Der induzierbare Kostimulator ICOS ist ein zu CD28 strukturell und funktionell verwandtes Molekül, das eine wichtige regulatorische Rolle bei der T-Zelleffektorfunktion spielt. Eine ICOS-Defizienz beim Mensch manifestiert sich in einer schweren Störung des humoralen Immunsystems. Eine murine ICOS-Defizienz führt ebenfalls zu einer Beeinträchtigung der T-Zell-abhängigen humoralen Immunantwort, bei der kleinere oder komplett fehlende Keimzentren zu beobachten sind. Vielfältige in vitro und in vivo Studien führten diese Phänomene auf die beeinträchtigte Regulation von Kommunikationsmolekülen der Zelloberfläche und der Zytokinexpression durch ICOS-defiziente T-Zellen zurück. Ein Ziel dieser Arbeit war es, mit Hilfe von ICOS KO Mäusen den Einfluss von ICOS auf die B-Zellentwicklung genauer zu untersuchen. Dabei konnte gezeigt werden, dass ICOS erst in der späten Phase der B-Zellentwicklung eine Rolle spielt, da der Interaktionspartner von ICOS erst auf transitionellen B-Zellen der Milz exprimiert wird. Durch die Etablierung eines in vivo adoptiven T-B Transfermodells konnte die Rolle von ICOS erstmalig bei der T-B Kooperation in den frühen Phasen der Immunantwort auf der Ebene Antigen-spezifischer T- und B-Zellen aufgeklärt werden. Dabei konnte beobachtet werden, dass eine ICOS-Defizienz einen dramatischen Einfluss auf die B-Zellexpansion und B-Zellproliferation hat. Zum ersten Mal konnte in vivo gezeigt werden, dass ICOS bei der T-B Kooperation eine entscheidende Rolle bei der Regulation diverser Oberflächenmarker der B-Zellen spielt, wodurch die B-Zellaktivierung, B-Zellproliferation und B-Zelldifferenzierung bei der Keimzentrums- und Plasmazellreaktion beeinflusst werden. Histologische Analysen zeigten, dass bei einer ICOS-Defizienz follikuläre T-Helferzellen nicht in die Keimzentrumsumgebung einwandern und daher keine T-Zellhilfe für die B-Zellen anbieten können. Dadurch kann die Keimzentrumsreaktion nicht weiter aufrechterhalten werden und eine Ausbildung von kleineren Keimzentren ist die Folge. Weiterhin konnte beobachtet werden, dass eine fehlende ICOS-Interaktion zwischen T- und B-Zellen zu einer Störung der Plasmazellgenerierung führt, wodurch auch die Mengen an messbaren Serumimmunglobulinen beeinflusst werden. Eine erhöhte Gabe von ICOS-defizienten T-Zellen kann diese Effekte nicht vollständig ausgleichen. Daher ist erkennbar, dass ICOS eine Vielzahl von zusätzlichen Faktoren beeinflusst, die für die ICOS-abhängigen B-Zelleffekte verantwortlich sind. / The inducible costimulator ICOS, structural and functional similar to CD28, plays an important regulatory role in T cell receptor function. The ICOS deficiency in humans is described as a severe dysfunction of the humoral immune response, resulting in dramatic reduced B cell numbers and impaired antibody response against pathogens. The murine ICOS-deficiency also leads to a disturbed T cell dependent immune response resulting in a reduced germinal center formation. Various in vitro and in vivo studies attributes this phenomenon to impaired upregulation of cell surface communication molecules and cytokine synthesis by ICOS-deficient T cells. In this work the investigations with ICOS KO mice should clarify the impact of ICOS in B cell development. As observed, ICOS can only play a role in the late phase B cell development, because the interaction partner is expressed on transitional B cells in the spleen. The establishment of an in vivo adoptive T-B transfer system could determine for the first time the role of ICOS in T-B cooperation in early immune response stages on antigen specific T and B cell levels. As shown, ICOS deficiency influences in a dramatic extend the B cell expansion and B cell proliferation. For the first time in vivo, we could demonstrate that ICOS plays a significant role by influencing the regulation of various B cell surface markers, which affects the B cell activation, B cell proliferation and B differentiation in germinal center or plasma cell reaction. Histological investigations revealed in the ICOS-deficiency that follicular T helper cells could not migrate into the germinal center microenvironment and therefore could not provide T cell help for B cells. As a result, the germinal center reaction could not maintained and therefore the formation of little germinal centers occurred. The missing interaction between T and B cells leads to a dysfunction in plasma cell generation and also influences the detectable amounts of serum immunglobulines. An administration of higher ICOS KO T cell numbers could not fully compensate these effects. Therefore, ICOS bias multitudes of additional factors, which are responsible for the ICOS dependent B cell effects.

Langlebige Gedächtnis-CD4 T Lymphozyten spielen eine entscheidende Rolle für die Bildung, Erhaltung und Reaktivierung anderer Gedächtnislymphozyten. Im Verlauf einer Immunreaktion wandern einige antigen-erfahrene CD4 T Zellen aus den sekundär lymphoiden Organen (SLO) ins Knochenmark (KM), wo sie als professionelle Gedächtnis-CD4 T Zellen ruhen und überdauern. Es ist jedoch weitgehend unverstanden wie die Vorläuferzellen in SLO gebildet werden. Der erste Teil dieser Arbeit identifiziert aktivierte CD49b+T-bet+/CXCR3+ CD4 T Zellen der Milz als Vorläuferzellen von KM-Gedächtnis-CD4 T Zellen. Der zweite Teil der Arbeit zeigt, dass die Vorläuferzellen nach einer verstärkten Zellproliferation und längerer kognitiver Interaktion mit dendritischen Zellen während der späten Aktivierungsphase der primären Immunantwort entstehen. Die Behandlung mit einem Zytostatikum oder die späte Blockade des kostimulatorischen CD28/B7-Signalweges verhindert wiederum deren Generierung. Fluoreszenzfarbstoffmarkierungsexperimente zeigen, dass mit zunehmender Zellteilung die Expression des Chemokinrezeptors CCR7 in den Vorläuferzellen verringert ist und die Expression des Zytokinrezeptors IL-2Rb erhöht ist. CCR7 ist für die Persistenz in der T-Zellzone von SLO entscheidend, sowie IL-2Rb für das langfristige Überleben der Zellen. Der dritte Teil dieser Arbeit untersucht die Rolle von B Zellen für die Etablierung des CD4 T-Zellgedächtnisses im KM. B Zellen wirken sich in der frühen Phase einer Immunantwort negativ auf die Akkumulation von Gedächtnis CD4 T Vorläuferzellen im KM aus, beeinflussen jedoch nicht die Proliferation von aktivierten CD4 T Zellen in der Milz während der Aktivierungsphase. Die Ergebnisse dieser Arbeit liefern neue Einblicke in die Generierung von Gedächtnis CD4 T Zellen des KM, die für neue Ansätze zur therapeutischen Stärkung des Immungedächtnisses im Rahmen von Impfungen oder dessen Ablation bei Autoimmunerkrankungen beitragen können. / Long-lived memory CD4 T lymphocytes play a crucial role in the generation, maintenance and reactivation of other memory lymphocytes. During an immune reaction, some antigen-experienced CD4 T cells relocate from secondary lymphoid organs (SLOs) to the bone marrow (BM) and reside and rest there as professional memory CD4 T cells. However, it remains elusive how the precursors of BM memory CD4 T cells are generated in SLOs. The first part of this thesis identifies splenic CD49b+T-bet+/CXCR3+ activated CD4 T cells as the precursors of BM memory CD4 T cells. The second part of this thesis describes that precursors of BM memory CD4 T cells are generated following enhanced cell proliferation and prolonged cognate interactions with dendritic cells (DCs) during the late activation phase of a primary immune response. Treatment with a cytostatic drug or blockage of the CD28/B7 costimulatory pathway in the late activation phase in turn abrogates the generation of precursors of BM memory CD4 T cells. Fluorescent-dye labeling experiments demonstrate that the more CD49b+CXCR3+ activated CD4 T cells divide, the more they lose the expression of CCR7, a chemokine receptor crucial for the persistence in the T cell zone of SLOs, and gain the expression of IL-2Rb, a cytokine receptor crucial for long-term survival. The third part of this thesis investigates the role of B cells for the establishment of resting CD4 T cell memory in the BM. B cells negatively impact the accumulation of memory CD4 T cell precursors in the BM during the early phase of an immune response but do not affect the cell division of activated CD4 T cells in the spleen during the activation phase. In sum, the results obtained in this thesis provide new insight into the generation of BM memory CD4 T cells that may help for the therapeutic strengthening of immune memory in the context of vaccination or its abolishment within the scope of autoimmune diseases.

Es stellt sich die Frage, wie diese Zellen im entzündeten Gewebe überleben können und wie sie ihren Stoffwechsel an die dortigen Bedingungen anpassen. Diese Arbeit beschreibt am Beispiel der Juvenilen Idiopathischen Arthritis (JIA) die Analyse des Stoffwechsels von CD4+ T Lymphozyten, die chronische Entzündungen antreiben undim entzündeten Gewebe lange Zeit persistieren. Pathogene CD4+ CD45RO+ PD1+ CXCR5-T Zellen wurden hierfür aus Synovialflüssigkeit von Patienten mit JIA isoliert und gezeigt, dass auch bei diesen Zellen der Stoffwechsel auf Fettsäureoxidation beruht. Wurde die Fettsäureoxidation durch Etomoxir blockiert, starben die Zellen. Die Störung des Stoffwechsels dieser Zellen könnte somit eine Option für einen neuen Therapieansatzdarstellen. Zusätzlich war die Expression des Transkriptionsfaktors Twist 1 in diesen CD4+CD45RO+ PD1+ CXCR5- T Zellen hochreguliert. Twist 1 ist ein Marker für T Lymphozyten, die in entzündetem Gewebe von Patienten mit chronisch-entzündlichen Erkrankungen der Gelenke oder des Darmes persistieren. Untersuchung in vitro ergaben außerdem, dass Twist 1 spezifisch von Th1 Lymphozyten exprimiert wird, die mehrfach restimuliert wurden. Dieser Transkriptionsfaktor wirkt einerseits der Gewebszerstörung, die von T Zellen verursacht wird, entgegen, und unterstützt anderseits die Persistenz der Zellen im Gewebe durch die Induktion der microRNA148a, die die Expression des pro-apoptotischen Proteins Bim reguliert. In dieser Arbeit zeigen wir dessen Einfluss auf die Regulation des Metabolismus von CD4+ T Lymphozyten bei chronischen Entzündungen. Dabei wird die Glycolyse verringert und vermehrt Fettsäuren synthetisiert, um die Zellen vor reaktiven oxidierenden Spezies (ROS) zu schützen. Zusätzlich konnten wir nachweisen, dass mehrfach re-stimulierte, Twist-defizienteTh1 Zellen unfähig sind, durch Fettsäureoxydation zu überleben, sondern den Stoffwechsel auf Lipid- Peroxidierung umstellen / How do CD4+ T cells adapt their metabolism for survival in the inflamed tissue? This thesis describes analysis of the metabolism of CD4 T lymphocytes driving chronic inflammation and persisting at the site of inflammation, exemplified by cells that reside in the inflamed tissue of patients with the rheumatic disease juvenile idiopathic arthritis. To specifically take aim at the CD4+ T lymphocytes persisting at the site of inflammation, it is important to determine how these cells adapt their metabolism. We show that pathogenic CD4+ CD45RO+ PD1+ CXCR5- T cells that were isolated from the synovial fluid of patients with juvenile idiopathic arthritis are dependent on a fatty acid oxidation for survival ex vivo. Their survival can be blocked by blocking FAO with Etomoxir, pointing to the option of targeting such cells by metabolic interference. Furthermore, CD4+ CD45RO+ PD1+ CXCR5- T cells had upregulated expression of Twist1, a hallmark transcription factor of T lymphocytes persisting in the inflamed tissues of patients with chronic-inflammatory diseases of joints or the gut. Expression of Twist1 is specific for Th1 lymphocytes which have repeatedly been re-stimulated in vitro, or isolated from inflamed. This transcription factor dampens immunopathology caused by the T cells and supports their persistence, by inducing microRNA148a, which regulates expression of the proapoptotic protein Bim. This thesis shows, through conditional genetic inactivation of Twist1 in CD4+ T lymphocytes, that Twist1 regulates the metabolism ofCD4 T lymphocytes of chronic inflammation, by downregulating glycolysis, promoting fatty acid synthesis and protecting the cells from ROS. Additionally, we show that Twist1 deficient repeatedly reactivated murine Th1 cells are unable to survive on fatty acid oxidation and have increased levels of lipid peroxidation.

Verstärkte Anstrengungen zur Förderung der T-Zell-basierten Immunität haben eine zwingende Notwendigkeit für unser Verständnis der menschlichen T-Zell-Funktion und –Erhaltung geschaffen. Das Paradigma, dass Gedächtnis-T-Lymphozyten kontinuierlich durch den Körper zirkulieren wurde vor kurzem durch die Entdeckung der Gedächtnis-T-Zellen, die in einer Vielzahl von Geweben, einschließlich des Knochenmarks angesiedelt sind, herausgefordert. Allerdings bleibt der Unterschied zwischen Funktionsweise von zirkulierenden und gewebeansässigen Gedächtnis-T-Zellen nur unzulänglich verstanden. Die Knochenmark ist die Heimat für eine große Anzahl Gedächtnis-T-Zellen. CD4+ Gedächtnis-T-Zellen aus dem Knochenmark beinhalten ein breites Spektrum an Antigenspezifitäten. Interessanterweise wurden CD4+ Gedächtnis-T-Zellen spezifisch für systemische Kindheitsantigene im Knochenmark von älteren Menschen gefunden, auch wenn sie nicht mehr in der Blutzirkulation nachgewiesen werden konnten. Gedächtnis-T-Zellen aus dem Knochenmark sind sesshaft und ruhend und Langzeitgedächtnis gegen systemische Antigene erhalten. Sowohl der Überlebensmechanismus von Gedächtnis-T-Zellen, als auch die Kapazität von gewebsansässigen Gedächtnis-T-Zellen nach einer systemischen Herausforderung mobilisiert zu werden, sind bisher nur unzureichend geklärt. Ich habe gezeigt, dass Gedächtnis-T-Zellen aus dem peripheren Blut und Knochenmark unterschiedliche Überlebensfähigkeiten haben. Weiterhin habe ich die Rolle von Überleben Faktoren in ihrer Erhaltung identifiziert. Zudem habe ich bestimmt, dass Gedächtnis-T-Zellen aus dem Blut und Knochenmark unterschiedliche Zellpopulationen sind, mit unterschiedliche TCRβ Repertoires. Schließlich konnte ich zeigen, dass sesshafte Gedächtnis-T-Zellen, die spezifisch für systemische Antigene sind, schnell in die Blutzirkulation mobilisiert werden. Zusammenfassend bieten diese Studien ein umfassenderes Verständnis der Funktion und des Erhalts des immunologischen Gedächtnisses. / Intensified efforts to promote protective T cell-based immunity in vaccines and immunotherapies have created a compelling need to expand our understanding of human T cell function and maintenance. The paradigm that memory T lymphocytes are continuously circulating through the body in search of their cognate antigen has been recently challenged by the discovery of memory T cells residing in a variety of tissues, including the bone marrow (BM). However, the division of labor and lifestyle of circulating versus tissue resident memory T cells remains poorly understood. The human BM is home to a great number of memory T cells. BM memory CD4+ T cells contain a wide array of antigen specificities. Interestingly, memory CD4+ T cells specific for systemic childhood antigens have been found in the BM of elderly humans, even when they were no longer detectable in peripheral blood (PB) circulation. BM memory T cells are resident, resting and maintain long-term memory to systemic antigens. The survival mechanisms of circulating and BM resident memory T cells; as well as the capacities of tissue resident memory T cells to be mobilized into blood circulation after systemic antigen re-challenge to confer us with immune protection remains to be elucidated. I have shown that PB and BM memory T cells have different survival capacities, as well as identified the role of survival factors in their maintenance. Moreover, using sequencing analysis of the TCRβ repertoire, I have determined that PB and BM memory T cells are separated cell populations. Finally, by tracking the dynamics of antigen-specific memory CD4+ T cells after systemic MMR re-vaccination I could show that TRM CD4+ T cells specific for systemic antigens can be rapidly mobilized into blood circulation and contribute to the immune response. These studies provide a more comprehensive understanding of the function and maintenance of immunological memory in humans.

T Zellen können in zwei Hauptpopulationen mit unterschiedlichen Aufgaben unterschieden werden. CD4+ T Zellen exprimieren im Zuge ihrer Aktivierung CD40L, welches ein zentraler kostimulatorischer Rezeptor zur Induktion von B-Zell basierter humoraler Immunität, APC Aktivierung und einer effizienten Effektor CD8+ T Zell Entwicklung ist („Helfer-Funktion“). Im Gegensatz dazu sind die zytotoxischen CD8+ T Zellen dazu vorbestimmt, infizierte oder maligne Zellen direkt abzutöten. Jedoch wurde eine Fraktion von CD8+ T Zellen identifiziert, die nach Aktivierung CD40L exprimiert. Bisher ist nicht verstanden, wie in solchen CD8+ T Zellen a) die CD40L Expression reguliert ist, b) wann und wie die Fähigkeit CD40L zu exprimieren implementiert wird und c) was die Folgen für das Immunsystem sind. In dieser Arbeit konnten wir zeigen, dass sowohl in CD4+ als auch in CD8+ T Zellen die CD40L Expression durch DNA-Methylierung regulatorischer Regionen des CD40LG Lokus reguliert wird. Die Demethylierung zentraler Elemente wird im Thymus implementiert, manifestiert sich mit der T-Zell Reifung und geht mit einer zunehmenden Stabilität der CD40L Expression einher. Erhöhte Expression von CD5 und NUR77 in CD40L+ CD8+ SP Thymozyten weisen auf eine positive Selektion mit hoher Affinität gegen Selbst-peptide während der Reifung im Thymus hin, welche das weitere Schicksal der CD40L exprimierenden CD8+ T Zellen beeinflusst. Naive CD40L+ CD8+ T Zellen besitzen ein anderes TCR Repertoire als CD40L- CD8+ T Zellen und reifen im Zuge ihrer Aktivierung bevorzugt zu Gedächtniszellen mit Zytokin- und Chemokinrezeptorprofilen von Tc2, Tc17 und Tc22 Zellen heran. Mit ihrem nicht-zytotoxischen Phänotyp und ihrer Genexpressionsignatur ähneln diese Zellen stark Helfer-CD4+ T Zellen und können von den klassisch zytotoxischen Tc1 und Tc17+1 Zellen durch ihre IL-6R und fehlende SLAMF7 Expression sowie der Expression von Markern die auf eine Fähigkeit in die Haut zu wandern schließen lassen, unterschieden werden. Zusammenfassend zeigen wir hier, dass naive CD8+ T Zellen von den frühsten Entwicklungsstadien im Thymus an nicht homogen sind und die Fähigkeiten über CD40L Expression eine Helferfunktion auszuüben beziehungsweise über die Sekretion zytolytischer Moleküle Zielzellen abzutöten unabhängig vom CD4+ or CD8+ T-Zell Status sind. Zellen mit Zytokin- und Genexpressionsignaturen, die mit denen der CD8+ Helfer-T Zellen übereinstimmen, wurden von uns und anderen in Geweben (Haut, Lunge) identifiziert und tragen zu den verschiedensten autoinflammatorischen Erkrankungen bei. Diese Arbeit insinuiert daher die Notwendigkeit einer grundlegenen Neubewertung der CD8+ T Zell Fähigkeiten und Funktionen in Immunantworten. / The T cell compartment consists of two major subsets with diverse assignments. CD4+ T cells express CD40L upon activation, a central co-stimulatory receptor to induce B cell mediated humoral immunity, activate APCs and prime efficient effector CD8+ T cell development (“helper function”). In contrast, cytotoxic CD8+ T cells are predetermined to kill infected or malignant cells directly. However, a fraction of CD8+ T cells expressing CD40L upon activation was identified. So far, it is not understood in CD8+ T cells a) how CD40L expression is regulated, b) when and how the ability of CD40L expression is implemented and c) what are the implications for the immune system. In this thesis, we found that CD40L expression is regulated by DNA-methylation of regulatory regions of the CD40LG locus in CD4+ as well as CD8+ T cells. The de-methylation of central elements is implemented in the thymus and increases with T cell maturation reflected by enhanced stability of CD40L expression. Elevated CD5 and NUR77 expression of CD40L+ CD8+ SP thymocytes suggests that high affine detection of self-peptides during positive selection in the thymus implements CD40L expression ability and predetermines the fate of the CD40L imprinted CD8+ T cells. CD40L+ naïve CD8+ T cells differ in their TCR repertoire from their CD40L- counterparts and preferentially mature into memory cell subsets with cytokine and chemokine receptor profiles of Tc2, Tc17 and Tc22 cells. With their non-cytotoxic phenotype and gene expression signatures, the CD40L+ memory CD8+ T cell subsets Tc2, Tc17 and Tc22 widely resemble helper CD4+ T cells and can be distinguished from classical cytotoxic Tc1 and Tc17+1 cells by their IL-6R and absent SLAMF7 expression and their skin migratory phenotype. Altogether, we demonstrate that from the earliest developmental stages in thymus onwards naive CD8+ T cells are not homogenous and the abilites to provide “CD40L based help” or “cytotoxicity mediated killing” are independent of the CD4+ or CD8+ T cell status. Cells with helper-type CD8+ T cell cytokine and gene-expression signatures were found at barrier sites (skin, lung) by us and others where they contribute to multiple autoinflammatory diseases. Therefore, this work insinuates the need to revisite CD8+ T cell capablities and function in immune responses.

Das Knochenmark (BM) beherbergt wesentliche Komponenten des adaptiven Immunsystems, die einen langfristigen Schutz gegen wiederkehrende Pathogene vermitteln können, sodass es sich als Reservoir für ein immunologisches Gedächtnis qualifiziert. Neben langlebiger Antikörper-produzierender Plasmazellen bleiben auch Antigen (Ag)-spezifische CD8+ und CD4+ T-Gedächtniszellen dauerhaft im Knochenmark erhalten, auch wenn sie in den sekundären lymphoiden Organen (SLOs) und im Blut abwesend sind. Es wird angenommen, dass diese T-Gedächtniszellen bei erneutem Kontakt mit den gleichen systemischen Pathogenen schnell reagieren können. Allerdings sind die biologischen Mechanismen für ihre langfristige Aufrechterhaltung immer noch umstritten und demnach ungeklärt. Unklar ist auch, wie die T-Gedächtniszellen des Knochenmarks bei erneuter Konfrontation mit demselben Antigen reagieren. Hier wird dieser Frage begegnet, indem durch klassiche Immunisierung mit definieren Antigenen eine stabile Population Ag-spezifischer CD8+ und CD4+ T-Gedächtniszellen im Knochenmark erzeugt wird. / The bone marrow (BM) harbors critical components of the adaptive immune system being able to provide long-lasting protection against previously encountered pathogens, thus qualifying as a reservoir of immunological memory. In addition to long-lived antibody producing plasma cells, antigen (Ag)-specific CD8+ and CD4+ memory T lymphocytes are maintained long-term in the BM even when they are absent from secondary lymphoid organs (SLOs) and blood. Those memory T cells are thought to respond fast upon re-encounter of systemic pathogens. However, the biological mechanisms behind their long-term maintenance in the BM are still a matter of debate and thus remain unclear. Similarly, it is also unclear how the memory T cells of the BM react to antigenic re-challenge. Here we address these issues by generating a stable pool of Ag-specific CD8+ and CD4+ memory T lymphocytes in the BM by classical immunizations with defined antigens.

T-Helfer-9-(Th9-)Zellen produzieren große Mengen Interleukin-(IL-)9 und lösen bei Wurm- und Tumorerkrankungen protektive Immunantworten aus. Sie sind aber auch maßgeblich an der Pathogenese chronisch entzündlicher Darmerkrankungen beteiligt. Im Widerspruch zu diesen entzündungsauslösenden Eigenschaften steht ihre Rolle bei der Erzeugung von Toleranz gegenüber allogenen Transplantaten. Diese gegensätzlichen inflammatorischen Eigenschaften deuten eine bisher nicht untersuchte funktionelle Heterogenität an. In vitro-differenzierte allo-reaktive Th9-Zellen zeigten sich in ihrer Gesamtheit pro-inflammatorisch. Dies äußerte sich nach Transfer in recombination activating gene-defiziente (Rag-/-) Mäuse durch einen akut einsetzenden Gewichtsverlust mit intestinaler Entzündung und durch die Abstoßung allogener Hauttransplantate. Mittels Einzelzell-Genexpressionsanalyse wurden zwei Th9-Subpopulationen identifiziert, die sich vor allem in ihrer CD96-Expression unterschieden (CD96low versus CD96high Th9-Zellen). Die differenzielle Expression von CD96 spiegelte sich auch im inflammatorischen Potenzial der Zellen wider. Während der Transfer von CD96low Th9-Zellen in Rag-/- Mäuse einen Gewichtsverlust mit Darmentzündung sowie die Transplantatzerstörung verursachte, zeigten CD96high-rekonstituierte Tiere kaum Entzündungsanzeichen im Transplantat bzw. im Darm. Dementsprechend verloren sie auch kein Gewicht. Es zeigte sich, dass CD96low Th9-Zellen ein höheres Potenzial zur Produktion von IL-4 und IL-9 sowie zur Expansion besaßen als CD96high Th9-Zellen. Eine Blockade von CD96 in vivo stellte die inflammatorischen Eigenschaften von CD96high Th9-Zellen wieder her, wodurch die funktionelle Relevanz der CD96-Expression unterstrichen wurde. Diese Daten belegen, dass es sich bei Th9-Zellen um eine funktionell heterogene Zellpopulation handelt. Weiterhin zeigen sie, dass CD96 – ein Molekül mit bislang unklarer Funktion in CD4+ T-Zellen – die Aktivität von Th9-Zellen negativ beeinflusst. / T helper 9 (Th9) cells are potent producers of interleukin(IL-)9 driving host immunity against worm infections and tumors. Furthermore, they are predominantly involved in the pathogenesis of chronic inflammatory bowel diseases. However, they also induce tolerance in allogeneic transplantation, which contrasts with their pro-inflammatory properties. These observations indicate a functional heterogeneity of Th9 cells not examined so far. Total in vitro differentiated allo-reactive Th9 cells injected into recombination activating gene-deficient (Rag-/-) mice caused weight loss, intestinal inflammation and rejection of allogenic skin grafts which proofed their inflammatory character. However, using single cell profiling, two subsets of Th9 cells mainly differing in their CD96 expression were identified (CD96low versus CD96high Th9 cells). Transfer of CD96low Th9 cells into Rag-/- mice induced severe weight loss, intestinal inflammation and graft destruction. In contrast, transfer of CD96high Th9 cells did cause neither weight loss nor resulted in graft rejection. Transcriptional profiling revealed a higher IL-9 and IL-4 expression potential as well as an increased expansion capacity in CD96low Th9 cells compared to CD96high Th9 cells. Blockade of CD96 in vivo restored the inflammatory properties of CD96high Th9 cells demonstrating, that expression of CD96 controls effector functions in Th9 cells. Thus, Th9 cells are heterogeneous in function. Moreover, this study suggests an inhibitory role for the co-signaling receptor CD96 – a molecule with so far unknown function in CD4+ T cells – in Th9 cells.

Die Infiltration von T Zellen in das Zentrale Nervensystem (ZNS) ist ein Charakteristikum neuroinflammatorischer Erkrankungen wie der Multiplen Sklerose (MS) und ihrem Tiermodell der experimentellen autoimmunen Enzephalomyelitis (EAE), und führt zur Aktivierung intrinsischer Hirnmakrophagen, den Mikrogliazellen, zu axonaler Schädigung sowie zum Zusammenbruch der Blut-Hirnschranke. Die T Zellen, welche als erste im Gehirn erscheinen, sind vom Subtyp Th1, spezifisch für Bestandteile der Myelinscheide, wie das myelinbasische Protein (MBP), produzieren inflammatorische Zytokine und rekrutieren andere unspezifische T Zellen und Makrophagen. Da sich diese Zellen des Immunsystems gegen körpereigene Bestandteile richten, spricht man von autoreaktiven T Zellen und einer autoimmunen Erkrankung. Im ersten Teil meiner Dissertation habe ich den Einfluss dieser autoreaktiven T Zellen auf den Aktivierungszustand von Mikrogliazellen mit Hilfe muriner Schnittkulturpräparate von Hippocampus und entorhinalem Kortex untersucht, welche den myelinisierten Fasertrakt Tractus perforans mit seinen Ursprungsneuronen und Zielzellen enthielten. Gering aktivierte MBP-spezifische T Zellen induzierten die Expression der Aktivitätsmarker MHC-II und ICAM-1 auf den Mikroglia und die damit verbundene axonale Schädigung (Phagozytose) im gleichen Maße wie hochaktivierte unspezifische T Zellen. Nur Th1 Zellen konnten Mikroglia aktivieren. MBP-spezifische Th2 Zellen hingegen reduzieren die Th1 induzierte Mikrogliaaktivierung (ICAM-1) auf Kontrollniveau. MBP-spezifische Th1 Zellen konnten die Expression von B7 auf Mikrogliazellen modulieren, während die MBP-spezifischen Th2 Zellen diese Eigenschaft nicht besaßen. Durch diese Befunde kann die prominente Rolle von autoreaktiven Th1 Zellen beim Auslösen neuroinflammatorischer Prozesse auf ihre einmalige Fähigkeit, Mikrogliazellen zu aktivieren und deren kostimulatorische Moleküle zu modulieren, zurückgeführt werden. Gleichzeitig bieten die Daten eine mögliche Erklärung für die protektive Rolle von Th2 Zellen bei MS und EAE. Es ist bekannt, dass autoreaktive T Zellen, wie die MBP-spezifischen Th1 Zellen, auch im gesunden Zustand im humanen und murinen T-Zell-Repertoire vorhanden sind. Die physiologische Funktion dieser Zellen ist unklar. Untersuchungen am Nervus opticus sowie im Rückenmark in vivo belegen, dass autoreaktive T Zellen und Makrophagen die Reorganisationsprozesse im ZNS nach traumatischer Schädigung positiv beeinflussen. Diese bei neuroinflammatorischen Erkrankungen so destruktiv wirkenden autoreaktiven T Zellen verhindern nach einem experimentell gesetzten Primärschaden im ZNS das Fortschreiten der Schädigung und es kommt zu einer fast vollständigen Regeneration des Gewebes. Im zweiten Teil meiner Promotionsarbeit habe ich versucht, die Mechanismen, welche hinter dieser Protektion stecken aufzuspüren. Dazu habe ich ebenfalls das in vitro Hirnschnittmodell benutzt. Für diese Fragestellungen wurden Akutschnitte verwendet, die ein Modell für primäre Schädigung im ZNS darstellen. MBP-spezifische Th2 Zellen hatten ein größeres protektives Potential als MBP-spezifische Th1 Zellen. Die nicht ZNS-spezifischen Th1 und Th2 Zellen benötigten ihr Antigen (OVA-Peptid), um signifikant protektiv zu wirken. Durch eine Superstimulation der OVA- und MBP-spezifischen T Zellen wurde eine Neuroprotektion auf gleichem Niveau erreicht. Die Neuroprotektion nach primärer Schädigung von ZNS Gewebe ist somit antigen- und stimulationsabhängig und wird hauptsächlich von Th2 Zellen unterstützt. / The invasion of T cells into the central nervous system (CNS) is a hallmark of neuro inflammatory diseases like multiple sclerosis (MS) and its rodent model, experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE), leading to activation of intrinsic macrophages, the microglia, axonal damage and break down of the blood brain barrier. The initial invading T cells are of the Th1 subtype and specific for parts of the myelin sheet like myelin basic protein (MBP). They produce inflammatory cytokines and recruit peripheral non-specific T cells and macrophages. Because these T cells are directed against a self antigen, they are called auto reactive T cells and the phenomenon an autoimmune disease. In the first part of my study I investigated the influence of auto reactive T cells on microglial cells' utilizing an organotypic slice culture system of hippocampus and entorhinal cortex. The slice culture contains a myelinated fibre tract - the tractus perforans - with its original and target neurons. Low activated MBP-specific T cells induced the expression of the activation markers ICAM-1 and MHC-II on microglia as well as microglial phagocytosis in the same manner as highly activated non-specific T cells. Only Th1 cells were able to activate microglia, while Th2 cells reduced the Th1 induced activation (ICAM-1 expression). MBP-specific Th1 cells could modulate the expression of co-stimulatory molecules B7-1 and B7-2, whereas MBP-specific Th2 cells could not. These findings could show why Th1 cells are responsible for EAE induction while Th2 cells can be protective. Auto reactive T cells like MBP-specific T cells have been found in the normal human and murine T cell repertoire. The physiological function of these cells is still unclear. Studies using the models of optic nerve crush or spinal cord crush have shown that macrophages and auto reactive T cells are involved in reorganisation and regeneration after CNS trauma. These auto reactive T cells, which are usually known to be destructive, could prevent CNS tissue from secondary degeneration. In the second part of my study I tried to identify the mechanisms involved in this phenomenon. I also used the organotypic slice culture system. Immediately after preparation causing the primary injury the slices were cultivated with T cells. Th2 cells were found to be more potent to prevent form secondary damage than Th1 cells. The non-CNS specific OVA Th1 and Th2 cells required their antigen to be fully protective. When over stimulated, MBP- and OVA-specific Th1 and Th2 cells proved to be protective to the same extend. Neuroprotection after primary injury depends on the T cell s state of activation and their antigen specificity. Among the cells examined I found Th2 cells were most effective in preventing CNS tissue from secondary injury.

Regulatorische T-Zellen (Treg) eröffnen neue immuntherapeutische Wege zur Kontrolle unerwünschter Immunreaktionen, jedoch wirft die Heterogenität dieser Zellen die Frage auf, welche Treg-Population für die klinische Anwendung. Darauf basierend werden in dieser Arbeit drei Fragestellungen bearbeitet: i) Bestimmung der Häufigkeit von Tregs und deren Subpopulationen in verschiedenen Altersgruppen bei Empfängern einer Organtransplantation (Tx) und einer gesunden Kontrollgruppe; ii) Vergleich der Suppressorkapazität verschiedener Treg-Populationen und in vitro-Expansion der Zellen unter Erhaltung ihrer Funktionalität; iii) Klärung der Differenzierungsmerkmale von Tregs und deren Verknüpfung mit konventionellen T-Zellen (Tconv) mittels Analyse des T-Zell-Rezeptor- (TCR) Repertoires. Sowohl bei gesunden Probanden als auch bei Tx-Empfänger konnte eine altersabhängige Verschiebung von naiven (TregN) hin zu dominant zentralen Gedächtnis-Zellen (TregCM) beobachtet werden, Treg von Tx-Empfängern hatten mehr Effektor-Memory-Zellen (EM) und sie waren mehr aktiviert. In Bezug auf die Kontrolle der frühen Tconv zeigen TregCM eine erhöhte Suppressorkapazität im Vergleich zu TregN. Außerdem sind im Gegensatz zu TregN nur TregCM dazu in der Lage, Apoptose bei Responderzellen zu induzieren. Der Grund hierfür könnte in der stärkeren Expression von CTLA-4 auf TregM liegen. Die Expansionskultur führte zur phänotypischen Veränderung der TregN, deren Umwandlung in TregCM mit einer verbesserten Suppressoraktivität verbunden ist. Die Daten legen nahe, dass das Expandieren mit gesamt Treg für die Adoptive-Treg-Therapie optimal sind, da sie der größte Anteil von ihnen die hochpotenten TregCM sind. TCR-Studien mittels Next Generation Sequencing zeigen weiter, dass TregM aus TregN entstehen, anstatt aus Tconv, in einem Antigen-gesteuerten Prozess. Diese Daten belegen erstmalig neue Erkenntnisse hinsichtlich der Unterschiede der TCR-Repertoires von TregM und Tconv beim Menschen. / Regulatory T cells (Treg) offer new immunotherapeutic options to control undesired immune reactions, but the heterogeinetiy of Treg raises the question which Treg population should be used for clinical translation Thus, this project involves three main parts: i) investigating Treg frequency and subsets distribution with age in healthy donors and transplant (Tx) patients; ii) comparing the suppressive capacity of Treg subsets and expanding them in vitro without losing functionality; iii) clarifyjing the differiation relationship of Treg subsets and their relation to conventional T cells (Tconv) by T cell receptor (TCR) repertoire analysis. From both healthy donors and Tx patients, an age-dependent shift from naïve Treg (TregN) to the dominant central-memory Treg (TregCM) was observed,; However,Treg in Tx patients contained more effector-memory EM cells, , and they were pre-activated due to the exposure to allo antigens,. Regarding control of early Tconv activation, TregCM showed enhanced suppressive capacity compared to TregN; furthermore, only TregCM could induce apoptosis of responder cells while TregN could not, which may result from thehigherexpression of cytotoxic T-lymphocyte antigen 4 (CTLA-4) on TregM. Following in vitro expansion of the Treg subsets, however, TregN converted mainly into TregCM phenotype with enhanced suppression activity. The poor proliferation capacity of TregEM might indicate EM as the terminal differential stage. These data suggest that expansion with total Treg is optimal for adoptive Treg therapy as the majority of them are the highly potent TregCM. Lastly, TCR repertoire study by next generation sequencing (NGS) indicate that TregM derived from TregN rather than Tconv in an antigen-driven process. The highest similarity of the TCR repertoires was observed between TregCM and TregEM. These data reveal new insights for the first time into the distinct TCR repertoires of Treg subsets and Tconv in human by NGS technology.

T-Zellrezeptor (TZR)-Gentherapie zeigte erste Erfolge in klinischen Studien, jedoch wurden gleichzeitig Risikofaktoren deutlich. Ein Risikofaktor ist das falsche Paaren der transferierten TZR-Ketten mit den endogenen, was zu TZR-Molekülen von unbekannter Spezifität führt und die Oberflächenexpression und somit auch die Funktionalität des transgenen TZR reduziert. Dieser Aspekt wurde in generierten T-Zellklonen mit einer konstitutiven/endogenen TZR-Expression sowie einer zweiten induzierbaren/transgenen TZR-Expression untersucht. Es konnte gezeigt werden, dass nach Induktion der transgenen TZR-Expression der endogene TZR seine Funktionalität verlor, obwohl er noch auf der Oberfläche detektierbar war. Als Ursachen wurden neben einer reduzierten Oberflächenexpression des endogenen TZR auch falsch gepaarte TZR-Moleküle, die mit Hilfe der Fluoreszenz-Resonanz-Energie-Transfer-Methode detektiert wurden, gefunden. Die Modifikation des TZR durch den Einbau einer zweiten Cystein-Brücke, was das Paaren der korrespondierenden TZR-Ketten stabilisieren soll, führte in den T-Zellklonen zu keiner Reduktion der falsch-paarenden TZR-Moleküle. In primären Wildtyp-T-Zellen verbesserte sich das richtige Paaren des transgenen TZR leicht und konnte durch Codon-Optimierung der TZR-Gene weiter verbessert werden. Der zweite untersuchte Risikofaktor ist die Insertionsmutagenese durch den retroviralen Vektor. Die sichere Verwendbarkeit von differenzierten T-Zellen für die TZR-Gentherapie wurde in einem Tiermodel mit wiederholter T-Zellstimulierung, um weitere Mutationen während der Zellteilung zu provozieren, analysiert. Im Laufe der Zeit reicherten sich die transferierten T-Zellen in den Tieren dramatisch an, aber entwickelten sich nicht zu T-Zelllymphomen. Die Proliferationskapazität und die Funktionalität der transferierten T-Zellen wurden bestätigt. Die Polyklonalität der TZR-gen-modifizierten T-Zellen wurde mit Hilfe der linear-amplifizierten Polymerasekettenreaktion nachgewiesen. / T cell receptor (TCR) gene therapy is a new therapy for cancer which showed first clinical success but at the same time risk factors evolved. One risk factor is the mispairing of the TCR chains with the endogenous TCR chains which leads to TCRs with unknown specificities and to a reduced expression and functionality of the transferred TCR. This aspect was analyzed in dual TCR T cell clones which had one constitutive/endogenous TCR expression as well as a second inducible/transgenic TCR expression. It could be shown that the endogenous TCR lost its functionality after induction of the transgenic TCR expression although it was still detectable on the cell surface. The reason was found in the lower surface expression level of the endogenous TCR as well as in mispaired TCR dimers detected by fluorescence resonance energy transfer (FRET) technique. Modification of the TCR by insertion of a second cysteine bridge which should stabilize the pairing of the corresponding TCR chains did not reduce the TCR mispairing in the T cell clones. In primary wild-type cells, the pairing of the transgenic TCR improved slightly and could be further improved by codon-optimization of the TCR genes. The second analyzed possible side effect of TCR gene therapy is the insertional mutagenesis by the retroviral vector. The safety of differentiated T cells for TCR gene therapy was analyzed in an animal model with a repetitive T cell stimulation to provide the opportunity for mutations to occur during cell division. Over time, transferred T cells increased dramatically in the recipient mice, but did not lead to T cell lymphomas. The proliferative capacity and the functionality of transferred T cells were confirmed. The polyclonality of the TCR gene-modified T cells could be confirmed by linear amplification-mediated polymerase-chain reaction.