Tese (doutorado)—Universidade de Brasília, Departamento de Biologia Celular, Instituto de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Biologia Molecular, 2018. / Submitted by Fabiana Santos (fabianacamargo@bce.unb.br) on 2018-09-04T20:45:35Z No. of bitstreams: 1 2018_RayaneNunesLima.pdf: 6996950 bytes, checksum: 2e6db0e375cb5a8815dab21b4f9cf1c0 (MD5) / Approved for entry into archive by Fabiana Santos (fabianacamargo@bce.unb.br) on 2018-09-11T18:44:15Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2018_RayaneNunesLima.pdf: 6996950 bytes, checksum: 2e6db0e375cb5a8815dab21b4f9cf1c0 (MD5) / Made available in DSpace on 2018-09-11T18:44:15Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2018_RayaneNunesLima.pdf: 6996950 bytes, checksum: 2e6db0e375cb5a8815dab21b4f9cf1c0 (MD5) Previous issue date: 2018-09-04 / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPQ). / O rápido progresso na compreensão dos mecanismos de enovelamento de proteínas e os avanços no campo da bioinformática forneceram ferramentas confiáveis para predizer as estruturas tridimensionais de proteínas de vírus de plantas. Por meio de Modelagem Estrutural por Homologia, foi possível obter um modelo tridimensional para a proteína do nucleocapsídeo (NP) e a proteína não estrutural do segmento S (NSs) de GRSV (Groundnut ringspot orthotospovirus) e para a NP de ZLCV (Zucchini lethal chlorosis orthotospovirus). Verificou-se que os monômeros GRSV NP e ZLCV NP são organizadas em um domínio globular (33-223 aa) contendo uma cavidade carregada positivamente para interação com RNA e com as duas cadeias terminais, formando um braço N-terminal (1-32 aa) e um braço C-terminal (224-258 aa). Além disso, a análise da estrutura tridimensional da proteína NSs de GRSV sugeriu uma possível atividade enzimática de fosfatase, para o metabolismo de nucleotídeos assim como um possível domínio de interação com a proteína Argonauta 1. A proteína NSs foi expressa de forma nativa e purificada para futuros ensaios de cristalização. Assim, as estruturas das NP e NSs podem lançar luz sobre os mecanismos de formação de RNP e silenciamento gênico e podem permitir a identificação de resíduos essenciais de aminoácidos como possíveis alvos para estratégias de controle das doenças causadas pelos orthotospovírus. Por fim, por meio da técnica de duplo híbrido em levedura, foi encontrada uma possível interação entre a proteína AtCSN5a e as proteínas NP e NSs de GRSV, e a relevância dessas interações para o sistema planta-vírus ainda serão investigadas. / The rapid progress in the understanding of protein folding mechanisms and the advances in the bioinformatics field have provided reliable tools for modeling and predict three-dimensional structures of plant virus proteins. Using Homology modeling technique, it was possible to obtain three-dimensional models for both NP and NSs of GRSV (Groundnut ringspot orthotospovirus) and for ZLCV NP (Zucchini lethal chlorosis orthotospovirus). GRSV NP and ZLCV NP monomers have been organized into a globular domain (33-223 aa) containing a positively charged cavity for RNA interactions, and two terminal chains forming an N-terminal arm (1-32 aa) and a C-terminal arm (224-258 aa). In addition, a three-dimensional structure of the GRSV NSs protein revealed a possible phosphatase enzymatic activity for nucleotide metabolism and a possible interaction domain with an Argonaute 1. Moreover, the NSS protein was natively expressed and purified for future crystallization assay. Thus, the proposed models can shed light on the mechanisms of RNP formation and gene silencing and may allow the identification of essential amino acid residues as possible targets for the orthotospovirus control strategy. Finally, using yeast two-hybrid technique, a possible interaction between the AtCSN5a protein and the NP and NSS of GRSV was found; however, the relevance of these interactions for the plant-virus system remains to be investigated.

Orientador: José Osmar Gaspar / Banca: Mário Tyago Murakami / Banca: Marinônio Lopes Cornélio / Resumo: No Brasil, foram descritas mais de dez viroses em feijoeiro, citando-se aquela causada pelo Southern bean mosaic virus (SBMV) do gênero Sobemovirus. Este vírus tem uma restrita gama de hospedeiras, confinada quase exclusivamente a espécies da família das leguminosas, sendo algumas de interesse econômico como o feijoeiro comum e a soja. O SBMV é a espécie tipo do gênero, possui partículas isométricas (28-30nm) contendo RNA genômico de 4-4,5kb com polaridade positiva e proteína capsidial com massa molecular de 29-30 kDa. O genoma do SBMV é constituído por quatro Open Reading Frames (ORFs) com sobreposição entre elas. A ORF 1 codifica uma possível proteína do movimento, a ORF 2 uma poliproteína, que por clivagem, origina três produtos funcionais: uma serino protease, uma proteína ligadora do genoma viral (VPg) e uma polimerase com atividade relacionada à replicação do RNA viral (RNA polimerase RNA-dependente, RpRd). Dentro da ORF 2 encontra-se a ORF 3, que codifica uma proteína de função desconhecida. A ORF 4 codifica a proteína capsidial, traduzida a partir de um RNA subgenômico. O presente trabalho consiste na expressão da proteína P1 do SBMV-SP em Escherichia coli, sua purificação e a posterior utilização para a produção de antissoro policlonal. As atividades realizadas compreenderam a purificação das partículas virais do SBMV isolado São Paulo (SBMV-SP) a partir de folhas infectadas de Phaseolus vulgaris 'Jalo', obtenção do RNA viral a partir de partículas purificadas, produção de cDNA utilizando primer anti-senso, amplificação do gene da proteína do movimento, purificação do fragmento amplificado, ligação em vetor de multiplicação pGEM-T, transformação em células competentes de Escherichia coli linhagem TOP 10, purificação do vetor, corte enzimático com as enzimas Bam HI e Hind III, subclonagem nos vetores de expressão... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: In Brazil, more than ten bean viroses were described, including the one caused by Southern bean mosaic virus (SBMV) from genus Sobemovirus. This virus has a strict host range, confined almost exclusively to species from leguminosas family, and some of them have economic importance, like the common bean and soya. SBMV is the type species from this genus, has isometric particles (28-30nm) that contains genomic RNA of 4-4,5kb with positive polarity and a capsidal protein with molecular mass of 29-30kDa. SBMV genome consistis of four Open Reading Frames (ORFs) with overlap between them. ORF 1 encodes a possible movement protein, ORF 2 a poliprotein, which origin three functional products by clivage: a serin protease, a viral genomic biding protein (VPg) and a polimerase. Inside ORF 2 is situated the ORF 3, that encodes a protein with unknow function. ORF 4 encodes the capsidal protein, translated by a subgenomic RNA. The activities performed until this moment were the purification of SBMV isolated São Paulo(SBMV-SP) viral particles, obtention of viral RNA from SBMV purified partcles, cDNA production using anti-sense primer, amplification of the supposed gene of movement protein, purification of the amplified fragment and later biding on expression vector pGEM-T. The recombinat vector were transformed in Escherichia coli cells competent and than purified and digested with Bam HI and Hind III enzime. The released fragment was subcloned in pMAL and pET28a, which were used on competent cells for expression tests. Analysis of gel poliacrialamida showed the efficiency of tests of expression. Using pET28a was observed an expression of a protein of approximately 22 kDa (17 kDa relating to MP + 5 kDa relating to the tail of histidine) which was purified in resin Ni-NTA by affinitive chromatography.Using pMAL was observed an expression of a protein of approximately... (Complete abstract click electronic access below) / Mestre

Orientador: Raghuvir Krishnaswamy Arni / Banca: Andréia Estela Moreira de Souza / Banca: Priscila Belintani / Banca: Anwar Ullah / Banca: José Ramon Beltran Abrego / Resumo: O Cole latent virus (CoLV) é um fitovírus cuja principal hospedeira é a couve comum. Pertence ao gênero Carlavirus, que é constituído por vírus que infectam diversos grupos de plantas, incluindo aquelas de grande importância econômica no mundo, como a batata, a soja, o amendoim e o milho. O Pepper ringspot virus (PepRSV) foi descrito no Brasil no início dos anos 60, sendo caracterizado como integrante do gênero Tobravirus, podendo causar danos a culturas como tomate e pimentão. Até o momento, o ciclo de vida desses vírus não é completamente conhecido. Sabe-se que algumas proteínas virais são essenciais na infecção. Dentre estas, a proteína capsidial (CP), a do movimento (MP) e a helicase (HEL) que ainda não possuem estruturas definidas. Desta forma, o trabalho teve como objetivo analisar a estrutura da proteína capsidial do Cole latent virus (CP-CoLV); da proteína do movimento do Pepper ringspot vírus (MP-PepRSV) e de um fragmento da helicase do Pepper ringspot virus (HEL-PepRSV). Vetores de expressão, contendo as sequências de interesse, foram transformados. Nos testes de indução de expressão a 37°C observou-se a formação de corpos de inclusão para as três proteínas em questão. Após lavagem dos corpos de inclusão, as proteínas purificadas foram reenoveladas e concentradas. Após reenovelamento, a CP-CoLV e a MP-PepRSV foram analisadas por dicroísmo circular para verificar o seu conteúdo de estrutura secundária. Essa análise confirmou a eficiência do processo de reenovelamento. A CP-CoLV também foi analisada por espalhamento dinâmico de luz, para estimar a distribuição de tamanho das populações de partículas que estão presentes na solução. Os dados do espalhamento dinâmico de luz mostraram que a proteína encontra-se estável e monodispersa. Dessa forma, dentre as proteínas estudadas, a CPCoLV apresentou melhores condições para os testes de cristalização. Através da expressão a 18°C, ... / Abstract: The Cole latent virus is a plant virus which infects mainly the common cole. It is a member of Carlavirus genus, which contains viruses that infect several plant groups, including those of great economic importance worldwide, as potato, soy, peanut and corn. The Pepper ringspot virus was first described during the 60's in Brazil. It is characterized as member of Tobravirus genus and it can damage to cultures as tomato and pepper. Until now, the viral life cycle is not completely elucidated. It is known that some viral proteins are essential for infection, including the capsid protein (CP), movement protein (MP) and helicase (HEL). Those proteins do not have the structure determined, yet. Therefore, this work aimed the structural study of the capsid protein of Cole latent virus (CP-CoLV); movement protein of Pepper ringspot virus (MPPepRSV) and a helicase fragment of Pepper ringspot virus (HEL-PepRSV). Expression vectors containing sequences of interest were transformed Tests for protein expression at 37°C resulted in formation of inclusion bodies for the three tested proteins. The proteins present in inclusion bodies were solubilized and purified under denaturing conditions. The purified proteins were refolding by dialysis and concentrated. After refolding CoLV-CP and MP-PepRSV were analyzed by circular dichroism to check its secondary structure content. This analysis confirmed the refolding efficiency. The CP-CoLV was also analyzed by Dynamic Light Scattering to estimate the size distribution of particle populations which are present in the solution. The data of the dynamic light scattering showed that the protein is stable and monodisperse. Thus, among the proteins studied, the CP-CoLV showed better conditions for crystallization trials. When expressed at 18°C, it was possible to obtain the CP -CoLV in its native state. The protein was purified under non-denaturing and analyzed by infra-red spectroscopy. Using homology molecular ... / Doutor

Orientador: Renate Krause Sakate / Coorientador: Julio Massaharu Marubayashi / Banca: Enrico Moriones Alonso / Banca: Antonio Carlos Maringoni / Banca: Marcelo Augusto Boechat Morandi / Banca: Valdir Atsushi Yuri / Banca: Kelly Cristina Gonçalves Rocha / Resumo: A mosca - branca, Bemisia tabaci (Gennadius) , é um complexo composto por pelo menos 36 espécies crípticas. É uma das mais importantes pragas agrícolas do mundo, sendo vetora de fitovírus, como os begomovírus (gênero Begomovirus , família Geminiviridae ) e cri nivírus (gênero Crinivirus , família Closteroviridae ) que causam sérios problemas em plantas de diversos países do mundo. Desde o final dos anos 80, a espécie Middle East - Asia Minor 1 - MEAM1 (conhecida como biótipo B) tem emergido em muitas regiões tropica is e subtropicais do mundo, deslocando as populações de B. tabaci até então existentes nestas regiões. Trabalhos prévios demonstraram que no Brasil apesar de MEAM1 predominar, existem duas espécies nativas chamadas de New World (NW, também conhecida como b iótipo A) e New World 2 encontradas no Estado de São Paulo. No primeiro capítulo da tese intitulado "Indigenous American species of the Bemisia tabaci complex are still widespread in the Americas" ficou evidenciado que MEAM1 não dizimou completamente as mo scas brancas nativas. NW está presente ao menos na Argentina, Brasil, Ilha de Martinica, México, E stados Unidos e Venezuela , enquanto que foi detectada NW2 na Argentina, Bolívia e Brasil. Espécies invasoras ( Euphorbia sp. e Ipomoea sp.), assim como plantas cultivadas como o tomateiro, soja e algodão podem ser hospedeiras de NW e NW2 . Outra espécie altamente invasiva que merece atenção é a Mediterranean (MED, também conhecida por biótipo Q), por apresentar resistência à maioria dos inseticidas utilizados na agricultura. O segundo capítulo intitulado "First report of ... / Abstract: The whitefly Bemisia tabaci (Gennadius) is a com plex of at least 36 cryptic species. It is one of the most important agricultural pests in the world, being vector of begomoviruses (genus Begomovirus , family Geminiviridae ) and crinivirus (genus Crinivirus , family Closteroviridae ) that cause serious probl ems in plants in many countries worldwide. Since the late 80s, the Middle East - Asia Minor 1 species - MEAM1 (known as biotype B) has emerged in many tropical and subtropical regions of the world, displacing native populations of B. tabaci . Previous work de monstrated that in Brazil at least two indigenous species called New World (NW, formerly the A biotype) and New World 2 (NW2) were still present in São Paulo State. Our first chapter entitled "Indigenous American species of the Bemisia tabaci complex are s till widespread in the Americas" highlight that MEAM1 has not completely displaced the native B. tabaci from the Americas. NW is present at least in Argentina, Brazil, Martinique, Mexico, United States and Venezuela, and NW2 in Argentina, Bolivia and Brazi l. Wild plants ( Euphorbia sp. and Ipomoea sp.) as well ... / Doutor

Orientador: Dirceu Maximino Fernandes / Banca : Roberto Lyra Villas Bôas / Banca: Marcelo Agenor Pavan / Banca: Rosemary Marques de Almeida Bertani / Banca: Pablo Forlan Vargas / Resumo: A utilização de plantas livres de vírus, associada a outrastecnologias, pode proporcionar maior produtividade no cultivo de alho vernalizado. Noentanto, essas plantas apresentam comportamento produtivo distinto das plantas infectadas,tornando necessária a adequação das técnicas de manejo empregadas na cultura até então.Estudos sobre a nutrição das plantas de alho livres de vírus ainda não são conclusivos.Visando alcançar alta produtividade, e considerando as características dos solos tropicais,os adubos fosfatados têm sido utilizados em altas doses. Então, o presente trabalho teve oobjetivo de verificar o efeito da adubação fosfatada no cultivo de alho vernalizado livre devírus. Para tanto foram conduzidos três experimentos em anos subsequentes, em área deprodução, na região de Santa Juliana - MG. No primeiro experimento foram avaliadasduas fontes (100% superfosfato simples: SS e 50% superfosfato simples + 50%termofosfato: SS+T) e 5 doses de fósforo (0, 100, 200, 300, 400 mg dm-3) em 4 repetições.Observou-se que houve pouca influência das fontes de fósforo utilizadas nos resultados eque as maiores doses de P utilizadas ocasionaram redução na produção e qualidade dosbulbos. No experimento 2 foram avaliadas 5 doses de P (0, 70, 140, 210, 180 e 350 mg dm-3) em 4 repetições, utilizando-se a fonte SS+T. Verificou-se que, da mesma forma que noprimeiro experimento, nas doses mais elevadas de P ocorreu redução da produção. Devido a uma chuva ocorrida... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: The use of virus-free garlic plants, associated with other technologies can increased productivity in vernalized garlic growing. However, these plants have different productive behavior from the infected plants, requiring the adequacy of management techniques used for the culture until then. Studies on virus-free garlic plants nutrition of are not conclusive. In order to achieve high productivity and considering the characteristics of tropical soil, phosphate fertilizers have been used in high doses. So, this study aimed to vertify the effect of phosphate fertilization on vernalized virus-free garlic growing. Therefore three experiments were carried out in subsequent years in growing field, in the Santa Juliana - MG. In the first experiment were evaluated two sources (SS and SS + T) and 5 doses of phosphorus (0, 100, 200, 300, 400 mg dm-3) in 4 replications. It was observed that the results were little influenced by the P sources and that higher doses of P applied occasioned reduction in yield and quality of the bulbs. In experiment 2 were evaluated five doses of P (0, 70, 140, 210, 180 and 350 mg dm-3) in 4 replicates using SS+T. It was found that, as in the first experiment, at the higher doses of P, there was a decrease of production. Due to a rain occurred in the differentiation stage, there was incidence of secondary bulb growth and it was verified that plants with this anomaly increased with P doses rising. The third experiment was carried out evaluating five levels of P (0, 50, 100, 150, 200 and 250 mg dm-3) in 4 replicates and it was also verified that there was a decrease in production at the highest dose. The use of 200 mg dm-3 of P, with the source superphosphate + thermophosphate, in soil with high phosphorus initial level, provided higher yield and percentage of bulbs in more valued classes ... / Doutor

Orientador: José Osmar Gaspar / Banca: Hugo Kuniyuki / Banca: Fátima Pereira de Souza / Resumo: O lenho estriado de rupestris ou cascudo (Rupestris stem pitting - RSP), um dos componentes do Complexo do lenho rugoso ("Rugose wood" - RW), é considerado uma das doenças de videira transmitidas por enxertia de grande relevância econômica para a viticultura. O Rupestris stem pitting associated virus - RSPaV foi associado com a doença do lenho estriado ou cascudo, sendo classificado como espécie do gênero Foveavirus, pertencente a família Flexiviridae. No presente trabalho, descrevem-se o sequenciamento do gene da proteína capsidial (CP) de um isolado brasileiro do RSPaV (RSPaV-SP), sua expressão em Escherichia coli, purificação da proteína capsidial recombinante e a produção de anti-soro policlonal em coelho. O sequenciamento do gene resultou em uma seqüência de 780 nucleotídeos e 259 aminoácidos deduzidos com massa molecular estimada de 28 kDa. A análise filogenética, entre a seqüência correspondente à CP do RSPaV-SP e outras variantes do mesmo vírus, evidenciou a formação de 4 grupos distintos, sendo o isolado brasileiro incluído no grupo da variante BS do RSPaV. A proteína capsidial recombinante foi purificada em coluna de afinidade e apresentou massa molecular estimada de 32kDa (4kDa da seqüência do vetor e 28kD da CP do RSPaV-SP). O anti-soro produzido apresentou-se específico na detecção da proteína capsidial recombinante purificada por "Western-blot", sem reação com proteína heteróloga a partir da diluição 1:4000. Nesta diluição, o anti-soro foi efetivo na detecção do vírus em extratos de plantas infectadas, sendo que nenhuma reação foi observada com extratos de plantas sadias. Considerando-se que este vírus apresenta variações de concentração na planta durante as estações do ano, e que, os testes sorológicos foram realizados durante a estação de baixa concentração do vírus, os resultados ...(Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Rupestris stem pitting (RSP), a component of the rugose wood (RW) complex, is one of the most graft-transmissible grapevine virus diseases with great economic importance for viticulture . Rupestris stem pitting-associated virus (RSPaV), genus Foveavirus within the family Flexiviridae, has been associated with this disease. This work reports the sequencing of the coat protein (CP) gene of a brazilian an isolate of RSPaV (RSPaV-SP), its expression in Escherichia coli, purification of the recombinant coat protein and production of a polyclonal antiserum in rabbit. CP gene was found to be 780nt long, with a 256 deduced amino acid sequence encoding a predicted protein of 28 kDa. In filogenetic analysis, with RSPaV-SP and other variants of the virus, four groups were found and the sequence of RSPaV-SP showed the highest identity with the variant RSPaV-BS. The recombinant coat protein was purified by affinity chromatography and showed a molecular weight of 32kDa (4 kDa from a small vector sequence plus 28 kDa for the CP of RSPaV-SP). The antiserum proved specific for detection of the recombinant protein by Western Blot, and did not react with heterologous proteins starting at a dilution of 1:4000. At this dilution, the antiserum was effective in the virus detection of leaf extracts of infected plants and no reaction was observed with extracts from healthy grapevines. Considering that the virus is found at low concentrations in the plants during the seasons of the year, the results obtained so far were highly satisfactory for RSPaV detection. Serological methods have advantages over the biological indexing method, since they are cheaper and can be used in large-scale tests such as ELISA. Experiments using the ELISA technique were not successful. Purification of the native recombinant protein would be an alternative more efective to detect the virus using these technique. / Mestre

Resumo: O Bidens mosaic virus (BiMV) é uma espécie tentativa de vírus do gênero Potyvirus e tem sido encontrado em culturas de importância econômica como ervilha e girassol. Recentemente foi proposto que o BiMV poderia ser uma estirpe do Potato virus Y (PVY). Em 2004 amostras de alface apresentando mosaico intenso, coletadas no município de São Manuel - SP, apresentavam-se infectadas pelo BiMV. Foi realizada a caracterização biológica, o sequenciamento parcial e a purificação deste isolado para obtenção de anti-soro policlonal. Verificou-se que este isolado possui gama de hospedeiros restrita à alface, Chenopodium quinoa, Chenopodium amaranticolor e ervilha (Pisum sativum) de forma assintomática. O vírus possui uma proteína capsidial em torno de 33 kDa e padronizou-se um teste de PTAELISA para o diagnóstico sorológico deste vírus. Também foi realizada a caracterização biológica e avanços no sequenciamento do genoma de um isolado de BiMV coletado a partir da planta de Bidens pilosa (picão preto). Este isolado foi capaz de infectar e causar sintomas em girassol (Helianthus annus), alface (Lactuca sativa), ervilha (Pisum sativum), C. quinoa, C. amaranticolor, Nicotiana benthamiana, N. clevelandii, N. occidentalis, Zinnia elegans e em Gomphrena globosa, nesta última de forma assintomática. Através do sequenciamento de um fragmento de 7.945 bp, correspondente à parte do gene da HC-Pro e dos genes da P3, 6K1, CI, 6K2, VPg, NIa, NIb, CP e à região 3'UTR, verificou-se que o BiMV é possivelmente uma espécie distinta do PVY, baseando-se nos atuais critérios para demarcação de espécies do International Committee on Taxonomy of Viruses (ICTV). Foram obtidos oligonucleotídeos específicos para diagnose do BiMV, que através de RT-PCR em uma só etapa, detectam eficientemente o vírus a partir de alface e de plantas daninhas associadas à cultura. Através desta técnica... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Bidens mosaic virus (BiMV) is a tentative species of the genus Potyvirus, and has been commonly found infecting pea and sunflower. Recently it was proposed that BiMV could be a member of the Potato virus Y (PVY) species. In 2004 lettuce plants showing intense mosaic symptoms were collected in São Manuel-SP and were infected with BiMV. The host range of this isolate was characterized, the genome partially sequenced and the virus was purified to obtain a polyclonal antiserum. The host range for this isolate was restricted to lettuce, Chenopodium quinoa, Chenopodium amaranticolor and pea (Pisum sativum) (assymptomatic). The virus has a coat protein with approximately 33 kDa and the antiserum could be used for serological diagnosis by PTA-ELISA tests. A BiMV isolate from Bidens pilosa was also studied in this work. This isolate infected sunflower (Helianthus annus), lettuce (Lactuca sativa), pea (Pisum sativum), C.quinoa, C. amaranticolor, N. benthamiana, N. clevelandii, N. occidentalis, Zinnia elegans and Gomphrena globosa (assymptomatic). A fragment of 7.945bp including part of the HC-Pro, the entire genes for P3, 6K1, CI, 6K2, VPg, NIa, Nib, CP and the 3'UTR region was sequenced. Based on the International Committee on Taxonomy of Viruses (ICTV) criteria of potyvirus species demarcation using the individual genes, BiMV could be considered a distinct species of PVY. Specific primers were obtained for BiMV diagnosis and efficiently used in a one step RT-PCR test for BiMV diagnoses. A total of 222 lettuce and 126 weeds samples were collected in the lettuce growing areas of Mogi das Cruzes, Campinas and Bauru and analysed by RT-PCR. Low incidence of BiMV was verified on lettuce. The presence of BiMV was also observed on B. pilosa and Galinsoga parviflora. This last plant species was identified as a new host of BiMV and Lettuce mottle virus (LeMoV) in this study. / Orientador: Renate Krause Sakate / Coorientador: Marcelo Agenor Pavan / Banca: Norberto da Silva / Banca: Marli Teixeira de Almeida Minhoni / Banca: Antonio Carlos Maringoni / Banca: Valdir Atsushi Yuki / Banca: Romulo Fujito Kobori / Doutor

Orientador: Marcelo Agenor Pavan / Coorientador: Renate Krause Sakate / Banca: Kelly Cristina Gonçalves Rocha / Banca: Jorge Alberto Marques Rezende / Resumo: As doenças causadas por vírus são um dos principais entraves sanitários nos sistemas de produção de orquídeas, uma vez que promovem consideráveis danos ao seu valor comercial, já que afetam diretamente sua estética e produtividade. São escassos os estudos relacionados aos principais vírus que ocorrem nessa planta ornamental em condições brasileiras. Em termos mundiais, Cymbidium mosaic virus (CymMV) e Odontoglossum ringspot virus (ORSV) prevalecem e são os vírus de maior importancia econômica.Tendo em vista esta questão, o presente trabalho objetivou avaliar, através de métodos sorológicos e moleculares, 385 amostras pertencentes a diferentes gêneros de orquídeas oriundas do estado de São Paulo a fim de estabelecer qual o(s) de maior importância fitossanitária. A análise de detecção foi realizada atraves do Enzyme linked immunossorbent assay (ELISA), com os antissoros comerciais contra: CymMV, ORSV, Cymbidium ringspot virus (CymRSV), Tomato spotted wilt virus (TSWV) e para o gênero Potyvirus. Para a análise de variabilidade, oligonucleotídeos foram desenhados para amplificar a região codificadora da proteína capsidial do CymMV e ORSV, bem como foi obtido da literatura um par de primers para detecção do Orchid fleck virus (OFV). O vírus de maior prevalência foi o CymMV, presente em 274 amostras (71,16%), seguido do ORSV presente em 61 amostras (15,85%), e OFV em 11 amostras (2,85%). Os demais vírus testados não foram identificados em nenhuma das amostras analisadas. Os sintomas causados pelo CymMV e ORSV são muito variaveis, além de serem confundidos com fatores abióticos, problemas nutricionais e fitotoxidez. Aparentemente a expressão de sintomas está relacionada ao gênero e idade da planta, bem como aos fatores climáticos das regiões de cultivo. Quanto a variabilidade... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Diseases caused by viruses are a major constraint in the production systems of orchids, as they promote considerable damage to its commercial value, as it directly affects their productivity and aesthetics. There are few studies related to major viruses that occur in this ornamental plant in the Brazilian conditions. Globally, Cymbidium mosaic virus (CymMV) and Odontoglossum ringspot virus (ORSV) are prevalent and the virus of greatest economic importance. Considering this issue, the present study aimed to evaluate, through serological and molecular methods, 385 samples of different orchid genera from São Paulo state in order to establish what is(are) the most important virus(es). As for the Enzyme linked immunossorbent assay (ELISA), commercial antisera were used against: CymMV, ORSV, Cymbidium ringspot virus (CymRSV), Tomato spotted wilt virus (TSWV) and the genus Potyvirus. Primers were designed to amplify the coding region of the capsidial protein CymMV and ORSV and a pair of primers for detection of Orchid fleck virus (OFV) was obtained from the literature. The the most prevalent virus was CymMV, present in 274 samples (71.16%), followed by ORSV present in 61 samples (15.85%) and OFV in 11 samples (2,85%). The other viruses tested were not identified in any of the samples analyzed. Symptoms caused by CymMV and ORSV are very variables, and are commonly confused with abiotic factors, nutritional problems and phytotoxicity. Apparently is related to gender and age of the plant, as well as the climate factors. As the genetic variability of CymMV e ORSV, was observed nucleotide identity... (Complete abstract click electronic access below) / Mestre

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, Departamento de Fitopatologia, Programa de Pós-Graduação em Fitopatologia, 2014. / Submitted by Albânia Cézar de Melo (albania@bce.unb.br) on 2014-06-09T16:07:15Z No. of bitstreams: 1 2014_JulianaOsseSouza.pdf: 1384800 bytes, checksum: d15414d5237039b2bcdb7ceef53ed647 (MD5) / Approved for entry into archive by Guimaraes Jacqueline(jacqueline.guimaraes@bce.unb.br) on 2014-06-11T11:28:14Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2014_JulianaOsseSouza.pdf: 1384800 bytes, checksum: d15414d5237039b2bcdb7ceef53ed647 (MD5) / Made available in DSpace on 2014-06-11T11:28:14Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2014_JulianaOsseSouza.pdf: 1384800 bytes, checksum: d15414d5237039b2bcdb7ceef53ed647 (MD5) / O tomateiro (Solanum lycopersicum) é uma cultura de grande importância econômica, em todo o mundo, incluindo o Brasil. O cultivo é realizado em todo o Brasil, mas sua produção está concentrada nos estados da região centro-sul, sendo Goiás o maior estado produtor, tanto em área quanto em volume de produção. Apesar da importância da região centro-sul para a tomaticultura, a região Nordeste possui uma expressiva área de cultivo, todavia esta região apresenta uma baixa produtividade. Dentre os problemas fitossanitários que atingem o tomateiro podem-se citar doenças causadas por fungos, bactérias, nematoides e vírus, as viroses mais importantes estão o complexo de espécies do gênero Tospovirus que causam o vira-cabeça do tomateiro, o mosaico do tomateiro causado pelo Tomato mosaic virus, os potyvírus Potato virus Y e Pepper yellow mosaic virus, o crinivírus Tomato chlorosis virus e o mosaico dourado do tomateiro, causado por várias espécies do gênero Begomovirus. Esses vírus são transmitidos por aleirodídeos (moscas-brancas) e causam a doença mais séria do tomateiro na atualidade. Os vírus do gênero Begomovirus são caracterizados por partícula icosaédrica geminada e possuir DNA circular de fita simples. O seu genoma é constituído de apenas um componente (monopartido) ou dois componentes conhecidos como DNA-A e DNA-B (bipartido). A identificação do vírus é baseada na análise e comparação do genoma do DNA-A dos isolados. As espécies de begomovírus apresentam uma distribuição geográfica bem definida, em geral, os monopartidos são encontrados no Velho Mundo e os bipartidos são encontrados no Novo Mundo. No Brasil foram relatadas onze espécies de begomovírus infectando tomateiro, além delas existem mais, pelo menos, seis espécies ainda em processo de caracterização. As espécies de begomovírus em tomateiros relatadas no Brasil são encontradas apenas no país e todas são bipartidas. Dentro do Brasil, há uma aparente distribuição diferenciada de espécies. Sabe-se que o Tomato severe rugose virus (ToSRV) é predominante na região centro-sul, por outro lado o Tomato mottle leaf curl virus (TMoLCV) parece ser predominante na região Nordeste. O estudo de diversidade e distribuição dos begomovírus ainda é deficiente para a região nordeste brasileira. O controle de vírus é complexo, mas técnicas de prevenção da entrada dos vírus no campo são altamente eficientes. Contudo, uma vez que, o vírus estão instalados na lavoura, a única forma de acabar com a infecção viral é através da eliminação das plantas, técnica essa, muitas vezes inviável para o produtor. A resistência sistêmica adquirida induzida por produtos químicos é uma realidade no combate a infecções por fungos e bactérias, entretanto o efeito desses produtos na prevenção de infecções virais é pouco conhecido. Baseado nessas demandas de pesquisa, os objetivos desse trabalho foram avaliar a diversidade de espécies de begomovírus em tomateiros, a partir de amostras coletadas entre os anos de 2009 e 2011 em diversos estados da região Nordeste do Brasil e norte de Minas Gerais, realizar a caracterização molecular das espécies encontradas e avaliar o efeito de oito produtos comercializados como indutores de resistência às infecções causadas pelos vírus das espécies: Tomato mosaic virus (ToMV) e Tomato sppoted wilt virus (TSWV). Um total de 28 amostras foram avaliadas dos estados de Pernambuco, Bahia, Ceará e Minas Gerais. A primeira análise constituiu na comparação do padrão de restrição de produtos amplificados por círculo rolante (específicos para DNA circular). Por meio dessa análise, dez padrões distintos foram identificados e dezesseis amostras selecionadas para a clonagem do genoma viral. Vinte e dois clones de DNA-A foram obtidos, todos de Tomato mottle leaf curl virus. Na análise filogenética os vírus foram separados em dois grupos, um formado por isolados provenientes dos estados da Bahia e Pernambuco e outro composto por isolados coletados no Ceará, o isolado coletado em Minas Gerais, se agrupou junto com os isolados da Bahia e Pernambuco. Conclui-se, portanto, que Tomato mottle leaf curl virus ainda predomina nos estados localizados na região da caatinga brasileira. Como resultado da avaliação do efeito de indutores de resistência, verificou-se que nenhum dos oito produtos comercializados apresentou efeito de redução de taxa de infecção, retardamento de aparecimento de sintomas ou diminuição da severidade de sintomas após a inoculação mecânica com os vírus ToMV e TSWV. Concluiu-se que, para as condições avaliadas no ensaio, o uso desses produtos não é recomendado para o manejo de vírus como ToMV e TSWV. ______________________________________________________________________________ ABSTRACT / Tomato plants are one of the most important crop in the world and in Brazil. The cultivation is done throughout the country, but its production is concentrated in the states of the south-central regions. Prominent among those is Goiás the largest tomato producing state, on both cultivated area and in raw production. Despite the importance of the south-central region for tomatoes production, the North-East region has also a significant growing area, but a low yield. Among the phytosanitary issues that affect tomatoes, it is listed those caused by fungi, bacteria, nematodes and viruses. Within, the most important viruses there are the species complex of the Tospovirus genus that cause the tomato spotted wilt disease, the tomato mosaic caused by Tomato mosaic virus, the potyviruses Potato virus Y e Pepper yellow mosaic virus, the crinivirus Tomato chlorosis virus and the tomato golden mosaic disease, caused by several species of the genus Begomovirus. These viruses are transmitted by whiteflies and are the source of some of the most serious disease of tomatoes today. The viruses of the Begomovirus genus are characterized by icosahedral twinned particles and possess a single stranded DNA. Its genome consists of only one component (monopartite) or two components known as DNA-A and DNA-B (bipartite). The identification of the viruses is based on the analysis and comparison of DNA-A genome of the isolates. The begomoviruses species have a distinct geographic distribution, in general, the monopartites are found in the Old World and the bipartites are found in the New World. In Brazil eleven begomovirus species infecting tomatoes plants were reported and from those there are at least six species still in the characterization process. The begomovirus species in tomato plants reported in Brazil are found only in Brazil and all of them are bipartites. Within Brazil, there is an apparent species differential distribution. It is known that the Tomato severe rugose virus (ToSRV) is prevalent in south-central region, on the other hand the Tomato mottle leaf curl virus (TMoLCV) seems to be prevalent in North-East region. The diversity study and distribution of begomoviruses is poorly done for the Brazilian North-East region isolates. The viruses control is complex, but prevention techniques of viruses entering in the field are highly efficient. However, once the viruses are established in the field, the only way to stop the viral infection is through the roguing technique that is often impractical for the grower. The systemic acquired resistance induced by chemical products is a reality in the fight against fungi and bacteria, however, the effect of these products in the prevention of viral infections is poorly understood. Based on these research demands, the objective of this study was to evaluate the species diversity of the begomoviruses in tomatoes plant, from samples collected from 2009 to 2011 in various states of the North-East region of Brazil and northern Minas Gerais, and to perform molecular characterization of the found species. Also evaluate of the effect of eight products sold as resistance inducers to viral infection: Tomato mosaic virus (ToMV) and Tomato spotted wilt virus (TSWV). A total of twenty eight samples were evaluated from the states of Pernambuco, Bahia, Ceará and Minas Gerais. The first analysis consisted of the comparison of the restriction profile of the amplified products by rolling circle (specific to circle DNA). From this analysis, ten distinct restriction profiles were identified and sixteen samples were selected for cloning of viral genome. Twenty two DNA-A clones were obtained, all of them of the Tomato mottle leaf curl virus. In the phylogenetic analysis the isolates were separated into two groups, one comprising isolates from Bahia and Pernambuco states and another composed by isolates collected in Ceará state, the isolated from Minas Gerais was grouped together with Bahia and Pernambuco isolates. Therefore, it is concluded that Tomato mottle leaf curl virus still prevails in states located in Brazilian caatinga region. As a result of the evaluating the effect of resistance inducers, it was found that none of the eight market products was effective in reducing the infection rate, delay to the onset of symptoms or decrease in severity symptoms after mechanical inoculation with the viruses ToMV and TSWV. It was concluded that to the conditions assessed in the trial, the use of these products is not recommended for the management of viruses as ToMV and TSWV.

Entre as hospedeiras de invasão sistêmica do vírus do mosaico do mamoeiro - estirpe mamoeiro (Papaya ringspot virus type P; PRSV-P) encontram-se espécies de cucurbitáceas, cuja suscetibilidade à transmissão experimental, mecânica e com afídeos, é variável. A literatura nacional e internacional apresenta resultados distintos quanto à recuperação desse vírus a partir de cucurbitáceas presentes próximas ou no interior de plantios de mamoeiros infectados com esse vírus. O presente trabalho teve como objetivo avaliar em casa de vegetação a suscetibilidade de quatro espécies de cucurbitáceas a cinco isolados do PRSV-P obtidos de diferentes regiões do Brasil e inoculados de forma mecânica. Visou também estudar a infecção natural de cucurbitáceas cultivadas nas entrelinhas ou próximas de mamoeiros com mosaico. Para o desenvolvimento do trabalho em casa-de-vegetação os isolados do PRSV-P mantidos em mamoeiros, foram inoculados nos cotilédones de abobrinha de moita cv. Caserta, moranga cv. Exposição, pepino híbrido Primepack Plus e melancia cv. Crimson Sweet. As plantas foram avaliadas com base nos sintomas e indexadas por PTA-ELISA, e recuperação biológica do biótipo P do PRSV através de inoculações em mamoeiro. A confirmação da infecção dos mamoeiros foi realizada da mesma forma, por sintomatologia e indexação por PTA-ELISA. A abobrinha de moita foi a espécie mais suscetível aos cinco isolados do PRSV-P, seguida da melancia e do pepino. Não foi possível transmitir o vírus a moranga cv. Exposição. Para estudar a infecção natural realizou-se um ensaio com plantas de abobrinha de moita em Linhares-ES, três ensaios independentes em Rinópolis-SP e quatro em Piracicaba-SP, incluindo-se nessa última localidade a melancia e o pepino. Depois de aproximadamente 40 a 60 dias de exposição em campo coletaram-se amostras individuais ou compostas (de 3 a 5 plantas) das folhas dos ponteiros das plantas para realizar a recuperação biológica do PRSV-P para mamoeiros em casa de vegetação. A presença de afídeos foi monitorada em Piracicaba durante a execução dos experimentos no campo. No único teste de exposição em Linhares, nenhuma planta de abobrinha cultivada entre mamoeiros com mosaico mostrou-se infectada com esse vírus. O PRSV-P foi recuperado da abobrinha de moita em proporções variáveis em 2 dos 3 testes realizados em Rinópolis, e em 3 dos 4 testes realizados em Piracicaba. Nenhuma planta de melancia e pepino cultivada entre mamoeiros com mosaico foi infectada com o PRSV-P. Não foi possível recuperar o PRSV-P de nenhuma planta de abobrinha cultivada entre 5 e 80 metros de distância dos mamoeiros com mosaico em Piracicaba. Foram capturados afídeos vetores do PRSV-P e foi possível detectar plantas infectadas com os potyvirus PRSV-W e ZYMV, o que demonstra a presença e atividade dos vetores de vírus. Os resultados confirmaram a suscetibilidade variável das espécies de cucurbitáceas ao PRSV-P. Embora a abobrinha de moita fosse a única espécie encontrada naturalmente infectada pelo PRSV-P quando cultivada entre linhas de mamoeiro com mosaico, a presença de cucurbitáceas nos campos de produção de mamoeiro, especialmente quando o controle do mosaico do mamoeiro é feito através do roguing, não é recomendada. / Besides Carica papaya, Papaya ringspot virus type P (PRSV-P) infects systemically only species belonging to the family Cucurbitaceae. Their susceptibility varies according to the species/cultivar, virus isolate and the method of inoculation. Attempts to recovery PRSV-P from naturally infected cucurbit plants grown near to or among diseased papaya trees have shown distinct results worldwide. This study aimed to evaluate the susceptibility of Cucurbita pepo cv. Caserta, Cucurbita maxima cv. Exposiçao, Cucumis sativus hybrid Primepack Plus, and Citrullus lanatus cv. Crimson Sweet to five isolates of PRSV-P obtained from different regions of Brazil. It was also evaluated the natural infection of cucurbit plants grown between rows and in the vicinity of papaya trees infected with PRSV-P. The five PRSV-P isolates were maintained in papaya plants. Cucurbit plants grown in pots under greenhouse conditions were mechanically inoculated with each isolate at the cotiledonary stage. The plants were assessed based on symptoms and infection was confirmed by PTA-ELISA using extracts from the inoculated cotyledons and upper leaves. The same extracts were also mechanically inoculated on papaya plants in order to recover the virus isolate. Inoculated papaya plants were also tested by PTA-ELISA. Zucchini squash was the most susceptible species to PRSV-P, followed by watermelon and cucumber. Pumpkin cv. Exposição was not infected. To study the natural infection of zucchini squash cv. Caserta by PRSV-P, a trial was carried out in Linhares, State of Espírito Santo; three independent trials were carried out in Rinópolis; and four trials were carried out in Piracicaba, both regions located in the State of São Paulo. Watermelon and cucurbit were also included in some trials in Piracicaba. After approximately 40 to 70 days, leaf samples were collected and tested individually or in groups of three to five plants for the presence of PRSV-P by mechanical inoculation on papaya plants under greenhouse conditions. None of the zucchini squash plants grown between rows of infected papaya trees in Linhares was found infected by PRSV-P based on the virus recovery test to papaya plants. The virus was also not recovered from watermelon and cucurbit plants grown between rows of infected papaya trees in Piracicaba. On the other hand, PRSV-P was recovery from zucchini squash plants grown intercalated with diseased papayas in Rinópolis and Piracicaba. The number of infected plants varied among the trial. Several attempts to recover PRSV-P from innumerous zucchini squash plants grown approximately five to 80 meters from diseased papaya trees in Piracicaba failed. Alates of several species of aphids were captured in the field at Piracicaba. Also, innumerous cucurbit plants were found infected by the potyviruses Papaya ringspot virus type W and Zucchini yellow mosaic virus, suggesting aphids activity in the area. The results confirmed the variable susceptibility of cucurbit species to infection with PRSV-P. Although natural infection with PRSV-P was restricted to zucchini squash cv. Caserta grown among infected papaya trees, the presence of cucurbit plants in the vicinity of papaya orchards, especially where disease control is done by systematic rouging of diseased plants, should not be allowed.