ocupadas com atividades rurais, que são destinadas as pastagens naturais e cultivadas. As principais plantas forrageiras plantadas no Brasil são dos gêneros Panicum, Brachiaria e Pennisetum, pertencentes à família Poaceae que têm como centro de origem e diversidade o continente africano. Plantas com sintomas de vírus, têm sido frequentemente encontradas, principalmente nos bancos de germoplasma da Embrapa Gado de Corte no estado do Mato Grosso do Sul, e da Embrapa Gado de Leite no estado da Bahia. Devido à falta de conhecimento do agente etiológico, o presente trabalho visou a identificação e caracterização de vírus em plantas forrageiras dos gêneros Panicum, Brachiaria e Pennisetum. Utilizando a plataforma de sequenciamento de alto desempenho Illumina, foi identificado o Johnsongrass mosaic virus. Inicialmente foi realizado um sequenciamento a partir de um acesso de Pennisetum. Posteriormente, foi realizado um segundo sequenciamento usando amostra composta de 5 acessos de Panicum e 5 de Brachiaria. Com esses sequenciamentos foram obtidos dois genomas de JGMV, um com 9828 nt de extensão, excluindo a cauda poli (A) originário do sequenciamento de Panicum e Brachiaria (JGMV-BR), e o outro com 9649 nt de extensão excluindo a poli (A) e a região 5ˊUTR, originário do sequenciamento de Pennisetum (JGMV-Penni). A técnica do 5ˊRACE foi usada para o isolamento da região 5ˊUTR, somente para um vírus JGMV-BR. A 3ˊUTR para cada isolado também foi amplificada e sequenciada. As análises da sequência predita de aminoácidos possibilitaram a dedução dos sítios de clivagem, bem como a identificação das sequências e motivos conservados dentro da sequência de cada proteína. As análises de comparações do genoma de cada vírus revelaram identidade da capa proteica de 77% (nt) do isolado JGMV-BR e 78% (nt) do isolado JGMV-Penni com o JGMV australiano (NC_003606). De acordo com o critério de demarcação de espécie para Potyvirus, em que o limiar para a demarcação de espécie é de 76-77% de identidade nucleotídica, os dois isolados de JGMV são uma estirpe da mesma espécie. As árvores filogenéticas geradas utilizando as sequências nucleotídicas e peptídicas da poliproteína revelaram que os dois isolados brasileiros de JGMV são filogeneticamente relacionados com o JGMV australiano, e ambos são relacionados ao Canna yellow streak virus. Além disso, várias espécies que infectam monocotiledôneas formaram um clado, onde JGMV se insere. A partir da sequência consenso do genoma completo de JGMV-BR, foram sintetizados primers específicos que correspondiam ao gene da capa proteica para a detecção de JGMV. Além disso, para avaliar a diversidade genética de JGMV, a partir dos 11 acessos utilizados no NGS, fragmentos gênicos de CP foram clonados e de 3 a 5 clones foram sequenciados para cada acesso avaliado. A matriz de comparação das sequências nucleotídicas da CP comparados com os isolados australianos e americanos variou de 77 a 82% de identidade nucleotídica. A árvore filogenética utilizando a sequência nucleotídica da CP, indica a presença de ao menos duas linhagens de JGMV, uma circulando nos EUA/Austrália e outra no Brasil. Além disso, é possível observar que alguns isolados de vírus foram encontrados em mais de um acesso e determinados acesso demostraram a presença de mais de um isolado. Assim, como resultado deste trabalho, foi realizado o primeiro relato de JGMV no Brasil. / Currently, Brazil has the largest commercial herd in the world, totaling 210 million head of cattle, for the production of meat, milk and dairy products. This makes it the largest exporter in the world meat and the 2nd largest producer, accounting for 16% of this trade. Considering milk production, Brazil is ranked 3rd in the world market. This production occurs in 48% of areas occupied by rural activities, which are used natural and cultivated pastures. The main forage crops planted in Brazil are Panicum, Brachiaria and Pennisetum, all belonging to the Poaceae family whose center of origin and diversity is in Africa. Plants with symptoms of virus have often been found, mainly in germoplasm banks Embrapa Beef Cattle in Mato Grosso do Sul, and the Embrapa Dairy Cattle in the state of Bahia. Due to lack of knowledge of the etiologic agent, the present study aimed to identify and characterize viruses in forages of Panicum, Brachiaria and Pennisetum. Using high performance platform Illumina sequencing, was identified Johnsongrass mosaic virus. Initially, sequencing was carried out from a Pennisetum line. A second sequencing was done using 5 of Panicum and 5 of Brachiaria lines. Thus, two genomes were obtained from JGMV, one with 9828 nt in length, excluding the poly (A) tail, from Panicum and Brachiaria (JGMV-BR), and the other with a length of 9649 nt, excluding the poly (A) and the 5ˊUTR region, from Pennisetum (JGMV-Penni). The 5ˊRACE technique was used for isolation of the 5ˊUTR of JGMV-BR. The 3ˊUTR for each isolate was also amplified and sequenced. Analysis of the predicted amino acid sequence permitted the deduction of the cleavage sites and the sequences and identifying the conserved motifs within the sequence of each protein. The genome comparisons analysis of each virus revealed identity of the coat protein of 77% (nt) of JGMV-BR and 78% (nt) of JGMV-Penni with JGMV Australian (NC_003606). According to the demarcation criterion for Potyvirus, where the threshold for species differentiation is 76-77% nucleotide identity, the two JGMV are isolated from a strain of the same species. Phylogenetic trees generated using the nucleotide and peptide sequence of the polyprotein revealed that the two Brazilian isolates of JGMV are phylogenetically related to the Australian JGMV, and both are related to Canna yellow streak virus. In addition, several species that infect monocots formed a clade where JGMV groups. From the consensus sequence of the complete genome of JGMV-BR specific primers were synthesized which corresponded to the gene for the coat protein detection JGMV. Furthermore, to evaluate the genetic diversity of JGMV, from 11 lines used in NGS CP gene fragments were cloned and 3 to 5 clones were sequenced for each lines evaluated. The comparison of the nucleotide sequences of the matrix CP compared with the Australian and American isolates ranged 77-82% nucleotide identity. The phylogenetic tree using the nucleotide sequence of CP indicates the presence of at least two strains of JGMV, one circulating US / Australia and other in Brazil. Furthermore, it is possible to observe that some virus isolates were found in more than one line and certain line demonstrated the presence of more than one isolated. Thus, as a result of this work, we performed the first report of JGMV in Brazil.