A parvovirose suína está mundialmente distribuída tornando-se responsável por expressivas perdas econômicas devido aos problemas reprodutivos. O presente trabalho teve como objetivo realizar a padronização da PCR em tempo real (qPCR) utilizando sonda TaqMan para detecção e quantificação de parvovirus suíno 1 (PPV1) em amostras de soro, baseado na região do gene NS1. A especificidade, sensibilidade, reprodutibilidade e quantificação da qPCR foram avaliadas e a casuística foi comparada com a nested PCR (nPCR). A curva padrão da qPCR apresentou linearidade de 6 x 106 cópias genômicas/mL (gce/mL) a 2 x 103 gce/mL, com um coeficiente de correlação (R2) de 0,98. No teste de especificidade, a qPCR não apresentou valores de Cycle threshold (Ct) nos patógenos do grupo de exclusão (circovirus suíno tipo 2, parvovirus canino, vírus da panleucopenia felina, , Erisipela e Leptospirose). Todas as cepas de PPV1 testadas apresentaram fluorescência, demonstrando uma especificidade de 100%. Comparando as duas técnicas, 11 amostras foram positivas em ambos os testes e a nPCR detectou quatro amostras a mais do que a qPCR. A concordância, sensibilidade e especificidade entre as técnicas foi de 98%, 73% e 100%, respectivamente. Portanto, a nPCR apresentou maior sensibilidade, no entanto, a qPCR poderá ser utilizada no diagnóstico e quantificação de PPV1, podendo auxiliar em estudos de viremia, epidemiologia e monitoramento do vírus nas granjas. No segundo estudo, foi realizada a detecção por PCR de circovírus suíno tipo 2 (PCV2), PPV1, parvovírus suíno tipo 2, torque teno vírus suíno 1 e 2 (TTV1 e TTV2) e hokovirus suíno (PHoV) em pools de órgãos (linfonodos, pulmões, fígado, baço e rim) de leitões apresentando a Sídrome Multissistêmica do Definhamento Suíno (PMWS). Todas as amostras foram PCR positivas para PCV2 e os outros vírus foram detectados em todos os rebanhos, com exceção do TTV1. As amostras também foram positivas na PCR para PPV1 (81,6%), PPV2 (73,7%), TTV1 (5,3%), TTV2 (86,8%) e PHoV (55,3%). Os resultados indicam que leitões com PMWS e infectados com PCV2 apresentaram co-infecções com outras espécies de parvovirus e anelovirus, que podem estar envolvidos na apresentação da PMWS. Devido às poucas informações sobre a variabilidade genética do PHoV, oito fragmentos sobrepostos da região VP1/VP2 de quatro amostras foram amplificados e sequenciados. Na análise filogenética, as amostras brasileiras de PHoV apresentaram-se mais estreitamente relacionadas às amostras européias. O presente trabalho relata a primeira detecção de PPV2 e PHoV em co-infecções com PCV2 e a primeira caracterização genética de amostras de PHoV no Brasil. / Porcine parvovirus 1 (PPV1) has worldwide distribution and causes an important reproductive losses. The present dissertation was performed to develop a real-time polymerase chain reaction (real-time PCR) using a TaqMan probe based on NS1 gene to detect and quantify PPV1 in serum samples. The specificity, sensitivity, reproducibility and quantitative range of the real time PCR were evaluated and compared with conventional nested PCR (nPCR). The standard curve of real-time PCR was linear ranging from 6 x 106 genome copies equivalent/mL (gce/mL) to 2 x 103 gce/mL with a square of the correlation coefficient (R2 value) of 0.98. No cross-reactivity was detected with closely related parvovirus or with viruses that causes similar symptoms and all PPV1 strains showed fluorescence in the assay. Comparing these techniques, 11 samples were positive in both tests and nPCR detected four additional samples. The concordance, sensitivity and specificity between the techniques were 98%, 73% and 100%, respectively. In conclusion, nPCR showed more sensitivity, however, real-time PCR could be a useful tool for diagnosis and quantification of PPV1 in serum samples and can be used for viremia studies, epidemiology and monitoring PPV1 infection in swine herds. The second study was performed in order to detect porcine circovirus 2 (PCV2), PPV1, porcine parvovirus 2, torque teno virus 1 and 2 (TTV1 and TTV2) and porcine hokovirus (PHoV) in different pooled tissues (lymph nodes, lungs, liver, spleen and kidneys) of piglets displaying Postweaning multisystemic wasting syndrome (PMWS) by PCR. All the samples were PCR positive for PCV2 and the other viruses were detected in all herds, with the exception of TTV1. The samples were positive for TTV2 (86.8%), PPV1 (81.6%), PPV2 (73.7%), PHoV (55.3%) and TTV1 (5.3%). These results showed that piglets displaying PMWS and infected with PCV2 presented co-infections with other virus, which could be involved in the syndrome. Since there are few data about genetic variability of PHoV, eight overlapping fragments of VP1/VP2 region of PHoV were amplified and. In phylogenetic analysis, Brazilian PHoV sequences were more closely related to European sequences. The results indicate that piglets displaying PMWS are PCV2 infected and can be co-infected with different parvovirus and circovirus species.

A presente dissertação versou sobre o parvovírus suíno (PPV) onde, em um primeiro trabalho foi realizado o diagnóstico do PPV em leitões (saudáveis e refugos) e em fêmeas (de distintas ordens de parto) através de nested-PCR do soro. Os títulos de anticorpos das fêmeas foram determinados por Inibição da Hemaglutinação (HI) e comparados com os resultados da nested-PCR. A nested-PCR obteve resultados positivos em amostras de todas as categorias analisadas: leitões saudáveis (15,7% de animais positivos), leitões refugos (18,2%) e fêmeas (17,8%). Os índices de reprodutoras positivas para as distintas ordens de parto foram de 20,8%, 8,7%, 12,5%, 27,3%, 20,8% e 15,0% para as ordens de parto 1, 2, 3, 4, 5 e>= 6, respectivamente. Através da HI, 84,7% dos soros possuiam anticorpos para PPV. Os títulos nas distintas ordens de parto foram de 2142,7 (8,7), 2403,1 (9,8), 2250,0 (9,9), 2952,2 (10,6), 2600,3 (9,8) e 2154,7 (9,7) para as ordens de parto 1, 2, 3, 4, 5 e>= 6 respectivamente (log2X entre parênteses). Não houve correlação estatisticamente significativa entre os resultados da nested-PCR e os títulos de HI. Ao contrário do que era esperado, fêmeas com altos títulos de anticorpos possuiam DNA do vírus na circulação. No segundo trabalho, foram estudas seqüências da porção VP1/VP2 de PPV retiradas do GenBank, juntamente com cinco amostras seqüenciadas no presente estudo. A análise foi realizada quanto à presença de determinados aminoácidos e através de filogenia. Como resultados, o seqüenciamento revelou que duas das novas amostras (S30 e S31) apresentavam modificações em regiões consideradas importantes para a virulência do PPV. Entre estas, destaca-se a modificação no sitio 586, com a presença do aminoácido Thr. A análise filogenética demonstrou que as seqüências de PPV se dividem em dois grupamentos, porém com apenas um grupamento bem definido. Por último, o relógio molecular revelou que a separação dos dois grupos ocorreu há 2890 anos e a divisão dos sub-grupamentos mais recentes ocorreu nos últimos três séculos. / The present dissertation studied porcine parvovirus (PPV) and the first part describes the diagnosis of PPV in piglets sera (healthy and attrition) and females (with distinct parity orders. through nested-PCR. The antibody titers from females were analized by Hemoaglutination Inhibition and compared with the results from the nested-PCR. The nested-PCR results displayed positive animals in all sampled categories: healthy piglets (15.7% of positive animals), attrition piglets (18.2%) and females (17.8%). The results for the distinct parities orders were 20.8%, 8.7%, 12.5%, 27.3%, 20.8% and 15.0% for the pariy orders 1, 2, 3, 4, 5 and>= 6, respectively. The HI test detected 84.7% of the females positive to PPV. The titers in the distinct orders were 2142.7 (8.7), 2403.1 (9.8), 2250.0 (9.9), 2952.2 (10.6), 2600.3 (9.8) and 2154.7 (9.7) to the parity orders 1, 2, 3, 4, 5 and>= 6 respectively (log2X in parenthesis). No statically correlation was evidenced between the nested-PCR and the HI titers. Curiously, females with high antibody titers displayed the viral DNA in their circulation. In the second part, sequences of the PPV region VP1/VP2 were retrieved from GenBank, together with five samples sequenced in the present study. The analysis was performed by identifying the presence of specific aminoacids and by phylogeny. The sequenced samples displayed the presence of important aminoacids substitutions, including Thr in the 586 site in two samples (S30 and S31). The phylogenetic analysis revealed two clusters among the PPV sequences. However, only one cluster displayed a high definition. The molecular clock displayed that the separation between the two main clusters occurred 2890 years ago, and the separation between the most recent sub-clusters happened in the last 300 years.

Orientador : Clarice Weis Arns / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-07-28T02:11:31Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Simoni_IsabelaCristina_D.pdf: 3619500 bytes, checksum: fd0570e13457c81fad8f7fbe7cbef2ab (MD5) Previous issue date: 2001 / Doutorado

Orientador: Claudio Lucio Rossi / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas / Made available in DSpace on 2018-08-03T17:10:10Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Souza_Silmarade_M.pdf: 628754 bytes, checksum: 47779be4a8883bc3cd6f875ae5d3c17d (MD5) Previous issue date: 2003 / Resumo: A infecção causada pelo citomegalovírus humano (HCMV) é geralmente assintomática ou está associada a sintomas clínicos brandos e não específicos em pessoas imunocompetentes. Entretanto, o vírus pode causar doença grave em determinados tipos de pacientes, como crianças com infecção congênita e pessoas com comprometimento do sistema imune. O diagnóstico sorológico da infecção primária recente pelo HCMV é usualmente baseado na detecção de anticorpos específicos da classe IgM, soroconversão e/ou aumento significativo dos títulos de anticorpos específicos IgG. Como a soroconversão e a elevação significativa das concentrações de anticorpos dificilmente são observadas, a detecção de anticorpos IgM tem sido o marcador sorológico mais freqüentemente usado para o diagnóstico da infecção aguda. Entretanto, a baixa especificidade de muitos testes utilizados na pesquisa de IgM anti-HCMV e a persistência desses anticorpos em algumas pessoas durante vários meses, ou mesmo anos, têm gerado diagnósticos incorretos de infecção aguda, causando preocupações desnecessárias, especialmente em mulheres grávidas e em pacientes com comprometimento do sistema imune. Com base na observação que a avidez dos anticorpos aumenta gradualmente após a exposição a um imunógeno, vários trabalhos têm mostrado que a determinação da avidez dos anticorpos IgG pode ser utilizada para identificar infecções recentes e antigas, incluindo a infecção pelo HCMV. No Brasil, os testes comerciais para a determinação da avidez dos anticorpos IgG anti-HCMV, além de muito caros, não estão disponíveis prontamente no mercado. O presente trabalho teve como objetivo desenvolver um teste de avidez imunoenzimático para o HCMV (ELISA HCMV), capaz de distinguir a infecção primária recente da infecção de longa duração. Na idealização do teste, foram considerados parâmetros importantes para laboratórios de rotina, como simplicidade e baixo custo. O teste foi padronizado com o kit comercial ETI-CYTOK G Plus (Sorin Biomedica, Itália), utilizando uréia 8 M para a dissociação dos anticorpos de baixa avidez. Para a validação do teste ELISA HCMV, a sua performance foi comparada com a do teste de avidez comercial automatizado VIDAS CMV IgG (bioMérieux, França), utilizando 24 soros de pacientes com infecção recente primária e 25 soros de pacientes com infecção de longa duração apresentando persistência de anticorpos específicos IgM. Resultados similares foram obtidos com os dois métodos de avidez. Todos os 24 soros de pacientes com infecção recentemente adquirida apresentaram índices de avidez compatíveis com infecção aguda utilizando o teste VIDAS CMV IgG, enquanto que um dos soros apresentou resultado duvidoso no teste ELISA HCMV. Os 25 soros de pacientes com infecção de longa duração apresentaram resultados idênticos com os dois métodos, com apenas um dos soros apresentando um valor não compatível. Estes resultados sugerem que o nosso teste de avidez pode ser potencialmente útil para o imunodiagnóstico da infecção pelo HCMV / Abstract: The infection caused by human cytomegalovirus (HCMV) is generally asymptomatic or is associated with mild non-specific clinical symptoms in immunocompetent subjects. The virus can, however, cause serious illness in congenitally infected infants and in immunocompromised patients. The serological diagnosis of a recently acquired HCMV infection is usually based on the detection of specific IgM antibodies, seroconversion, and/or a four-fold or greater rise in the titre of HCMV-specific IgG antibodies. Since seroconversion and a rise in IgG titres are seldom demonstrable, the detection of HCMV-specific IgM antibodies has been the most frequently used serological marker for diagnosing acute infection. However, the use of tests with a low specificity and the persistence, in some patients, of specific IgM antibodies for a long time have led to the misdiagnosis of acute HCMV infection and unnecessary concern, especially with respect to pregnant women and immunocompromised patients. Based on the observation that antibody avidity gradually increases after exposure to an immunogen, several reports have shown that the avidity of IgG antibodies can be used as a marker for identifying recent primary and long-term infections, including HCMV infections. In Brazil, commercial assays for evaluating the avidity of HCMV-specific IgG are expensive and are not readily available. The aim of this study was to standardize an economical and simple in-house HCMV-enzyme-linked immunosorbent assay avidity test (ELISA HCMV) for distinguishing recent primary from long-term infection. The test was standardized with the commercial kit ETI-CYTOK G Plus (Sorin Biomedica, Italy) using 8 M urea in phosphate-buffered saline to dissociate low-avidity antibodies. To validate the ELISA HCMV test, its performance was compared with that of the commercial automated VIDAS CMV IgG avidity assay (bioMérieux, France), using well-characterized sera from patients with recent primary and long-term HCMV infections. Forty-nine sera, 24 from patients with a recent primary HCMV infection and 25 from patients with a long-term HCMV infection with a sustained persistence of specific IgM antibodies, were tested. Similar results were obtained with the two avidity methods. All sera from the 24 patients with recently acquired infection had avidity indices compatible with acute HCMV infection by the VIDAS test, whereas with the in-house test, one serum sample had an equivocal result. In the 25 sera from patients with long-term infection, identical results were obtained with the two methods, with only one serum sample having an incompatible value. These findings suggest that our in-house avidity test could be a potentially useful tool for the immunodiagnosis of HCMV infection / Mestrado / Ciencias Biomedicas / Mestre em Ciências Médicas

Orientador: Clarice Weis Arns / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-04T11:34:54Z (GMT). No. of bitstreams: 1 D'Arce_ReginaCeliaFreitas_D.pdf: 5035070 bytes, checksum: 70450102e2aa6208d35d5a038918c516 (MD5) Previous issue date: 2004 / Resumo: O presente estudo teve como objetivo o desenvolvimento de técnicas moleculares diferenciais para o diagnóstico do Vírus da Bronquite Infecciosa (VBI), responsável por infecções respiratória e urogenital agudas, altamente contagiosas em frangos e galinhas, e do Pneumovírus Aviário (PVA), agente etiológico da Rinotraqueíte dos Perus e associado à Síndrome da Cabeça Inchada (SCI) em galinhas. Sorotipos do VBI e subtipos do PV A foram cultivados em ovos embrionados e em células CER (Chicken Embryo Related), respectivamente. Foram adaptadas as técnicas de extração do RNA viral, RT -PCR, nested-PCR subtipo-especmco. para o PVA e RT -PCR-RFLP para o VBI a partir dos vírus cultivados, sendo testadas posteriormente em material coletado de aves infectadas experimentalmente. Tanto o PVA como o VBI foram detectados por RT-PCR e/ou nested-PCR nos grupos infectados com os agentes isoladamente ou em co-infecção, principalmente nos dias 3 e 6 pós-inoculação. As técnicas diagnósticas desenvolvidas foram então utilizadas na detecção viral de materiais clínicos, obtidos de plantéis avícolas com histórico de problemas respiratórios e sorologia positiva para os agentes estudados. Para o PVA obteve-se a detecção de oito vírus de campo, todos pertencentes ao subtipo A, donde foi possível o isolamento de quatro amostras. No caso do VBI foram detectadas três amostras de campo, todos diferenciados da amostra vacinal por RFLP, dos quais isolou-se duas amostras em ovos embrionados. Amostras positivas tiveram seus fragmentos de PCR seqüenciados, confirmando a classificação obtida através da nested-PCR para o PVA e do RFLP para o VBI. A análise das seqüências do VBI mostrou que os isolados de campo diferem de todos os sorotipos descritos até o momento. As técnicas molecu1ares otimizadas nesse estudo confinaram sua capacidade em diferenciar os subtipos A e B do PV A, bem como as variantes detectadas de VBI de campo e o sorotipo vacinal, demonstrando ser adequadas alternativas diagnósticas e valiosas ferramentas para estudos de epidemiologia molecular / Abstract: The aim of this study was the development of molecu1ar techniques able to differentiate Infectious Bronchitis Virus (IBV), responsible for high 'contagious acute respiratory and renal infections in chickens, and Avian Pneumovirus (APV), causal agent of Turkey Rhinotracheitis and associated to Swollen head Syndrome (SHS) in chickens. APV and IBV strains, representatives of subtypes A and B and serotype Massachussets, were multiplied in Chicken Embryo Related (CER) cell line and embrionated eggs, respectively. The techniques of RNA extraction, RT -PCR, APV subtype-specific nested-PCR and RT -PCR-RFLP for IBV diagnosis were adapted, and then tested in experimentally infected chickens. Both viruses were detected by RT -PCR and/or nested-PCR in the groups infected with the agents separately or in co-infection, mainly at 3rd end 6th day post infection. Moreover, these techniques were utilised in clinical field samples from chicken and turkey flocks with respiratory problems and positive APV and IBV serology. Eight APV were detected, all of them classified as subtype A, where four samples were isolated. In the case of IBV, three field samples were detected, originating two viral isolation, all different from vaccine serotype by RFLP. The PCR products were sequenced, confirming the APV nested-PCR and IBV RFLP classification. IBV sequence analysis showed that the Brazilian field samples detected in this study are distinct from all serotype described 50 far. These optimised techniques could be useful to direct differentiation of APV subtypes A and B, and IBV field and vaccine strains, proving to be a valuable molecular epidemiological tool / Doutorado / Microbiologia / Doutor em Genetica e Biologia Molecular

Orientador: Antonio Fernandes Pestana de Castro / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-07-13T23:19:32Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Arita_GoncalaMariaMartins_M.pdf: 9310353 bytes, checksum: f2ade0de335e487237939e6bbb772414 (MD5) Previous issue date: 1990 / Resumo: No presente estudo o virus da lingua azul-sorotipo 4 (VLA-S4) adaptado às linhagens celulares BHK-21, clone 13 e VERO apresentou efeito citopático característico entre 72 e 96h pos-inoculação, com títulos que variaram entre 10 'POT. 3.6¿ a 10 'POT. 5.6¿ DICC 50%/ml. A partir do sedimento das células infectadas as partículas virais foram purificadas em ultracentrifugações em gradiente de CsCI, e apresentavam densidade de cerca de 1,38 g/cm 'POT. 3¿. Ao microscópio eletrônico foram visualizadas partículas com forma aproximadamente esférica e diâmetro médio de 54,99 '+ ou ¿' 0,12 nm, correspondentes ao virion e de 49,68 '+ ou ¿' 0,08 nm, ao nucleocapsideo. O perfil eletroforético do ARN do VLA-S4 mostrou a presença de dez segmentos com valores de PM 2,92 x 10 'POT. 6¿ d (segmento 1) e 0,49 X 10 'POT. 6¿ d (segmento 10) e o das proteínas, as sete proteínas estruturais -VP1 a VP7- com PM variando de 103,69 x 10 'POT. 3¿ d (VP1) a 30,24 x 10 'POT. 3¿ d ( VP7 ) . O antígeno solúvel (AS), produzido a partir do sobrenadante de culturas de células VERO infectadas pelo VLA e concentrado por ultrafiltração sequencial em membranas com CNL de 10.000 e 25.000, apresentou em teste de identidade com os antígenos do NADC e comercial (COM), uma única linha de precipitação, nítida e confluente. Na análise do perfil eletroforético dos três antígenos observou-se um padrão muito semelhante, o que sugere que as três preparações antigênicas contém proteínas semelhantes. A avaliação semi-quantitativa deste antígeno em imunodifusão radial simples apresentou uma potência relativa 127 ligeiramente superior à do NADC e igual à do COM, e na titulação em bloco por imunodifusão dupla. titulo de uso 1/2, evidenciando-se que o AS poderia ser utilizado em provas rotineiras de 1DGA. para o diagnóstico soro lógico da LA. O componente protéico do AS, principal responsável pela linha de precipitação em 1DGA, apresentou PM 60,00 x 10 'POT. 3' d, sugerindo tratar-se, provavelmente, da proteína NS1 (P5a) ou da VP5. A imunofluorescência indireta (IF1), executada em células VERO adicionadas de soros e conjugados anti-1gG de bovinos ou de ovinos, apresentou fluorescência intracitoplasmática, com aspecto granular, e em algumas células foi observada apenas na membrana celular. Foram testadas 190 amostras de soros sanguíneos de bovinos e 72 de ovinos, pelas técnicas de IDGA e 1FI. Em IDGA obteve-se um total de 134 amostras positivas e 128 amostras negativas, enquanto que em 1FI observou-se 137 amostras positivas e 125 negativas. A análise estatística destes dados registrou uma alta concordância para os soros de bovinos e para os soros de ovinos, entre as duas técnicas. Em 1FI encontrou-se alta sensibilidade, especificidade e valores preditivos dos resultados positivos e dos resultados negativos, em comparação com a IDGA. o que nos permite afirmar que as duas técnicas podem ser utilizadas na rotina laboratorial como instrumento para uma avaliação real da situação epidemiológica da LA no nosso meio. A 1FI oferece a vantagem adicional da possibilidade de ser utilizada para detecção de antígenos virais em cultivos celulares inoculados pelo VLA / Abstract: In the present study a strain of Bluetongue virus, serotype 4 (BTV-S4), when adapted to BHK 21, clone 13 and to VERO cell lines has shown a distinctive cytophatic effect between 72 h and 96 h after inoculation, with titres ranging from 10 'POT. 3.6¿ to 10 'POT. 3.6¿ DICT 50%/ml. After a high speed centrifugation of the packed infected cells the viral particles were purified by ultracentrifugation using CsCIgradient, showing density around 1.38 g/cm 'POT. 3¿. In the electron microscope, two types of spherical particles were observed one with a mean diameter of 54.99 ' + ou ¿' 0,12 run corresponding to the virion and the other of 49.68 ' + ou ¿' 0,08 nm, corresponding to the nucleocapsid. The electrophoretic profiles of the RNAextracted from BTV-S4 showed ten segments with MW between 2.96 x 10 'POT. 6¿ d (segment 1) to 0.49 X 10 'POT. 6¿ d (aegment 10). With regard to the atructural proteina, the MW a180 varied from 103.69 X 10 'POT. 3¿ d (VP1) to 30.24 x 10 'POT. 3¿ d (VP7). The aoluble antigen (SA) produced from culture supernatanta of BTV-infected VERO cells and concentrated by aequential ultrafiltration with membranes with cut-off values 10.000 and 25.000, when compared with the antigens produced by by the agar gel the NADC and commercially, showed total identity immunodiffusion (AGID) test forming a nitid and confluent precipitation line without any spur. The electrophoretic protein profile of the 3 antigens was quite ainÜlar suggesting an identical antigen preparation. A semiquantitative evaluation of thia antigen by aingle radial immune diffusion test showed a relative potency slightly higher than the NADC and equal to the commercial one. Furthermore checking block titration revealed that routine dilution of this antigen to be used in AG1D for the serological diagnosis of BT should be 1/2. The proteie eomponent of the AS. main responsible for the IDGA reaction, showed a MW around 60.00 x 10 'POT. 3¿ d suggesting that this might be, probably, the NS1 (P5a) protein or the VP5. The indireet immunofluorescent technique (IIFT) carried out with BTVinfected VERO cells using bovine and ovine sera and anti-1gG conjugates showed a granular intracytoplasmatie fluorescenee and in some cells this fluorescence was observed only on cellular membranes. Sera from 190 bovine and 72 ovine were examined by AG1D and 11FT. In the AG1D 134 samples were positive for BTV antibodies and 128 were negative, whereas in the 11FT 137 sera were positive for BTV antibodies and 125 were negative. Statistical analysis of these data showed close agreement between the two techniques, regardless of the kind of sera examined. 1n the 11FT, high sensitivity, specificity and predictable values for positive and negative results were found compared with the 1DGA, which means, that both techniques can routinely be used in epidemiologic evaluation studies of BT in our country. The 11FT offers an additional advantage as it may be used to detect viral antigens in BT-infected cell lines / Mestrado / Microbiologia / Mestre em Ciências Biológicas

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:26:04Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2009-02-09Bitstream added on 2014-06-13T19:53:58Z : No. of bitstreams: 1 rubio_ml_me_sjrp.pdf: 553575 bytes, checksum: e63be6b1c41d36a603fd12ca20a88442 (MD5) / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / Fundação para o Desenvolvimento da UNESP (FUNDUNESP) / Paramyxoviridae, é um vírus envelopado com tamanho médio de 120 a 300nm, de simetria helicoidal, que apresenta um genoma de RNA fita simples não segmentado de polaridade negativa. Este genoma codifica 11 proteínas, dentre as quais as glicoproteínas de membrana que são responsáveis pela infectividade do vírus. A proteína F, em associação com a proteína G e SH, é responsável pela fusão da membrana viral à célula que será infectada, ou seja, esta proteína proporciona a entrada e instalação do vírus na célula. Conhecer a forma de interação das proteínas da membrana viral com a célula que será infectada é importante para propor um mecanismo de inibição deste processo de infecção viral. Existem evidências que os glicosaminoglicanos são potenciais inibidores da infecção causada por vários vírus. A hipótese é de que este processo de inibição ocorra devido à ligação dos glicosaminoglicanos às proteínas da membrana viral, mais especificamente na proteína G, que apresenta um domínio de ligação para heparina, impedindo desta forma, que o vírus se ligue na célula hospedeira e que inicie o processo de infecção. O objetivo deste trabalho foi verificar a atuação de glicosaminoglicanos como potenciais inibidores da infecção viral. Esta análise foi realizada por meio de experimento de cultivo de células Hep2 na presença dos glicosaminoglicanos heparina e dextrana sulfatada que foram inoculadas com o vírus sincicial respiratório do tipo A (RSVA) e analisados por meio das técnicas de PCR e Imunofluorescência Indireta. Os resultados mostraram que a heparina e a dextrana sulfatada apresentam efeito inibitório da infecção viral em cultivo de células Hep2. / The respiratory sincicial virus (RSV) is part of Pneumovirus genus of the Paramyxoviridae family, is an enveloped virus with average size of 120 to 300nm, helical symmetry, that presents a genome consisting of a single strand, no segmented, RNA negative. This genome codifies for 11 proteins including the membrane glycoproteins which are responsible for the infectivity of the virus. Protein F in association with protein G and SH is responsible for the fusion of the viral membrane with the cell that will be infected, that is, this protein provides the entrance and the virus to settle in the cell. To know the form of interaction of viral membrane proteins with the cell that will be infected is important to propose a mechanism to inhibit of this process of viral infection. Evidences exist that the glycosaminoglycans are potential inhibitors of the infection caused by some viruses. The hypothesis is that this process of inhibition occurs more specifically due to the interation between glycosaminoglycans and the proteins of the viral membrane, more specifically in protein G, that presents a domain of linking for heparin, avoiding the virus to bind to the host cell and initiating the infection process. The aim of this work was to verify the performance of glycosaminoglycans as inhibitors of the viral infection. This analysis was accomplished through experiments of Hep2 cell culture in the presence of these glycosaminoglycans (heparin and dextran sulfate) that was inoculated with the respiratory sincicial virus type A (RSVA) and analyzed through the technique of PCR and Indirect Imunofluorecence. The results had shown that the heparin and the dextran sulfate presented an inhibitory effect of the viral infection in Hep2 cells culture.

Doenças infecciosas veiculadas pela água são causa comum de enfermidades em seres humanos no mundo inteiro. Dentre os patógenos causadores destas doenças, os vírus merecem destaque, pois possuem a capacidade de sobreviver em ambientes aquáticos e de permanecer infectantes por meses. A avaliação da balneabilidade das águas brasileiras é monitorada através da densidade de coliformes termotolerantes (CT), classificando as águas de recreação em próprias ou impróprias. Este trabalho tem como objetivo detectar e quantificar genomas de Adenovirus (AdV) e Enterovirus (EV) em amostras de água das praias de Ipanema e do Lami em Porto Alegre – RS e avaliar as condições de balneabilidade através da quantificação de CT. A metodologia utilizada foi reação em cadeia da polimerase em tempo real (qPCR) para os vírus e o método de tubos múltiplos para quantificação de CT. Entre os meses de novembro de 2011 e abril de 2012, foram coletadas 36 amostras de água: 18 amostras de Ipanema e 18 da praia do Lami. Em 30 (83,3%) das 36 amostras coletadas foi detectada a presença de genomas virais. Genoma de AdV foi detectado em 28 (77,8%) amostras, enquanto de EV foi detectado apenas em 8 amostras (22,2%). Em contraste com as baixas concentrações de CT, a pesquisa de AdV e EV demonstrou alta positividade (83,3%), o que demonstra a baixa correlação entre os micro-organismos utilizados como marcadores fecais e a presença de genomas virais em amostras de água. / Waterborne diseases are a common cause of illness in humans worldwide. Among the pathogens causing these diseases, the viruses are noteworthy because they have the ability to survive in aquatic environments and remain infective for months. In Brazil the evaluation of recreational waters is made by monitoring the density of fecal coliform (FC), classifying recreational waters in appropriate or inappropriate. This work aims to detect and quantify genomes of Adenovirus (AdV) and Enterovirus (EV) in water samples from Ipanema and Lami beaches in Porto Alegre - RS and assess the conditions of bathing by quantifying FC. The methodology used was real time polymerase chain reaction (qPCR) for virus and multiple tube technique for FC. Between the months of November 2011 and April 2012 were collected 36 water samples: 18 samples in Ipanema and 18 in Lami. In 30 (83.3%) of the 36 samples the presence of viral genomes was detected. AdV genome was detected in 28 (77.8%) samples, while the EV was only detected in 8 samples (22.2%). In contrast to the low concentrations of FC, research of EV and AdV showed a high positivity (83.3%), which demonstrates the low correlation between micro-organisms used as fecal markers and the presence of viral genomes in water samples.

Orientador: João Manuel Grisi Candeias / Resumo: Foram estudadas 112 gestantes atendidas no Ambulatório de Infecções Genitais (AIG) do Hospital das Clínicas, UNESP, Botucatu, no período de março de 2001 a julho de 2005. Todas as gestantes apresentavam lesões genitais sugestivas, pela patologia, de doença HPV induzida. Para essas lesões foi avaliado o local da coleta das mesmas e a presença do vírus HPV e da bactéria Chlamydia trachomatis. Nessas pacientes também se analisou a idade, o estado civil, o uso de anticoncepcional, infecções genitais e a paridade. Ambos os agentes causam problemas na gestação, tais como baixo peso aos nascer e parto prematuro. Casuística e Métodos: As pesquisas tanto de HPV como de Chlamydia t0rachomatis foram realizadas através de PCR utilizando-se, respectivamente, os primers GP5+ e GP6+ e PCT1 e PCT2. Os HPV's foram tipados por sequenciamento. Resultados: A positividade de HPV foi de 79,31%. Com relação aos tipos os mais encontrados foram o 6 e o 18. Para a Chlamydia a positividade foi de 15,8%. Conclusão: Os dados encontrados em nosso estudo são compatíveis com os encontrados na literatura em todo o mundo, demonstrando que, mesmo em países desenvolvidos, a taxa de mulheres contaminadas com HPV é muito alta. Com relação à Chlamydia, os dados também são compatíveis com os da literatura mostrando associação clara entre a presença dos dois agentes e problemas gestacionais. / Abstract: Not available. / Mestre

As doenças respiratórias são bastante comuns na avicultura industrial, entre as quais a bronquite infecciosa das galinhas (BIG) é uma doença de importância econômica. A doença é causada pelo vírus da bronquite infecciosa (VBI) e gera grandes perdas em todas as etapas do processo de produção de aves, seja em frangos de corte, reprodutores e/ou poedeiras. Além do quadro respiratório, o VBI pode se apresentar de outras formas clínicas. As diferentes cepas do vírus possuem tropismo diferenciado pelos sistemas digestório, reprodutivo e urinário. Diversos dados recentes de caracterização genética do vírus no país demonstram a ocorrência de um único genótipo variante no Brasil (BR-I), além do genótipo vacinal Massachusetts (Mass). No entanto, pouco se sabe sobre a frequência e distribuição tecidual destas variantes nos plantéis brasileiros. A presente dissertação é composta por dois artigos científicos sobre este tema. O objetivo do primeiro trabalho foi avaliar os genótipos de ocorrência em lotes de comercialização industrial no país. Para isso, foram obtidas amostras de lotes da Região Sul, Sudeste, Centro-Oeste e Nordeste do país. A caracterização foi realizada a partir do sequenciamento parcial do gene S de 49 amostras que foram comparadas com sequências de referência do GenBank e de isolados de campo do país. Onze amostras (22,4%) foram filogeneticamente similares ao genótipo vacinal Mass e 34 amostras (69,4%) agruparam com o genótipo brasileiro, previamente descrito, denominado BR-I. No entanto, quatro amostras (8,2%) formaram um novo grupo, denominado BR-II. Estes resultados demonstram a maior ocorrência do genótipo variante de campo tipicamente brasileiro. O segundo trabalho teve por objetivo determinar a frequência do VBI em diferentes regiões do país, além de determinar a frequência dos genótipos brasileiros em duas categorias de aves (frangos de corte e matrizes), de diferentes idades e nos diferentes sistemas fisiológicos infectados pelo VBI. Para isso, foram obtidos pools de órgãos de 198 lotes de frangos e 234 lotes de matrizes com sinais clínicos de BIG, das regiões Sul, Centro-Oeste e Nordeste do país. A detecção do VBI foi realizada por real time RT-PCR (qRT-PCR) da região 5’ UTR e a determinação dos genótipos por sequenciamento parcial do gene S1. Os resultados demonstraram frequência similar do VBI nas granjas das diferentes regiões do país, com índice maior em frangos de corte (média de 54%) do que em matrizes (média de 30,8%). O VBI foi detectado em aves de todas as idades, no entanto, o genótipo Mass foi mais frequentemente encontrado em frangos de até quatro semanas de idade, em frangos com idade próxima ao abate (> 4semanas) e matrizes houve o predomínio do genótipo BR. O sistema com maior frequência de detecção do VBI, em matrizes, foi o digestório (40%), com diferença significativa. Em frangos, a frequência de detecção nos sistemas digestório (43,5%) e respiratório (37,7%) não apresentou diferença significativa. Estes resultados demonstram a alta frequência dos genótipos brasileiros nos plantéis, sendo encontrados principalmente nos órgãos do sistema digestivo. / Infectious bronchitis (IB) is one of the most important respiratory diseases in the poultry industry. The agent, infectious bronchitis virus (IBV), generates losses in all stages of the poultry production (broilers, breeders and/or layers). Besides respiratory signs, IBV may present other different clinical forms: digestive, reproductive and urinary. IBV presents also a high genetic diversity among strains in different poultry-producing regions of the world. Recent studies demonstrate a large dissemination of local variant strains in Brazil (genotype BR-I), but the vaccine genotype Massachusetts (Mass) is also frequently found in poultry flocks. The present Masters Dissertation has two scientific articles on this topic. The aim of the first study was to evaluate the genotypes occurring in industrial poultry production flocks in Brazil. Samples of poultry flocks were obtained from different regions (South, Southeast, Midwest and Northeast). Molecular characterization was performed by partial sequencing of the S gene and comparison with reference (obtained in Genbank database) and field isolates sequences. Eleven samples (22.4%) were phylogenetically similar to Mass vaccine genotype and 34 samples (69.4%) grouped with the BR-I genotype. However, four samples (8.2%) originated a new group, denominated BR-II. These results demonstrate a high prevalence of the variant genotype BR-I in Brazil and the emergence of the novel BR-II genotype in the Midwest region. The second study aimed to determine the occurrence of IBV in different regions of the country and to evaluate the viral frequency in two poultry production types of birds (broilers and breeders), in different ages and in different physiological systems. Organs pools were collected from 198 broilers and 234 breeder flocks with IB clinical signs and from the three different Brazilian geographic regions: South, Midwest and Northeast. IBV detection was carried out by real time RT-PCR (qRT-PCR) of the 5' untranslated region and genotyping by partial sequencing of the S1 gene. The results showed similar IBV frequency on farms of different regions of the country with a higher rate in broilers (average 54%) than in breeders (mean 30.8%). IBV was detected in birds of all ages. Mass genotype was more often found in chickens up to four weeks of age, while BR genotypes were more frequent in broilers next to slaughter age and in all ages of breeders. The system with highest frequency of IBV was the digestive (40%) in breeders. In broilers, the frequency of detection in the digestive (43.5%) and respiratory (37.7%) systems showed no significant difference. These results demonstrate the high frequency of the Brazilian genotypes in the flocks, being found mainly in the organs of the digestive system.