Submitted by Ana Paula Macedo (ensino@ioc.fiocruz.br) on 2013-10-03T12:29:19Z No. of bitstreams: 1 NOEMIA SANTANA LIMA.pdf: 3498499 bytes, checksum: a5726622efcddf45a18f49e17d2f093f (MD5) / Made available in DSpace on 2013-10-03T12:29:19Z (GMT). No. of bitstreams: 1 NOEMIA SANTANA LIMA.pdf: 3498499 bytes, checksum: a5726622efcddf45a18f49e17d2f093f (MD5) Previous issue date: 2011 / Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Oswaldo Cruz. Rio de Janeiro, RJ, Brasil / A Febre Amarela, uma doença causada por um representante do gênero Flavivírus, é caracterizada principalmente por grave injúria hepática que pode levar ao óbito. Há 70 anos, esta doença tem sido controlada por uma vacina constituída do vírus atenuado cepa 17D, que apresenta raríssimos casos de efeitos adversos. O vírus vacinal exibe replicação limitada no hospedeiro, porém com significativa disseminação da massa viral, levando a uma resposta imune forte e de longa duração. Devido a estas qualidades, o uso do vírus FA 17D como um vetor de expressão mostra-se atraente para desenvolvimento de novas vacinas humanas. Apenas recentemente a vacina contra a febre amarela vem sendo estudada para esclarecimento dos mecanismos da imunidade gerada pelo vírus 17D e pouco é sabido sobre o tropismo e sítios de proliferação viral. Este trabalho investigou o potencial proliferativo do vírus FA 17D como modelo para o estudo de outros vírus recombinantes produzidos no laboratório, com o objetivo de caracterizar o grau de dispersão viral em diferentes órgãos. Para tanto, camundongos isogênicos (BALB/c) foram inoculados por via subcutânea na região dorsal com 105 ou 2 x 106 PFU do vírus 17DD. Após 1, 2, 4, 7 e 11 dias foram colhidos o soro, a pele do sítio de inoculação, os linfonodos drenantes, o fígado e o baço para detecção do RNA viral por RT-PCR semi-nested e quantificação da carga viral por qRT-PCR. Verificou-se que com a dose maior mais camundongos apresentaram RNA viral nos órgãos e o vírus atingiu fígado e baço mais precocemente, sendo detectado também no soro a partir do 1º dia pós-inoculação. Pele e linfonodo drenante do local da inoculação parecem ser sítios de replicação primária, onde o RNA viral foi detectado nos primeiros dias de infecção, com queda da carga viral após o 7º dia. Foram dosados alguns marcadores de função hepática (AST, ALT e bilirrubina) para verificar se a imunização com o vírus 17DD poderia induzir disfunções ou lesões hepáticas, porém os resultados não mostraram diferença significativa entre o grupo vacinado e o grupo controle, mostrando que a vacina não afeta o funcionamento do fígado. Tentamos ainda avaliar alterações no perfil de citocinas séricas após imunização com o vírus 17DD através do ensaio de detecção múltipla, porém a técnica não foi sensível o suficiente para detectar qualquer alteração. O modelo estabelecido neste trabalho poderá servir como base de comparação para avaliação de novos candidatos vacinais constituídos de vírus FA recombinantes. / The Yellow Fever, a disease caused by a virus of the genus Flavivirus, is mainly characterized by severe liver injury that can lead to death. For 70 years, this disease has been controlled by a vaccine consisting of attenuated virus strain 17D, which features rare cases of adverse effects. The vaccine virus shows limited replication in the host, but with significant spread of the viral mass, leading to a strong and long lasting immune response. Because of these qualities, the use of FA 17D virus as an expression vector has been attractive for developing new human vaccines. Only recently the vaccine against yellow fever has been studied to elucidate mechanisms of immunity activated by FA 17D virus and little is known about viral tropism and its sites of proliferation. This study investigated the proliferative potential of FA 17D virus as a model for studying other recombinant viruses produced in the laboratory with the aim of characterizing the degree of viral spread in different organs. Inbred mice (BALB/c) were inoculated subcutaneously in the dorsal region with 105 or 2 x 106 PFU of 17DD virus. After 1, 2, 4, 7 and 11 days, we harvested serum, the skin of the inoculation site, draining lymph node, liver and spleen for detection of viral RNA by semi-nested RT-PCR and viral load quantification by qRT-PCR. It was found that with higher doses it is possible to detect more viral RNA in organs. Hence, since the first day post-vaccination, we could detect the virus in liver, spleen and serum. Furthermore, skin and draining lymph node of the site of inoculation seem to be primary sites of replication, where the viral RNA was detected in the first days of infection, with a drop in viral load after 7 days. We measured some markers of liver function (AST, ALT and bilirubin) to verify if the immunization with 17DD virus could induce dysfunction or liver injury, but the results showed no significant difference between vaccinated and control groups, showing that the vaccine does not affect liver function. We also tried to evaluate changes in serum cytokine profile after immunization with 17DD virus by multiple detection assay, but the technique was not sensitive enough to detect any change. The model established in this work can serve as a basis of comparison for evaluation of new recombinant YF 17D virus vaccine candidates.

Made available in DSpace on 2015-02-27T17:39:04Z (GMT). No. of bitstreams: 2 64.pdf: 604343 bytes, checksum: edae78b2242ec5e83a56d865390be3ce (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2010 / Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Nacional de Controle de Qualidade em Saúde / O presente trabalho teve como objetivo (i) avaliar o processo de controle da qualidade relacionado às vacinas contra febre amarela utilizadas pelo Programa Nacional de Imunizações (PNI) do Ministério da Saúde no período de 2000 a 2008, através de levantamento de dados provenientes do Sistema de Gerenciamento de Amostras (SGA) do Instituto Nacional de Controle de Qualidade em Saúde (INCQS) da Fundação Oswaldo Cruz (Fiocruz) e (ii) propor a utilização de gráficos de controle, como ferramentas úteis para a melhoria desse processo, a partir da análise comparativa dos resultados obtidos para vacinas nacionais e importadas, e da consistência de produção e detecção de tendências sistemáticas. Teve ainda como proposta (iii) a validação retrospectiva do teste de potência da vacina em questão, através da demonstração de sua confiabilidade (variabilidade e precisão) e do acompanhamento do desempenho da vacina de referência usada nos testes de potência e termoestabilidade. Compuseram a análise relativa ao controle da qualidade das vacinas contra febre amarela os seguintes parâmetros: (i.) análise do protocolo resumido de produção e controle emitido pelo fabricante, (ii.) teste de potência, (iii.) teste de termoestabilidade, (iv.) teste de determinação de ovalbumina, (v.) teste de esterilidade bacteriana e fúngica, (vi.) teor de umidade residual e (vii.) endotoxina bacteriana. Para confecção dos gráficos de controle foram estabelecidos os limites de controle (3 DP a partir da média) e limites de alerta (2 DP), calculados a partir dos 20 primeiros resultados a cada ano, como definido pela OMS (OMS, 1997) e através do programa SPC Explorer RT, versão 5.21 (Quality America Inc.). No período estudado ingressaram no INCQS 1031 lotes de vacinas contra febre amarela, produzidos por dois fabricantes distintos (97% pelo fabricante A e 3% pelo fabricante B), representando um total de 285 milhões de doses individuais. / O presente trabalho teve como objetivo (i) avaliar o processo de controle da qualidade relacionado às vacinas contra febre amarela utilizadas pelo Programa Nacional de Imunizações (PNI) do Ministério da Saúde no período de 2000 a 2008, através de levantamento de dados provenientes do Sistema de Gerenciamento de Amostras (SGA) do Instituto Nacional de Controle de Qualidade em Saúde (INCQS) da Fundação Oswaldo Cruz (Fiocruz) e (ii) propor a utilização de gráficos de controle, como ferramentas úteis para a melhoria desse processo, a partir da análise comparativa dos resultados obtidos para vacinas nacionais e importadas, e da consistência de produção e detecção de tendências sistemáticas. Teve ainda como proposta (iii) a validação retrospectiva do teste de potência da vacina em questão, através da demonstração de sua confiabilidade (variabilidade e precisão) e do acompanhamento do desempenho da vacina de referência usada nos testes de potência e termoestabilidade. Compuseram a análise relativa ao controle da qualidade das vacinas contra febre amarela os seguintes parâmetros: (i.) análise do protocolo resumido de produção e controle emitido pelo fabricante, (ii.) teste de potência, (iii.) teste de termoestabilidade, (iv.) teste de determinação de ovalbumina, (v.) teste de esterilidade bacteriana e fúngica, (vi.) teor de umidade residual e (vii.) endotoxina bacteriana. Para confecção dos gráficos de controle foram estabelecidos os limites de controle (3 DP a partir da média) e limites de alerta (2 DP), calculados a partir dos 20 primeiros resultados a cada ano, como definido pela OMS (OMS, 1997) e através do programa SPC Explorer RT, versão 5.21 (Quality America Inc.). No período estudado ingressaram no INCQS 1031 lotes de vacinas contra febre amarela, produzidos por dois fabricantes distintos (97% pelo fabricante A e 3% pelo fabricante B), representando um total de 285 milhões de doses individuais. Desse total, 5 lotes do fabricante A (0,5% do total de lotes deste fabricante) foram consideramos insatisfatórios (cerca de 1,7 milhões de doses), sendo três lotes no teste de esterilidade bacteriana e fúngica e dois lotes no teste de umidade residual. A avaliação dos gráficos de controle dos resultados de potência e de termoestabilidade mostraram que estes testes apresentam menor variação no INCQS do que no fabricante A. Além disso, no ano de 2007 foi possível observar um número significativo de valores do teste de potência deste fabricante abaixo do limite inferior de controle. Estes valores concentravam-se na segunda metade do gráfico, coincidindo com um período em que houve maior demanda pela vacina contra febre amarela, devido ao aumento no número de casos da doença no Brasil e em alguns países da América do Sul. Nosso resultados indicam ainda que no INCQS, o processo está sob controle estatístico e as causas especiais de variação, caso ocorram estão sendo controladas. Quanto à validação retrospectiva do teste de potência contra febre amarela no INCQS, concluímos que a exatidão foi de 0,19 (0,09-0,25), e recuperação de 96,14. A precisão total foi de 14,48%, sendo a repetitividade de 11,92% e precisão intermediária de 7,78% entre ensaios, e 7,80% entre analistas. Estes valores encontram-se satisfatórios e de acordo com o preconizado para ensaios biológicos por agências internacionais.

Made available in DSpace on 2011-05-04T12:42:06Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2010 / A efetividade das vacinas contra febre amarela tem sido aferida indiretamentepelo sucesso das ações de vacinação em muitos países. Em que pese o sucesso das ações de vacinação no controle da doença, há questões pendentes sobre a imunogenicidade e reatogenicidade das vacinas disponíveis que precisam ser avaliadas para definição de estratégias das ações básicas de imunização na infância. Em um estudo observacional com a vacina 17DD, foi demonstrada menor imunogenicidade vacinal em crianças, principalmente com a aplicação simultânea da vacina contra sarampo (Grupo Colaborativo,2003). No atual calendário básico de imunizações há a possibilidade da aplicação simultânea das vacinas contra febre amarela e da vacina tríplice viral. Um ensaio clínico multicêntrico, randomizado, duplo-cego, foi realizado para investigar a imunogenicidade ea reatogenicidade das vacinas contra febre amarela (17D213/77 e 17DD) em crianças (Collaborative Group for Studies with Yellow Fever Vaccine, 2007) e definir os possíveisdeterminantes. A relevância deste estudo está na capacidade de obter dados para responder questões relativas às estratégias do Programa Nacional de Imunizações necessárias para adefinição das políticas públicas para controle e prevenção da doenças. A proporção de soroconversão e soropositividade pós-vacinal contra febre amarela em crianças aos 9 e 12meses de idade foi menor do que a observada previamente em ensaio clínico em adultos. Não houve diferença na imunogenicidade ou reatogenicidade das subcepas de vacinas contra febre amarela testadas (17D e 17DD). / A situação sorológica das mães não foi um fator determinante de menor soroconversão em crianças menores de 12 meses de idade, porém a presença de anticorpos pré-vacinais contra febre amarela em crianças menores de12 meses está associada a menor soroconversão. A vacinação simultânea contra febre amarela e tríplice viral afeta substancialmente a resposta imunológica para rubéola e febreamarela, mas não a vacina contra sarampo, o que pode influenciar de forma relevante as estratégias para controle da febre amarela e rubéola. A presença de anticorpos contradengue, independentemente de seu título, não interfere na imunogenicidade ou no padrão de reatogenicidade das vacinas contra febre amarela aplicadas em crianças residentes emáreas endêmicas. A proporção estimada de soronegatividade após duas doses de vacina contra febre amarela em crianças menores de 2 anos de idade foi de apenas 1,25 por cento. A ocorrência de casos esporádicos e surtos não permite que a idade recomendada para aprimovacinação seja deslocada para idades em que a vacina mostrou maiorimunogenicidade. Uma alternativa seria alterar o esquema primário de vacinação contra febre amarela para duas doses: mantendo a primeira dose aos 9 meses e aplicando umasegunda dose após 12 meses de vida. A aplicação da segunda dose aos 18 meses de idade seria conveniente para não coincidir com outras vacinas do calendário de imunizações. Aprimeira dose aos 9 meses seria mantida para proteger indivíduos de zonas endêmicas, o mais cedo possível. A segunda dose permitiria (1) imunizar um número adicional de crianças que não tinham respondido à primovacinação (falha primária), (2) reforçar respostas à primovacinação, e (3) ampliar as oportunidades de vacinar aqueles que não haviam recebido a primovacinação aos 9 meses.

Submitted by Priscila Nascimento (pnascimento@icict.fiocruz.br) on 2012-12-05T16:27:54Z No. of bitstreams: 1 francis-reisdorfer.pdf: 950272 bytes, checksum: cd830ca14cc83c70d5e0bee55d4e68e6 (MD5) / Made available in DSpace on 2012-12-05T16:27:54Z (GMT). No. of bitstreams: 1 francis-reisdorfer.pdf: 950272 bytes, checksum: cd830ca14cc83c70d5e0bee55d4e68e6 (MD5) Previous issue date: 2011 / Fundação Oswaldo Cruz. Instituto de Tecnologia em Imunobiológicos. Rio de Janeiro, RJ, Brasil. / A febre amarela (FA) é uma doença viral aguda, transmitida por mosquitos vetores, que pode causar doença grave e morte. O vírus da FA é um membro da família Flaviviridae do gênero Flavivírus. No Brasil, todas as regiões já apresentaram casos da doença e o número de casos fatais tem aumentado. Até hoje, a vacinação é o meio mais eficaz para prevenir e controlar a FA. A partir de 2011, o quantitativo solicitado tanto pelo Ministério da Saúde quanto para exportação aumentou, e este é um dos motivos que leva a discussão para a formação de um estoque estratégico deste produto em Bio-Manguinhos. Portanto, para que seja garantido o suprimento da vacina febre amarela (atenuada) aos órgãos nacionais e internacionais em momentos de maior demanda, assim como aumentar a oferta e melhorar o aproveitamento de doses distribuídas, evitando o desperdício de uma vacina estável, estudos de estabilidade foram realizados visando à extensão do prazo de validade das vacinas febre amarela (atenuada) 05 e 10 doses de 24 para 36 meses, quando armazenadas a -20ºC e a 2-8ºC. Para aanálise da estabilidade da vacina 10 doses, foram avaliados dados retrospectivos de potência, termoestabilidade, umidade residual, e outros parâmetros menos críticos, obtidos a partir de estudos de estabilidade longa duração (-20ºC e 2-8ºC / 48 meses) e pós-reconstituição (2-8ºC / 08 horas), assim como dados obtidos nos períodos de 2009 e 2010. Para a análise da estabilidade da vacina 05 doses, foram avaliados dados retrospectivos de potência obtidos de estudos de acompanhamento da estabilidade realizados entre 2003 e 2009 (-20ºC / 36 meses), além de estudos complementares de acompanhamento da estabilidade, realizados com lotes produzidos entre2005 e 2006 (-20ºC e 2-8ºC / 48 meses). Os dados obtidos para ambas as apresentações puderam ser comparados, pois elas são constituídas pela mesma formulação, diferenciando-se somente no volume de envase. Para a análise estatística dos dados foram utilizados a regressão linear, a análise de covariância (ANCOVA), além do cálculo de intervalos de confiança, intervalos preditivos e extrapolação de dados. Os resultados de potência e termoestabilidade tanto para a vacina05 doses quanto para a 10 doses decaem ao longo do tempo de armazenamento em ambas as temperaturas, entretanto permanecem de acordo com as respectivas especificações. Já os resultadosde umidade residual obtidos para a vacina 10 doses revelaram um incremento na umidade ao longo do tempo, mas também se mantêm de acordo com a respectiva especificação. Os resultados de potência e esterilidade, obtidos para a vacina 10 doses em estudos pós-reconstituição, também demonstraram a estabilidade deste produto armazenado por 08 horas a 2-8ºC. Portanto, o prazo de validade das vacinas febre amarela (atenuada) 05 e 10 doses pode ser estendidopara 36 meses, quando armazenado a -20ºC ou a 2-8ºC, sem alteração de sua qualidade. / Yellow fever (YF) is an acute viral disease, transmitted by mosquitoes, which can cause serious illness and death. The YF virus is a member of the Flaviviridaefamily, Flavivirus genus. In Brazil, all regions have already had cases of the disease and the number of fatalities has increased. Until now, vaccination is the only effective means to prevent and control YF. From 2011, the amount of vaccine requested by Ministry of Health and for exports increased, and this is one of the reasons leading the discussion for the formation of a strategic stock of this product in Bio-Manguinhos. Therefore, to ensure the regularsupply of yellow fever vaccine (attenuated) to the national and international agencies in timesof high demand, as well as increase supply and improve the use of doses distributed, avoiding the waste of a stable vaccine, stability studies were performed to propose the extension of the shelf-life of yellow fever vaccine 05 doses (YFV-05) and 10 doses (YFV-10) from 24 to 36 months when stored at -20ºC and 2-8°C. For the stability analysis of YFV-10 were evaluated retrospective potency, thermostability and residual moisture data, and other parameters less critical, obtained from studies of long-term stability (-20ºC and 2-8ºC / 48 months) and after reconstitution (2-8ºC / 08 hours) as well as data obtained during the periods of 2009 and 2010. To analyze the stability of YFV-05 were evaluated retrospective potency data obtained from annual stability studiesconducted between 2003 and 2009 (-20ºC / 36 months) in addition to complementary annual stability studies, carried out with batches produced between 2005 and 2006 (-20ºC and 2-8ºC / 48 months). The data obtained for both presentation could be compared because both have the same formulation, differing only in filling volume. For the statistical analysis were used linear regression, analysis of covariance (ANCOVA), and the calculation of confidence intervals, predictive intervals and data extrapolation. The results of potency and thermostability for both YFV-05 and YFV-10 decay over time at both storage temperatures and remain according to specifications. However, the results obtained for residual moisture to YFV-10 revealed an increase in moisture over time, but remaining according to specification. Analysis of potency and sterility obtained for YFV-10 after reconstitution study also demonstrated the stability of the product stored for 08 hours to 2-8°C. Therefore, the shelf-life of yellow fever vaccine 05 and 10 doses may be extended for 36 months when stored at -20 C or 2-8ºC, without changing itsquality.

Submitted by Priscila Nascimento (pnascimento@icict.fiocruz.br) on 2012-11-12T18:43:04Z No. of bitstreams: 1 ricardo-de-carvalho.pdf: 1945198 bytes, checksum: 8586b33e6fabb5d0036c0443e9c26caa (MD5) / Made available in DSpace on 2012-11-12T18:43:04Z (GMT). No. of bitstreams: 1 ricardo-de-carvalho.pdf: 1945198 bytes, checksum: 8586b33e6fabb5d0036c0443e9c26caa (MD5) Previous issue date: 2005 / Fundação Oswaldo Cruz. Instituto de Tecnologia em Imunobiológicos. Rio de Janeiro, RJ, Brasil / Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Oswaldo Cruz Rio de Janeiro, RJ, Brasil. / Esta dissertação investiga a aplicação do Controle Estatístico de Processo (CEP) nas principais fases da produção da suspensão viral (SV) da vacina contra febre amarela produzida em Bio-Manguinhos/FIOCRUZ, Brasil. Empregada na formulação do produto final, a SV é preparada em várias etapas, utilizando a tecnologia aperfeiçoada no Brasil (egg passage), desde 1937. O sistema de CEP implantado está baseado em recursos computacionais, perfeitamente adaptados à realidadeda Instituição. Os gráficos de controle foram a principal ferramenta estatística empregada.Sete variáveis relativas às etapas da produção da SV foram estudadas: perdas de ovos no transporte; ovos não embrionados; embriões mortos na primeira incubação; perdas na inoculação; embriões mortos na segunda incubação; perdas na coleta de embriões e rendimento na coleta de embriões. Dentre as variáveis investigadas, perdas por transporte e fertilidade dos ovos não sofrem interferência direta da produção, porém são de fundamental importância para as fases seguintes e, por esse motivo, foram estudadas. Os resultados mostraram que seis variáveis, das sete analisadas, apresentaram resultados sob controle, ainda que duas delas não tenham atendido a uma das regras sensibilizantes estabelecidas: ovos não embrionados e perdas na coleta. A variável rendimento ficou caracterizada como não controlada.Em relação à capacidade, os processos de transporte de ovos e ovos não embrionados foram classificados como processos incapazes (Cpk< 1,00). Os processos com as variáveis embriões mortos na primeira incubação e perdas na inoculação foram considerados como relativamentecapazes (1,00 ≤Cpk < 1,33) e, finalmente, os processos com variáveis embriões mortos na segunda incubação e perdas na coleta foram considerados capazes (Cpk ≥1,33). Pela análise do conjunto, os resultados indicam a necessidade de ajustes, intensificação e controle contínuo dos processos que estão sendo praticados. / This work deals with the application of Statistical Control Process (SCP) to the main parts of the production of Viral Suspension (VS) ofthe yellow fever vaccine manufactured by Bio-Manguinhos/FIOCRUZ, Brazil. The VS is used in the formulation of the final product and is prepared in several steps, using a technology (egg passage), which has been being improved in Brazil since 1937. The SCP system used is based on computational resources that are well adapted to the Institution reality. Control graphs were the main statistical tools employed. Seven variables related to the productionof the VS were investigated: transporting losses of eggs; non-germinated eggs; dead embryos during the first incubation; losses during inoculation; dead embryos during the second incubation; losses during embryo collect and efficiency in collecting embryo. Among the studied variables, transporting losses and fertility of eggs do not relate directly to the production, but are of fundamental importance for the subsequent steps, and were also studied for this reason. The results showed that six out of seven analyzed variables were under control, although two of them did not attend one of the established sensitivity rules: non germinated eggs and losses in collecting. Efficiency ended up characterized as a non-controlled variable. As far as capacity is concerned, transporting of eggs and non-germinated eggs were classified as uncapable processes (Cpk < 1,00). Dead embryos during the first incubation and losses during inoculation were considered as relatively capable processes (1,00 ≤Cpk < 1,33). Finally, dead embryos during the second incubation and losses in collecting embryo were considered capable processes (Cpk ≥1,33). The results, thus, show a necessity of adjustments,intensification and continuous control of the currently used processes.

Submitted by Nuzia Santos (nuzia@cpqrr.fiocruz.br) on 2013-01-08T10:40:45Z No. of bitstreams: 1 Tese_Maria Luiza Silva.pdf: 18437840 bytes, checksum: 99e60f1ec0d4d9df9e50bbec11e91cd0 (MD5) / Made available in DSpace on 2013-01-08T10:40:45Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Tese_Maria Luiza Silva.pdf: 18437840 bytes, checksum: 99e60f1ec0d4d9df9e50bbec11e91cd0 (MD5) / Neste trabalho, o perfil fenotípico e de síntese de citocinas pró-inflamatórias (IFN-, TNF- e IL-12) e reguladoras (IL-4, IL-5 e IL-10) em células da imunidade inata (neutrófilos, monócitos e células NK) e adaptativa (linfócitos CD4+, linfócitos CD8+ e linfócitos CD19+) do sangue periférico de indivíduos primo e/ou revacinados com a vacina antiamarílica 17DD, bem como um caso de reação adversa à vacinação foram investigados por citometria de fluxo após cultura rápida in vitro na ausência e presença da estimulação antígeno-específica. Foram avaliados 10 adultos saudáveis, com idade entre 21 e 51 anos, em 4 tempos distintos: antes da vacinação, 7, 15 e 30 dias após primovacinação. Após cultura in vitro foi observado um perfil global de citocinas pró-inflamatórias, transiente no 7° dia, principalmente devido às células da imunidade inata, seguido por perfil misto de citocinas inflamatórias e reguladoras nos 15° e 30° dias após a vacinação antiamarílica 17DD. Em um 2º estudo, foi observada uma resposta imune adaptativa robusta, acompanhada por anormalidades na resposta do sistema imune inato em um caso de evento adverso grave, seguido à vacinação 17D. Em adição, em um 3º estudo, foram incluídas 60 crianças com idade entre 9 e 47 meses, um ano após a primo e/ou revacinação antiamarílica 17DD, classificadas de acordo com os níveis de anticorpos neutralizantes antiamarílicos apresentados após a vacinação em: respondedoras (médios ou altos títulos de anticorpos neutralizantes), não respondedoras, respondedoras após revacinação e um grupo de crianças não vacinadas. Os dados da avaliação do impacto dos antígenos vacinais 17DD no perfil das citocinas dos leucócitos periféricos destas crianças demonstraram que, na presença de títulos médios de anticorpos neutralizantes após a primovacinação, o estímulo por antígenos vacinais 17DD in vitro foi capaz de induzir um perfil balanceado de citocinas pró-inflamatórias e reguladoras, envolvendo células da imunidade inata e adaptativa, enquanto que uma assinatura polarizada reguladora foi observada no grupo de crianças primovacinadas não respondedoras e uma assinatura proeminente pró-inflamatória no grupo de crianças que apresentaram títulos altos de anticorpos neutralizantes após a primovacinação. Em conjunto os dados sugerem que uma resposta imune predominantemente do tipo balanceada, com síntese de citocinas pró-inflamatórias e reguladoras, envolvendo tanto células da imunidade inata quanto da imunidade adaptativa parece ser essencial para a indução de uma resposta imune efetiva e segura após a vacinação antiamarílica. / In this study, phenotypic analysis and intracytoplasmic pro-inflammatory (IFN-, TNF- and IL-12) and regulatory (IL-4, IL-5 and IL-10) cytokines synthesis by innate (neutrophils, monocytes and NK cells) and adaptive (CD4+ and CD8+ T subsets, and CD19+) immunity cells of peripheral leucocytes of 17DD yellow fever (YF) prime or revaccinated volunteers, as well as a case of serious adverse events (YF-SAE) temporally associated with 17D YF vaccination were performed using short-term cultures, in absence or presence of YF-17DD-antigens, and single-cell flow cytometry. Ten healthy non-vaccinated volunteers, aged 21 to 51 years were evaluated at four consecutive periods including: before vaccination, 7, 15 and 30 days after vaccination. After whole blood cells culture, the overall cytokine signature showed a transient pro-inflammatory profile at day 7, mainly due to the innate immunity cells, which draws back toward a mixed or modulated pattern at day 15 and day 30 in most vaccines. In another study a robust adaptive response and abnormalities in the innate immune system were observed in one severe adverse event following primary YF-17D vaccination. In addition it was evaluated sixty healthy children with age raging from 9 to 47 months, one year after 17DD yellow fever prime or revaccination, classified according to anti-YF neutralizing antibodies results after vaccination as seroconverters (medium or high neutralizing antibodies levels), non-seroconverters, seroconverters after revaccination, and a unvaccinated group. The impact of YF-17DD-antigens recall on cytokine profiles of YF-17DD primo-vaccinated children characterized by single-cell flow cytometry after short-term cultures of whole blood samples demonstrate that the overall signature of high cytokine producers triggered by YF-Ag recall is associated with the levels of anti-YF neutralizing antibodies, with a balanced pro-inflammatory and regulatory profile of innate and adaptive immunity being the hallmark of seroconverters who presented medium neutralizing antibodies levels, whereas a polarized regulatory signature is observed in non-seroconverters and a prominent pro-inflammatory signature is characteristic of seroconverters who presented high neutralizing antibodies levels. Taken together, the results suggest that mixed type immune response, pro and anti-inflammatory, involving both innate immunity cells and adaptive immunity cells, it may play a pivotal role in the establishment of effective and safe immunization by yellow fever vaccine

Made available in DSpace on 2016-05-11T13:01:04Z (GMT). No. of bitstreams: 2 pedro_manso_ioc_dout_2014.pdf: 3405057 bytes, checksum: 6746c4f31f57631cda4cf25c55563336 (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2014 / Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Oswaldo Cruz. Rio de Janeiro, RJ, Brasil / A vacina contra febre amarela é produzida a partir da inoculação do vírus atenuado 17DD em ovos embrionados de galinha. Esta vacina é extremamente eficaz e segura, gerando imunidade que pode perdurar por até trinta e cinco anos. Embora a replicação deste vírus em embriões de galinha seja utilizada desde 1937, pouco se sabe sobre os aspectos da infecção nestes embriões, especialmente que órgãos, tecidos e células são responsáveis pela replicação viral. Nesse trabalho, analisamos embriões de galinha (Gallus gallus) infectados pelo vírus da FA 17DD em diferentes tempos de infecção (24, 48, 72 e 96 horas) conforme as condições empregadas na produção de vacina na Fiocruz. Identificamos o vírus da Febre Amarela através de imunofluorescência em diferentes tecidos, correlacionamos a presença deste agente infeccioso às pequenas reações histopatológicas observadas nos tecidos, validamos essa detecção pela confirmação do material genético viral e seu sequenciamento, e confirmamos que este vírus replica na região onde foi identificado pela presença detecção de seu intermediário replicativo. Nesse sentido observamos que as alterações histopatológicas que ocorrem nos embriões de galinha infectados pelo vírus FA 17DD se apresenta branda e sistêmica ao longo do tempo analisado. Nossos dados apontam que as primeiras células a manifestar a infecção são mioblastos com aspecto mesenquimal que puderam ser observados no coração e no músculo esquelético a partir de 48 horas de infecção Após 72 horas, o vírus FA 17DD replica em células do músculo esquelético, cardiomiócitos, células da glia e neurônios, no epitélio tubular renal, parênquima pulmonar e fibroblastos. Nossos dados permitem sugerir o tecido muscular esquelético como um local privilegiado na produção das partículas virais. Após 96 horas a infecção se torna mais intensa no sistema nervoso e se mantém nos mesmos níveis nos demais tecidos já infectados. O conjunto de dados gerados nesse trabalho contribui para elucidar aspectos importantes sobre a patologia da febre amarela em embriões de galinha, e evidenciar os tecidos e células responsáveis pela produção do vírus FA 17DD nestes embriões. Estes dados podem ser úteis na compreensão e formulação de novas estratégias de produção da vacina, além de impactar no desenvolvimento de estratégias baseadas no uso do vírus FA 17DD como plataforma de produção para outras vacinas / Yellow fever vaccine is produced from the inoculation of attenuated virus YF 17DD in embryonated chicken eggs. This vaccine is extremely effective and safe, generating immunity that can persist across up to thirty-five years. Although replication of this virus in chicken embryos is used since 1937, little is known about aspects of infection in these embryos, especially that organs, tissues and cells are responsible for viral replication. In this study we analyzed chicken embryos (Gallus gallus) infected in vaccine production (Biomanguinhos) with YF 17DD virus in different times post infection (24, 48, 72 and 96 hours). Here it was possible to detect the Yellow Fever Virus by immunofluorescence, to correlate this presence with tiny tissue reactions, to validate it by genomic RNA detection and to sequence it in the same studied area, confirming that this virus is replicated in these regions by the replicative intermediate detection. In this thesis the histopathological changes that occur in chicken embryos infected by YF 17DD virus during the production of yellow fever vaccine were observed in a kinetic way. We observed that the infection in these embryos presented itself mild and systemic. Our data show that the first cells which express infection are myoblasts with mesenchymal shape that could be observed in the heart and skeletal muscle at 48 hours of infection. After 72 hours the yellow fever virus 17DD replicates mainly in skeletal muscle cells, cardiomyocytes, glial cells and neurons, but also in the renal tubular epithelium, lung parenchyma and fibroblasts. Our findings suggested skeletal muscle tissue as a main place in the production of viral particles. After 96 hours the infection becomes more intense in the nervous system and is maintained at the same levels in other tissues already infected. The data generated in this study contributes to elucidate important aspects of the yellow fever pathology in chicken embryos, and elucidate the tissues and cells responsible for YF 17DD virus production in this model. Our data may be helpful in the understanding and design new strategies of vaccine production, and impact in development of strategies based on the use of the virus YF 17DD as a platform for other vaccines production.

Submitted by Priscila Nascimento (pnascimento@icict.fiocruz.br) on 2012-11-16T12:24:56Z No. of bitstreams: 1 rafael-lawson-ferreira.pdf: 3259100 bytes, checksum: 120506960b3b1958e6509f56db6fef38 (MD5) / Made available in DSpace on 2012-11-16T12:24:56Z (GMT). No. of bitstreams: 1 rafael-lawson-ferreira.pdf: 3259100 bytes, checksum: 120506960b3b1958e6509f56db6fef38 (MD5) Previous issue date: 2007 / Fundação Oswaldo Cruz. Instituto de Tecnologia em Imunobiológicos. Rio de Janeiro, RJ, Brasil / Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Oswaldo Cruz. Rio de Janeiro, RJ, Brasil. / O Instituto de Tecnologia em Imunobiológicos - Bio-Manguinhos/ FIOCRUZ (BM) é um importante centro de produção de imunobiológicosna América Latina. Dentre as vacinas produzidas em Bio-Manguinhos, sob condiçõesde boas práticas de fabricação, a vacina contra Febre Amarela (VcFA), produzida a partir de ovos embrionados SPF, é certificada pela Agência Nacional de Vigilância Sanitária e Organização Mundial de Saúde para suprir a demanda do Ministério da Saúde e das Agências das Nações Unidas. Para garantir a segurança da vacina assim como a ausência de agentes adventícios, testes de Controlede Qualidade (CQ) devem ser realizados na matéria-prima e nas diferentes etapasda produção. Por recomendação da Organização Mundial de Saúde, em vacinas produzidas para o uso humano deve ser demonstrada a ausência de M. oralee M. pneumoniaee quando material de origem aviária é utilizado durante a produção, ausência de M. gallisepticume M. synoviae. Da mesma forma como o desenvolvimento de novos produtos tem evoluído, o CQ deve seguir estas novasabordagens cujos benefícios imediatos seriam a rapidez na liberação de resultados, maior sensibilidade e especificidade. O micoplasma é um importante agenteadventício amplamente encontrado em diferentes tipos de substratos biológicos, porém é um microrganismo fastidioso e de difícil detecção pelo exame direto (cultura do microrganismo) o qual requer um longo prazo para obtenção de resultados, cerca de 35 dias. Em nosso trabalho selecionamos o par de oligonucleotídeos iniciadores GPO-1 e MGSO com o objetivo de estabelecer um teste para detecção de micoplasmas por PCR no CQ da VcFA. Os oligonucleotídeos selecionados amplificam fragmentos de aproximadamente 700 pb na região do gene do rDNA 16S. Foram testadas diferentes metodologias de extração de DNA, como fervura, fenol/clorofórmio e kits comerciais avaliando a adaptabilidade da técnica para os diferentes produtos intermediários. A metodologia proposta, neste trabalho, foi capaz de detectar M. pneumoniaeem concentrações entre 6,25 e 3,125 UFC/mL e M. synoviaeentre 12,5 e 6,25 UFC/mL, em produtos intermediários intencionalmente contaminados, em concentrações inferiores do que as preconizadas pela OMS. Além disso, os oligonucleotídeos selecionados demonstraram especificidade pelas espécies de micoplasmas utilizadas, não apresentando amplificação quando o DNA de outras espécies bacterianas foi utilizado. Paralelamente, foi realizado um ensaio de polimorfismo do comprimento dos fragmentos da restrição (RFLP) para identificação da espécie de micoplasma, onde selecionamos as enzimas de restrição MboI e HinfI, capazes de diferenciar as três espécies de micoplasmas de referência utilizadas (M. gallisepticum, M. pneumoniaee M. synoviae). / The Institute of Technology in Immunobiologicals - Bio-Manguinhos/ FIOCRUZ is an important immunobiological production center in Latin America. Among the vaccines produced in Bio-Manguinhos under good manufacturingpractice, the vaccine against Yellow Fever (YF-Vaccine), produced in SPF embrionated eggs, is certified by the Brazilian National Surveillance Agency and World Health Organization to achieve the demand of the Brazilian Ministry of Health and the United Nations Agencies. In order to guarantee the safety of the vaccine as well as the absence of contaminant agents, tests of Quality Control (QC) must be done along its production. By advice of WHO, on vaccines produced for human use, there must be demonstrated the absence of M. oraleand M. pneumoniae. When poultry material is used during the production, absence of M. gallisepticumand M. synoviae is also required. Mycoplasma is a fastidious microorganism of difficult detection through culturing, which requires a long term for conclusive results, about 35 days. We selected the primer pair GPO-1 and MGSO to establish a mycoplasma detection through PCR in YF-Vaccine. The selected oligonucleotides amplify fragments of roughly 700 bp in the 16S rRNA gene region. Different methodologies of DNA extraction were performed, such as boiling, phenol/chloroform and commercial kits, thus, evaluating the adaptability of each method for the intermediary products. The proposed methodology in this study was capable to detect M. pneumoniaein concentration between 6,25 and 3,125 CFU/mL and M. synoviae,between 12,5 and 6,25 CFU/mL, in spiked intermediate products which constitute lower detection limits throw thosestipulated by WHO. In addition, selected oligonucleotides demonstrated specificity to the Mycoplasma species used in this work, not presenting amplification productswhen other bacteria species was used. Three reference mycoplasmas species (M. gallisepticum, M. pneumoniaeand M. synoviae) could be differentiated based on restriction fragments length polymorphism (RFLP) after digestion of the amplification products by HinfI and MboI.

INTRODUÇÃO: A Febre Amarela (FA) é uma doença viral aguda endêmica em grande parte do Brasil. A principal medida de prevenção é a vacinação. O presente estudo avaliou a prevalência e os títulos de anticorpos neutralizantes em pessoas com 60 anos ou mais que haviam recebido anteriormente a vacina de FA 17DD, em comparação a adultos saudáveis com 18 a 59 anos. Além disso, foram avaliadas a correlação entre os títulos de anticorpos e o tempo decorrido desde a vacinação, nos participantes que receberam apenas uma dose da vacina, e a prevalência de anticorpos nos vacinados há menos e há mais de dez anos. MÉTODOS: Os participantes foram recrutados entre pessoas que procuraram o Centro de Referência para Imunobiológicos Especiais (CRIE) do Hospital das Clínicas da Faculdade de Medicina da Universidade de São Paulo (HCFMUSP) para receber diferentes vacinas e que referiam ter recebido a vacina de FA anteriormente. Os seguintes dados foram coletados: idade, etnia, sexo, número de doses da vacina de FA recebidas, data da última vacinação de FA. Foi realizada contagem de linfócitos TCD4+ usando citometria de fluxo. Os anticorpos neutralizantes contra FA foram dosados pelo teste de neutralização por redução de 50% das placas de lise (PRNT50). RESULTADOS: Foram incluídos 94 indivíduos, 46 com idade de 60 anos ou mais (Grupo 1) e 48 com 18 a 59 anos (Grupo 2). Não houve diferença significativa entre os dois grupos na distribuição de gênero, etnia, número de doses de vacina de FA recebidas anteriormente, tempo desde a última dose e contagem de linfócitos TCD4+. Não houve diferença na prevalência de anticorpos neutralizantes anti-FA entre os dois grupos (87% e 93,8% nos Grupos 1 e 2, respectivamente, p=0,263). O título médio geométrico (GMT) dos anticorpos neutralizantes foi maior no grupo mais jovem (3,77 log10mUI/mL) comparado ao grupo mais velho (3,64 log10mUI/mL) e essa diferença foi estatisticamente significante (p=0,022). Não foi encontrada correlação entre os títulos de anticorpos neutralizantes e o tempo decorrido desde a vacinação entre os participantes que receberam apenas uma dose de vacina, tendo sido analisados os dois grupos conjuntamente. Também não foi encontrada diferença estatisticamente significativa na prevalência de anticorpos neutralizantes entre os participantes que receberam apenas uma dose da vacina de FA há mais de 10 anos ou há menos de 10 anos. CONCLUSÕES: São necessários outros estudos de persistência de anticorpos na população idosa devido à possibilidade de resposta vacinal alterada pela imunosenescência / INTRODUCTION. Yellow Fever (YF) is an acute viral disease endemic in large parts of Brazil. The main preventive measure is vaccination. This study aimed to assess the prevalence and titers of neutralizing antibodies in persons aged 60 years and older who had previously received YF 17DD vaccine, in comparison to healthy adults aged 18 to 59 years. The study also evaluated the correlation between the antibodies titers and the time elapsed since vaccination, in participants who had received a single dose of the vaccine, and the prevalence of antibodies in participants vaccinated within ten years and more than ten years before enrollment. METHODS. Participants were recruited among persons who came to the Reference Center for Special Immunobiologicals (Centro de Referência para Imunobiológcos Especiais, CRIE) of the Hospital das Clínicas da Faculdade de Medicina da Universidade de São Paulo (HC-FMUSP) to receive any vaccine and who had previously received the YF vaccine. The following data were collected: age, ethnicity, gender, number of YF vaccine doses taken and date of last YF vaccination. CD4 T cells counts were performed using flow cytometry. YF neutralizing antibodies were measured using test of neutralization by 50% reduction of lysis plaques (PRNT50). RESULTS. Ninety-four subjects were enrolled: 46 persons aged 60 years and older (Group 1) and 48 persons aged 18 to 59 years (Group 2). There was no significant difference between the groups regarding gender, ethnicity, number of YF vaccine doses previously received, time since the last dose and CD4+T cells count. There was no difference in the prevalence of YF neutralizing antibodies between the groups (87% and 93.8% in Groups 1 and 2, respectively, p=0.263). The log-transformed Geometric Mean Titer (GMT) of YF neutralizing antibodies was higher in the younger group (3.77 log10mUI/mL) in comparison to the older group (3.64 log10mUI/mL), and this difference was statistically significant (p=0.022). There was no correlation between YF neutralizing antibodies titers and time elapsed since vaccination among the participants who had previously received a single dose of YF vaccine, with the two groups analyzed together. There was no significant difference in the prevalence of neutralizing antibodies among participants who received a single dose of YF vaccine within ten years or more than 10 years before enrollment. CONCLUSIONS. Further studies on antibodies persistence in the elderly are necessary, considering the possibility of compromised immune response to vaccines due to immunosenescence

INTRODUÇÃO: A Febre Amarela (FA) é uma doença viral aguda endêmica em grande parte do Brasil. A principal medida de prevenção é a vacinação. O presente estudo avaliou a prevalência e os títulos de anticorpos neutralizantes em pessoas com 60 anos ou mais que haviam recebido anteriormente a vacina de FA 17DD, em comparação a adultos saudáveis com 18 a 59 anos. Além disso, foram avaliadas a correlação entre os títulos de anticorpos e o tempo decorrido desde a vacinação, nos participantes que receberam apenas uma dose da vacina, e a prevalência de anticorpos nos vacinados há menos e há mais de dez anos. MÉTODOS: Os participantes foram recrutados entre pessoas que procuraram o Centro de Referência para Imunobiológicos Especiais (CRIE) do Hospital das Clínicas da Faculdade de Medicina da Universidade de São Paulo (HCFMUSP) para receber diferentes vacinas e que referiam ter recebido a vacina de FA anteriormente. Os seguintes dados foram coletados: idade, etnia, sexo, número de doses da vacina de FA recebidas, data da última vacinação de FA. Foi realizada contagem de linfócitos TCD4+ usando citometria de fluxo. Os anticorpos neutralizantes contra FA foram dosados pelo teste de neutralização por redução de 50% das placas de lise (PRNT50). RESULTADOS: Foram incluídos 94 indivíduos, 46 com idade de 60 anos ou mais (Grupo 1) e 48 com 18 a 59 anos (Grupo 2). Não houve diferença significativa entre os dois grupos na distribuição de gênero, etnia, número de doses de vacina de FA recebidas anteriormente, tempo desde a última dose e contagem de linfócitos TCD4+. Não houve diferença na prevalência de anticorpos neutralizantes anti-FA entre os dois grupos (87% e 93,8% nos Grupos 1 e 2, respectivamente, p=0,263). O título médio geométrico (GMT) dos anticorpos neutralizantes foi maior no grupo mais jovem (3,77 log10mUI/mL) comparado ao grupo mais velho (3,64 log10mUI/mL) e essa diferença foi estatisticamente significante (p=0,022). Não foi encontrada correlação entre os títulos de anticorpos neutralizantes e o tempo decorrido desde a vacinação entre os participantes que receberam apenas uma dose de vacina, tendo sido analisados os dois grupos conjuntamente. Também não foi encontrada diferença estatisticamente significativa na prevalência de anticorpos neutralizantes entre os participantes que receberam apenas uma dose da vacina de FA há mais de 10 anos ou há menos de 10 anos. CONCLUSÕES: São necessários outros estudos de persistência de anticorpos na população idosa devido à possibilidade de resposta vacinal alterada pela imunosenescência / INTRODUCTION. Yellow Fever (YF) is an acute viral disease endemic in large parts of Brazil. The main preventive measure is vaccination. This study aimed to assess the prevalence and titers of neutralizing antibodies in persons aged 60 years and older who had previously received YF 17DD vaccine, in comparison to healthy adults aged 18 to 59 years. The study also evaluated the correlation between the antibodies titers and the time elapsed since vaccination, in participants who had received a single dose of the vaccine, and the prevalence of antibodies in participants vaccinated within ten years and more than ten years before enrollment. METHODS. Participants were recruited among persons who came to the Reference Center for Special Immunobiologicals (Centro de Referência para Imunobiológcos Especiais, CRIE) of the Hospital das Clínicas da Faculdade de Medicina da Universidade de São Paulo (HC-FMUSP) to receive any vaccine and who had previously received the YF vaccine. The following data were collected: age, ethnicity, gender, number of YF vaccine doses taken and date of last YF vaccination. CD4 T cells counts were performed using flow cytometry. YF neutralizing antibodies were measured using test of neutralization by 50% reduction of lysis plaques (PRNT50). RESULTS. Ninety-four subjects were enrolled: 46 persons aged 60 years and older (Group 1) and 48 persons aged 18 to 59 years (Group 2). There was no significant difference between the groups regarding gender, ethnicity, number of YF vaccine doses previously received, time since the last dose and CD4+T cells count. There was no difference in the prevalence of YF neutralizing antibodies between the groups (87% and 93.8% in Groups 1 and 2, respectively, p=0.263). The log-transformed Geometric Mean Titer (GMT) of YF neutralizing antibodies was higher in the younger group (3.77 log10mUI/mL) in comparison to the older group (3.64 log10mUI/mL), and this difference was statistically significant (p=0.022). There was no correlation between YF neutralizing antibodies titers and time elapsed since vaccination among the participants who had previously received a single dose of YF vaccine, with the two groups analyzed together. There was no significant difference in the prevalence of neutralizing antibodies among participants who received a single dose of YF vaccine within ten years or more than 10 years before enrollment. CONCLUSIONS. Further studies on antibodies persistence in the elderly are necessary, considering the possibility of compromised immune response to vaccines due to immunosenescence