Le retrait des nématicides rend urgent la mise au point de méthodes alternatives de lutte contre les nématodes parasites des cultures et la création de variétés résistantes est une voie prometteuse. En vignoble, le nématode Xiphinema index a un impact économique élevé en transmettant le Grapevine fanleaf virus (GFLV), principal virus du court-noué de la vigne et première virose de la vigne à l’échelle mondiale. Des porte-greffe résistants vis-à-vis du vecteur X. index basés sur la source de résistance muscadine (Muscadinia rotundifolia) sont en cours de sélection chez la vigne afin de stopper ou retarder l’infection. Sur cette culture, une étude antérieure avait montré que ce nématode parthénogénétique méiotique est aussi capable de se reproduire (rarement) de façon sexuée. Un travail préliminaire de phylogéographie avait permis de révéler les groupes prédominants de diversité et de sélectionner des populations représentatives pour la création de lignées monofemelles. La durabilité de la résistance doit prendre en compte la diversité du nématode. Dans ce contexte, la thèse a d’abord complété et approfondi l’approche phylogéographique en utilisant une très large gamme d’échantillons originaires de l’aire mondiale de répartition de la vigne. Nos résultats permettent de proposer des hypothèses fortes afin de localiser l’aire native du nématode X. index au Moyen-Orient et de retracer ses itinéraires de dissémination à partir de l’Antiquité. IIs illustrent également le lien étroit depuis cette époque entre la dissémination du nématode et celle de la vigne domestiquée par l’homme. La deuxième partie de la thèse a évalué la durabilité de la résistance de matériel porte-greffe issu de la muscadine en serre (nématodes non virulifères sur plants entre 3 et 6 ans) et en vignoble (nématodes virulifères sur plants âgés de 16 ans). En serre, des accessions résistantes F1 ou BC1, préalablement obtenues à partir d’in vitro ou de boutures ligneuses, ont été inoculées avec un mélange de 4 lignées représentatives, chaque lignée étant traçable avec des marqueurs microsatellites. Nous avons montré que les nématodes issus de plants obtenus par multiplication in vitro surmontent progressivement la résistance tandis que le matériel issu de boutures exprime une résistance durable. La multiplication progressive des nématodes sur le matériel résistant uniquement dans le cas où il est issu d’in vitro écarte a priori l’hypothèse d’une adaptation génétique du nématode. Elle apparaît liée à une architecture différente du système racinaire chez les plants issus de ce type de multiplication, multiplication qui pourrait induire des changements physiologiques discrets mais durables dans les tissus racinaires apicaux à partir desquels les nématodes se nourrissent. Le génotypage des nématodes par microsatellites a permis de détecter un taux bas mais croissant d’individus hybrides entre lignées sur les plants âgés de 4 à 6 ans, ce qui confirme l’aptitude de multiplication sexuée précédemment observée en vignoble. Du fait que l’observation d’individus hybrides apparaît indépendante du type de propagation et du statut de résistance de la plante, nos résultats écartent l’hybridation comme mode d’adaptation du nématode qui serait à même d’expliquer le contournement de la résistance chez les plants issus d’in vitro. En vignoble, après 16 années, les nématodes ont été quasi-impossibles à détecter sur l’accession résistante BC1 qui est également peu affectée par les attaques virales, tandis que des effectifs de nématodes plus élevés ont été retrouvés sur une accession témoin sensible dont les plants sont par contre très majoritairement morts ou en dépérissement. Considérés globalement, nos résultats montrent que la stratégie de résistance basée sur la muscadine apparaît durable. Cette stratégie ciblée sur le nématode vecteur contribuera à réduire significativement l’impact du GFLV transmis par X. index. / The ban of most nematicides renders urgent control alternatives against plant-parasitic nematodes and breeding for resistant plant varieties is promising. In vineyards, the nematode Xiphinema index has a high economical impact by transmitting Grapevine fanleaf virus (GFLV), the main virus of ‘Court-noué’ disease and the first grapevine viral disease worldwide. Resistant rootstocks are being selected in grapevine, using Muscadinia rotundifolia (muscadine) as a resistance source to the vector, in order to arrest or delay GFLV transmission. In this crop, a previous study had shown that this meiotic parthenogenetic nematode is able to reproduce sexually (rarely) in the field. A preliminary phylogenetic work had allowed to reveal the predominant diversity groups and to select representative populations for the creation of single-female lines. Resistance durability is a real challenge that must consider the key information of the nematode diversity. In this context, the PhD project first completed and deepened our phylogeographical approach using an extended geographic coverage of the worldwide nematode distribution. Our results allow proposing strong hypotheses to locate the native area of X. index in the Middle-East and trace its dissemination routes from the Antiquity. They also highlight the close link since this epoch between dissemination of the nematode and domesticated grapevine by man. The second part of the PhD project has then evaluated the durability of muscadine-derived rootstock material in greenhouse (non viruliferous nematodes on plants aged 3 to 6 years) and field (viruliferous nematodes on plants aged 16 years) conditions. In the greenhouse, F1 and BC1 resistant accessions, previously obtained from both in vitro and hardwood-cutting propagation, were inoculated with 4 mixed representative X. index lines, traceable each with microsatellite markers. We showed that nematodes from plants obtained from in vitro progressively overcame the resistance while the material obtained from cuttings displayed a durable resistance. Nematode progressive multiplication in resistant accessions obtained only from in vitro removes a priori the hypothesis of a nematode genetic adaptation and appears linked to a different architecture of the root system in this propagation type. This type may have induced discrete but durable physiological changes in apical root tissues from where nematodes feed. Nematode microsatellite genotyping allowed detecting a low but increasing rate of hybrid individuals from 4 to 6 years, which confirms data from the vineyard. As the hybrid occurrence appears independent from the propagation type and the resistance status of the plant, our data discard hybridization as the mode of adaptation of the nematode underlying resistance breakdown from in vitro plants. In field conditions, after 16 years, nematodes were almost undetectable on the resistant BC1 accession, also almost unaffected by the viral attacks, while higher numbers were detected on a susceptible control accession, whose plants were by contrast in high majority dead or poorly vigorous. Taken all together, our results show that the muscadine-derived resistance strategy appears durable. This strategy focused on vector control will significantly contribute to reduce the impact of GFLV transmitted by X. index.

Le statut hydrique de la vigne est reconnu comme étant un facteur essentiel dans la production viticole. A l'échelle de la parcelle agricole, les travaux de recherche ont permis de mettre au point différentes méthodes de caractérisation du statut hydrique. Cependant, du fait de leur lourdeur de mise en oeuvre, ces méthodes sont difficilement utilisables à l'échelle de la petite région, alors qu'il existe un fort besoin d'informations sur le statut hydrique à cette échelle. L'objectif principal de ce travail est l'obtention d'un statut hydrique spatialisé en milieu viticole méditerranéen, à l'échelle de la petite région. Le site d'étude est la basse vallée de la Peyne, zone de production viticole de 65 km2, représentative du vignoble méditerranéen. La démarche générale consiste à spatialiser l'évapotranspiration réelle (ETR), choisie comme indicateur du statut hydrique, par l'intermédiaire de deux modèles spatialisées (S-SEBI, Roerink et al., 2000 et WDI, Moran et al., 1994) issus d'images de télédétection dans l'infrarouge thermique (capteur ASTER). Les résultats de ces modèles sont validés par comparaison avec des mesures et des simulations locales de l'ETR. Ces simulations, réalisées en utilisant un modèle de transfert hydriques (HYDRUS-1D, Simunek et al., 1998), représentent une solution de validation originale pour obtenir une ETR locale sur un grand nombre de sites, à un coût expérimental réduit. Une étude de sensibilité permet d'apprécier la robustesse de ces modèles spatialisés vis à vis des conditions expérimentales. Après avoir vérifié que les simulations locales réalisées avec HYDRUS 1-D pouvaient effectivement servir de données de validation, nous montrons que les modèles spatialisés testés permettent d'estimer l'ETR à l'échelle journalière avec une précision satisfaisante, le modèle S-SEBI, pourtant plus empirique, donnant de meilleurs résultats que le modèle WDI (RMSE de 0.8 mm.j-1 et 1.1 mm.j-1 respectivement). Nous montrons que ces approches de spatialisation sont sensibles aux conditions expérimentales considérées (champs d'étude spatial pour le S-SEBI, vitesse du vent pour le WDI). Enfin, les résultats de spatialisation mettent en évidence d'importantes variabilités spatio-temporelles de l'ETR sur la zone d'étude. Les structures spatiales de statut hydrique observées à partir des deux modélisations réalisées sont très similaires et semblent être fortement liées aux caractéristiques pédo-paysagères de la zone d'étude / Vineyard hydric status is recognized as an essential factor for wine-producing. At the field scale, research work allowed to develop different methods for hydric status characterization. However, because of tedious implementation, these methods are useless at the watershed scale, whereas hydric status information at this scale is strongly needed. The main objective of this study is to spatialize vineyard hydric status over a Mediterranean watershed. The study site take place in the basse vallée de la Peyne, a 65 km2 wine-producing area, that is representative of the Mediterranean vineyards. The general procedure to achieve this objective was to spatialize actual evapotranspiration (ET), choose as hydric status indicator, through two spatialized models (S-SEBI Roerink et al., 2000 and WDI, Moran et al., 1994) derived from thermal infrared remote sensing imagery (ASTER sensor). The results of these models were validated by comparison with local ET measurements and simulations. These simulations made by a water transfers model (HYDRUS-1D, Simunek et al., 1998), that represent an original validation method to obtain local ET over an important number of sites, at a minimal experimental cost. A sensibility study allowed to identified the sturdiness of these spatialized models to the experimental conditions. After checking that local ET simulations obtained by the HYDRUS 1-D approach were correctly simulated, we showed that S-SEBI and WDI spatialized model, allowed to estimate ET with satisfactory accuracies. The more empiric S-SEBI model produced better results than the WDI model (RMSE about 0.8 mm.j-1 and 1.1 mm.j-1 respectively). Further, the sensibility study showed that these spatialisation approaches were sensitive to experimental conditions, (spatial extent for S-SEBI and wind speed for WDI). Finally, these spatialisation results depicted for important ET spatio-temporal variability over the Peyne watershed. The spatial patterns retrieved by the two models are similar and seems to be strongly related to pedological and landscape characteristics within the study site.

Les flavonoïdes (anthocyanes, flavonols et proanthocyanidines) sont des éléments clés de la qualité organoleptique des baies de raisin. Chez les végétaux, l’expression des gènes de la voie de biosynthèse de ces composés est contrôlée par des complexes protéiques organisés autour des facteurs de transcription de type MYB. Dans le cadre de cette thèse, une première approche s’est intéressée aux mécanismes de régulation de l’expression du gène VvMyb5a et de l’activité biologique de la protéine codée par ce gène. L’analyse du promoteur VvMyb5a a montré que son activité au cours du développement de la baie serait plutôt placée sous contrôle hormonal. Des expériences de double hybride ont révélé que la protéine VvMyb5a pouvait interagir avec une protéine kinase de type GAMYB et une protéine WD40. Une deuxième approche, basée sur l’analyse globale du transcriptome de mutants naturels de vigne affectés dans la biosynthèse des anthocyanes, a permis d’identifier deux nouveaux gènes MYB nommés VvMybPA1 et VvMyb24. L’expression différentielle de ces gènes dans des baies de cépages rouges et blancs a été confirmée et leurs caractérisations fonctionnelles ont été engagées chez Arabidopsis thaliana. / Flavonoids, like anthocyanins, flavonols and condensed tannins, are key elements of he organoleptic quality of grape berries. In plants, expression of genes encoding enzymes of he flavonoid biosynthetic pathway is controlled by small protein complexes organised around MYB transcription factors. In the present work, we first focused on the regulatory mechanisms of VvMyb5a expression and on the biological activity of the corresponding protein. Promoter analysis indicated that VvMyb5a expression is probably mainly controlled by hormones. A yeast two-hybrid screen revealed that VvMyb5a can interact with a GAMYB ype protein kinase and a WD40 protein. In a second time, global transcriptome analysis of grapevine natural mutants deficient in anthocyanin biosynthesis led to the identification of wo new MYB genes, named VvMybPA1 and VvMyb24. Differential expression of these two genes in red and white berry skins was confirmed by RT-PCR and their functional characterizations have been initiated in Arabidopsis thaliana.

La compréhension du processus d’adaptation des populations de parasites à leur plante-hôte est une question fondamentale en écologie évolutive. C’est également un enjeu majeur de recherche finalisée qui a des retombées pour la protection des cultures. L’oomycète Plasmopara viticola, agent causal du mildiou de la vigne, attaque les espèces du genre Vitis. Dans un contexte où l’enjeu principal des programmes d’amélioration est la durabilité des résistances, des connaissances nouvelles sur l’écologie et l’évolution de l'interaction entre le parasite et son hôte sont nécessaires afin d’évaluer le potentiel du mildiou à surmonter ces résistances. Dans ma thèse, je me suis intéressée au rôle de la plante-hôte comme facteur d’évolution des populations de mildiou, en posant cette question à différentes échelles évolutives : (i) dans le bassin d’origine du pathogène (Amérique du Nord), j’ai cherché à évaluer le degré de spécialisation du parasite sur sa gamme d’hôtes sauvages et cultivés; (ii) en Europe, où le mildiou de la vigne a été introduit récemment, j’ai étudié l’évolution des populations de mildiou soumis à la pression de sélection des résistances des nouvelles variétés de vigne. Pour comprendre la spécialisation plante-hôte dans ce pathosystème où plusieurs espèces cryptiques ont été identifiées, nous avons réalisé des tests d’inoculations croisées entre espèces hôtes (Vitis spp.) et agent pathogène (P. viticola). Les données phénotypiques et morphologiques apportent les preuves d’une spécialisation plante-hôte au sein des populations de P. viticola : les espèces A et D de mildiou sont spécialisées sur leur plante-hôte, tandis que le processus de spécialisation est en cours pour les espèces B et C. Même si aucune différenciation génétique n’a été montrée au sein de l’espèce C, il existe deux groupes distincts au sein de l’espèce B. Les isolats du compartiment cultivé sont en moyenne plus agressifs que les isolats issus des vignes sauvages, indiquant une adaptation des isolats cultivés sur leur plante hôte. A partir d’un large échantillonnage, nous avons étudié la distribution des espèces de mildiou sur leurs plantes-hôtes sauvages et cultivées. Ce travail a permis d’identifier une nouvelle espèce cryptique et a confirmé la spécialisation plante-hôte. En Europe, nos résultats montrent que le déploiement limité de variétés à résistantes partielles a conduit à des modifications des populations de mildiou: apparition d’isolats virulents (i.e. contournant un QTL majeur de résistance), et augmentation de l’agressivité sur Vitis vinifera. Dans le but de comprendre les mécanismes à l’origine de la spécialisation et du contournement des résistances, nous nous sommes intéressés au répertoire d’effecteurs du parasite. Une centaine d’effecteurs candidats ont été identifiés en utilisant les données disponibles sur le génome de P. viticola. L’analyse du polymorphisme de 32 candidats sur une sélection d’isolats montre que trois d’entre eux évoluent sous sélection positive. Ces résultats soulignent l’importance de la plante-hôte comme facteur de diversification des populations de l’agent pathogène et révèlent que le mildiou s’adapte rapidement aux résistances de la vigne. Il est désormais nécessaire de mieux appréhender le déploiement des résistances de la vigne afin qu’elles puissent être durables. / Understanding the process of adaptation of parasite populations to their host-plant is a key issue in evolutionary ecology. It is also a major subject in applied research that has implications for crop protection. The oomycete Plasmopara viticola, the causal agent of downy mildew, attacks the species of the Vitis genus. In a context where the main concern of the breeding programs is the durability of resistance, new knowledge about the ecology and evolution of the interaction between parasite and host is needed in order to evaluate the potential of downy mildew to overcome the resistance. In my thesis, I addressed the role of the host-plant as an evolutionary factor for downy mildew populations, by asking this question at two different evolutionary scales: (i) in the pathogen region of origin (North America) I assessed the degree of specialization of the parasite on its wild and cultivated host range (ii) in Europe, where downy mildew has been introduced recently, I studied the evolution of downy mildew populations subject to the selection pressure imposed by resistant grapevine varieties. To understand the host-plant specialization in this pathosystem, where several cryptic species have been identified, we performed cross inoculations between different host (Vitis spp.) and pathogen (P. viticola) species. Morphological and phenotypic data provide evidence of host-plant specialization in P. viticola populations: downy mildew species A and D are specialized on their host-plant, while the specialization process is ongoing for species B and C. Although no genetic differentiation has been shown inside species C, there are two distinct groups within species B. Isolates from the cultivated compartment are on average more aggressive than isolates from wild vines, indicating an adaptation of isolates growing on cultivated host-plants. Finally, a large-scale study of the distribution of downy mildew species on both their wild and cultivated host-plants resulted in the identification of a new cryptic species and confirmed the host-plant specialization. In Europe, our results show that the limited deployment of resistant varieties has led to changes in downy mildew populations: emergence of virulent isolates (i.e. breakdown of a major QTL for resistance), and increased aggressiveness on Vitis vinifera. In order to understand the mechanisms at the origin of specialization and resistance breakdown, we examined the parasite’s effector repertoire. Over one hundred effector candidates were identified using available data on the P. viticola genome. The polymorphism of 32 candidate genes revealed that three of them evolve under positive selection. Our results reveal the strong ability of downy mildew to adapt to its host plant and to plant resistance. They should be taken into account when devising strategies for the deployment of grapevine resistances in order to guarantee their durability.

L’esca est une maladie de dépérissement du bois de la vigne conduisant à la mort des ceps. Actuellement le vignoble mondial est atteint, et au niveau français, cette maladie ne cesse de progresser. Ainsi, 8% des ceps dans le Jura et 4,5% dans la région de Bordeaux manifestent des symptômes d’esca, selon les parcelles des chiffres beaucoup plus élevés sont obtenus, certains cépages sont aussi beaucoup plus sensibles que d’autres. Plusieurs champignons seraient impliqués dans l’esca mais leur rôle ainsi que la détermination de la microflore responsable de cette maladie est encore sujette à interrogation. Dans ce contexte, l’objectif de cette thèse a été de caractériser et de comparer les microflores fongiques et bactériennes colonisant le bois de ceps de vigne ayant exprimé ou non des symptômes foliaires d’esca. Dans un premier temps, nous avons prélevé des ceps (cultivar Cabernet Sauvignon) relativement jeunes (10 ans d’âge) car ils présentaient l’intérêt d’être peu dégradés au niveau du bois du tronc, les symptômes foliaires étant associés à la présence d’amadou (une nécrose typique de l’esca) uniquement dans les bras. Une grande diversité dans les communautés fongiques (674 OTUs) et bactériennes (222 OTUs) colonisant le bois a été observée. Cette diversité est plus importante dans le bois sain de la vigne que dans celui partiellement ou totalement nécrosé. Les techniques utilisées, i.e. isolement/séquençage de souches, empreinte moléculaire (Single Strand Conformation Polymorphism, SSCP) et pyroséquençage 454, ont montré que les communautés bactériennes ou fongiques étaient différentes dans les tissus dégradés comparés à ceux qui ne l’étaient pas. Des changements de microflores en fonction du temps (expérimentation durant 1 année) ont aussi été observés. D’une façon générale, les espèces de champignons impliquées dans l’esca sont déjà présentes dans le bois apparemment sain de ceps esca-foliaires symptomatiques mais aussi des asymptomatiques. Il n’a pas été possible de différencier ces 2 types de microflores au niveau du bois sain des plants, cette différentiation se faisant au niveau des nécroses, qui sont plus abondantes dans les ceps esca-symptomatiques. Pour la première fois nous avons montré que des communautés bactériennes spécifiques étaient associées à l’esca, leurs aptitudes trophiques étant différentes selon les tissus où elles étaient prélevées. Les espèces isolées suggèrent que certaines pourraient avoir un rôle dans la protection du végétal, d’autres dans la dégradation des structures du bois, e.g. de la lignine, préparant ainsi le terrain aux champignons dégradateurs des tissus ligneux, déjà présents à l’intérieur des ceps. Nous avons aussi étudiés des ceps plus âgés (cultivar Baco blanc), de 42 et 58 ans, qui avaient un rendement acceptable et n’avaient pas manifesté de symptômes d’esca ou eutypiose (une autre maladie du bois) l’année du prélèvement. Au niveau des tissus fonctionnels du bois, les communautés fongiques étaient caractéristiques de plants atteints par l’eutypiose (ceps de 42 ans) ou de l’esca (ceux de 58 ans). La non expression par les ceps de ces 2 maladies pourrait cependant être associée à la forte présence de champignons mycoparasites et protecteur du végétal, comme Trichoderma spp., dans ces tissus fonctionnels. Les interactions au sein des communautés fongiques créant un équilibre où le pathogène ne se développerait pas de façon extensive. Les caractéristiques du Baco blanc, un hybride, moins sensible à certaines maladies de la vigne, pourrait aussi expliquer ce résultat. Ainsi la présence d’une microflore bénéfique naturellement présente dans le bois des ceps associée à des plants ayant une tolérance à ces maladies pourrait ouvrir de nouvelles perspectives pour lutter l’esca, voire l’eutypiose, pour lesquelles aucun moyen de protection n’existe aujourd’hui. / Esca is a Grapevine Trunk Disease (GTD) that induces a decline in grapevine vigour that generally leads up with the death of the plants. Nowadays, vineyards worldwide are attacked by esca and, in France this disease increases steadily. In the Jura, 8% of the grapevines are esca-foliar symptomatic and approximately 4.5% in the Bordeaux region. However, some vineyards are more severely attacked by esca, and certain cultivars are more susceptible than others. Although several pathogenic fungi are associated with esca, their individual roles and their interaction with other microorganisms for the esca have still to be determined. In this context, the objective of the present PhD study is to characterize and compare the bacterial and fungal microflora that colonize the wood tissues of esca-foliar symptomatic and asymptomatic grapevines. First, we sampled young (10 year-old) grapevines (Cabernet Sauvignon cultivar) because they had only few necroses in the trunk and white-rot (also called amadou) was only present in the cordons of symptomatic plants. Great diversity in the fungal (674 OTUs) and bacterial (222 OTUs) communities was observed. This diversity was higher in the apparently healthy wood than in the partially or totally necrotic wood tissues. The methods used isolation/sequencing of microbial strains, a molecular fingerprinting method (Single Strand Conformation Polymorphism, SSCP) and 454 pyrosequencing showed that the fungal and bacterial communities of the necrotic and healthy wood tissues were different. Changes in the microflora over time (over a one-year period) have been observed. Fungal species involved in esca are already present in the apparently healthy wood of esca-foliar symptomatic plants but also in the asymptomatic ones. It was not possible to differentiate these 2 microflora. Only microflora from the necroses differed from those of the healthy wood with these necroses being more developed in the esca-foliar symptomatic grapevines. For the first time, we were able to determine that specific bacterial communities are associated with esca. Depending on the wood tissues, different types of bacteria were isolated, with different trophic behaviour. Two roles could be assigned to the species isolated from the various wood tissues: (i) a positive role, due to the biocontrol potential that many species have; (ii) a negative one, by predisposing the wood of grapevines to fungal attacks. We also studied, old (42 and 58 year-old) grapevines of the cultivar, Baco blanc, that produced regular harvests. The plants had no expressed foliar symptoms of esca or eutypa dieback during the sampling year. Many plant pathogens colonized the functional wood tissues, but in 58 year-old plants they were associated with esca, and in 42 year-old plants, with eutypa dieback. The absence of GTDs expression could be linked to the numerous plant protectant mycoparasites, such as Trichoderma spp., that colonized the functional wood tissues. Interactions between species within the fungal communities may create a balance that is unfavourable to the development of the pathogens. The use of Baco blanc, a hybrid less susceptible to certain grapevine diseases could also explain this result. So, because no means of protection are currently available, the combination of beneficial microflora within the garpevine wood tissues with plants that are tolerant to esca, or even eutypa dieback, could be helpful to control those diseases.

Les maladies fongiques du bois de la vigne que sont le syndrome de l'esca, le Black Dead Arm (BDA) et l'Eutypiose sont particulièrement dommageables à la profession vitivinicole, et sont actuellement en progression. Le temps d'incubation nécessaire à l'expression de ces maladies au champ complique l'évaluation de solutions préventives adaptées en condition contrôlée ainsi qu'en condition de terrain. Ces travaux de thèse ont eu pour objectifs la conception et la validation de tests PCR quantitatifs en temps réel (RtqPCR), permettant la détection et la quantification in planta de cinq champignons associés aux maladies de dépérissement de la vigne, Phaeomoniella chlamydospora et Phaeoacremonium aleophilum (esca), Diplodia seriata et Neofusicoccum parvum (BDA), et Eutypa lata (Eutypiose). Le développement de tests multiplexes a ensuite été entrepris et ces derniers ont été évalués pour la détection de quatre champignons (2 associés à esca et 2 au BDA) dans le bois de jeunes plants issus de pépinière viticole. Enfin, l'étude de l'interaction in planta de deux champignons associés au syndrome de l'esca de la vigne (P.chlamydospora et P.aleophilum) a été réalisée par RT-qPCR, et complétée par la caractérisation histologique de la réponse de la plante à la blessure dans le bois, en inoculation individuelle et en co-inoculation. / Grapevine trunk diseases, among which esca's syndrome, Black Dead Arm (BDA) and Eutypiosis, represent a real threat for grape and wine industry. Incubation time required before symptoms externalization in field complicates the evaluation of the efficacy of preventive solution in control and field conditions. These thesis's works focused on the design and the validation of Real Time quantitative PCR assays (RT-qPCR), in order to detect and quantify in vine plant five fungi associated with grapevine trunk disease, Phaeomoniella chlamydospora et Phaeoacremonium aleophilum (esca), Diplodia seriata et Neofusicoccum parvum (BDA), et Eutypa lata (Eutypiosis). The development of multiplex assays was undertaken and these last were evaluated in order to detect four fungi (esca and BDA) in wood sample from young plants in vine nursery. Finally, a study of the interaction between two fungi associated with esca's syndrome has been determined in planta through RT-qPCR, and completed by a histological analysis of plant response to injury of woody tissues.

La vigne est sujette à de nombreuses contraintes biotiques et abiotiques face auxquelles elle devra optimiser ses stratégies de défense, en favorisant parfois des interconnections entre les réponses adaptatives au stress abiotique et la gestion de la réponse immune face à un pathogène. Dans cette étude nous avons évalué l'effet du stress hydrique (par privation d'eau) sur différentes réactions adaptatives au stress, mais aussi sur des réponses de défense et sur la sensibilité des feuilles et des baies de la vigne à Botrytis cinerea. Ces réactions ont été suivies en utilisant des boutures végétatives de deux cépages : cv. Meski (MSK), tolérant à la sécheresse et cv. Chardonnay (CHR), sensible. La relation entre les réponses au stress hydrique et la réponse immune a également été recherchée au moyen de feuilles de vitroplants et de baies isolées de Chardonnay exposées à des osmotica : le polyéthylène glycol (PEG) et une forte concentration en saccahrose (SUC). Les résultats montrent que le stress hydrique/osmotique conduit à des modifications physiologiques et biochimiques importantes dans les feuilles et les baies mûres de vigne. L'amélioration de la tolérance chez MSK est associée à une faible inhibition de l'activité photosynthétique, une altération du profil des acides aminés et un catabolisme actif des polyamines (PAs) comparé au CHR. Ces résultats suggèrent un rôle potentiel des déviations métaboliques observées dans les processus de tolérance de la vigne au stress osmotique. La tolérance du MSK au déficit hydrique est également corrélée à une forte induction des réponses de défense accumulation de resvératrol et e-viniférine, expression de certains gènes de défense dont STS, Gluc (PR-2), Chit-4c (PR-3) et PR-5 dans les feuilles, ainsi qu'à une faible sensibilité à B. cinerea.Ces résultats suggèrent un lien étroit entre la tolérance au déficit hydrique et la capacité de la vigne à exprimer davantage ses mécanismes de défense et à résister mieux à B. cinerea. Des expériences pharmacologiques ont montré qu'en situation de stress hydrique/osmotique, le catabolisme des PAs, via des diamine- et PA-oxydases, est impliqué dans la régulation de l'homéostasie des PAs et de l'expression des réactions de défense. L'application du stress osmotique avant l'infection des feuilles par B. cinerea potentialise l'accumulation des PAs en réduisant fortement leur dégradation. Ces effets sont corrélés à une réduction de l'amplitude des réponses de défense après infection, et à une sensibilité accrue à B. cinerea. Ces résultats rendent compte (1) de l'importance des stress abiotiques dans la régulation de la réponse immune chez la vigne et sa résistance à B. cinerea et (2) du fait que le niveau des réponses de défense osmo-induites et la résistance au pathogène sont tributaires, au moins en partie, de certains mécanismes adaptatifs au stress, comme c'est le cas ici des voies de dégradation des polyamines. / Grapevine is often exposed to both biotic and abiotic stresses, and it will optimize defense strategies by favoing sometimes the cross-talk between adaptive responses to abiotic stress and immune response against pathogen challenge. In this study we evaluated the effect of water stress (by withholding water) on different adaptive responses, and also on defense responses and sensitivity of grapevine leaves or berries to Botrytis cinerea. These reactions were monitored using vegetative cuttings of two varieties: Meski (MSK) a drought tolerant cultivar and Chardonnay (CHR) as a sensitive one. The relationship between the responses to water stress and the immune response was also assessed using detached leaves from vitroplantlets and detached ripe berries from Chardonnay exposed to osmotic agents: polyethlene glycole (PEG) and a high concentration of sucrose (SUC). The results show that water/osmotic stress leads to significant physiological and biochemical changes in grapevine leaves and ripe berries. The improved tolerance of MSK to drought is associated with a weak inhibition of photosynthetic activity, altered amino acid profile and an activation of polyamine (PA) catabolism, compared to the sensitive plant CHR. These results suggest a potential role of metabolic deviations observed in the process of osmotic stress olerance. MSK tolerance to water deficit is also correlated with a strong induction of defense responses, such as accumulation of resveratrol and e-viniferin, enhanced expression of defense-related genes, including STS , Gluc (PR-2), Chit-4c (PR-3) and PR-5, and a low susceptibility of leaves to B. cinerea. These results suggest a close connection between water stress tolerance and the ability of grapevine to express more their defense mechanisms and then to resist better to the pathogen B. cinerea. Pharmacological experiments showed that experiencing water/osmotic stress, PA oxidation through diamine- and PA-oxidases is involved in the regulation of PA homeostasis and the expression of defense reactions in both leaves and berries. The application of osmotic stress before leaf infection by B. cinerea potentiates PA accumulation probably by reducing PA degradation. These effects are correlated with a reduction of defense responses after B. cinerea infection, as well as to an increased susceptibility to B. cinerea.These results highlight (1) the importance of abiotic stress in regulating the immune response in grapevine plants and resistance to B. cinerea and (2) that the level of defense responses induced by osmotic and the resistance of grapevine to the pathogen are dependent, at least in part, on some adaptive mechanisms to stress, as it is the case here for polyamine degradation pathways.

Dans cette étude, nous avons dans un premier temps adapte le protocole d'embryogenèse somatique primaire a différentes variétés d'hybrides porte-greffes (3309C, 110R, Fercal, 41B et SO4) en nous appuyant sur l'expérience acquise au laboratoire sur Vitis vinifera cv Chardonnay. Les résultats montrent que le génotype, le type d'explant (étamine, fleur ou nœud), le type et la dose d'auxine utilisés dans le milieu d’induction (2,4-D ou 2,4,5-T) ont une influence sur les efficacités d'embryogenèse somatique. En effet, pour le 3309C, l'utilisation du 2,4,5-T dans le milieu d'induction a montré une efficacité embryogène supérieure à partir de nœuds par rapport à celle obtenue à partir d'étamines. Cependant la meilleure efficacité a été obtenue à partir de fleurs de cette variété, sur un milieu d'induction contenant du 2,4-D. De plus, le protocole d'embryogenèse somatique secondaire utilise de manière récurrente au laboratoire nous a permis d'obtenir des masses embryogènes ainsi que des embryons somatiques secondaires de ces porte-greffes. Le protocole de conversion des embryons en plantes, en présence de 4,5 uM de cytokinine (BAP) s'est avère efficace pour le 11OR et le 41B. Dans un second temps, nous avons co-cultivé le matériel embryogène obtenu pour quatre de ces génotypes (110R, 3309C, Fercal et 41B), avec Agrobacterium tumefaciens contenant trois constructions génétiques : (i) une copie d'une séquence partielle (1020 pb) du gène de la coque protéique du virus en orientation sens; (ii) une partie courte en sens et en anti-sens (280 pb) de cette même séquence formant une structure en épingle a cheveux (hpRNA = hairpin RNA) ; (iii) un amiRNA ciblant une séquence virale. Le gène bactérien codant la néomycine phosphotransférase et conférant la résistance à un antibiotique, la kanamycine, a été utilisé comme gène de sélection. Les conditions de sélection a la kanamycine ont nécessité des adaptations expérimentales telles que l’ajustement de la concentration en antibiotique puisque la sélection avec 75 mg.L-1 de kanamycine s'avère insuffisamment drastique dans Ia plupart de nos expériences de co-cullture. Les résultats d'analyse moléculaire par PCR ont montré l'amplification probable des fragments d'intérêt (CPGFLV et amiRI1TA-71) dans des échantillons de 11OR et de 41B résistants à la kanamycine. Cependant des analyses moléculaires supplémentaires par AL-PCR ne nous ont pas renseignées sur une éventuelle intégration du transgène amiRATA-71 dans des masses embryogènes de 41B. / In this study, we initially adapted the protocol of primary somatic embryogenesis in different varieties of hybrid rootstocks (3309C, 110R, Fercal, 41B and SO4) building on the experience gained in the laboratory on Vitis vinifera cv Chardonnay. The results show that the genotype, the explant type (stamen, flower or node), the type and the dose of auxin used in the induction medium (2,4-D or 2,4,5-T) influence the efficiency of somatic embryogenesis. Indeed, for the 3309C, the use of 2,4,5-T in the induction medium showed a higher efficiency from embryogenic nodes compared to that obtained from stamens. However, the better efficiency was obtained from the flowers of this variety on an induction medium containing 2,4-D. In addition, a protocol used in the laboratory for secondary somatic embryogenesis allowed us to obtain embryogenic masses as well as secondary somatic embryos from these rootstocks. The protocol conversion of embryos into plants, in the presence of 4.5 [tM of cytokinin (BAP), was effective for the 110R and 41B. In a second step, we co-cultivated embryogenic material obtained for four of these genotypes (110R, 3309C, Fercal and 41B), with Agrobacteriwn tumefaciens containing three genetic constructs: (i) a copy of a partial sequence (1020 bp) of the coat protein gene of the virus in the sense orientation, (ii) a short part-way and antisense (280 bp) of the same sequence forming a hairpin structure (hairpin RNA = hpRNA) (iii) one amiRNA targeting a viral sequence. The nptll bacterial gene encoding neomycin phosphotransferase and conferring resistance to the antibiotic kanamycin, was used as the selection gene. The selection conditions to kanamycin have required experimental adaptations such as adjusting the concentration of antibiotic because the selection with 75 mg.L-1 of kanamycin was not enough drastic in most of our experiments of co-culture. The results of molecular analysis by PCR showed probable amplification of fragments of interest (CPGFLV and amiRNA-71) in samples of 11OR and 41B resistant to kanamycin. However, additional molecular analysis by AL-PCR did not inform us about a possible integration of the transgene amiRNA-71 in embryogenic masses of 41B.

Vitis vinifera subsp. vinifera L., les principales espèces de raisins sont cultivées pour la production de fruits et la production de vin dans le monde est un hôte naturel d'une grande variété de micro-organismes procaryotes et eucaryotes qui interagissent avec la vigne, ayant des effets bénéfiques ou phytopathogènes. Ils pourraient également jouer un rôle majeur dans le rendement des fruits, la qualité du raisin, la protection des plantes et, finalement, dans le modèle de la fermentation du raisin et la production de vin. La phyllosphère (constituée des parties aériennes de la plante) est l'un des habitats microbiens les plus répandus sur terre et est un milieu assez négligé, en particulier dans les vignes et de nombreuses questions liées à cet habitat microbien sont toujours sans réponse.Cette thèse est un effort pour répondre à une question fondamentale en écologie microbienne: quels sont les facteurs qui déterminent le microbiome dans la phyllosphère de la vigne? Les communautés microbiennes de la phyllosphère (PMCs) vivent à l'interface plante-climat et sa capacité à s'établir, prospérer et se reproduire sur la surface des feuilles ou des fruits dépend de plusieurs caractéristiques fonctionnelles microbiennes, comme la capacité de se fixer sur la cuticule et d'utiliser la foliaire. nutriments ainsi que les conditions climatiques dominantes comme la température, l'humidité de l'air et la pluie. La chimie des feuilles ou des fruits, la physiologie et la structure morphologique diffèrent selon le génotype et l'espèce puisque tous ces traits ont une base génétique, et cette variation peut mener à une combinaison différente d'assemblage de PMC parmi les génotypes de plantes. Ainsi, le premier objectif de notre travail était d'évaluer les impacts des cultivars de vigne (variétés de Vitis vinifera L) et des espèces de vigne (espèces Vitis entièrement différentes) sur l'assemblage du microbiome dans la phyllosphère à un endroit géographique particulier (pour minimiser les effets environnementaux) . Plus tard, les impacts de certains cultivars et terroirs de vigne commercialement importants (représentés par trois zones climatiques françaises) ont également été évalués et comparés. Les impacts de la saison et des organes extérieurs de la plante (feuilles et baies) sur la structuration des taxons microbiens dans la phyllosphère ont également été évalués et présentés dans ce travail. De plus, des impacts spécifiques à l'espèce sur le microbiome de la phyllosphère ont également été testés et représentés.Dans l'ensemble, notre étude a évalué et comparé les nombreuses facettes des facteurs qui peuvent influencer structure du microbiome dans la phyllosphère avec un accent particulier sur la pression de sélection relative exercée par le génotype de la vigne et son interaction avec différentes conditions climatiques (ou terroir), ce qui peut améliorer nos chances de trouver des gènes contrôlant les PMCs sur la phyllosphère. les gènes sont réellement importants dans des environnements réalistes et probablement ces gènes nous donneraient de nouvelles idées pour la sélection de nouveaux cépages sains présentant de meilleurs caractères sur leur phyllosphère. De plus, considérant que les PMC végétales jouent un rôle crucial dans la santé et la forme des plantes car elles peuvent moduler la susceptibilité foliaire aux infections, cette étude pourrait également être utile pour développer des méthodes de biocontrôle innovantes et naturelles ou phytostimulation contre les pathogènes de la vigne. de variétés résistantes innovantes. / Vitis vinifera subsp. vinifera L., the main grape species are grown for fruit and wine production over the world is a natural host of a wide variety of prokaryotic and eukaryotic microorganisms that interact with grapevine, having either beneficial or phytopathogenic effects. They could also play a major role in fruit yield, grape quality, plant protection and, ultimately, in the pattern of grape fermentation and wine production. Phyllosphere (consists of the aerial parts of the plant) is one of the most prevalent microbial habitats on earth and is quite a neglected milieu, especially in grapevines and many questions related to this microbial habitat, are still unanswered.This thesis is an effort to answer a very fundamental question in microbial ecology- what are the drivers that shape the microbiome in the grapevine's phyllosphere? The phyllosphere microbial communities (PMCs) live at the plant-climate interface and its ability to establish, thrive and reproduce on the leaf or fruit surface depends on several microbial functional traits, such as the ability to attach to the cuticle and to use the foliar nutrients as well as well as to the prevailing climatic conditions like temperature, air humidity and rain. Leaf or fruit chemistry, physiology, and morphological structure differ among plant genotype and species as all these traits have a genetic basis, and this variation may lead to a different combination of PMCs assemblage among plant genotypes. Hence, the first objective of our work was to assess the impacts of grapevine cultivars (varieties of Vitis vinifera L) and grapevine species (entirely different Vitis species) on microbiome assemblage in the phyllosphere at a particular geographic location (to minimize the environmental effects). Later on, impacts of some commercially important grapevine cultivars and terroirs (represented by three French climate zones) were also assessed and compared. Impacts of the season and exterior plant organs (leaf and berries) on microbial taxa structuring in the phyllosphere was also assessed and presented in this work. Furthermore, species-specific impacts on phyllosphere microbiome were also tested and represented.Overall our study assessed and compared the many facets of the factors that may influence themicrobiome structure in the phyllosphere with a special focus on relative selection pressure exerted by grapevine genotype and its interaction with different climatic conditions (or terroir), which may improve our chances to find genes that controls PMCs on phyllosphere, and simultaneously increase our confidence that those genes are actually important in realistic environments and probably those genes would give us new insights for breeding new and healthy grape varieties displaying better traits on their phyllosphere. Moreover, considering that the plant PMCs plays a crucial role in plant health and fitness as it can modulate leaf susceptibility to infection, this study could also be helpful to develop innovative and natural biocontrol methods or phytostimulation against grapevine pathogens or rethink breeding schemes for the creation of innovative resistant varieties.

Le sol, composante du Terroir doit être considéré comme une ressource non renouvelable essentielle au fonctionnement des agroécosystèmes. Or, les sols viticoles sont particulièrement vulnérables aux dégradations. L’objectif central de ma thèse est donc d’évaluer comment les pratiques viticoles affectent la qualité des sols dans le Languedoc-Roussillon. Pour ce faire, j’ai d’abord évalué la qualité des sols sur 164 parcelles présentant une grande variabilité de pratiques culturales et réparties sur 9 zones pédologiques très diversifiées. Puis, j’ai évalué la vitesse de changement de la qualité des sols par l’analyse de 24 parcelles d’une zone homogène converties progressivement en viticulture biologique depuis un maximum de 17 ans. Plusieurs indicateurs physiques (densité apparente, porosité totale, stabilité structurale et humidité à la capacité au champ), chimiques (teneur en carbone et azote, C/N, disponibilité des éléments P, K, et Cu, capacité d’échange cationique) et biologiques (biomasse microbienne, respirométrie, nématodes, vers de terre) ont été mesurés afin de fournir une vision holistique de la qualité des sols. Mes résultats montrent une diversité de qualité des sols viticoles au regard des perturbations subies par les différentes pratiques. J’ai également démontré que la majorité des indicateurs étudiés sont sensibles aux pratiques viticoles indépendamment des types de sol étudiés. Concernant la dynamique de changement, la qualité des sols viticoles se stabilise après 7-11 de pratiques biologiques. Toutefois, malgré une augmentation significative des activités biologiques du sol (micro-organismes et nématodes libres), la conversion depuis 17 ans n’a pas mis en évidence une amélioration nette de la qualité du sol. En conclusion, nous avons confirmé la vulnérabilité des sols viticoles languedociens aux pratiques en cours. Mes travaux mettent en lumière l’importance du transfert des connaissances acquises lors de ce travail pour améliorer la perception de la qualité des sols par les viticulteurs et les professionnels de la filière viticole. / Soils should be considered as a non-enewable yet essential resource for agroecosystem functioning. Animportant component of the Terroir, vineyard soils are nevertheless particularly vulnerable to degradation.The main objective of my PhD was to assess the effect of viticultural practices on soil quality in theLanguedoc©Roussillon region. In this aim, I first assessed soil quality on 164 vineyard plots representing awide range of viticultural practices and located in 9 contrasted soil type zones. I then estimated the speed of change in soil quality, by analyzing 24 plots from one homogeneous zone after their conversion toorganic viticulture, undertaken 1 to 17 years ago. Several physical (bulk density, total porosity, structuralstability and soil moisture at field capacity) as well as chemical (carbon and nitrogen content, C/N, P, K and Cu availability, cation exchange capacity) and biological (microbial biomass, respiration, nematode andearthworm abundance) indicators were measured in order to provide a holistic appraisal of soil quality. Myresults show that the variability of vineyard soil quality reflects the perturbations inflicted by differentmanagement practices. I have also established that the majority of the studied indicators are sensitive toviticultural practices, independently of soil type. The study of the dynamics of the change in vineyard soilquality revealed stabilization after 7 to 11 years of organic management practices. However, despite asignificant increase in biological activity (microbial biomass and free©living nematode abundance), no clearimprovement in soil quality was apparent 17 years after conversion to organic viticulture. In conclusion, we have confirmed the vulnerability of Languedoc©Roussillon vineyard soils to current management practices. My work highlights the importance of transferring the acquired knowledge to winegrowers and wine sector professionals in order to improve their perception of soil quality.