O gênero botânico Clerodendrum pertence à família Lamiaceae e compreende várias espécies ornamentais, geralmente trepadeiras, das quais as mais comumente cultivadas são coração-sangrento (C. x speciosum Tiejism. & Binn.) e lágrima-de-Cristo (C. thomsonae Balf.). Manchas cloróticas e necróticas em folhas de coração-sangrento foram observadas pela primeira vez em um jardim de Piracicaba, SP, associadas à infestação com Brevipalpus phoenicis Geijskes (Acari: Tenuipalpidae). Exames de secções de tecidos das lesões foliares ao microscópio eletrônico revelaram ocorrência de efeitos citopáticos do tipo nuclear e concluiu-se que os sintomas eram causados por um vírus transmitido por Brevipalpus (VTB), o qual foi tentativamente designado de mancha clorótica de Clerodendrum (Clerodendrum chlorotic spot virus- ClCSV). O ClCSV é transmitido mecanicamente de coração-sangrento para coração-sangrento e em ensaios preliminares foi transmitido mecanicamente e por Brevipalpus phoenicis para várias outras plantas, além da ocorrência de sua disseminação natural por esses ácaros para outras espécies. Ocorre a infecção sistêmica nas hospedeiras Chenopodium quinoa Will. e C. amaranticolor Coste & Reyn. infectadas com ClCSV caso as plantas sejam mantidas por cerca de 2 semanas entre 28-30 oC. Utilizando-se estas plantas realizou-se a purificação parcial do vírus. Este trabalho apresenta a caracterização biológica e molecular do ClCSV. Os resultados dos testes PTA-ELISA e RT-PCR demonstraram a detecção do ClCSV em diversas hospedeiras, além da análise da reação sorológica e molecular deste vírus com os outros VTBs do tipo nuclear. O seqüenciamento do produto de PCR revelou que as seqüências de nucleotídeos apresentaram similaridade com a polimerase de OFV (Orchid Fleck Virus), outro VTB do tipo nuclear. Além da identificação sorológica do vírus foram realizadas análises morfo-anatômicas para visualização das alterações causadas pelo ClCSV em tecidos de Clerodendrum x speciosum e em hospedeiras infectadas. / The botanical genus Clerodendrum belongs to the family Lamiaceae and includes several ornamental species, usually climbing, and heart-bloody (C. x speciosum Tiejism. & Binn.) and tear-in-Christ (C. thomsonae Balf. ) are among the most cultivated. Necrotic and chlorotic spots on leaves of heart-blood have been observed for the first time in a garden of Piracicaba, associated with an infestation of Brevipalpus phoenicis Geijskes (Acari: Tenuipalpidae). Sections of diseased tissues examined in the electron microscope revealed characteristic cytopathic effects of the nuclear type and concluded that the symptoms were caused by a virus transmitted by Brevipalpus (VTB), tentatively named Clerodendrum chlorotic spot virus (ClCSV). This virus is transmitted through mechanical inoculation from heart-bloody to heart-bloody and in preliminary tests mechanically and by mites for several other plants, in addition to the natural occurrence of its spread to other species. Systemic infection occurs in the host Chenopodium quinoa Will. and C. amaranticolor Coste & Reyn. infected with ClCSV if the plants are kept at 28-30°C for about 2 weeks. These plants were used for partial purification of vírus. This study presents the biological and molecular characterization of ClCSV. Through the PTA-ELISA and RT-PCR tests was possible to detect the ClCSV in different host, in addition to the analysis of serological and molecular reaction of this virus with other type of nuclear VTBs. From the sequencing of the PCR product was obtained from nucleotide sequences that showed similarity to the polymerase of OFV (Orchid Fleck Virus), another type of nuclear VTB. Morpho-anatomical analysis were performed to see the changes caused by ClCSV in tissues of Clerodendrum x speciosum and other infected hosts. It was possible to observe the occurrence of hypertrophy, cell plasmolisis and the reduction of starch grains in the áreas injured in all plants infected by ClCSV.

A morte súbita dos citros (MSC) foi identificada em 2001, no município de Comendador Gomes, Minas Gerais, e desde então foi responsável pela perda de 4 milhões de plantas na região sul do Triângulo Mineiro, e no norte e noroeste do estado de São Paulo. É uma doença de combinação copa/porta-enxerto, afetando principalmente laranjeira doce enxertada em limoeiro Cravo, e que culmina na morte das plantas. Passados dez anos do seu relato, até hoje não se tem conhecimento exato do agente causal e dos possíveis vetores. Sabe-se, todavia, que em todas as plantas com morte súbita encontram-se o vírus da tristeza dos citros (Citrus tristeza virus - CTV) e um vírus do Gênero Marafivirus, Família Tymoviridae, denominado Citrus sudden death associated virus (CSDaV). Devido esse fato, há a necessidade de separá-los para testar os postulados de Koch para o CSDaV. O principal objetivo deste trabalho foi tentar isolar o CSDaV para verificar o seu real envolvimento com a MSC. Também se procurou purificar esse vírus para a produção de antissoro policlonal para trabalhos de diagnose da doença. Para a purificação do CSDaV foi utilizado o protocolo de purificação do Potato leaf roll virus, porém os resultados não foram satisfatórios devido a constante presença do CTV. Tentativas de remoção do CTV por meio de imunoprecipitação com antissoro homólogo não foram satisfatórias. O antissoro produzido reagiu indistintamente com extratos de plantas infectadas com o CSDaV e o CTV. O CSDaV foi transmitido mecanicamente para plantas de Nicotiana sp., N. clevelandii, Chenopodium amaranticolor e C. quinoa, causando principalmente infecção localizada. A presença do vírus foi confirmada por RT-PCR e a sua identidade por meio do sequenciamento de nucleotídeos do produto da amplificação. Tentativas de transmissão do CSDaV usando inóculo de extrato de folhas de plantas do campo , por meio da Cuscuta sp., através de cortes no tronco das plantas com lâmina embebida no inóculo, com pulgões Toxoptera citricida aparentemente virulíferos somente para o tymovirus e por meio da inoculação de sementes de citros deram resultados negativos. / Citrus sudden death (CSD) disease was identified in 2001, at Comendador Comes County, State of Minas Gerais, Brazil. Since then the disease has caused the death of 4 million trees in Southwestern Minas Gerais State and Northern São Paulo State. This new and destructive disease affects sweet orange as well as other species, varieties, and hybrids when grafted on Rangpur (Citrus limonia). Then years after the first report on CSD, the causal agent and possible vector(s) have not been precisely identified. It is known, however, that all disease trees are infected with Citrus tristeza virus (CTV) and Citrus sudden death associate virus (CSDaV), which is a member of the Genus Marafivirus, Famíly Tymoviridae. Due to this, it is necessary to separate these pathogens, in order to complete Kochs postulated for the CSDaV. The main purpose of the present work was to try to isolate the CSDaV to verify its role on CSD disease. In addition, attempts were done to purify the virus and produce polyclonal antiserum for disease diagnosis. Purification was carried out as described for Potato leaf roll virus, but results were not suitable due to the constant presence of CTV. Efforts to remove CTV by immunoprecipitation with homologous antiserum did not succeed. The produced antiserum reacted indistinctly with extracts of plants infected with both viruses. SCDaV was mechanically transmitted to Nicotiana sp., N. clevelandii, Chenopodium amaranticolor, and C. quinoa, causing mainly local infection. Infection was confirmed by RT-PCR and virus identity was determined by nucleotide sequence of the amplified fragment. Efforts to transmit CSDaV, using as inoculum extract from field infected plants, by means of Cucucuta sp., by incisions on the trunk of the test-plants, with Toxoptera citricida apparently viruliferous only for the tymovirus, and by means of citrus seed inoculation gave negative results.

O Passion flower little leaf mosaic virus (PLLMV) foi encontrado causando danos severos em plantios de maracujazeiro (Passilora edulis f. flavicarpa) em dois municípios do Estado da Bahia no ano de 2001. Nesses locais foi constatada que a incidência deste begomovirus estava relacionada à colonização das plantas por Bemisia tabaci, cujo biótipo não foi identificado. Até o momento este vírus não parece constituir grave ameaça a cultura do maracujazeiro, o que aparentemente esta relacionado ao fato de P. edulis f. flavicarpa não ser preferida para a alimentação desse aleyrodídeo. Assim, os objetivos deste trabalho foram: a) selecionar espécies silvestres de Passiflora resistentes a este begomovirus que possam ser úteis em futuro programa de melhoramento genético; b) identificar possíveis hospedeiros alternativos do patógeno entre algumas espécies da vegetação espontânea e cultivadas e c) avaliar se adultos de B. tabaci biótipo B presentes no Estado de São Paulo são capazes de transmitir esse vírus. A reação de espécies silvestres de Passiflora foi avaliada por enxertia em maracujazeiro amarelo infectado que serviu como de fonte de inóculo. As avaliações foram feitas por meio da expressão de sintomas, análise de PCR e teste de recuperação do vírus para maracujazeiro amarelo. As espécies P. alata, P. quadrangularis, P. morifolia, P. serrato-digitata, P. suberosa e P. foetida foram suscetíveis ao PLLMV, enquanto P. caerulea, P. cincinnata, P nitida, P. mucronata e P. giberti se mostraram resistentes a este vírus. No estudo de hospedeiros alternativos, primeiramente o PLLMV foi inoculado mecanicamente nas seguintes espécies vegetais: Capsicum annuum, Chenopodium quinoa, Solanum lycopersicon, S. tuberosum, P. edulis f. flavicarpa, Phaseolus vulgaris, Nicotiana benthamiana e Sida sp.. Somente N. benthamiana foi infectada sistemicamente. Posteriormente foram feitas tentativas de transmissão desse begomovirus por meio de enxertia, usando-se como fonte de inóculo (porta-enxerto), plantas infectadas de N. benthamiana. Foram avaliadas as seguintes espécies vegetais: S. pimpinellifolium, S. lycopersicon, S. tuberosum, N. benthamiana, D. stramonium, C. annuum, N. glutinosa e Sida rhombifolia. O vírus foi transmitido somente para plantas de S. pimpinellifolium. As sucessivas transmissões mecânicas do PLLMV em N. benthamiana permitiram a seleção de uma estirpe fraca e protetora deste begomovirus. B. tabaci biótipo B não foi capaz de transmitir o PLLMV. / The Passion flower little leaf mosaic virus (PLLMV) was found causing severe damage in passion flower (Passilora edulis f. flavicarpa ) orchards in two counties of Bahia state, in 2001. The high incidence of this begomovirus was related to the colonization of plants by Bemisia tabaci, whose biotype was not indentified. To date this virus doesnt seem to be a serious threat to the passion flower cultivation, which apparently is related to the fact that P. edulis f. flavicarpa is not a preferred specie for whitefly feeding. The aim of this work were: a) to select wild species of Passifloraceae resistant to PLLMV, that may be useful in future breeding program; b) to indentify some possible alternative hosts of the pathogen among some weed and cultivaded species and c) to evaluat whether adults of B. tabaci biotype B are capable of transmitting this virus. The reaction of wild species of Passifloracea was evaluated by grafting on infected yellow passion fruit that served as a source of inoculum. The evaluation of these plants were done by means of symptoms, PCR test and biological recovery of the virus to yellow passion fruit. The sepecies P. alata, P. quadrangularis, P. morifolia, P. serrato-digitata, P. suberosa and P. foetida were susceptible to PLLMV, while P. caerulea, P. cincinnata, P nitida, P. mucronata and P. giberti were resistant to this virus. In the study of alternative hosts, at first, PLLMV was mechanically inoculated in the following species: Capsicum annuum, Chenopodium quinoa, Solanum lycopersicon, S. tuberosum, Passiflora edulis f. flavicarpa, Phaseolus vulgaris, Nicotiana benthamiana and Sida sp. Only N. benthamiana was systematically infected. Subsequently, graft transmission of PLLMV was carried out using infected N. benthamiana as source of inoculum (root stock). The following species were evaluated: Solanum pimpinellifolium, S. lycopersicon, S. tuberosum, N. benthamiana, D. stramonium, C. annuum, N. glutinosa and Sida rhombifolia.The virus was transmited only to S. pimpinellifolium. Successive mechanical transmissions of PLLMV in N. benthamiana led to the selection of a mild and protective strain of this begomovirus. B. tabaci biotype B was not able to transmit the PLLMV.

Submitted by Reginaldo Soares de Freitas (reginaldo.freitas@ufv.br) on 2017-06-20T18:12:54Z No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 1756399 bytes, checksum: 4cd93ccd34ab97ff3909ee83598fa241 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-06-20T18:12:54Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 1756399 bytes, checksum: 4cd93ccd34ab97ff3909ee83598fa241 (MD5) Previous issue date: 2016-02-25 / A maioria dos begomovírus monossegmenados do Velho Mundo (família Geminiviridae) estão associados a DNAs satélites, classificados como alfa- e betassatélites. Os alfassatélites são capazes de replicar-se de forma autônoma, mas dependem do vírus auxiliar para o movimento, encapsidação e transmissão pelo inseto vetor (Bemisia tabaci). Recentemente, o Euphorbia yellow mosaic alphasatellite (EuYMA) foi encontrado em associação com o begomovírus Euphorbia yellow mosaic virus (EuYMV), infectando plantas de Euphorbia heterophylla no Brasil. Compreender a dinâmica da interação entre begomovírus e DNAs satélite em plantas não cultivadas, tais como E. heterophylla, é importante porque eles podem ser transferidos para plantas cultivadas, dado o hábito polífago de B. tabaci. Este estudo teve como objetivos: (i) analisar as diferenças fenotípicas da infecção pelo EuYMV na presença e na ausência do EuYMA; (ii) avaliar se a proteína alfa-Rep do EuYMA possui atividade supressora de silenciamento de RNA; (iii) comparar a transmissão do EuYMV por B. tabaci MEAM1, na ausência e na presença do EuYMA. Foram coletadas amostras (n=165) de E. heterophylla em diversos estados do Brasil. Clones infecciosos foram gerados para realizar-se a caracterização biológica e inoculação das plantas. EuYMV foi detectado em 126 amostras e EuYMA foi detectado em apenas seis amostras. Isoladamente, o EuYMV causa clorose internerval e mosaico amarelo. Em associação com o EuYMA, os sintomas são mais severos, caracterizados por mosaico amarelo muito mais intenso, encarquilhamento foliar e redução do crescimento. O DNA-A do EuYMV pode infectar E. heterophylla na ausência do DNA-B, provocando ou não um mosaico amarelo atenuado. A sequência codificadora completa do gene alfa-Rep do EuYMA foi clonada em vetor binário e transformada em células de Agrobacterium tumefaciens. Um ensaio de supressão de silenciamento de RNA foi realizado com esta construção em plantas de Nicotiana benthamiana. Os resultados indicam que a proteína alfa-Rep do EuYMA não atua como supressora de silenciamento de RNA. Foi realizado um ensaio de transmissão do EuYMV por B. tabaci, na presença e ausência de EuYMA, em duas repetições biológicas. Vinte plantas foram utilizadas para cada tratamento. Isoladamente, o EuYMV foi transmitido para 17 e 18 plantas na primeira e segunda repetição, respectivamente. Em associação com EuYMA, o vírus foi transmitido para 15 e 14 plantas na primeira e segunda repetição, respectivamente, uma diferença estatisticamente significativa. Assim, os resultados indicam que o EuYMA afeta negativamente a transmissão do EuYMV pelo vetor, consequentemente afetando a disseminação do vírus no campo. / The majority of Old World monopartite begomoviruses (family Geminiviridae) are associated with satellite DNAs, classified as alpha- and betasatellites. Alphasatellites are capable of autonomous replication, but depend on the helper virus for movement, encapsidation and transmission by the insect vector (Bemisia tabaci). Recently, Euphorbia yellow mosaic alphasattelite (EuYMA) was found in association with Euphorbia yellow mosaic virus (EuYMV), infecting Euphorbia heterophylla plants in Brazil. Understanding the dynamics of the interaction between begomoviruses and satellite DNAs in non-cultivated plants, such as E. heterophylla, is important as they can be transferred to cultivated plants, given the polyphagous habit of B. tabaci. The objectives of this study were: (i) to analyze phenotypic differences of EuYMV infection in the presence and absence of EuYMA; (ii) to evaluate whether the alpha-Rep protein of EuYMA possesses RNA silencing suppressor activity; (iii) to compare the transmission of EuYMV by B. tabaci MEAM1 in the absence and presence of EuYMA. Samples (n=165) of E. heterophylla were collected in several states of Brazil. Infectious clones were generated to perform the biological characterization and inoculation. EuYMV was detected in 126 samples and EuYMA was detected only in six samples,. Alone, EuYMV causes interveinal chlorosis and yellow mosaic. In combination with EuYMA, the symptoms are more severe, characterized by a more intense yellow mosaic, leaf shriveling and stunting. The DNA-A of EuYMV can infect E. heterophylla in the absence of the DNA-B, causing attenuated yellow mosaic or no symptoms at all. The complete coding sequence of the alpha-Rep gene of EuYMA was cloned in a binary vector and transformed in Agrobacterium tumefaciens. An RNA silencing supression assay was performed with this construct in Nicotiana benthamiana plants. The results indicate that the alpha-Rep protein of EuYMA does not act as an RNA silencing suppressor. A transmission assay of EuYMV by B. tabaci, in the presence and absence of EuYMA, was performed in two biological replications. Twenty plants were used for each treatment. Alone, EuYMV was transmitted to 17 and 18 plants, in the first and second replication respectively. In association with EuYMA, the virus was transmitted to 15 and 14 plants, in the first and second replication respectively, a difference which was statistically significant. Thus, our results indicate that EuYMA negatively affects the transmission of EuYMV by the vector, consequently affecting the spread of the virus in the field.

Orientador: Luciana Rossini Pinto / Coorientador: Marcos Cesar Gonçalves / Banca: Gustavo Vitti Môro / Banca: Fernando Javier Sanhueza Salas / Resumo: Este trabalho teve como tema a avaliação da resistência de cultivares de cana-de-açúcar (Saccharum sp.) ao vírus do amarelecimento foliar (SCYLV) e ao seu principal afídeo vetor Melanaphis sacchari (Zehntner). Cinco cultivares de cana-de-açúcar (IACSP93 3046, IACSP95 5000, IACSP95 5094, IACSP96 3076 e SP71 6163) escolhidas devido à importância econômica para os canaviais brasileiros, foram multiplicadas por cultura de meristema e indexadas em uma biofábrica e avaliadas quanto à resistência ao seu inseto vetor M. sacchari, por meio do estudo do comportamento deste afídeo nessas cultivares através de testes de antibiose, antixenose e EPG (Eletrical Penetration Graphs). Paralelamente, um segundo ensaio foi estabelecido para avaliar o desenvolvimento do amarelecimento foliar em campo, após inoculação do vírus (SCYLV) nas plantas indexadas. Os pulgões mostraram uma preferência para a cultivar IACSP96 3076 e melhor desenvolvimento populacional na IACSP95 5000. Parâmetros floemáticos favoráveis ao desenvolvimento de M. sacchari foram descobertos na cultivar SP71 6163 reforçando sua suscetibilidade a infecção de SCYLV, e comprovando por meio de avaliações de severidade de sintomas, que o amarelecimento da cana-de-açúcar expressa-se com maior rapidez e intensidade nesta cultivar / Abstract: This research focused on the evaluation of resistance in sugarcane (Saccharum spp.) to the Sugarcane yellow leaf virus (SCYLV) and to its main vector, the sugarcane aphid Melanaphis sacchari (Zehntner). Five sugarcane varieties (IACSP93 3046, IACSP95 5000, IACSP95 5094, IACSP96 3076, and SP71 6163), chosen due to their economic importance to Brazilian sugarcane growing areas, were multiplied by tissue tip culture, indexed, and evaluated in terms of the aphids' behavior by the traditional antibiosis, antixenosis and EPG (Electrical Penetration Graphs). At the same time, a second test was set up for evaluating the development of yellowing leaf on field after inoculation with SCYLV. The aphid showed preference for IACSP96 3076 and higher population growths indexes on IACSP95 5000. We found out favorable parameters on the insect behavior over variety SP71 6163 that reinforce its previously known high susceptibility to SCYLV infection. We also demonstrate by these experiments the existence of pre and post-phloematic penetration factors that influence the behavior of M. sacchari and further transmission of SCYLV, and proving through initial assessments of symptoms severity that YLS yellowing of sugarcane expressed faster and more strongly in this cultivar / Mestre

Orientador: Renate Krause Sakate / Banca: Marcelo Agenor Pavan / Banca: Massaharu Marubayashi / Resumo: A alface (Lactuca sativa L.), pertencente à família Asteraceae, é uma das hortaliças mais consumidas no Brasil. Um dos principais problemas fitossanitários para essa cultura são as fitoviroses, em especial o Lettuce mosaic virus (LMV), que causa elevados prejuízos aos produtores em diversas regiões do país, além do Lettuce mottle virus (LeMoV), que vem crescendo em importância nos últimos anos. Como forma de controle, o uso de variedades resistentes é maneira mais eficaz de contornar os danos causados por vírus. Na maioria das variedades resistentes de alface faz-se o uso de genes recessivos, em sua maioria envolvidos na interação planta-vírus, são os chamados codificadores de fatores de iniciação de tradução eucarióticos (eIFs). Diante disso, este trabalho teve como objetivo avaliar dois genótipos de alface (169501 e 169501C), quanto a resistência ao LMV e ao LeMoV. Foram realizadas transmissões via extrato vegetal nos dois genótipos de alface com LMV e LeMoV em diferentes intervalos de tempo. Para LMV também foram realizadas transmissões por afídeos. As duas variedades testadas se mostraram resistentes ao LMV nas duas formas de transmissão, mas apresentaram sintomas quando inoculadas com LeMoV. Em reações de RT-PCR com oligonucleotídeos específicos, foram comprovadas a ausência de LMV e a infecção por LeMoV nas plantas inoculadas. O isolado de LMV após análise do sequenciamento da porção N' terminal da ... / Abstract: Lettuce (Lactuca sativa L.) belongs to the Asteraceae family and is one of the most consumed vegetables in Brazil. One of the major disease problems in this crop are plant viruses, especially the Lettuce mosaic virus (LMV) that cause losses to producers in various regions of the country, but also Lettuce mottle virus (LeMoV). As a form of control, the use of resistant varieties is the most effective way to overcome the damage caused by plant viruses. Most of the resistant varieties of lettuce makes the use of recessive genes, mostly involved in plant-virus interactions and characterized as eukaryotic translation initiation factor (eIFs). Thus, this study aimed to evaluate two lettuce genotypes (169501 and 169501C) for resistance to LMV and LeMoV. LMV and LeMoV were sap transmitted at different time of intervals. For LMV also transmissions with aphids were carried out. The two varieties tested were resistant to LMV in both forms of transmission, but showed symptoms when inoculated with LeMoV. In RT-PCR with specific primers, LMV was not detected but LeMoV yes, confirming the infection in the inoculated plants. The isolate of LMV used in the tests was not classified as belonging to subgroups Most ... / Mestre

A cultura do maracujazeiro tem sido afetada por um grande número de pragas e doenças, que exigem dedicação e esforços urgentes, no sentido de minimizar as perdas e evitar sua disseminação. O vírus da pinta verde do maracujazeiro (PVM) (Passion fruit green spot virus PFGSV) caracteriza-se por induzir a formação de pequenas manchas verdes em frutos e em folhas, e lesões necróticas em ramos. Exames de secções ultrafinas de tecidos infectados ao microscópio eletrônico de transmissão consistentemente revelam a presença de partículas baciliformes em cisternas do retículo endoplasmático e viroplasma denso no citoplasma. Os efeitos citopáticos encontrados, a relação com o ácaro vetor, Brevipalpus phoenicis, e a comparação com outros vírus transmitidos por Brevipalpus (VTB), como o da leprose dos citros, classifica o vírus como sendo do tipo citoplasmático. Seu relato inicial deu-se há cerca de 10 anos em Vera Cruz-SP, mas em 1994 foi relatada uma doença no Estado da Bahia chamada de definhamento precoce do maracujazeiro (DPM), que apresenta sintomas, efeitos citopáticos e vetor semelhantes ao da pinta verde, tendo sido sugerida a possibilidade de serem duas denominações para uma mesma doença. Atualmente a PVM/DPM encontra-se em vários outros Estados como Minas Gerais, Rio de Janeiro, Sergipe, Rondônia, Maranhão, Rio Grande do Norte, Paraíba e Pará, além do Distrito Federal. Sua diagnose ainda depende dos sintomas observados, infestação por ácaros Brevipalpus e microscopia eletrônica. Para se desenvolver um método de diagnose molecular, que permita detectar o vírus causador da PVM/DPM de maneira rápida e confiável, em grande número de amostras, foi feita uma Biblioteca de cDNA a partir do RNA dupla fita do vírus, extraído de tecidos sintomáticos de maracujazeiros infectados com um isolado do PFGSV encontrado em Limeira-SP. Com o sequenciamento parcial do genoma viral, foram desenhados primers específicos que amplificam partes dos genes putativos da p24 e aqueles que codificam a proteína de movimento (MP) e a Replicase (Rep) de diferentes isolados do PFGSV. Primers do PFGSV e de dois outros VTBs do tipo citoplasmático (VTB-C) para os quais se dispõe de primers para sua detecção por RT-PCR (vírus da leprose dos citros C - CiLV-C; mancha anelar de Solanum violaefolium - SvRSV) foram testados em reações homólogas e heterólogas. Ocorreram amplificações por RT-PCR gerando fragmentos de tamanho esperados apenas para os vírus homológos, mas não nas reações heterólogas, indicando que PFGSV deve diferir do CiLV-C e SvRSV. Assim, tem-se agora uma ferramenta molecular que detecta especificamente o PFGSV. Um estudo inicial sobre a variabilidade genética do PFGSV foi feito a partir da extração do RNA total, seguido de RT-PCR utilizando os primers específicos, purificação dos fragmentos obtidos e uso da técnica de Single Strand Conformational Polymorphism (SSCP). Foram analisados isolados procedentes de diferentes regiões brasileiras e em geral a variabilidade foi maior para as amostras do Estado de São Paulo. Logrou-se transmitir experimentalmente o PFGSV com ácaros para uma espécie silvestre de maracujá (Passiflora morifolia). / In Brazil, passion fruits are affected by several diseases and pests which affect their yield. Among them, a recently recognized viral disease, caused by Passion fruit green spot virus (PFGSV), is characterized by the presence of green spots on fruits and senescent leaves, and necrotic lesions on branches. When the infection is early, stem lesions may coalesce, girdling the branch resulting in the subsequent death of the plant. Electron microscopic examination of the thin sections of infected tissues revealed the presence of short, bacilliform particles in the cistern of the endoplasmic reticulum and dense, vacuolated viroplasma in the cytoplasm. The disease was shown to be transmitted by the mite Brevipalpus phoenicis (Acari: Tenuipalpidae). The localized symptoms, transmission by Brevipalpus mite and the observed cytopathic effect are considered evidences to demonstrate the viral nature of the disease and place it among the socalled cytoplasmic type of Brevipalpus-transmitted viruses (C-BTV), whose prototype is the Citrus leprosis virus C (CiLV-C). Though the first report of the disease occurred more than 10 years ago at Vera Cruz-SP, little is known about PFGSV, though it has been found in several passion flower growing areas in Brazil. In 1994 was report a disease named of DPM (definhamento precoce do maracujazeiro) was reported state of Bahia, with characteristics similar to that of the PVM and it has been suggested that DPM and PVM are the same disease. Subsequently the PVM/DPM has been found in several others Brazilian States as Minas Gerais, Rio de Janeiro, Sergipe, Rondônia, Maranhão, Rio Grande do Norte, Paraíba, Pará and Distrito Federal. Diagnosis has been made by symptoms, association with Brevipalpus mites and the time consuming transmission electron microscopy. This work reports the results of efforts to generate a quick and precise method to detect the virus for the diagnosis of the disease, evaluate the variability of the PFGSV isolates from different regions of the country and determine the taxonomic position of this virus. From the dsRNA present in extracts of the PFGSV-infected passion flower plant tissues, a cDNA library was obtained and its sequencing permitted to identify part of the viral genome. Based on these sequences, particularly of p24 and the putative genes that code for the movement protein (MP) and replicase (Rep), specific primers were designed which specifically detected PFGSV by RT-PCR in extracts of PFGSV-infected tissues. Evaluation of the variability of different isolates of PFGSV was made by single strand conformational polymorphism (SSCP) of the amplified fragments of the viral genome. In general, it a larger variation was found in isolates from São Paulo state. PFGSV seems to differ from two other C-BTV with available primers, CiLV-C and the Solanum violaefolium ringspot virus (SvRSV), since RT-PCR assays do not cross amplify their genomes. Experimental transmission of PFGSV by mites to woodland passion flower (Passiflora morifolia) was achieved.

O objetivo do trabalho foi estudar uma forma alternativa para o controle do endurecimento dos frutos do maracujazeiro, pela produção de plantas transgênicas contendo o gene da proteína capsidial do Passionfruit woodness virus - PWV. O vetor de expressão foi construído utilizando-se os plasmídeos pCambia 2300 e pCambia 2301, que contêm o gene de seleção nptII, para resistência ao antibiótico canamicina. O plasmídeo pCambia 2301 contém também o gene repórter uidA (GUS). Os plasmídeos foram introduzidos em Agrobacterium tumefaciens, estirpes EHA 105 e LBA 4404, pelo método do choque térmico. Os explantes para transformação genética constituíram-se de discos de folhas jovens (6 mm de diâmetro), das variedades IAC 275 e IAC 277, coletados de plantas mantidas em sob fotoperíodo de 16 h luz, a 27 °C. Os explantes foram inoculados com suspensão bacteriana (5x108 UFC/mL) por 20 min e transferidos para placa de Petri contendo o meio de cultura MS + thidiazuron (TDZ - 0,25 mg/L) + nitrato de prata (AgNO3 - 4 mg/L) + acetoseringona (1 µM/L). O co-cultivo foi realizado à temperatura de 24 °C, em ausência de luz, por um período de 3 dias. Para seleção e regeneração de plantas os explantes foram transferidos para meio de cultura de seleção MS + TDZ (0,25 mg/L) + AgNO3 (4 mg/L) + canamicina (100 mg/L) + cefotaxime (500 mg/L). A incubação foi realizada a 27 °C, em ausência de luz, por um período de 4 - 6 semanas. As gemas adventícias desenvolvidas foram transferidas para o meio de cultura MSM + 10% de água de coco e incubadas sob fotoperíodo de 16 h de luz. A transformação genética foi identificada pelo teste histoquímico GUS e por PCR. Obteve-se um total de 22 plantas PCR positivas. Destas, 8 foram analisadas por Southern blot para confirmação da integração do transgene. A transcrição e expressão do transgene foram analisadas por Northern e Western blot, respectivamente. As plantas transgênicas avaliadas foram multiplicadas e inoculadas com 3 diferentes estirpes do PWV. A linhagem T2 apresentou resistência a infecção dos três isolados utilizados. / The main purpose of this work was to study an alternative way to control the Passionfruit woodiness virus - PWV through the production of transgenic plants which contained the Passionfruit woodness virus coat protein gene. The binary vector was built by using pCambia 2300 and pCambia 2301 plasmids, which contain the selection gene nptII. The pCambia 2301 plasmid also contains the reporter gene uidA (GUS). The plasmids were introduced into Agrobacterium tumefaciens, EHA 105 and LBA 4404 strains, via thermal shock method. The explants for the genetic transformation were young leaf disks (6 mm of diameter) of IAC 275 and IAC 277 varietys, extracted from plants kept under 16 h photoperiod, at 27 °C. The explants were inoculated with a bacterial suspension (5x108 UFC/mL) for 20 min and then transferred to Petri dishes containing cocolture medium MS + thidiazuron (TDZ - 0,25 mg/L) + silver nitrate (AgNO3 - 4 mg/L) + acetosyringone (1 µM/L). The co-culture was performed at 24 °C t, in the dark, for a three-day period. For the selection and regeneration of plants, the explants were transferred to the selection culture medium MS + TDZ (0,25 mg/L) + AgNO3 (4 mg/L) + kanamycin (100 mg/L) + cefotaxime (500 mg/L). The incubation was performed at 27 °C, in dark, for 4 - 6 weeks. The adventitious buds developed were then transferred to the culture medium MSM + 10% coconut water and kept incubated under 16 h photoperiod. The genetic transformation was identified through GUS and PCR tests. There were 22 PCR positive plants. Out of those, 8 were Southern blot analyzed for the confirmation of transgenc integration. The transgene transcription and expression were determined by Northern and Western blot respectively. The transgenic plants were then multiplied and inoculated with 3 different strains of PWV, and the line 2 showed resistance to the three strains used.

O Passion flower little leaf mosaic virus (PLLMV) foi encontrado causando danos severos em plantios de maracujazeiro (Passilora edulis f. flavicarpa) em dois municípios do Estado da Bahia no ano de 2001. Nesses locais foi constatada que a incidência deste begomovirus estava relacionada à colonização das plantas por Bemisia tabaci, cujo biótipo não foi identificado. Até o momento este vírus não parece constituir grave ameaça a cultura do maracujazeiro, o que aparentemente esta relacionado ao fato de P. edulis f. flavicarpa não ser preferida para a alimentação desse aleyrodídeo. Assim, os objetivos deste trabalho foram: a) selecionar espécies silvestres de Passiflora resistentes a este begomovirus que possam ser úteis em futuro programa de melhoramento genético; b) identificar possíveis hospedeiros alternativos do patógeno entre algumas espécies da vegetação espontânea e cultivadas e c) avaliar se adultos de B. tabaci biótipo B presentes no Estado de São Paulo são capazes de transmitir esse vírus. A reação de espécies silvestres de Passiflora foi avaliada por enxertia em maracujazeiro amarelo infectado que serviu como de fonte de inóculo. As avaliações foram feitas por meio da expressão de sintomas, análise de PCR e teste de recuperação do vírus para maracujazeiro amarelo. As espécies P. alata, P. quadrangularis, P. morifolia, P. serrato-digitata, P. suberosa e P. foetida foram suscetíveis ao PLLMV, enquanto P. caerulea, P. cincinnata, P nitida, P. mucronata e P. giberti se mostraram resistentes a este vírus. No estudo de hospedeiros alternativos, primeiramente o PLLMV foi inoculado mecanicamente nas seguintes espécies vegetais: Capsicum annuum, Chenopodium quinoa, Solanum lycopersicon, S. tuberosum, P. edulis f. flavicarpa, Phaseolus vulgaris, Nicotiana benthamiana e Sida sp.. Somente N. benthamiana foi infectada sistemicamente. Posteriormente foram feitas tentativas de transmissão desse begomovirus por meio de enxertia, usando-se como fonte de inóculo (porta-enxerto), plantas infectadas de N. benthamiana. Foram avaliadas as seguintes espécies vegetais: S. pimpinellifolium, S. lycopersicon, S. tuberosum, N. benthamiana, D. stramonium, C. annuum, N. glutinosa e Sida rhombifolia. O vírus foi transmitido somente para plantas de S. pimpinellifolium. As sucessivas transmissões mecânicas do PLLMV em N. benthamiana permitiram a seleção de uma estirpe fraca e protetora deste begomovirus. B. tabaci biótipo B não foi capaz de transmitir o PLLMV. / The Passion flower little leaf mosaic virus (PLLMV) was found causing severe damage in passion flower (Passilora edulis f. flavicarpa ) orchards in two counties of Bahia state, in 2001. The high incidence of this begomovirus was related to the colonization of plants by Bemisia tabaci, whose biotype was not indentified. To date this virus doesnt seem to be a serious threat to the passion flower cultivation, which apparently is related to the fact that P. edulis f. flavicarpa is not a preferred specie for whitefly feeding. The aim of this work were: a) to select wild species of Passifloraceae resistant to PLLMV, that may be useful in future breeding program; b) to indentify some possible alternative hosts of the pathogen among some weed and cultivaded species and c) to evaluat whether adults of B. tabaci biotype B are capable of transmitting this virus. The reaction of wild species of Passifloracea was evaluated by grafting on infected yellow passion fruit that served as a source of inoculum. The evaluation of these plants were done by means of symptoms, PCR test and biological recovery of the virus to yellow passion fruit. The sepecies P. alata, P. quadrangularis, P. morifolia, P. serrato-digitata, P. suberosa and P. foetida were susceptible to PLLMV, while P. caerulea, P. cincinnata, P nitida, P. mucronata and P. giberti were resistant to this virus. In the study of alternative hosts, at first, PLLMV was mechanically inoculated in the following species: Capsicum annuum, Chenopodium quinoa, Solanum lycopersicon, S. tuberosum, Passiflora edulis f. flavicarpa, Phaseolus vulgaris, Nicotiana benthamiana and Sida sp. Only N. benthamiana was systematically infected. Subsequently, graft transmission of PLLMV was carried out using infected N. benthamiana as source of inoculum (root stock). The following species were evaluated: Solanum pimpinellifolium, S. lycopersicon, S. tuberosum, N. benthamiana, D. stramonium, C. annuum, N. glutinosa and Sida rhombifolia.The virus was transmited only to S. pimpinellifolium. Successive mechanical transmissions of PLLMV in N. benthamiana led to the selection of a mild and protective strain of this begomovirus. B. tabaci biotype B was not able to transmit the PLLMV.

A morte súbita dos citros (MSC) foi identificada em 2001, no município de Comendador Gomes, Minas Gerais, e desde então foi responsável pela perda de 4 milhões de plantas na região sul do Triângulo Mineiro, e no norte e noroeste do estado de São Paulo. É uma doença de combinação copa/porta-enxerto, afetando principalmente laranjeira doce enxertada em limoeiro Cravo, e que culmina na morte das plantas. Passados dez anos do seu relato, até hoje não se tem conhecimento exato do agente causal e dos possíveis vetores. Sabe-se, todavia, que em todas as plantas com morte súbita encontram-se o vírus da tristeza dos citros (Citrus tristeza virus - CTV) e um vírus do Gênero Marafivirus, Família Tymoviridae, denominado Citrus sudden death associated virus (CSDaV). Devido esse fato, há a necessidade de separá-los para testar os postulados de Koch para o CSDaV. O principal objetivo deste trabalho foi tentar isolar o CSDaV para verificar o seu real envolvimento com a MSC. Também se procurou purificar esse vírus para a produção de antissoro policlonal para trabalhos de diagnose da doença. Para a purificação do CSDaV foi utilizado o protocolo de purificação do Potato leaf roll virus, porém os resultados não foram satisfatórios devido a constante presença do CTV. Tentativas de remoção do CTV por meio de imunoprecipitação com antissoro homólogo não foram satisfatórias. O antissoro produzido reagiu indistintamente com extratos de plantas infectadas com o CSDaV e o CTV. O CSDaV foi transmitido mecanicamente para plantas de Nicotiana sp., N. clevelandii, Chenopodium amaranticolor e C. quinoa, causando principalmente infecção localizada. A presença do vírus foi confirmada por RT-PCR e a sua identidade por meio do sequenciamento de nucleotídeos do produto da amplificação. Tentativas de transmissão do CSDaV usando inóculo de extrato de folhas de plantas do campo , por meio da Cuscuta sp., através de cortes no tronco das plantas com lâmina embebida no inóculo, com pulgões Toxoptera citricida aparentemente virulíferos somente para o tymovirus e por meio da inoculação de sementes de citros deram resultados negativos. / Citrus sudden death (CSD) disease was identified in 2001, at Comendador Comes County, State of Minas Gerais, Brazil. Since then the disease has caused the death of 4 million trees in Southwestern Minas Gerais State and Northern São Paulo State. This new and destructive disease affects sweet orange as well as other species, varieties, and hybrids when grafted on Rangpur (Citrus limonia). Then years after the first report on CSD, the causal agent and possible vector(s) have not been precisely identified. It is known, however, that all disease trees are infected with Citrus tristeza virus (CTV) and Citrus sudden death associate virus (CSDaV), which is a member of the Genus Marafivirus, Famíly Tymoviridae. Due to this, it is necessary to separate these pathogens, in order to complete Kochs postulated for the CSDaV. The main purpose of the present work was to try to isolate the CSDaV to verify its role on CSD disease. In addition, attempts were done to purify the virus and produce polyclonal antiserum for disease diagnosis. Purification was carried out as described for Potato leaf roll virus, but results were not suitable due to the constant presence of CTV. Efforts to remove CTV by immunoprecipitation with homologous antiserum did not succeed. The produced antiserum reacted indistinctly with extracts of plants infected with both viruses. SCDaV was mechanically transmitted to Nicotiana sp., N. clevelandii, Chenopodium amaranticolor, and C. quinoa, causing mainly local infection. Infection was confirmed by RT-PCR and virus identity was determined by nucleotide sequence of the amplified fragment. Efforts to transmit CSDaV, using as inoculum extract from field infected plants, by means of Cucucuta sp., by incisions on the trunk of the test-plants, with Toxoptera citricida apparently viruliferous only for the tymovirus, and by means of citrus seed inoculation gave negative results.