In der vorliegenden Arbeit wurde die Wirkung von Valproinsäure (VPA) auf Keimzelltumoren des Hodens in vivo und in vitro untersucht. Keimzelltumoren des Hodens (TGCT) sind die häufigsten soliden malignen Tumoren des Mannes zwischen dem 15. und 34. Lebensjahr. Nach therapeutischen und histogenetischen Kriterien werden die TGCT in Seminome und Nicht-Seminome unterteilt. VPA gilt seit 2001 als weiterer Wirkstoff der Gruppe der Histondeacetylaseinhibitoren die über die Wirkung auf die Chromatinstruktur und epi-gentische Modifikation unterschiedliche Effekte in den Zellen erzielen können. VPA führt in unterschiedlichen malignen Tumoren zu einer Proliferationshemmung, Apoptoseinduktion und kann den Differenzierungsgrad in Tumorzellen beeinflussen. Im In-vivo-Mausmodell konnte gezeigt werden, dass VPA eine antitumoröse Potenz auch auf TGCT besitzt. Es zeigte sich in vitro eine Proliferationshemmung und Apoptoseinduktion sowie eine Differen-zierungsinduktion unter VPA-Behandlung. Konkordant zu anderen Tumor konnte eine verstärkte Histonacetylierung unter VPA gezeigt werden. In einer Mikroarray-expressionsanalyse zeigten sich für die Zelllinie TCam-2 als Modell eines seminomatösen Keimzelltumors eine differentielle Expression von 1810 Genen unter VPA-Behandlung und eine differentielle Expression von 1061 Genen für die Zelllinie NTERA-2 als Modell eines embryonalen Karzinoms (Nicht-Seminom). Hierunter fanden sich eine Reihe von differentiell exprimierten Kandidatengenen, deren Regulation Einfluss auf die o.g. Proliferations-hemmung und Apoptoseinduktion haben können. In beiden Zelllinien wurde das Stammzell-genmuster durch Behandlung mit VPA verändert und vermehrt Differenzierungsmarker exprimiert. Insbesondere supprimierte VPA die Expression von NANOG, OCT3/4 in beiden Zelllinien und in der Nicht-seminomatösen Zelllinie NTERA-2 zusätzlich SOX2 als Schlüsselgene zur Erhaltung der Pluripotenz. Beides konnte mittels Mikroarray und q-RT-PCR gezeigt werden.

Diss. (sammanfattning) Uppsala : Uppsala universitet, 2007. / Härtill 5 uppsatser.

A epilepsia é normalmente a associação de pré-disposição genética e doença ou uma lesão cerebral. Aproximadamente 1 entre 50 a 100 pessoas apresentam essa pré-disposição à convulsões. Um dos fármacos mais prescritos e utilizados para o tratamento de convulsões é o ácido valpróico (AV), tornando-se a medicação de primeira escolha no tratamento da epilepsia infantil por apresentar um amplo espectro de ação, embora apresente efeitos colaterais bastante conhecidos como pancreatite e a hepatotoxicidade, que pode ser fatal. Sistemas nanoparticulados como nanocápsulas, obtidas a partir da utilização de polímeros biodegradáveis como o polietilenoglicol (PEG) e macromoléculas naturais como a quitosana (QS), que proporcionam hidrofilia e bioadesividade, têm sido estudadas com o objetivo de aumentar a penetração cerebral e reduzir a dosagem do fármaco. Nesse contexto, o presente trabalho teve como objetivo desenvolver e caracterizar físico-quimicamente nanocápsulas de poli(ε-caprolactona) contendo AV e revestidas com QS (NCQ) e/ou com PEG 6000 (NCP e NCQP), investigar a farmacocinética plasmática, a penetração do AV através da barreira hematoencefálica (BHE) por microdiálise e a hepatotoxicidade em ratos Wistar. Nanocápsulas revestidas com QS (NCQ) foram obtidas pelo método de nanoprecipitação do polímero pré-formado seguido do revestimento com adição de 5 mL de solução de QS a 1%. Para a preparação de NCP, foi utilizada metodologia similar adicionando 0,7% de PEG 6000 na fase aquosa. Para a preparação de NCQP, as nanocápsulas preparadas com a adição de 0,35% de PEG 6000 e revestidas posteriormente com solução de QS a 1% (2,5 mL). As formulações foram caracterizadas físico-quimicamente avaliando-se o tamanho das partículas, potencial zeta, pH e taxa de incorporação. As nanocápsulas foram visualizadas por MET e a estabilidade foi investigada por retroespalhamento de luz (Turbiscan Lab®). As formulações (AV 5 mg/mL) apresentaram um pequeno tamanho de partícula (144,2 ± 2,0 nm, 153,2 ± 1,8 nm, e 231,3 ± 15,6 nm, para NCQ, NCP e NCQP, respectivamente), com baixo índice de polidispersão, alta taxa de incorporação (95 a 98 %), pH ácido, potencial zeta positivo para NCQ (+8,7 ± 0,4 mV) e negativo para NCP (- 6,6 ± 0,8 mV) e NCQP (- 2,8 ± 1,3 mV). As fotomicrografias mostraram partículas de forma esférica e as formulações demonstraram boa estabilidade durante 24h de análise a 40°C. As concentrações plasmáticas foram investigadas em ratos Wistar (15 mg/kg via i.v. de AV) para todas as formulações e valproato sódico (grupo controle). A análise farmacocinética compartimental apresentou uma distribuição muito rápida para o AV em NCQ e a ASC0-∞ aproximadamente duas vezes menor em comparação à NCP, NCQP e o fármaco livre (3874 ± 1775; 8280 ± 2136; 7849 ± 1021 e 7978 ± 3622 μg/mL/min, respectivamente). O clearance do AV aumentou significativamente para NCQ (0,284 ± 0,156 L/h/kg) (α = 0,05%). A penetração do AV através da BHE foi realizada em ratos Wistar acordados por microdiálise (MD) cerebral, no córtex frontal utilizando sondas CMA/12 (3 mm). Os experimentos de MD mostraram um aumento de 5 vezes no fator de penetração cerebral após a administração de NCQ em comparação com o fármaco em solução (0,110 and 0,021, respectivamente), demonstrando a viabilidade da utilização de QS como polímero de revestimento objetivando a BHE. A NCP demonstrou um aumento de 1,7 vezes no fator de penetração cerebral e NCQP não demonstrou qualquer diferença na penetração. A investigação da hepatotoxicidade do AV foi realizada após cinco dias de tratamento (dose de 30 mg/kg q12h de AV) em solução ou em nanocápsulas (NCQ ou NCP) com grupo controle de solução salina. Os níveis séricos de asparto aminotransferase (AST), alanina aminotransferase (ALT), gama-glutamiltransferase (GGT), fosfatase alcalina (FAL), creatinina (CRE) e uréia foram determinados. Os resultados mostram a manutenção dos níveis normais de enzimas hepáticas como a ALT e FAL para NCQ (54,2 ± 11,2 UI/mL and 149 ± 26 UI/mL) demonstrando um efeito hepatoprotetor não observado para os outros grupos. Análises histológicas do fígado dos animais não apresentaram a formação de esteatose microvesicular para NCQ em comparação com a formação de esteatoses em todos os outros grupos, incluindo o grupo controle. Ao final, os resultados indicaram que NCQ possa ser uma formulação em potencial, necessitando ser investigada pelo aumento da penetração cerebral de AV e efeito hepatoprotetor observados. / Epilepsy is usually a combination of genetic pre-disposition and a disease or a brain damage. About 1 in 50 to 100 people has this genetic predisposition to seizures. One of the world’s most prescribed drugs to treat epileptic seizures is valproic acid (VA), which is the first choice drug to treat epilepsy in childhood due to its broad spectrum of action, although its well known side effects such as pancreatitis, hepatotoxicity can be fatal. Nanoparticulated systems such as nanocapsules, obtained from biodegradable polymers like polyethylene glycol and natural macromolecules like chitosan, who gives the system hidrophilicity and bioadhesivity, have been used to increase brain penetration and reduce drug doses. In this context, the present work aimed to develop and physicochemically characterize poly(ε-caprolactone) nanocapsules loaded with VA and coated with chitosan (NCQ) and/or polyethylene glycol (PEG) 6000 (NCP and NCQP), and to investigate their plasma pharmacokinetics, VA blood-brain barrier penetration (BBB) by microdialysis and hepatotoxicity in Wistar rats. Nanocapsules coated with chitosan were obtained by nanoprecipitation of preformed polymer followed by coating with 1% chitosan solution added prior to final adjustments at a volume of 5 mL. For NCP preparation, similar methodology was used adding 0.7% PEG 6000 in the aqueous phase. For NCQP preparation, the nanocapsules prepared with PEG 6000 (0.35% w/v) was further coated with chitosan 1% in solution adding 2.5 mL prior to the final adjustments. The formulations were physicochemical characterized by particle size, zeta potential, pH, incorporation efficiency. The particles were visualized by MET and the stability investigated by backscattering (Turbiscan Lab®). The formulations (VA 5 mg/mL) presented small particle sizes (144.2 ± 2.0 nm, 153.2 ± 1.8 nm, and 231.3 ± 15.6 nm, for NCQ, NCP and NCQP, respectively), with low polidispersion index, high incorporation efficiency (95 to 98 %) and acid pH. The zeta potential was positive for NCQ (+8.7 ± 0.4 mV) and negative for NCP (- 6.6 ± 0.8 mV) and NCQP (- 2.8 ± 1.3 mV). The photomicrography of all formulations showed spherically shaped particles. The formulations showed good stability during 24 hours investigation at 40 ºC. Plasma concentrations were investigated in Wisar rats after 15 mg/kg i.v. dosing of all formulations and sodium valproate solution (control group). The pharmacokinetic compartmental analysis showed a very rapid distribution of VA when incorporated in NCQ in comparison to the other formulations and the AUC0-∞ about two times lower in comparison to NCP, NCQP and the drug alone (3874 ± 1775; 8280 ±2136; 7849 ± 1021 and 7978 ± 3622 μg/mL/min, respectively). VA clearance was significantly increased after NCQ dosing (0.284 ± 0.156 L/h/kg) (α = 0.05 %). Drug penetration through BBB was performed in awaken Wistar rats by brain microdialysis at the frontal cortex using CMA/12 probes (3 mm). The microdialysis experiments showed a five times increase in VA brain penetration factor after NCQ administration in comparison to drug alone (0.110 and 0.021, respectively), demonstrating the viability of chitosan as coating polymer to aim the BBB. NCP showed only a 1.7 times increase in brain penetration factor and NCQP did not showed any difference in comparison to drug alone. The investigation of drug hepatotoxicity was conducted after 5 days i.v. dosing of VA 30 mg/kg q12h as solution or nanocapsules (NCQ or NCP). A saline control group was also investigated. Serum levels of asparte aminotransferase, alanine aminotransferase, gamma-glutamyltransferase, alkaline phosfatase, creatinin and urea were determined. The results showed the maintenance of normal levels of hepatic enzymes such as alanine aminotransferase and alkaline phosfatase for NCQ (54.2 ± 11.2 IU/mL and 149 ± 26 IU/mL) showing a hepatoprotective effect not observed in the other groups investigated. Histological analysis of animals livers showed no microvesicular steatosis formation when NCQ was administered in comparison with the formation of steatosis in all other groups including control. Overall the results indicate that NCQ is a potential formulation to be investigated for the treatment of epilepsy due to its increase in VA brain penetration and hepatoprotective effect observed.

The body of work presented here is a compendium of the multiple steps required for an investigator initiated trial of an existing medication (Valproic Acid- VPA) for a new indication (Retinitis Pigmentosa – RP). The chapters are listed in logical and chronological order of the process. In order to access patient records an expedited Institutional Review Board (IRB) application for retrospective chart review was submitted (Chapter 1). These records enabled the statistical analysis which not only laid the framework for the trial design, but also became the basis for two manuscripts (Chapter 2). Protocol development informed by the preliminary human studies (Chapter 3) was an instrumental part of the Investigational New Drug (IND) application (Chapter 3.5). This protocol along with the extensive case report forms that detail the intended data to be collected are included in the IND application. Because the Phase II clinical trial proposed attempting to identify the specific RP mutations of the subjects utilizing a National Eye Institute (NEI) study that enabled free genotyping services, two IRB applications were submitted (Chapter 3.6). The first was for approval of the NEI genotyping protocol, the second involved the VPA intervention. Two very different sources of funding for this trial were attempted (Chapter 4) – the NIH via the Challenge Grant mechanism and a private eye disease foundation (Foundation Fighting Blindness). In Chapter 5 I detail the alternate study designs that were considered and developed for this trial (and ultimately abandoned). Finally, in Chapter 6, I formally detail my suggestions to aid in the development of a comprehensive investigator initiated core facility at UMMMC. The goal of this project was two-fold. The first was to learn the entire process of trial and protocol design both from a Umass Institutional perspective as well as from the perspective of the FDA. The second goal was the very real prospect of helping patients with a blinding disease. This work was successful on both counts. IRB approval was received for all the submitted applications. The complexity and uniqueness of many aspects of these submissions culminated in a comprehensive learning experience. The process of working with the Umass Research Pharmacy as well as developing the industry contacts and know-how to develop a workable and financially feasible placebo were both particularly important learning experiences. FDA approval of the IND submission was also received, and the process of pre-communication and delving into the considerable and ever-changing rules and regulations resulted in an extensive and valuable knowledge base. While the practicality of funding has limited the ability of this trial to move forward at this point, given the extensive framework laid by this body of work, we are actively pursuing other opportunities. The third outcome of this work, while not as intentional, was the considerable process of determining the specific competencies and infrastructure that exist at UMMMC to enable investigator initiated drug intervention studies. While this institution is clearly moving rapidly in the direction of translational research, the many needs of these studies are often only clearly understood when the process is specifically undertaken. In completing the approval of this Phase II clinical trial, I was not only able to better understand and define the existing capabilities of UMMMC for this kind of research, I was able to add to that infrastructure when the existing knowledge or skill set was not available. In this manner, I was able to inform and guide many of the support personnel who guided me and have become a part of the strategic direction of UMMMC towards clinical translational research.

Made available in DSpace on 2014-12-17T15:28:53Z (GMT). No. of bitstreams: 1 JulianaABMS_DISSERT.pdf: 2223845 bytes, checksum: 223f33020eca4ef9f2713bc27ef300ca (MD5) Previous issue date: 2013-08-23 / Coordena??o de Aperfei?oamento de Pessoal de N?vel Superior / Autism comprises a heterogeneous group of neurodevelopmental disorders that affects the brain maturation and produces sensorial, motor, language and social interaction deficits in early childhood. Several studies have shown a major involvement of genetic factors leading to a predisposition to autism, which are possibly affected by environmental modulators during embryonic and post-natal life. Recent studies in animal models indicate that alterations in epigenetic control during development can generate neuronal maturation disturbances and produce a hyper-excitable circuit, resulting in typical symptoms of autism. In the animal model of autism induced by valproic acid (VPA) during rat pregnancy, behavioral, electrophysiological and cellular alterations have been reported which can also be observed in patients with autism. However, only a few studies have correlated behavioral alterations with the supposed neuronal hyper-excitability in this model. The aim of this project was to generate an animal model of autism by pre-natal exposure to VPA and evaluate the early post-natal development and pre-puberal (PND30) behavior in the offspring. Furthermore, we quantified the parvalbumin-positive neuronal distribution in the medial prefrontal cortex and Purkinje cells in the cerebellum of VPA animals. Our results show that VPA treatment induced developmental alterations, which were observed in behavioral changes as compared to vehicle-treated controls. VPA animals showed clear behavioral abnormalities such as hyperlocomotion, prolonged stereotipies and reduced social interaction with an unfamiliar mate. Cellular quantification revealed a decrease in the number of parvalbumin-positive interneurons in the anterior cingulate cortex and in the prelimbic cortex of the mPFC, suggesting an excitatory/inhibitory unbalance in this animal model of autism. Moreover, we also observed that the neuronal reduction occurred mainly in the cortical layers II/III and V/VI. We did not detect any change in the density of Purkinje neurons in the Crus I region of the cerebellar cortex. Together, our results strengthens the face validity of the VPA model in rats and shed light on specific changes in the inhibitory circuitry of the prefrontal cortex in this autism model. Further studies should address the challenges to clarify particular electrophysiological correlates of the cellular alterations in order to better understand the behavioral dysfunctions / O autismo compreende um grupo heterog?neo de desordens do neurodesenvolvimento que afetam a matura??o cerebral e produzem d?ficits sensoriais, motores, de linguagem e de intera??o social no in?cio da inf?ncia. Diversos estudos tem demonstrado um importante envolvimento de fatores gen?ticos que levam ? predisposi??o ao autismo, que s?o possivelmente afetados por modula??es ambientais durante a vida embrion?ria e p?s-natal. Estudos recentes em modelos animais indicam que altera??es no controle epigen?tico durante o desenvolvimento podem gerar dist?rbios na matura??o neuronal e produzir um circuito hiper-excit?vel, resultando em sintomas t?picos do autismo. No modelo animal de autismo induzido por ?cido valpr?ico (VPA) durante a gesta??o de ratas, foram observadas altera??es comportamentais, eletrofisiol?gicas e celulares semelhantes ?s observadas nos pacientes com autismo. Entretanto, ainda s?o poucos os estudos que correlacionam altera??es comportamentais com a suposta hiper-excitabilidade neuronal desse modelo. O objetivo desse estudo foi de gerar o modelo animal de autismo por exposi??o pr?-natal ao VPA e avaliar o desenvolvimento e comportamento p?s-natal e pr?-p?bere (PND 30). Al?m disso, quantificamos a distribui??o neuronal de interneur?nios parvalbumina-positivos no c?rtex pr?-frontal medial (CPFm) e de c?lulas de Purkinje no cerebelo de animais VPA. Nossos resultados mostraram que o tratamento com VPA induziu altera??es no desenvolvimento, que foram observadas em altera??es comportamentais quando comparadas com os animais controle. Animais VPA mostraram claras altera??es comportamentais, como hiperlocomo??o, estereotipia prolongada e redu??o na intera??o social com animal n?o-familiar. A quantifica??o celular revelou uma diminui??o no n?mero de interneur?nios parvalbumina-positivos no c?rtex cingulado anterior e no c?rtex pr?-l?mbico, sugerindo um desbalan?o na excita??o/inibi??o nesse modelo animal de autismo. Tamb?m observamos que essa redu??o ocorreu principalmente nas camadas corticais II/III e V/VI. N?o observamos modifica??o na densidade de c?lulas de Purkinje na regi?o Crus I do c?rtex cerebelar. Em conjunto, nossos resultados fortalecem a validade de face do modelo VPA em ratos e relatam modifica??es espec?ficas na circuitaria inibit?ria do CPFm nesse modelo de autismo. Novos estudos devem abordar correlatos eletrofisiol?gicos particulares com altera??es celulares, de forma a esclarecer as disfun??es comportamentais encontradas nesse modelo animal

A epilepsia é normalmente a associação de pré-disposição genética e doença ou uma lesão cerebral. Aproximadamente 1 entre 50 a 100 pessoas apresentam essa pré-disposição à convulsões. Um dos fármacos mais prescritos e utilizados para o tratamento de convulsões é o ácido valpróico (AV), tornando-se a medicação de primeira escolha no tratamento da epilepsia infantil por apresentar um amplo espectro de ação, embora apresente efeitos colaterais bastante conhecidos como pancreatite e a hepatotoxicidade, que pode ser fatal. Sistemas nanoparticulados como nanocápsulas, obtidas a partir da utilização de polímeros biodegradáveis como o polietilenoglicol (PEG) e macromoléculas naturais como a quitosana (QS), que proporcionam hidrofilia e bioadesividade, têm sido estudadas com o objetivo de aumentar a penetração cerebral e reduzir a dosagem do fármaco. Nesse contexto, o presente trabalho teve como objetivo desenvolver e caracterizar físico-quimicamente nanocápsulas de poli(ε-caprolactona) contendo AV e revestidas com QS (NCQ) e/ou com PEG 6000 (NCP e NCQP), investigar a farmacocinética plasmática, a penetração do AV através da barreira hematoencefálica (BHE) por microdiálise e a hepatotoxicidade em ratos Wistar. Nanocápsulas revestidas com QS (NCQ) foram obtidas pelo método de nanoprecipitação do polímero pré-formado seguido do revestimento com adição de 5 mL de solução de QS a 1%. Para a preparação de NCP, foi utilizada metodologia similar adicionando 0,7% de PEG 6000 na fase aquosa. Para a preparação de NCQP, as nanocápsulas preparadas com a adição de 0,35% de PEG 6000 e revestidas posteriormente com solução de QS a 1% (2,5 mL). As formulações foram caracterizadas físico-quimicamente avaliando-se o tamanho das partículas, potencial zeta, pH e taxa de incorporação. As nanocápsulas foram visualizadas por MET e a estabilidade foi investigada por retroespalhamento de luz (Turbiscan Lab®). As formulações (AV 5 mg/mL) apresentaram um pequeno tamanho de partícula (144,2 ± 2,0 nm, 153,2 ± 1,8 nm, e 231,3 ± 15,6 nm, para NCQ, NCP e NCQP, respectivamente), com baixo índice de polidispersão, alta taxa de incorporação (95 a 98 %), pH ácido, potencial zeta positivo para NCQ (+8,7 ± 0,4 mV) e negativo para NCP (- 6,6 ± 0,8 mV) e NCQP (- 2,8 ± 1,3 mV). As fotomicrografias mostraram partículas de forma esférica e as formulações demonstraram boa estabilidade durante 24h de análise a 40°C. As concentrações plasmáticas foram investigadas em ratos Wistar (15 mg/kg via i.v. de AV) para todas as formulações e valproato sódico (grupo controle). A análise farmacocinética compartimental apresentou uma distribuição muito rápida para o AV em NCQ e a ASC0-∞ aproximadamente duas vezes menor em comparação à NCP, NCQP e o fármaco livre (3874 ± 1775; 8280 ± 2136; 7849 ± 1021 e 7978 ± 3622 μg/mL/min, respectivamente). O clearance do AV aumentou significativamente para NCQ (0,284 ± 0,156 L/h/kg) (α = 0,05%). A penetração do AV através da BHE foi realizada em ratos Wistar acordados por microdiálise (MD) cerebral, no córtex frontal utilizando sondas CMA/12 (3 mm). Os experimentos de MD mostraram um aumento de 5 vezes no fator de penetração cerebral após a administração de NCQ em comparação com o fármaco em solução (0,110 and 0,021, respectivamente), demonstrando a viabilidade da utilização de QS como polímero de revestimento objetivando a BHE. A NCP demonstrou um aumento de 1,7 vezes no fator de penetração cerebral e NCQP não demonstrou qualquer diferença na penetração. A investigação da hepatotoxicidade do AV foi realizada após cinco dias de tratamento (dose de 30 mg/kg q12h de AV) em solução ou em nanocápsulas (NCQ ou NCP) com grupo controle de solução salina. Os níveis séricos de asparto aminotransferase (AST), alanina aminotransferase (ALT), gama-glutamiltransferase (GGT), fosfatase alcalina (FAL), creatinina (CRE) e uréia foram determinados. Os resultados mostram a manutenção dos níveis normais de enzimas hepáticas como a ALT e FAL para NCQ (54,2 ± 11,2 UI/mL and 149 ± 26 UI/mL) demonstrando um efeito hepatoprotetor não observado para os outros grupos. Análises histológicas do fígado dos animais não apresentaram a formação de esteatose microvesicular para NCQ em comparação com a formação de esteatoses em todos os outros grupos, incluindo o grupo controle. Ao final, os resultados indicaram que NCQ possa ser uma formulação em potencial, necessitando ser investigada pelo aumento da penetração cerebral de AV e efeito hepatoprotetor observados. / Epilepsy is usually a combination of genetic pre-disposition and a disease or a brain damage. About 1 in 50 to 100 people has this genetic predisposition to seizures. One of the world’s most prescribed drugs to treat epileptic seizures is valproic acid (VA), which is the first choice drug to treat epilepsy in childhood due to its broad spectrum of action, although its well known side effects such as pancreatitis, hepatotoxicity can be fatal. Nanoparticulated systems such as nanocapsules, obtained from biodegradable polymers like polyethylene glycol and natural macromolecules like chitosan, who gives the system hidrophilicity and bioadhesivity, have been used to increase brain penetration and reduce drug doses. In this context, the present work aimed to develop and physicochemically characterize poly(ε-caprolactone) nanocapsules loaded with VA and coated with chitosan (NCQ) and/or polyethylene glycol (PEG) 6000 (NCP and NCQP), and to investigate their plasma pharmacokinetics, VA blood-brain barrier penetration (BBB) by microdialysis and hepatotoxicity in Wistar rats. Nanocapsules coated with chitosan were obtained by nanoprecipitation of preformed polymer followed by coating with 1% chitosan solution added prior to final adjustments at a volume of 5 mL. For NCP preparation, similar methodology was used adding 0.7% PEG 6000 in the aqueous phase. For NCQP preparation, the nanocapsules prepared with PEG 6000 (0.35% w/v) was further coated with chitosan 1% in solution adding 2.5 mL prior to the final adjustments. The formulations were physicochemical characterized by particle size, zeta potential, pH, incorporation efficiency. The particles were visualized by MET and the stability investigated by backscattering (Turbiscan Lab®). The formulations (VA 5 mg/mL) presented small particle sizes (144.2 ± 2.0 nm, 153.2 ± 1.8 nm, and 231.3 ± 15.6 nm, for NCQ, NCP and NCQP, respectively), with low polidispersion index, high incorporation efficiency (95 to 98 %) and acid pH. The zeta potential was positive for NCQ (+8.7 ± 0.4 mV) and negative for NCP (- 6.6 ± 0.8 mV) and NCQP (- 2.8 ± 1.3 mV). The photomicrography of all formulations showed spherically shaped particles. The formulations showed good stability during 24 hours investigation at 40 ºC. Plasma concentrations were investigated in Wisar rats after 15 mg/kg i.v. dosing of all formulations and sodium valproate solution (control group). The pharmacokinetic compartmental analysis showed a very rapid distribution of VA when incorporated in NCQ in comparison to the other formulations and the AUC0-∞ about two times lower in comparison to NCP, NCQP and the drug alone (3874 ± 1775; 8280 ±2136; 7849 ± 1021 and 7978 ± 3622 μg/mL/min, respectively). VA clearance was significantly increased after NCQ dosing (0.284 ± 0.156 L/h/kg) (α = 0.05 %). Drug penetration through BBB was performed in awaken Wistar rats by brain microdialysis at the frontal cortex using CMA/12 probes (3 mm). The microdialysis experiments showed a five times increase in VA brain penetration factor after NCQ administration in comparison to drug alone (0.110 and 0.021, respectively), demonstrating the viability of chitosan as coating polymer to aim the BBB. NCP showed only a 1.7 times increase in brain penetration factor and NCQP did not showed any difference in comparison to drug alone. The investigation of drug hepatotoxicity was conducted after 5 days i.v. dosing of VA 30 mg/kg q12h as solution or nanocapsules (NCQ or NCP). A saline control group was also investigated. Serum levels of asparte aminotransferase, alanine aminotransferase, gamma-glutamyltransferase, alkaline phosfatase, creatinin and urea were determined. The results showed the maintenance of normal levels of hepatic enzymes such as alanine aminotransferase and alkaline phosfatase for NCQ (54.2 ± 11.2 IU/mL and 149 ± 26 IU/mL) showing a hepatoprotective effect not observed in the other groups investigated. Histological analysis of animals livers showed no microvesicular steatosis formation when NCQ was administered in comparison with the formation of steatosis in all other groups including control. Overall the results indicate that NCQ is a potential formulation to be investigated for the treatment of epilepsy due to its increase in VA brain penetration and hepatoprotective effect observed.

A epilepsia é normalmente a associação de pré-disposição genética e doença ou uma lesão cerebral. Aproximadamente 1 entre 50 a 100 pessoas apresentam essa pré-disposição à convulsões. Um dos fármacos mais prescritos e utilizados para o tratamento de convulsões é o ácido valpróico (AV), tornando-se a medicação de primeira escolha no tratamento da epilepsia infantil por apresentar um amplo espectro de ação, embora apresente efeitos colaterais bastante conhecidos como pancreatite e a hepatotoxicidade, que pode ser fatal. Sistemas nanoparticulados como nanocápsulas, obtidas a partir da utilização de polímeros biodegradáveis como o polietilenoglicol (PEG) e macromoléculas naturais como a quitosana (QS), que proporcionam hidrofilia e bioadesividade, têm sido estudadas com o objetivo de aumentar a penetração cerebral e reduzir a dosagem do fármaco. Nesse contexto, o presente trabalho teve como objetivo desenvolver e caracterizar físico-quimicamente nanocápsulas de poli(ε-caprolactona) contendo AV e revestidas com QS (NCQ) e/ou com PEG 6000 (NCP e NCQP), investigar a farmacocinética plasmática, a penetração do AV através da barreira hematoencefálica (BHE) por microdiálise e a hepatotoxicidade em ratos Wistar. Nanocápsulas revestidas com QS (NCQ) foram obtidas pelo método de nanoprecipitação do polímero pré-formado seguido do revestimento com adição de 5 mL de solução de QS a 1%. Para a preparação de NCP, foi utilizada metodologia similar adicionando 0,7% de PEG 6000 na fase aquosa. Para a preparação de NCQP, as nanocápsulas preparadas com a adição de 0,35% de PEG 6000 e revestidas posteriormente com solução de QS a 1% (2,5 mL). As formulações foram caracterizadas físico-quimicamente avaliando-se o tamanho das partículas, potencial zeta, pH e taxa de incorporação. As nanocápsulas foram visualizadas por MET e a estabilidade foi investigada por retroespalhamento de luz (Turbiscan Lab®). As formulações (AV 5 mg/mL) apresentaram um pequeno tamanho de partícula (144,2 ± 2,0 nm, 153,2 ± 1,8 nm, e 231,3 ± 15,6 nm, para NCQ, NCP e NCQP, respectivamente), com baixo índice de polidispersão, alta taxa de incorporação (95 a 98 %), pH ácido, potencial zeta positivo para NCQ (+8,7 ± 0,4 mV) e negativo para NCP (- 6,6 ± 0,8 mV) e NCQP (- 2,8 ± 1,3 mV). As fotomicrografias mostraram partículas de forma esférica e as formulações demonstraram boa estabilidade durante 24h de análise a 40°C. As concentrações plasmáticas foram investigadas em ratos Wistar (15 mg/kg via i.v. de AV) para todas as formulações e valproato sódico (grupo controle). A análise farmacocinética compartimental apresentou uma distribuição muito rápida para o AV em NCQ e a ASC0-∞ aproximadamente duas vezes menor em comparação à NCP, NCQP e o fármaco livre (3874 ± 1775; 8280 ± 2136; 7849 ± 1021 e 7978 ± 3622 μg/mL/min, respectivamente). O clearance do AV aumentou significativamente para NCQ (0,284 ± 0,156 L/h/kg) (α = 0,05%). A penetração do AV através da BHE foi realizada em ratos Wistar acordados por microdiálise (MD) cerebral, no córtex frontal utilizando sondas CMA/12 (3 mm). Os experimentos de MD mostraram um aumento de 5 vezes no fator de penetração cerebral após a administração de NCQ em comparação com o fármaco em solução (0,110 and 0,021, respectivamente), demonstrando a viabilidade da utilização de QS como polímero de revestimento objetivando a BHE. A NCP demonstrou um aumento de 1,7 vezes no fator de penetração cerebral e NCQP não demonstrou qualquer diferença na penetração. A investigação da hepatotoxicidade do AV foi realizada após cinco dias de tratamento (dose de 30 mg/kg q12h de AV) em solução ou em nanocápsulas (NCQ ou NCP) com grupo controle de solução salina. Os níveis séricos de asparto aminotransferase (AST), alanina aminotransferase (ALT), gama-glutamiltransferase (GGT), fosfatase alcalina (FAL), creatinina (CRE) e uréia foram determinados. Os resultados mostram a manutenção dos níveis normais de enzimas hepáticas como a ALT e FAL para NCQ (54,2 ± 11,2 UI/mL and 149 ± 26 UI/mL) demonstrando um efeito hepatoprotetor não observado para os outros grupos. Análises histológicas do fígado dos animais não apresentaram a formação de esteatose microvesicular para NCQ em comparação com a formação de esteatoses em todos os outros grupos, incluindo o grupo controle. Ao final, os resultados indicaram que NCQ possa ser uma formulação em potencial, necessitando ser investigada pelo aumento da penetração cerebral de AV e efeito hepatoprotetor observados. / Epilepsy is usually a combination of genetic pre-disposition and a disease or a brain damage. About 1 in 50 to 100 people has this genetic predisposition to seizures. One of the world’s most prescribed drugs to treat epileptic seizures is valproic acid (VA), which is the first choice drug to treat epilepsy in childhood due to its broad spectrum of action, although its well known side effects such as pancreatitis, hepatotoxicity can be fatal. Nanoparticulated systems such as nanocapsules, obtained from biodegradable polymers like polyethylene glycol and natural macromolecules like chitosan, who gives the system hidrophilicity and bioadhesivity, have been used to increase brain penetration and reduce drug doses. In this context, the present work aimed to develop and physicochemically characterize poly(ε-caprolactone) nanocapsules loaded with VA and coated with chitosan (NCQ) and/or polyethylene glycol (PEG) 6000 (NCP and NCQP), and to investigate their plasma pharmacokinetics, VA blood-brain barrier penetration (BBB) by microdialysis and hepatotoxicity in Wistar rats. Nanocapsules coated with chitosan were obtained by nanoprecipitation of preformed polymer followed by coating with 1% chitosan solution added prior to final adjustments at a volume of 5 mL. For NCP preparation, similar methodology was used adding 0.7% PEG 6000 in the aqueous phase. For NCQP preparation, the nanocapsules prepared with PEG 6000 (0.35% w/v) was further coated with chitosan 1% in solution adding 2.5 mL prior to the final adjustments. The formulations were physicochemical characterized by particle size, zeta potential, pH, incorporation efficiency. The particles were visualized by MET and the stability investigated by backscattering (Turbiscan Lab®). The formulations (VA 5 mg/mL) presented small particle sizes (144.2 ± 2.0 nm, 153.2 ± 1.8 nm, and 231.3 ± 15.6 nm, for NCQ, NCP and NCQP, respectively), with low polidispersion index, high incorporation efficiency (95 to 98 %) and acid pH. The zeta potential was positive for NCQ (+8.7 ± 0.4 mV) and negative for NCP (- 6.6 ± 0.8 mV) and NCQP (- 2.8 ± 1.3 mV). The photomicrography of all formulations showed spherically shaped particles. The formulations showed good stability during 24 hours investigation at 40 ºC. Plasma concentrations were investigated in Wisar rats after 15 mg/kg i.v. dosing of all formulations and sodium valproate solution (control group). The pharmacokinetic compartmental analysis showed a very rapid distribution of VA when incorporated in NCQ in comparison to the other formulations and the AUC0-∞ about two times lower in comparison to NCP, NCQP and the drug alone (3874 ± 1775; 8280 ±2136; 7849 ± 1021 and 7978 ± 3622 μg/mL/min, respectively). VA clearance was significantly increased after NCQ dosing (0.284 ± 0.156 L/h/kg) (α = 0.05 %). Drug penetration through BBB was performed in awaken Wistar rats by brain microdialysis at the frontal cortex using CMA/12 probes (3 mm). The microdialysis experiments showed a five times increase in VA brain penetration factor after NCQ administration in comparison to drug alone (0.110 and 0.021, respectively), demonstrating the viability of chitosan as coating polymer to aim the BBB. NCP showed only a 1.7 times increase in brain penetration factor and NCQP did not showed any difference in comparison to drug alone. The investigation of drug hepatotoxicity was conducted after 5 days i.v. dosing of VA 30 mg/kg q12h as solution or nanocapsules (NCQ or NCP). A saline control group was also investigated. Serum levels of asparte aminotransferase, alanine aminotransferase, gamma-glutamyltransferase, alkaline phosfatase, creatinin and urea were determined. The results showed the maintenance of normal levels of hepatic enzymes such as alanine aminotransferase and alkaline phosfatase for NCQ (54.2 ± 11.2 IU/mL and 149 ± 26 IU/mL) showing a hepatoprotective effect not observed in the other groups investigated. Histological analysis of animals livers showed no microvesicular steatosis formation when NCQ was administered in comparison with the formation of steatosis in all other groups including control. Overall the results indicate that NCQ is a potential formulation to be investigated for the treatment of epilepsy due to its increase in VA brain penetration and hepatoprotective effect observed.

Human induced pluripotent stem cells (iPSCs) represent a scalable cell source for the generation of hematopoietic progenitor cells (iHPCs); however, a lack of efficient iHPC expansion in vitro currently limits translational applications. To address this translational bottleneck, we assessed a panel of stem cell agonist cocktails (SCACs), originally developed to enhance cord-blood derived HSPC (CB-HSPC) expansion, on iHPC expansion. Three SCACs and GAS6 (X2A, X2A+GAS6, SM6, or SMA) were supplemented during iHPC differentiation and subsequent expansion using the STEMdiff™ Hematopoietic Kit. This monolayer differentiation strategy yielded a population of CD34⁺CD43⁺ and CD45⁺CD34⁺ iHPC. SCAC supplementation during iHPC differentiation yielded up to 2.5-fold higher frequency of CD34⁺CD43⁺ hematopoietic progenitors and up to 2.9-fold higher frequency of CD45⁺CD34⁺CD45RA⁻CD90⁺ HSC-like cells compared to non-treated controls. Subsequent SCAC supplementation during 2 weeks of expansion culture also significantly increased iHPC expansion (X2A+GAS6: 3.8-fold, X2A: 3.5-fold, SM6: 2.8-fold, SMA: 2.0-fold). The expanded iHPCs retained high levels of CD34⁺CD43⁺ expression but we observed an increase in the expansion of HSC-like cell fraction. The collective expansion observed with the SCACs was 1.5- to 2.8-fold higher than UM171 treatment alone. Furthermore, all SCAC-supplemented iHPCs retained multilineage potency, producing erythroid and granulocyte-macrophage progenitors in CFU assays. However, prolonged expansion, beyond 7 days, reduced multilineage potential, indicating a limited expansion window. Although optimal timing and composition of SCAC supplementation remains to be refined, these results highlight that exploiting the additive and synergistic effects of multiple small molecules represents a promising approach for enhancing iHPC expansion yields and biomanufacturing.

Embora a transferência nuclear de células somáticas (TNCS) seja uma ferramenta promissora, seu amplo uso é impedido devido às altas taxas de mortalidade durante o desenvolvimento dos animais clonados. Acredita-se que a reprogramação epigenética anormal seja a principal causa desta baixa eficiência. Nós hipotetizamos que agentes modificadores de cromatina (AMCs) atingindo a acetilação das histonas e a metilação do DNA poderiam alterar a configuração da cromatina e torná-la mais facilmente reprogramável. Deste modo, fibroblastos bovinos foram tratados com 5-aza-2\'-deoxicitidina (AZA) mais tricostatina A (TSA) ou hidralazina (HH) mais ácido valpróico (VPA) enquanto, em outro experimento, zigotos bovinos clonados foram tratados com TSA. O tratamento dos fibroblastos com AZA+TSA ou HH+VPA aumentou a acetilação das histonas, mas não afetou o nível de metilação do DNA. Entretanto, o tratamento com HH+VPA diminuiu a viabilidade/proliferação celular. O uso destas células como doadoras de núcleo não mostrou efeitos positivos sobre o desenvolvimento pré- e pós-implantação. Em relação ao tratamento dos zigotos clonados com TSA, o tratamento destes mostrou um aumento nos padrões de acetilação das histonas, mas não reduziu o nível de metilação do DNA. Além disso, este tratamento não resultou em efeito positivo sobre o desenvolvimento pré- e pósimplantação. Este trabalho fornece evidências de que o tratamento de células doadoras de núcleo ou zigotos clonados com AMCs não tem efeito positive sobre o desenvolvimento pré- e pós-implantação de bovinos clonados. / Although somatic cell nuclear transfer (SCNT) is a promising tool, its potential use is hampered by the high mortality rates during the development to term of cloned offspring. Abnormal epigenetic reprogramming of donor nuclei after SCNT is thought to be the main cause of this low efficiency. We hypothesized that chromatinmodifying agents (CMAs) targeting chromatin acetylation and DNA methylation could alter the chromatin configuration and turn them more amenable to reprogramming. Thus, bovine fibroblasts were treated with 5-aza-2\'-deoxycytidine (AZA) plus trichostatin (TSA) or hydralazine (HH) plus valproic acid (VPA) whereas, in another trial, cloned bovine zygotes were treated with TSA. The treatment of fibroblasts with either AZA+TSA or HH+VPA increased histone acetylation, but did not affect the level of DNA methylation. However, treatment with HH+VPA decreased cellular viability and proliferation. The use of these cells as nuclear donors showed no positive effect on pre- and post-implantation development. Regarding the treatment of cloned zygotes with TSA, treated one-cell embryos showed an increase in the acetylation patterns, but not in the level of DNA methylation. Moreover, this treatment revealed no positive effect on pre- and post-implantation development. This work provides evidence the treatment of either nuclear donor cells or cloned zygotes with CMAs has no positive effect on pre- and post-implantation development of cloned cattle.

A amiotrofia espinal (AEP) é a mais freqüente das doenças neuromusculares (DNM) responsáveis pela Síndrome da Criança Hipotônica (SCH), causada pela degeneração das células do corno anterior da medula espinhal. O comprometimento neurológico se estabelece de forma rápida e intensa nos primeiros meses de vida de tal maneira que, em pouco tempo, a única atividade motora voluntária persistente pode ser a motricidade ocular. O Ácido Valpróico é um medicamento de fácil aquisição e administração, demonstrou-se eficaz em evitar a deleção do exon 7, o que prolongaria ainda mais a sobrevivência dos neurônios. Com base nesta nova perspectiva terapêutica para esta drástica doença e por não existir nenhuma forma de avaliação motora validada e de fácil reprodutibilidade, foi desenvolvido um protocolo de avaliação física-funcional para acompanhamento deste grupo de pacientes e de outros com a SCH, com o objetivo de avaliar quantitativamente e qualitativamente a evolução de aquisição motora nos pacientes, selecionando provas funcionais e criando uma nova forma de avaliação utilizando o recurso da filmagem para posterior examinação, de fácil aplicação em consultório, que permitam uniformizar a interpretação dos resultados em diferentes pesquisas ou individualmente ao longo de um acompanhamento clínico. Cinco pacientes com AEP-I, com idades variando de 04 a 18 meses, sem a necessidade de auxílio respiratórios, e submetidos à intervenção medicamentosa com o Ácido Valpróico, foram avaliados em 05 visitas, totalizando um acompanhamento de 2 meses e meio. A análise das aquisições motoras obedeceu a um roteiro de movimentação utilizando a filmagem e posteriormente atribuindo uma pontuação. Os resultados demonstraram que todas as crianças participantes do estudo não apresentaram piora do quadro motor, o que seria esperado pela evolução natural da doença. Consideramos assim que: os pacientes submetidos à intervenção medicamentosa com o Ácido Valpróico apresentaram uma tendência à melhora das aquisições motoras, em relação ao descrito na evolução natural da doença e a utilização da filmagem como método de análise de aquisição motora se mostrou ser um recurso eficaz no acompanhamento da evolução motora dos pacientes. / The spinal muscle atrophy (SMA) is the most frequent neuromuscular disease responsible for Hypotonic Children Syndrome (HCS). SMA is caused by anterior horn cells degeneration in the narrow. The neurological impairment is quickly and strongly established in the first months of life, so, after few months, the only movement that the children can do is moving the eyes. The Valproic acid is a drug easy to buy and to manage, and seems to avoid exon 7 deletion, which could prolong the neurons life. By this new therapeutic knowledge, and for don\'t exist a validate and easy to reproduce way to evaluate the motor function, there were made a functional evaluation protocol to follow the group of patients with SMA and other patients with HCS, with the purpose to qualify and to quantify the motor gain in these patients, creating a new form to evaluate, using film to exam in the end. It\'s easy to apply in the office and can became the only way to evaluate the results in different trials. There were evaluate five patients with SMA type 1, ages from 04 to 18 months, without respiratory assistance use, underwent to Valproic acid intervention. They were evaluated in five visits, in a total 2 years and a half of following. The motor acquisitions were made from the film and scores. The results showed that no one off al children presented a motor loss, which would be expected for the natural evolution of SMA type 1. Consequently, the patients that underwent to valproic acid trial presented a tendency to gain motor abilities when compared to the natural evolution of the disease and the film as an analyze method seem to be an efficient way to follow the motor evolution of these patients.