ZTLs vermitteln die Eliminierung von infizierten und entarteten Zellen durch Apoptose. Neuste Erkenntnisse unserer Gruppe haben gezeigt, dass eine Subpopulation der CD8+ T-Zellen, anstelle der zytotoxischen Marker das Oberflächenmolekül CD40L exprimiert. Die Expression von CD40L ist bislang als Schlüsselmolekül für die CD4+ T-Zell vermittelte Hilfe bekannt, welche durch Bindung an den CD40 Rezeptor auf anderen Immunzellen induziert wird. Das von den CD4+ T–Zellen ausgehende CD40L Signal ist besonders für die T-Zell abhängige B-Zell Aktivierung und die Bildung von Keimzentren essentiell, in denen B-Zellen heranreifen und hochaffine Antikörper produzieren um den Organismus vor eindringenden Erregern zu schützen. Aufgrund der CD40L-assoziierten Helferfunktion sollte in dieser Arbeit untersucht werden, welche Auswirkungen die Interaktion von CD8+CD40L+ T-Zellen mit B Zellen hat. In in vitro Studien konnte gezeigt werden, dass 50% der antigen-spezifischen CD8+ T-Zellen nach Aktivierung durch B-Zellen CD40L hochregulieren. Sowohl auf RNA- als auch auf Proteinebene induzierten CD8+CD40L+ T-Zellen einen B-Zell Phänotyp, der stark dem von CD4+ T-Zellen stimulierten B-Zellen ähnelte. In Infektionsversuchen mit dem B-Zell-trophen Virus MHV-68 konnte gezeigt werden, dass transgene Mäuse mit CD40L defizienten CD8+ T-Zellen im Vergleich zu Kontrolltieren eine signifikante Reduktion der Keimzentrums-B-Zellen in den Lymphknoten der oberen Halsregion aufweisen. Eine genauere Betrachtung des B-Zell Repertoires von IgG Gedächtniszellen ergab jedoch, dass die Sequenzen der IGHJ3 Genfamilie bevorzugt für die Modifikation der CDR3 Region in Mäusen mit CD40L defizienten CD8+ T-Zellen verwendet wird, die eine entscheidende Rolle bei der Antigenerkennung spielt. Zusammengefasst kann mit dieser Arbeit zum ersten Mal gezeigt werden, dass CD8+CD40L+ T-Zellen Helferfunktionen durch Unterstützung der B-Zell Aktivierung und Bildung von Keimzentren übernehmen können. / CTLs are important for the elimination of infected and degenerated cells by inducing apoptosis of the target cells. Recently our group identified a sub-population of CD8+ T cells expressing CD40L instead of common CTL markers. To that date, transient CD40L expression on T cells has been only described as a function of activated CD4+ T cells, which displays this key molecule for CD4+ T cell mediated help by binding to the CD40 receptor on other immune cells. Particularly, CD40L signaling provided by CD4+ T cells is indispensable for T cell dependent B cell activation and GC responses, which generate B cells secreting high affinity antibodies that protect the host from invading pathogens. Due to its associated helper functions, this thesis aimed to dissect whether CD40L positive CD8+ T cells are restricted to cytotoxic killing or if this sub-population possesses similar properties as CD4+ T cells when interacting with B cells. In vitro co-culture experiments showed that 50% of murine antigen specific CD8+ T cells up-regulated CD40L upon activation by antigen presenting B cells. When compared to CD40L deficient CD8+ T cells, the interaction of CD8+ CD40L+ T cells induced remarkable changes in B cells on the RNA and protein level and triggered a B cell phenotype resembling that of B cells primed by CD4+ T cells. By the infection of mice with the B cell trophic virus MHV-68, it was found that E8IcrexCD40Lflox transgenic mice lacking CD40L only on matured CD8+ T cells, exhibited a significant decrease of GC B cells in superficial cervical lymph nodes at the acute state of infection compared to WT mice. A closer look into the memory B cell repertoire revealed a preferred usage of the murine IGHJ3 gene family that modifies the CDR3 and thus the recognition groove of the B cell antibody in E8IcrexCD40Lflox mice. In summary, this work provides sufficient evidence that CD8+ CD40L+ T cells adopt helper-like functions by supporting B cell activation and subsequent GC formation.

Eine mangelhafte Produktion des Zytokins Interleukin-2 (IL-2), sowie Veränderungen in der Population der CD4+Foxp3+ regulatorischen T Zellen (Treg) wurden im Zusammenhang mit der Autoimmunkrankheit Systemischer Lupus erythematodes (SLE) beschrieben. Jedoch wurde ein möglicher kausaler Zusammenhang zwischen diesen beiden Auffälligkeiten und der Pathogenese des SLE bis jetzt nicht aufschlussreich untersucht. Durchflusszytometrische Analysen zeigten hier, dass der Anteil an Treg mit hoher Expression der IL-2 Rezeptoruntereinheit CD25, die mit funktioneller und metabolischer Treg Aktivität assoziiert wurde, in SLE Patienten erniedrigt ist. Außerdem ist das homöostatische Gleichgewicht zwischen Treg und konventionellen T Zellen gestört. In vitro Experimente zeigten, dass eine defekte IL-2 Produktion der CD4+ T Zellen für die niedrige CD25 Expression der Treg von SLE Patienten verantwortlich ist, wohingegen Stimulation mit IL-2 in vitro die CD25 Expression der Treg wiederherstellt und auch das Überleben der Treg erhöht. Vor allem niedrige IL-2 Konzentrationen hatten einen selektiven Effekt auf die Treg Population, während andere Lymphozyten nur wenig beeinflusst wurden. Basierend auf diesen Ergebnissen wurde eine klinische Studie mit niedrig dosiertem IL-2 zur Behandlung von Patienten mit refraktärem SLE implementiert. Niedrig dosiertes IL-2 führte zu einer peripheren Expansion suppressiver Treg mit stark erhöhter CD25 Expression und verbesserte das homöostatische Gleichgewicht zwischen Treg und konventionellen T Zellen. Diese Effekte wurden von einer klinischen Remission in drei der fünf mit IL-2 behandelten SLE Patienten begleitet. Zusammenfassend machen die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit die Bedeutung des IL-2 Defizits für die Veränderungen in der Treg Population und die Pathogenese des SLE deutlich, und zeigen, dass niedrig dosiertes IL-2 einen sicheren und effizienten neuen Therapieansatz darstellt, der direkt in die Pathogenese des SLE eingreift. / A defective production of the cytokine Interleukin-2 (IL-2), as well as abnormalities in the population of CD4+Foxp3+ regulatory T cells (Treg), have been described in association with the autoimmune disease systemic lupus erythematosus (SLE). However, a possible causal relationship between these two features and SLE pathogenesis has not been adequately investigated so far. Here, flow-cytometric analyses showed that the proportion of Treg expressing high levels of the IL-2 receptor subunit CD25, which was associated with functional and metabolic Treg activity, is reduced in SLE patients. In addition, the homeostatic balance between Treg and conventional T cells is disturbed in SLE. In vitro experiments showed that a defective IL-2 production by CD4+ T cells accounts for the low CD25 expression in Treg from SLE patients. In contrast, in vitro stimulation with IL-2 restores CD25 expression in Treg and enhances their survival. Especially low IL-2 concentrations had a selective effect on the Treg population, while other lymphocytes were only marginally affected. Based on these results, a clinical trial with low-dose IL-2 was implemented for the treatment of patients with refractory SLE. Low-dose IL-2 treatment of SLE patients caused a selective peripheral expansion of suppressive Treg with strongly increased CD25 expression levels, and improved the homeostatic balance between Treg and conventional T cells. These effects were accompanied by clinical remission in three of the five SLE patients that were treated with low-dose IL-2 during the course of this study. In summary, this work demonstrates the impact of IL-2 deficiency for the Treg abnormalities and disease pathogenesis in SLE, and it proposes low-dose IL-2 as a safe and efficient novel therapeutic approach, which directly targets SLE pathogenesis.

Der adoptive Transfer von TZR-modifizierten T Zellen ist mit potentiellen Risiken verbunden. Autoimmunreaktionen können auftreten, wenn Tumor-assoziierte Antigene auf normalem Gewebe erkannt werden, Fehlpaarung der TZR-Ketten zur Bildung eines autoreaktiven Rezeptors führen oder ein sonst anerger auto-reaktiver endogener Rezeptor aktiviert wird. Auch besteht das Risiko der malignen Transformation der Zelle durch Insertionsmutagenese. Daher ist es notwendig, die transferierten T Zellen im Fall schwerer Nebenwirkungen eliminieren zu können. Derzeit verfügbare Sicherheitsmechanismen sind für die Therapie mit TZR-modifizierten T Zellen ungeeignet. In dieser Arbeit wurde ein neuer Sicherheitsansatz entwickelt, der auf einem TZR-intrinsischen Depletionsmechanismus beruht und TZR-veränderte T Zellen eliminieren kann. Durch Einfügen eines myc-tags in murine (OT-I, P14) und humane (gp100) TZRs konnten TZR-exprimierende T Zellen in vitro und in vivo mittels eines myc-spezifischen Antikörpers depletiert werden. Die T Zellen behielten vergleichbare Funktionalität hinsichtlich Antigenerkennung und Zytokinsekretion wie Zellen, die den Wild-Typ Rezeptor exprimierten. Die Depletion adoptiv transferierter T Zellen verhinderte lethalen Diabetes in einem Mausversuch. Im verwendeten Modell wurden Splenozyten, die einen myc-getagten OT-I TZR exprimierten, in RIP-mOVA Mäuse injiziert, welche in den Inselzellen des Pankreas das OT-I-spezifische Antigen Ovalbumin exprimieren. Zerstörung der Inselzellen durch die T-Zellen induzierte lethalen Diabetes in unbehandelten Mäusen. Tiere, denen ein myc-spezifischer Antikörper verabreicht wurde, zeigten keine Symptome. Dieser neuartige Sicherheitsmechanismus erlaubt es, adoptive T Zelltherapie abzubrechen, falls schwere Nebenwirkungen auftreten. Im Gegensatz zu früheren Strategien muss kein zusätzliches Sicherheitsgen eingebaut werden und die Sicherheit des Ansatzes wird durch Verlust oder Herunterregulierung des Transgens nicht beeinflusst. / Adoptive transfer of TCR gene-modified T lymphocytes into patients is associated with potential risk factors. First, auto-immunity may occur if a tumor-associated antigen is targeted on normal tissue, if TCR chain mispairing leads to the formation of an auto-reactive receptor or if an otherwise anergic endogenous receptor specific for an auto-antigen becomes activated. Second, retroviral integration could lead to malignant transformation of the T cell. Therefore, it is essential to have the possibility to deplete the transferred T cells in vivo in case of severe side effects. The available safety modalities comprise disadvantages rendering them less feasible for the application in therapy with TCR gene-modified T cells. In this study, a safeguard based on a TCR-intrinsic depletion mechanism has been developed that eliminates auto-reactive TCR-redirected T cells. By introducing a myc-tag into the murine (OT-I, P14) or human (gp100) TCRs it was possible to deplete TCR-expressing T cells in vitro and in vivo with a myc-specific antibody. The T cells maintained equal function compared to cells expressing the wild-type receptor as shown by antigen binding and cytokine secretion. Importantly, the in vivo depletion of adoptively transferred T cells prevented disease in an auto-immune mouse model. Here, splenocytes transduced with a myc-tagged OT-I TCR were injected into RIP-mOVA mice expressing the OT-I-specific antigen ovalbumin in the pancreatic beta-cells. Destruction of these cells by the adoptively transferred T cells led to severe diabetes in untreated mice. Animals receiving a myc-specific antibody after T cell transfer showed no increase in blood glucose levels. The developed safeguard allows termination of adoptive therapy in case of severe side-effects. The strategy is superior to previous ones as it relies on a TCR-intrinsic mechanism which does not require introduction of an additional gene and safety is not hampered by loss or low expression of the transgene.

Bei der Aufrechterhaltung des homeostatischen Gleichgewichts und der peripheren Selbst-Toleranz spielen CD4+CD25+ regulatorische T-Zellen (Tregs) eine wichtige Rolle. In Vorarbeiten wurden Subpopulationen von murinen CD4+ Tregs identifiziert, die sich durch die Expression des Integrins alphaE auszeichnen. Diese alphaE+ Treg Subpopulationen weisen einen Effektor/Memory-ähnlichen Phänotyp auf. In der vorliegenden Dissertation wurde untersucht, welche Bedingungen zur Entwicklung von alphaE+ Effektor/Memory Tregs in vivo führen und aus welchen Vorläuferzellen sie entstehen. Dabei zeigte sich, dass es sich bei den alphaE+ Tregs um Effektor/Memory T-Zellen handelt, die unter physiologischen Bedingungen in vivo ein hohes Maß an Zellteilung aufweisen, welche zum Teil abhängig von der bakteriellen Besiedelung des Darms ist. Darüber hinaus wurde beobachtet, dass alphaE+ Tregs nach oraler, antigen-spezifischer Aktivierung in den darm-assozierten lymphoiden Geweben sowohl aus konventionellen naiven CD4+ T-Zellen, als auch aus thymus-generierten naiven CD4+CD25+ Tregs entstehen können. Zusammenfassend deuten die erzielten Ergebnisse darauf hin, dass das spezifische mukosale Mikroenvironment sowohl die Expansion als auch Konvertierung von Tregs fördert und so eine wichtige Rolle für die Aufrechterhaltung der Homeostase von alphaE+Foxp3+ Tregs spielt. Zudem wurde in dieser Arbeit die Ausbildung von gewebespezifischen Homingrezeptor-Phänotypen von naiven CD4+CD25+ Tregs untersucht. In in vitro Kultur-Systemen zeigte sich, dass selektive Modulation von Tregs, ähnlich wie bei konventionellen T-Zellen, die Induktion von organspezifischen Migrationseigenschaften ermöglicht. So konnte eine effiziente Wanderung von Tregs in den Darm ausgelöst werden. Diese Daten legen den Schluss nahe, dass die Herstellung von Tregs mit spezifischen Wanderungseigenschaften eine Option für therapeutische Anwendungen in der adoptiven T-Zell Therapie sein könnte. / Regulatory CD4+CD25+ T cells (Tregs) play an important role in immune homeostasis and in the maintenance of self-tolerance. Previously, subsets of murine CD4+ Tregs characterised by expression of the integrin alphaE had been identified. These alphaE+ Treg subsets display an effector/memory-like phenotype. In the present study the circumstances favouring in vivo generation of effector/memory-like alphaE+ Tregs were analysed. The results presented here show that alphaE+ effector/memory-like Treg subsets contain a large fraction of cycling cells under physiologic conditions in healthy mice. This in vivo proliferation depended, at least in part, on intestinal commensal microflora. Furthermore, it was observed that alphaE+ Tregs not only developed by differentiation of naive-like CD4+CD25+ Tregs, but were also generated de novo from naive CD4+ T cells in the gut-associated lymphoid tissue upon oral antigen delivery. Taken together, these results indicate that the mucosal microenvironment favours both expansion and conversion of Tregs and thereby represents an important mechanism for the homeostatic maintenance of alphaE+Foxp3+ Tregs. In addition, susceptibility of naive CD4+CD25+ Tregs to acquire tissue-specific homing receptor phenotypes was investigated. In vitro culture systems demonstrated that Tregs, similarly to conventional T cells, could be configured with organ-selective homing properties allowing efficient targeting into the gut. These results suggest that generation of Tregs with specific homing properties for therapeutic purposes in adoptive T cell therapy might be a feasible option.

Die initialen immunologischen Prozesse, die zur Entwicklung autoimmuner Lebererkrankungen führen, sind weitgehend unbekannt. Deshalb wurden in dieser Arbeit die Antigenpräsentation, die Migration sowie der Phänotyp in vivo aktivierter CD8 T-Zellen in der Leber anhand eines Mausmodells der autoimmunen Hepatitis untersucht. Es konnte gezeigt werden, dass hepatische dendritische Zellen an der Entstehung von CD8 Effektor-T-Zellen und an der Inflammation der Leber beteiligt sind. Kupffer-Zellen dagegen nehmen im autoimmunen Kontext in der Leber eine tolerogene Funktion ein. Die in vivo in der Leber aktivierten CD8 T-Zellen zeigten spezifische Oberflächenmarker und ein ungewöhnliches Migrationsverhalten. So wurde zum einen mit Neuropilin-1 ein weitgehend unbekannter Oberflächenmarker identifiziert, zum anderen spricht die Expression von bekannten Markern, die den Aktivierungsstatus der CD8 T-Zellen definieren, für einen hybriden Phänotyp. Sie besitzen sowohl Charakteristika von naiven CD8 T-Zellen als auch von Effektorzellen, eine Eigenschaft, die auch bei zentralen Gedächtniszellen gefunden wird. In der Leber aktivierte CD8 T-Zellen können nicht nur proinflammatorische Zytokine ausschütten und somit eine Inflammation in der Leber auslösen, sondern sind außerdem in der Lage durch Lymphknoten zu zirkulieren. Dagegen ist ihnen der Zugang zum Darm verwehrt, womit eine direkte regulatorische Funktion im Darm ausgeschlossen werden kann. Obwohl auf in der Leber aktivierten CD8 T-Zellen spezifische Adhäsionsmoleküle identifiziert wurden, existiert keine exklusive gewebespezifische Migration in die Leber, wie sie etwa für im Darm aktivierte CD8 T-Zellen nachgewiesen wurde. Im darmassoziierten lymphatischen Gewebe aktivierte CD8 T-Zellen akkumulieren in der Leber und tragen möglicherweise zur Schädigung der Leber im Rahmen chronisch entzündlicher Darmerkrankungen bei. Diese Arbeit trägt somit zum besseren Verständnis der Entstehung autoimmuner Prozesse in der Leber bei. / Initial immunological processes leading to autoimmune liver diseases are largely unknown. Therefore this thesis analyzed the antigen presentation, the migration as well as the phenotype of in vivo activated CD8 T cells in the liver by employing a mouse model for autoimmune hepatitis. It was shown that hepatic dendritic cells are effective antigen-presenting cells, which contribute to the induction of functional effector CD8 T cells in the liver and hepatitis. In contrast, Kupffer cells have a tolerogenic role during autoimmune processes in the liver. CD8 T cells that were in vivo activated in the liver display specific surface markers and unusual migration patterns. On the one hand an unusual surface molecule Neuropilin-1 was identified, on the other hand expression of well-known markers defining the activation-status of CD8 T cells suggests a hybrid phenotype. They reflect aspects of naive and effector T cells, characteristics also found on central memory T cells. Liver-primed CD8 T cells do not only produce pro-inflammatory cytokines leading to hepatitis, but they also retain their ability to circulate through lymph nodes. However, they have no access to the gut, which suggests that a direct regulatory function in the gut can be excluded. Although specific adhesion molecules on CD8 T cells activated in the liver were identified, no exclusive tissue-specific migration into the liver exists, as was shown for CD8 T cells primed in the gut. CD8 T cells activated in the gut-associated lymphoid tissue accumulate in the liver, in principle enabling them to induce liver pathology in the context of inflammatory bowel disease. Thus, the here described findings contribute to the understanding of initial immunological processes in autoimmune liver diseases.

In den letzten zwei Jahrzehnten wurden T-Lymphozyten verstärkt als Zielzellen für genetische Modifikationen eingesetzt, mit der Absicht vererbbare oder erworbene Krankheiten zu behandeln. Vor kurzem konnte unsere Arbeitsgruppe zeigen, dass alloantigen-spezifische, genmodifizierte T-Lymphozyten ein enormes Potential besitzen, als Transport- Systeme für therapeutische Gene in allogene Transplantate zu dienen. Diese T-Lymphozyten migrieren und akkumulieren spezifisch in das allogene Transplantat, in welchem es zu einer lokalen und starken T-Zell aktivierungsabhängigen Expression des Transgens kommt. In der vorliegenden Arbeit wurde das Potential von viralem IL-10 als therapeutisches Transgen untersucht. Dazu wurde zunächst in der gemischten Lymphozyten-Kultur (MLR) eine Lewis T-Zelllinie spezifisch für Ratten-DA Alloantigene generiert. Während der MLR wurden die Lymphozyten retroviral transduziert, so dass sie vIL-10 stabil exprimieren. Der Zytokin-Level der TvIL-10-Lymphozyten liegt 48h nach der T-Zellaktivierung zwischen 1-2ng/m. Die vIL-10 transgenen T-Lymphozyten zeigen einen CD4+CD25+ Phänotyp und sezernieren neben vIL-10 auch Ratten IL-10 und IFN-g aber kein IL-4, ähnlich wie T-regulatorische Zellen Typ 1 (Treg1). Zunächst wurden die vIL-10 transgenen T-Lymphozyten hinsichtlich ihres Potentials untersucht, die alloantigen-spezifische Immunantwort in vitro zu modulieren. Dazu wurden 5% vIL-10 transgener T-Lymphozyten zu einer MLR hinzugegeben. Zuvor wurden die naiven Lewis T-Lymphozyten mit einem Membranfarbstoff markiert, um die Proliferation und die Zytokin-Expression dieser Zellen zu untersuchen. Im Vergleich zu Kontroll-MLRs ohne transgene oder mit EGFP-transgenen Lymphozyten konnte eine signifikante Inhibierung der Proliferation als auch der INF-g Expression von naiven T-Lymphozyten detektiert werden. Trotz dieses großen Potentials in vitro, führte der adoptive Transfer der vIL-10 transgenen Zellen allein oder in Kombination mit Cyclosporin (0,5mg/kg/Tag) nicht zu einer Verlängerung der Transplantatüberlebenszeit im allogenen Herztransplantationsmodell. Diese Daten zeigen, dass die Überexpression von vIL-10 im Transplantat eines starken Abstoßungsmodells nicht zur Verlängerung der Transplantatüberlebenszeit führt. Außerdem kann das in vitro gezeigte regulatorische Potential dieser T-Zellen nicht zwangsläufig auf ihr in vivo Potential übertragen werden. / During last two decades T lymphocytes have become key targets for genetic modification in order to treat inherited or acquired human diseases. Recently, we demonstrated the capacity of allospecific gene-engineered T lymphocytes as a transport shuttle for therapeutic transgenes into allografts. These lymphocytes migrate and accumulate specifically in allografts where alloantigen-driven T cell activation strongly enhances local expression of the gene of interest. In this study, the influence of viral IL-10 as a therapeutic transgene was addressed. Lewis T cell lines specific for DA rat alloantigens were generated in a modified mixed lymphocyte reaction protocol (MLR). During MLR, lymphocytes were genetically modified to express vIL-10 using a retroviral gene expression system. The cytokine level in the supernatant of TvIL-10-lymphocytes varied between 1-2 ng/ml 48h after T-cell activation. Like T regulatory 1 (Treg1) cells, vIL-10 transgenic T lymphocytes express the phenotype CD4+25+ and secrete, in addition to vIL-10, rat IL-10 and IFN-g but no IL-4. First we evaluated the potential of vIL-10 transgenic T cell lines to modulate alloantigen-specific immune responses in vitro. Small numbers of TvIL-10-lymphocytes were added to MLR (less than 5%). Naive cells were stained with membrane dyes to trace proliferation and to analyze cytokine expression. In comparison to control MLR with no transgenic cells or equal numbers of TEGFP-lymphocytes, the proliferation as well as the production of IFN-g of naive responder cells were significantly diminished. Despite this regulatory capacity in vitro, the vIL-10 transgenic T lymphocytes were not able, either alone or in combination with suboptimal cyclosporine (0,5mg/kg/day), to prolong the survival of DA rat cardiac allografts in LEW recipients. These data demonstrate that intragraft IL-10 overexpression is not sufficient to prolong allograft survival in a high-responder strain combination and that the regulatory capacity of T cells in vitro does not predict their in vivo efficiency.

Die Infektion mit Schistosoma mansoni resultiert in einer Th2-Immunantwort mit Eosinophilie und erhöhtem IgE-Titer, wobei der wasserlösliche Extrakt der S. mansoni Eier (SEA) ausreicht um diese Reaktion auszulösen. In der vorliegenden Arbeit konnte demonstriert werden, dass sich IL-4-produzierende CD4+ T-Lymphozyten in Zellkulturen mit SEA-konditionierten Dendritischen Zellen (DCs) trotz gleichzeitig vorkommenden IFN-gamma entwickeln und SEA die Expression von Faktoren in DCs, die üblicherweise mit einer Th1-Antwort einhergehen, auf Transkriptions- und Proteinebene selektiv hemmt. Um den Faktor aus S. mansoni Eiern zu isolieren, der zur Expression von IL-4 in CD4+ Zellen und zur Inhibition von IL-12 in DCs führt, wurde eine Gelfiltrationschromatographie der exkretorisch/sekretorischen Ei-antigene (ES) durchgeführt und die Fraktionen in vitro getestet. Darin wurde gezeigt, dass Fraktionen mit einer Proteinbande von 30 kD die Expression von IL-4 in CD4+ Zellen induzieren. Dieses ES-Protein wurde durch N-terminale Sequenzierung als hepatotoxische Ribonuclease Omega-1 identifiziert, welches ebenfalls die Expression von IL-12 in DCs inhibiert und die Produktion von IL-4 in CD4+ Zellen bei einer 10-fach geringeren Proteinkonzentration als mit dem Kontrollansatz SEA induziert. Zudem sollte untersucht werden, inwieweit Toll-like Rezeptoren in der Generierung einer Th2 Antwort gegen schistosomale Antigene involviert sind. Dazu wurden TLR2-, TLR3-, TLR4- und MyD88-defiziente Mäuse mit S. mansoni infiziert und immunologische und pathologische Daten in der akuten und chronischen Phase der Infektion analysiert. Demnach sind TLR2, TLR3, TLR4 und MyD88-abhängige Signaltransduktionswege nicht für eine-Th2 Antwort notwendig, jedoch ist letzteres Molekül in der Ausprägung der typischen Leberfibrose involviert. / Infection with Schistosoma mansoni results in the induction of a Th2 immune response, eosinophilia and increased levels of IgE. The water-soluble extract of S. mansoni eggs (SEA) is sufficient to promote TH2 polarization in a dendritic cell-dependent manner. In this thesis, it was demonstrated that IL-4+ CD4+ cells emerge in cultures with SEA-conditioned dendritic cells (DCs) in the presence of IFN-gamma and that SEA inhibits selectively the expression of IL-12 and co-stimulatory markers in DCs on the transcriptional and protein level. To identify the putative protein in S. mansoni eggs mediating a Th2 induction, a gel filtration chromatography of the excretory/secretory egg antigens (ES) was conducted and the fractions tested in vitro. Fractions containing a single band of 30 kD were sufficient to promote IL-4 induction in naïve CD4+ cells. Using N-terminal sequencing this ES-protein was identified as the hepatotoxic S. mansoni ribonuclease omega-1 which displayed both biological functions observed with SEA: inhibition of IL-12 in LPS-stimulated DCs and induction of IL-4+ CD4 cells at a 10 fold lower protein concentration than SEA. In order to understand, if the innate immune receptors TLR2, TLR3, TLR4 or the TLR adaptor molecule MyD88 are involved in the generation of the Th2 response against schistosomal antigens, the respective knock out mice were infected and immunological and pathological parameters were analyzed during acute and chronic phase of infection. This study showed that during S. mansoni infection TLR2, TLR3, TLR4 and TLR activation through the MyD88-dependent pathway are neither required for the induction (priming and polarization) nor for the down-regulation of Th2 responses, however, the fibrotic response against S. mansoni eggs was significantly reduced in MyD88-deficient mice suggesting a detrimental role of this pathway in liver pathology.

Bei der Kreuzpräsentation durch dendritische Zellen (DC) werden extrazelluläre Antigene in den MHC I-Präsentationsweg eingeschleust und CD8+ T-Zellen präsentiert. Bisher werden die kreuzpräsentierenden DC der Maus durch die Expression der Moleküle CD8 in der Milz und CD103 in der Peripherie abgegrenzt; der kreuzpräsentierende Subtyp primärer humaner DC war vor Beginn dieser Arbeit nicht bekannt. Innerhalb dieser Arbeit konnte erstmals eine durchflusszytometrische Färbung von XCR1 auf der Oberfläche von Zellen etabliert werden, wodurch demonstriert wurde, dass XCR1 auf 83 % der CD8+ und 4 % der CD8-CD4- DC der Milz exprimiert wird. Der Phänotyp der XCR1+ DC der Milz unterschied sich deutlich von dem der XCR1- DC. In Milzen von Batf3- und Irf 8-defizienten Mäusen konnten keine XCR1+ DC detektiert werden. Zudem wurde nach Applikation des Wachstumsfaktors Flt3 Ligand in C57BL/6 Mäusen der Anteil der XCR1+ DC signifikant erhöht. Diese Ergebnisse verdeutlichen, dass die Entwicklung der XCR1+ DC von diesen Faktoren abhängig ist. Funktionell waren die XCR1+ DC wesentlich effektiver in der Kreuzpräsentation von löslichen und zellassoziierten Antigenen. Damit kann XCR1 als Oberflächenmarker verwendet werden, um murine kreuzpräsentierende DC zu kennzeichnen. Um herauszufinden, ob XCR1+ DC auch im Menschen existieren, wurde die Expression von XCR1 auf Zellen des humanen peripheren Blutes anhand von qPCR und Durchflusszytometrie untersucht. Ausschließlich CD141+ DC exprimierten XCR1-mRNA und -Protein. Durch die Etablierung einer effektiven Sortierungsstrategie zur Isolierung aller DC-Subtypen konnte erstmals gezeigt werden, dass die CD141+ DC den einzigen effektiven kreuzpräsentierenden DC-Subtyp des Blutes darstellen. XCR1 ist somit auch im humanen System spezifisch auf kreuzpräsentierenden DC exprimiert. Zusammengefasst zeigen die Ergebnisse, dass es sich bei den XCR1+ DC der Maus und des Menschen um funktionelle Homologe handelt. / Cross-presentation by dendritic cells (DC) is a process, in which extracellular antigen is shunted into the MHC I presentation pathway and presented to CD8+ T cells. So far, murine cross-presenting DC were defined by the expression of the molecules CD8 in the spleen and CD103 in the periphery. However, cross-presenting DC have not been characterized in humans. In this work, a flow cytometric staining of XCR1 was established for the first time which allowed the detection of XCR1 on 83 % of CD8+ DC and 4 % of CD8-CD4- DC of the spleen. The phenotype of splenic XCR1+ DC differed markedly from XCR1- DC. Both, Batf3- and Irf 8-deficient mouse strains showed an absence of splenic XCR1+ DC. Furthermore, the frequency of XCR1+ DC was significantly increased in spleens of C57BL/6 mice treated with Flt3 ligand. These results demonstrate that the development of XCR1+ DC is dependent of these factors. To test the ability to cross-present antigen, all splenic conventional DC were sorted according to their expression of CD8 and XCR1. XCR1+ DC were most efficient in cross-presenting soluble and cell-associated antigen to CD8+ T cells. Therefore, XCR1 is the first surface marker that can be used to delineate murine cross-presenting DC and the development of this distinct DC population is strongly dependent on Batf3, IRF-8 and Flt3 ligand. To explore if XCR1+ DC also exist in men, cell populations of human peripheral blood were analysed for their XCR1-expression using qPCR and flow cytometric staining. Only CD141+ DC express XCR1 mRNA and protein. An efficient sorting strategy for the isolation of all DC subsets was established to compare their ability to cross-present soluble and cell-associated antigen. CD141+ DC were the only effective cross-presenting DC subtype. Therefore, XCR1 is also in the human a receptor expressed specifically on cross-presenting DC. In summary, the data show that the XCR1+ DC of mouse and men are functional homologues.

Die vorliegende Studie präsentiert eine Analyse der Integration der AhR und Wnt/beta-catenin Signalwege in den CYP1A1 Promotor sowie den regulatorischen Einfluss der Promotorlogik auf die Genexpression. Experimentell wurde diese Analyse mithilfe 29 mutagener Reporterkonstrukte des humanen CYP1A1 Promotors durchgeführt. Ein mathematisches Modell, welches eine Repräsentation des Crosstalks der Signaltransduktionswege mit einer statistisch mechanischen Beschreibung der kombinatorischen Promotorbelegung kombiniert, komplementierte den experimentellen Ansatz. Unter zusätzlicher Zuhilfenahme von gut kontrollierbaren synthetischen Promotorkonstrukten fand ich heraus, dass nur jenes Dioxin-responsive Element das sich am nächsten am Transkriptionsstartpunkt befindet, die Promotorbelegung an die RNA Polymerase kommuniziert. Außerdem beobachtete ich, dass Transkriptionsfaktoren alleine mit Transkriptionsfaktoren interagieren die mit benachbarten Bindestellen assoziieren, d.h. Interaktionen überbrücken keine größeren Entfernungen. Der Modellierungsansatz ermöglichte zudem die erfolgreiche Vorhersage einer UND-Gatter-ähnlichen Integration der beiden Signalwege in den Promotor. Für die genomische Architektur des CYP1A1 Promotors konnte ich die Signifikanz der Zielbindestelle des Wnt/beta-catenin Signalwegs innerhalb des cis-regulatorischen Region demonstrieren. Mithilfe des Modells fand ich heraus, dass diese Bindestelle am stärksten und vielfältigsten mit den restlichen Transkriptionsfaktoren interagiert. Zusätzliche konnte, im Vergleich zu dem alles-oder-nichts UND-Gatter der synthetischen Konstrukte, eine sehr viel graduellere Antwort auf die Integration der beiden Signalwege aufgezeigt werden. Abschließend wurde das physiologisch zu beobachtende Expressionsmuster von dem Modell vorhergesagt und experimentell validiert. / The study at hand presents an analysis of the integration of the AhR and the Wnt/beta-catenin signaling pathways into the CYP1A1 promoter as well as the regulatory influence of the promoter logic on gene expression. Experimentally, this analysis was conducted with the help of 29 mutant constructs of the human CYP1A1 promoter. I complemented this experimental approach with a set of mathematical models that combined a representation of the signaling crosstalk with a statistical mechanics description of the combinatorial promoter occupancy. With the help of well controllable synthetic promoter constructs I found that only the dioxin responsive element closest to the transcription start site communicates the promoter occupancy to the RNA polymerase. Furthermore, transcription factors only interact with transcription factors that associate with nearby binding sites, i.e., no long-distance binding was observed. The modeling approach subsequently enabled the successful prediction of an AND-gate-like integration of the two signaling pathways into the promoter. For the genomic architecture of the CYP1A1 promoter, I could demonstrate the importance of the Wnt/beta-catenin pathway target binding site within the cis-regulatory region. The model uncovered that this binding site is the strongest and most promiscuous interaction partner of the remaining transcription factors. In addition, a less switch-like response to the integration of the two signaling pathways as compared to the all-or-none AND-gate within the synthetic constructs could be demonstrated. And lastly, the physiological expression pattern in liver lobules could be successfully predicted by the model and experimentally verified.

Der induzierbare Kostimulator ICOS ist ein zu CD28 strukturell und funktionell verwandtes Molekül, das eine wichtige regulatorische Rolle bei der T-Zelleffektorfunktion spielt. Eine ICOS-Defizienz beim Mensch manifestiert sich in einer schweren Störung des humoralen Immunsystems. Eine murine ICOS-Defizienz führt ebenfalls zu einer Beeinträchtigung der T-Zell-abhängigen humoralen Immunantwort, bei der kleinere oder komplett fehlende Keimzentren zu beobachten sind. Vielfältige in vitro und in vivo Studien führten diese Phänomene auf die beeinträchtigte Regulation von Kommunikationsmolekülen der Zelloberfläche und der Zytokinexpression durch ICOS-defiziente T-Zellen zurück. Ein Ziel dieser Arbeit war es, mit Hilfe von ICOS KO Mäusen den Einfluss von ICOS auf die B-Zellentwicklung genauer zu untersuchen. Dabei konnte gezeigt werden, dass ICOS erst in der späten Phase der B-Zellentwicklung eine Rolle spielt, da der Interaktionspartner von ICOS erst auf transitionellen B-Zellen der Milz exprimiert wird. Durch die Etablierung eines in vivo adoptiven T-B Transfermodells konnte die Rolle von ICOS erstmalig bei der T-B Kooperation in den frühen Phasen der Immunantwort auf der Ebene Antigen-spezifischer T- und B-Zellen aufgeklärt werden. Dabei konnte beobachtet werden, dass eine ICOS-Defizienz einen dramatischen Einfluss auf die B-Zellexpansion und B-Zellproliferation hat. Zum ersten Mal konnte in vivo gezeigt werden, dass ICOS bei der T-B Kooperation eine entscheidende Rolle bei der Regulation diverser Oberflächenmarker der B-Zellen spielt, wodurch die B-Zellaktivierung, B-Zellproliferation und B-Zelldifferenzierung bei der Keimzentrums- und Plasmazellreaktion beeinflusst werden. Histologische Analysen zeigten, dass bei einer ICOS-Defizienz follikuläre T-Helferzellen nicht in die Keimzentrumsumgebung einwandern und daher keine T-Zellhilfe für die B-Zellen anbieten können. Dadurch kann die Keimzentrumsreaktion nicht weiter aufrechterhalten werden und eine Ausbildung von kleineren Keimzentren ist die Folge. Weiterhin konnte beobachtet werden, dass eine fehlende ICOS-Interaktion zwischen T- und B-Zellen zu einer Störung der Plasmazellgenerierung führt, wodurch auch die Mengen an messbaren Serumimmunglobulinen beeinflusst werden. Eine erhöhte Gabe von ICOS-defizienten T-Zellen kann diese Effekte nicht vollständig ausgleichen. Daher ist erkennbar, dass ICOS eine Vielzahl von zusätzlichen Faktoren beeinflusst, die für die ICOS-abhängigen B-Zelleffekte verantwortlich sind. / The inducible costimulator ICOS, structural and functional similar to CD28, plays an important regulatory role in T cell receptor function. The ICOS deficiency in humans is described as a severe dysfunction of the humoral immune response, resulting in dramatic reduced B cell numbers and impaired antibody response against pathogens. The murine ICOS-deficiency also leads to a disturbed T cell dependent immune response resulting in a reduced germinal center formation. Various in vitro and in vivo studies attributes this phenomenon to impaired upregulation of cell surface communication molecules and cytokine synthesis by ICOS-deficient T cells. In this work the investigations with ICOS KO mice should clarify the impact of ICOS in B cell development. As observed, ICOS can only play a role in the late phase B cell development, because the interaction partner is expressed on transitional B cells in the spleen. The establishment of an in vivo adoptive T-B transfer system could determine for the first time the role of ICOS in T-B cooperation in early immune response stages on antigen specific T and B cell levels. As shown, ICOS deficiency influences in a dramatic extend the B cell expansion and B cell proliferation. For the first time in vivo, we could demonstrate that ICOS plays a significant role by influencing the regulation of various B cell surface markers, which affects the B cell activation, B cell proliferation and B differentiation in germinal center or plasma cell reaction. Histological investigations revealed in the ICOS-deficiency that follicular T helper cells could not migrate into the germinal center microenvironment and therefore could not provide T cell help for B cells. As a result, the germinal center reaction could not maintained and therefore the formation of little germinal centers occurred. The missing interaction between T and B cells leads to a dysfunction in plasma cell generation and also influences the detectable amounts of serum immunglobulines. An administration of higher ICOS KO T cell numbers could not fully compensate these effects. Therefore, ICOS bias multitudes of additional factors, which are responsible for the ICOS dependent B cell effects.