In der eukaryotischen Ontogenese ist die Etablierung differenzierungsspezifischer Genexpression eng an die Unterteilung des Genoms in funktionell getrennte Domänen gekoppelt. Solche Domänen lassen entweder erhöhte transkriptionelle Aktivität zu oder unterdrücken sie und werden Eu- bzw. Heterochromatin genannt. Heterochromatin enthält spezielle Proteine, die zur Ausbildung dieser repressiven Chromatinstruktur beitragen. Eine der Hauptfragen in der Heterochromatinbiologie ist, wie solche Proteine rekrutiert werden. Dieser Prozess ist entscheidend damit einzelnde Regionen im Genom koordiniert zeit- und ortsabhängig reprimiert werden können. In Saccharomyces cerevisiae entsteht Hetero-chromatin an den silent-mating-type Loci HMRa und HMLalpha durch die zielgerichtete Rekrutierung des Sir-Komplexes über eine Gruppe von Proteinen, die an sogenannte silencer-DNA Sequenzen binden. In diese Arbeit wird gezeigt, daß das Protein Sum1, bisher bekannt als Repressor meiotischer Gene im vegetativen Zellzyklus, als Heterochromatin-Rekrutierungsfaktor für HMLalpha fungiert. Sum1 konnte in vitro und in vivo an HMLalpha über ein funktionelles Element innerhalb des HML-E silencers binden und die Deletion von SUM1 verursachte einen Verlust von Repression an HMLalpha. SUM1 beeinflußte außerdem die Fähigkeit von HML-E als Replikationsstartpunkt (origin) zu agieren, was eine Rolle von Sum1 in der Replikation nahelegt. Die Beobachtung, daß orc2-1 und orc5-1 mit sum1Delta synthetisch lethal waren und daß cdc6-1, cdc7-1 oder cdc45-1 mit sum1Delta einen synthetischen Wachstumsdefekt aufwiesen unterstützt die Vermutung, daß SUM1 eine globale Rolle in der Replikationsinitiation besitzt. In einer genomweiten Suche wurden ARS Elemente gefunden, die sowohl Sum1 als auch ORC rekrutieren. Dabei konnte gezeigt werden, daß die Replikationsaktivität dieser ARS Elemente von Sum1 bzw. Sum1 Bindungsstellen abhängig war. Als Repressor von meiosespezifischen Genen interagiert Sum1 oft mit der Histondeacetylase Hst1. In diesem Zusammenhang konnte gezeigt werden, daß SUM1-regulierte origins ebenfalls HST1 zur vollen Aktivität benötigten. Zusammenfassend schlagen wir Sum1 als neuartigen Modulator für die Replikationsinitiation an einer Untergruppe chromosomaler Replikationsstartpunkte vor. / The division of eukaryotic chromatin into functionally distinct domains is critical to implement gene expression programs that drive the development of multicellular organisms. Regions termed euchromatin exist in the genome that are generally conducive to transcription, whereas heterochromatin contains specialized chromatin binding proteins that repress transcription in these regions. A central question in heterochromatin biology is how the heterochromatin factors are targeted to specific genomic regions, a process that is crucial to ensure that the designated domains, and only they, are repressed in the appropriate spatial and temporal fashion. In Saccharomyces cerevisiae heterochromatinization at the silent mating-type loci HMRa and HMLalpha is achieved by targeting the Sir complex to these regions via a set of anchor proteins that bind to the silencers. Here, we have identified a novel heterochromatin targeting factor for HMLalpha, the protein Sum1, a repressor of meiotic genes during vegetative growth. Sum1 bound both in vitro and in vivo to HMLalpha via a functional element within the HML-E silencer, and deletion of SUM1 caused HMLalpha derepression. Significantly SUM1 was also required for origin activity of HML-E, suggesting a role of Sum1 in replication initiation. Our observations of a synthetic lethality between orc2-1 or orc5-1 and sum1Delta as well as a synthetic growth defect of cdc6-1, cdc7-1 and cdc45-1 with sum1Delta support the notion that SUM1 has a global role in replication initiation. In a genome-wide search for Sum1-regulated origins, we identified a set of autonomous replicative sequences (ARS elements) that bound both the origin recognition complex and Sum1. Full initiation activity of these origins required Sum1, and their origin activity was decreased upon removal of the Sum1 binding site. In its role as a repressor of meiosis specific genes, Sum1 often works in concert with the histone deacetylase Hst1. We found that SUM1-regulated origins also required HST1 for full activity. Taken together we propose that Sum1 is a novel replication initiation modulator for a subset of chromosomal origins.

Die Durchführung von Experimenten und das mathematische Modellieren von zellulären Prozessen gehören in der Systembiologie untrennbar zusammen. Das gemeinsame Ziel ist die Aufklärung des Zusammenspiels intrazellulärer Prozesse wie Metabolismus, Genexpression oder Signaltransduktion. Während sich molekularbiologische Untersuchungen mit den molekularen Mechanismen einzelner isolierter Systeme beschäftigen, zielt die Systembiologie auf die Aufklärung der Zusammenhänge ganzer Prozesse und schließlich auch ganzer Zellen ab. Die Verfügbarkeit von umfangreichen Datensätzen und die steigenden Möglichkeiten im Bereich der Computersimulation haben in den letzten Jahren den Weg geebnet, um auch Ganzzellsimulationen nicht mehr unmöglich erscheinen zu lassen. Diese Arbeit stellt das erste eukaryotische Ganzzellmodell der Bäckerhefe Saccharomyces cerevisiae vor. Hefe als eukaryotischer Modellorganismus ist hierbei der perfekte Kandidat für die Erstellung eines solchen Modells. Er bietet, als wohl meist erforschter eukaryotischer Einzeller in Verbindung mit der Verfügbarkeit einer großen Menge experimenteller Daten, beste Voraussetzungen zur Erstellung eines solchen Modells. Das Projekt ist hierbei in drei Teile gegliedert: i) Die Erstellung eines modularen Ganzzellmodells das alle zellulären Funktionen wie Zellzyklus, Genexpression, Metabolismus, Transport und Wachstum abbildet. ii) Die Implementation einer spezialisierten Simulationsumgebung in Verbindung mit einer Datenbank, um die Erstellung, Simulation und Parametrisierung von Modulen zu ermöglichen. iii) Die Durchführung von Experimenten, um einen ganzheitlichen Datensatz zu erlangen, der Wachstum, Genexpression und Metabolismus abbildet. Die hier vorgestellte Arbeit liefert nicht nur ein mathematisches Modell, sondern benennt auch die Herausforderungen, die während der Arbeit an einem Ganzzellmodell auftreten und stellt mögliche Lösungsansätze vor. / In systems biology experiments and mathematical modeling are going hand in hand to gain and increase understanding of cellular processes like metabolism, gene expression, or signaling pathways. While molecular biology investigates single isolated parts and molecular mechanisms of cellular processes, systems biology aims at unraveling the whole process and ultimately whole organisms. Today the availability of comprehensive high-throughput data and computational power paved the way to increase the size of analyzed systems to reach the cellular level. This thesis presents the first whole-cell model (WCM) of a eukaryotic cell, the yeast Saccharomyces cerevisiae. This established model organism is the perfect candidate for the implementation of a holistic model based on the available experimental data and the accumulated biological knowledge. The project is split into three parts: i) The creation of a modular functional-complete whole-cell model, combining the processes cell cycle, gene expression, metabolism, transport, and growth. ii) The implementation of a specialized simulation environment and a database to support module creation, simulation, and parameterization. iii) The elicitation of experimental data by conducting an experiment to achieve a comprehensive data set for parameterization, combining growth, metabolic, proteomic, and transcriptomic data. The presented work provides not only a simple mathematical model but also addresses challenges occurring during the development of whole-cell models and names possible solutions and new methodologies required for the creation of WCMs.

Die MYST-HAT Sas2 in Saccharomyces cerevisiae acetyliert Histon H4 an Lysin 16 (H4 K16Ac), was die Heterochromatinausbreitung an Telomeren begrenzt. Sas2 interagiert mit den Histonchaperonen Asf1 und CAF-1. Da CAF-1 während der DNA-Replikation in der S-Phase aktiv ist, ergab sich die Hypothese, dass Sas2-katalysiertes H4 K16Ac genomweit während der S-Phase ins Chromatin eingebaut wird. Durch Aktivierung von Sas2 stieg die Menge von H4 K16Ac in der S-Phase, aber nicht in der G1-Phase, in Abhängigkeit von Asf1 und CAF-1 an. Dieses H4 K16Ac wurde jedoch nicht ins Chromatin eingebaut. Dies deutete auf die Existenz eines H4 K16Ac-Pools hin. Sas2-katalysiertes H4 K16Ac hat auch eine genomweite Funktion, da das H4 K16Ac-Niveau an ORFs in sas2D Zellen vermindert ist. Eine Hypothese ist, dass H4 K16Ac euchromatische Gene vor SIR-vermittelter transkriptioneller Stilllegung schützt. Entsprechend ist das H4 K16Ac-Niveau an schwach transkribierten Genen hoch und an stark transkribierten Genen niedrig. Wir konnten zeigen, dass sich H4 K16Ac an GAL-Genen während deren Repression anreichert. Dieser H4 K16Ac-Einbau ist abhängig vom Histonchaperon Spt6. In spt6-1004 Zellen war das H4 K16Ac-Niveau an stark sowie an schwach transkribierten Genen höher als im Wildtyp, während die H4-Menge an diesen Genen reduziert war. Dies weist auf einen indirekten Effekt von Spt6 hin, indem es das H4 K16Ac-Niveau durch den Einbau von K16-unacetyliertem H4 während der Transkription reguliert. Die Abwesenheit anderer Histonchaperone (Asf1, CAF-1, HIR, Rtt106) hatte keinen Einfluss auf den repressionsgekoppelten H4 K16Ac-Einbau. Weiterhin konnten wir zeigen, dass H4 K16Ac nicht notwendig ist, um die Bindung des SIR-Komplexes an euchromatischen Genen zu verhindern, da das verminderte H4 K16Ac-Niveau an ORFs in sas2D Zellen nicht auf Deacetylierung durch Sir2 zurückzuführen war. Daher verhindert Sas2-katalysiertes H4 K16Ac die SIR-Bindung nur an subtelomerischen Loci, jedoch nicht in genomweitem Maßstab. / In Saccharomyces cerevisiae, the MYST HAT Sas2 acetylates histone H4 lysine 16 (H4 K16Ac), which prevents the spreading of heterochromatin at telomeres. Sas2 interacts with the histone chaperones Asf1 and CAF-1, the latter of which is active during DNA replication in S-phase, suggesting a genome-wide incorporation of Sas2-mediated H4 K16Ac during S-phase. Upon activation of Sas2, H4 K16Ac on bulk histone H4 increased during S-phase, but not G1-phase, in an Asf1- and CAF-1-dependent manner. Unexpectedly, H4 K16Ac was not incorporated into chromatin during S-phase following its acetylation, which suggested the existence of a nuclear pool of H4 K16Ac. Moreover, Sas2-mediated H4 K16Ac is suggested to have a genome-wide function, since in sas2D cells, H4 K16Ac is decreased at ORFs. One hypothesis is that Sas2-mediated H4 K16Ac might protect euchromatic genes from being spuriously silenced by SIR proteins. Accordingly, H4 K16Ac is highly enriched at poorly transcribed genes, but not at highly expressed genes. In this study, we found that H4 K16Ac became enriched at GAL genes upon repression. Importantly, this H4 K16Ac incorporation required the histone chaperone Spt6. In spt6-1004 cells, H4 K16Ac levels were higher at highly and poorly transcribed genes compared to wild type, whereas H4 occupancy was lower than in wild type. The data suggested an indirect effect of Spt6 in that it regulates H4 K16Ac levels by the incorporation of K16-unacetylated histone H4 during transcription. In contrast, the absence of other histone chaperones (Asf1, CAF-1, HIR, Rtt106) had no effect on H4 K16Ac enrichment upon gene repression. Moreover, we could show that H4 K16Ac was not necessary to prevent the erroneous binding of the SIR complex in euchromatic regions. The decrease of H4 K16Ac at ORFs in sas2∆ cells was not caused by an activity of the HDAC Sir2. Thus, Sas2-mediated H4 K16Ac prevents the binding of the SIR complex only at subtelomeric loci, but not on a genome-wide scale.

SH3-Domänen sind Proteinmodule, die über die Erkennung prolinreicher Peptidsequenzen Protein-Protein-Interaktionen in einer Vielzahl von zellulären Prozessen vermitteln. In der vorliegenden Arbeit wurde die Erkennung von Peptidliganden durch ausgewählte SH3–Domänen hinsichtlich Selektivität versus Promiskuität untersucht. Diese Arbeiten dienten als Vorversuche für einen kompletten proteomischen Ansatz aller SH3-Domänen aus S. cerevisiae. Für die vier ausgewählten SH3-Domänen, nämlich Myo5, Abp1, Yhr016 und Rvs167, wurden die Ligandenpräferenzen durch Interaktionsanalysen mit einem vollständigen Satz prolinreichen Peptidliganden, abgeleitet aus dem Hefeproteom ermittelt. Hierzu wurde ein Peptid–Array Ansatz gewählt. Mit der SPOT-Technologie wurden 2953 15mere Peptide als Array auf einem Celluloseträger Schritt für Schritt synthetisiert. Hierfür wurde zuerst die Art des Celluloseträgers festgelegt und anschließend überprüft, ob sich ein Array mehrmals in Interaktionsexperimenten verwenden lässt. Es zeigte sich, dass eine Regeneration der Arrays nicht möglich war, so dass für jedes Interaktionsexperiment ein neues Peptidarray synthetisiert werden musste. Die Interaktionsstudien bestätigten die Bindung prolinreicher Sequenzmotive als eine universelle Eigenschaft der vier SH3-Domänen, wobei die einzelnen SH3–Domänen-Peptid-Interaktionen von zusätzlichen, spezifitätsdetermierenden Resten im Liganden abhängig waren. Darüber hinaus zeigten die Experimente deutliche Unterschiede hinsichtlich Selektivität und Promiskuität im Erkennungsverhalten der vier Domänen. Die Domänen konnten nach steigender Selektivität an Hand der Bestimmung von Grenzwerten und Integralen geordnet werden, nämlich Myo5 < Abp1 < Yhr016 < Rvs167. Ein gemeinsamer Ligand für alle vier Domänen konnte nicht identifiziert werden. Dagegen konnten gemeinsame Liganden für die Domänenpaare Myo5/Abp1 und Yhr016/Rvs167 bestimmt werden. Die Bindungspräferenzen zweier ausgewählter Liganden, dem Myo5/Abp1 Liganden ERPKRRAPPPAPKKP und dem Yhr016/Rvs167 Liganden VQQDSLPKLPFRSWG, wurden mit Hilfe von Substitutions- und Längenanalysen detailliert charakterisiert. Es zeigte sich deutlich, dass die selektiveren SH3-Domänen Yhr016 und Rvs167 einen klar definierten und kurzen Konsensus im Liganden binden, hingegen die mehr promiskuitiven Domänen Myo5 und Abp1 ein stärker variables und längeres Motiv im Liganden erkennen. Die Ergebnisse dieser Arbeit zeigten, dass die hier gewählte Methode geeignet ist, die proteomische Charakterisierung aller dreißig Hefe SH3-Domänen in Angriff zu nehmen. / SH3-Domains are protein modules, which recognize polyproline sequences. The Domains are involved in a variety of cellular processes. The recognition rules between peptide ligands and selected SH3-Domains were analysed in respect of selectivity versus promiscuity. This dissertation is a preliminary test for subsequent scanning the whole number of yeast SH3-Domains. The SH3-Domains Myo5, Abp1, Yhr016 and Rvs167 were selected and chosen for interaction with all yeast polyproline ligands. A peptide array was chosen and built up with SPOT-Synthesis. 2953 15-mere peptides were spotted as an array on a cellulose membrane and inspected for regeneration method. The regeneration failed and therefore four arrays were synthesised. The scanning experiments revealed an interaction between Ligand and Domain with a common polyproline core. However, these experiments demonstrated as well that specific residues were needed for operative ligand domain interaction. In addition, these four SH3-Domains exhibited clear differences in selectivity and promiscuity of recognition profiles. The integrals and the results after the setting of the threshold showed a distinct increase in selectivity. The arrangement was based on the increasing selectivity: 1. Myo5 2. Abp1 3. but cases of consistency were found between Abp1- and Myo5-SH3, as well as ligands between Yhr16- and Rvs167-SH3. The Myo5-/Abp1-Ligand ERPKRRAPPPAPKKP and the Yhr016-/Rvs167 ligand VQQDSLPKLPFRSWG were selected for characterisation of the peptide domain interaction through the analysis of substitution and length. The data showed that more selective Domains like Yhr016 and Rvs167 had a well-defined and short consensus, whereas more promiscuous Domains like Yhr016 and Rvs167 showed a mutable and longer consensus. In conclusion, the data showed that the SPOT-Synthesis is a suitable technique for a proteomic characterisation of the whole 30 yeast SH3-Domains.

Die LAMMER-Kinasen sind Dual-Spezifität-Proteinkinasen, die durch das namensgebende einzigartige LAMMER-Motiv gekennzeichnet sind. Sie sind evolutionär hoch konserviert und in den meisten Eukaryonten vorhanden. Die vorliegende Arbeit stellt die erste funktionelle Charakterisierung eines bisher kaum erforschten Vertreters der LAMMER-Proteinkinase Familie Kns1 aus der Bäckerhefe dar. Phänotypische Analysen belegten eine entscheidende Rolle für Kns1 in der Regulation der Toleranz gegenüber basischem pH-Stress. Das Entfernen des KNS1 Gens führte zu einer gesteigerten Empfindlichkeit der Zellen gegenüber basischen Wachstumsbedingungen. Weitere Analysen zeigten, dass Kns1 neben der katalytischen Aktivität auch nicht-katalytischen Mechanismen zur Förderung des Zellwachstums unter alkalischem pH-Stress nutzt. Die Reinigung des Kns1 Proteins in voller Länge aus E. coli ermöglichte die Identifizierung von neun in vitro-Autophosphorylierungsstellen mittels Massenspektrometrie. Die Mutation von Thr562, eine Autophosphorylierungsstelle innerhalb des LAMMER-Motivs, zu Alanin ergab in vitro eine Kinase mit intrinsischer katalytischer Aktivität, die sich jedoch in vivo hauptsächlich wie die katalytisch inaktive Kns1-Mutante verhielt. Die Calcium/Calmodulin-abhängige Proteinkinase II Cmk2, die konstitutiv autokatalytische Eigenschaften besitzt, wurde früher als mögliches in vitro Substrat von Kns1 vorgeschlagen. In dieser Arbeit beweise ich durch Verwendung einer katalytisch inaktiven Cmk2-Mutante als Substrat, dass Kns1 Cmk2 in vitro phosphoryliert. Darüber hinaus zeige ich, dass Cmk2 die basische pH-Toleranz der Zellen beschränkt. Gestützt durch genetische Hinweise agieren beide Proteine gemeinsam bei der Regulation der alkalischen Stresstoleranz, wobei Kns1 möglicherweise Cmk2 herabreguliert. Zusammenfassend beschreibt diese Arbeit eine neue und entscheidende Rolle von Kns1 und Cmk2 bei der Anpassung der Hefe an alkalisches Milieu. / The LAMMER protein kinases, termed after a unique signature motif found in their catalytic domains, are an evolutionary conserved family of dual-specificity kinases that are present in most eukaryotes. Here I report the first functional characterization of one of the most unexplored members of the LAMMER family, the budding yeast Kns1. Phenotypic analysis uncovered a crucial role for Kns1 in the control of the yeast tolerance to high pH stress. Deletion of the KNS1 gene conferred high sensitivity to alkaline pH, whereas its overexpression increased tolerance to this stress. Further analysis established that Kns1 promotes growth under alkaline pH stress using not only its catalytic activity but also non-catalytic mechanisms. Large-scale purification of full-length Kns1 from E. coli allowed for the identification of nine in vitro autophosphorylation sites on Kns1 by mass spectrometry. Mutation of the threonine residue at position 562, an autophosphorylation site located within the LAMMER motif, to a non-phosphorylatable residue yielded a kinase that preserves intrinsic catalytic activity in vitro but mostly behaves like the catalytically inactive mutant in vivo. This finding showed the physiological importance of autophosphorylation site Thr562 in the regulation of Kns1 function. The protein Cmk2, a calcium/calmodulin-dependent protein kinase II with autocatalytic properties, has been previously proposed as a possible in vitro substrate for Kns1. Here I demonstrate that Kns1 phosphorylates Cmk2 in vitro using a catalytically inactive Cmk2 mutant as substrate and show that Cmk2 restricts alkaline tolerance. Genetic evidence suggested that both proteins act in concert on a common pathway, in which Kns1 may downregulate Cmk2 to confer alkaline tolerance. In conclusion, this thesis describes a novel and crucial role for Kns1 and its in vitro substrate Cmk2 in the adaptation of yeast to alkaline stress.

Der Zellzyklus organisiert die Zellteilung, und kontrolliert die Replikation der DNA sowie die Weitergabe des Genoms an die nächste Zellgeneration. Er unterliegt einer strengen Kontrolle auf molekularer Ebene. Diese molekularen Kontrollmechanismen sind für das Überleben eines Organismus essentiell, da Fehler Krankheiten begüngstigen können. Vor allem Krebs ist assoziiert mit Abweichungen im Ablauf des Zellzyklus. Die Aufklärung solcher Kontrollmechanismen auf molekularer Ebene ermöglicht einerseits das Verständnis deren grundlegender Funktionsweise, andererseits können solche Erkenntnisse dazu beitragen, Methoden zu entwickeln um den Zellzyklus steuern zu können. Um die molekularen Abläufe des Zellzyklus in ihrer Gesamtheit besser zu verstehen, eignen sich computergestützte Analysen. Beim Zellzyklus handelt es sich um einen Signaltransduktionsweg. Die Eigenschaften dieser Prozesse stellen Rekonstruktion und Übersetzung in digital lesbare Formate vor besondere Herausforderungen in Bezug auf Skalierbarkeit, Simulierbarkeit und Parameterschätzung. Diese Studie präsentiert eine großskalige Netzwerkrekonstruktion des Zellzyklus des Modellorganismus Saccharomyces cerevisiae. Hierfür wurde die reaction-contingency Sprache benutzt, die sowohl eine mechanistisch detaillierte Rekonstruktion auf molekularer Ebene zulässt, als auch deren Übersetzung in ein bipartites Boolesches Modell. Für das Boolesche Modell mit 2506 Knoten konnte ein zyklischer Attraktor bestimmt werden, der das Verhalten einer sich teilenden Hefezelle darstellt. Das Boolesche Modell reproduziert zudem das erwartete phänotypische Verhalten bei Aktivierung von vier Zellzyklusinhibitoren, und in 32 von 37 getesteten Mutanten. Die Rekonstruktion des Zellzyklus der Hefe kann in Folgestudien genutzt werden, um Signaltransduktionswege zu integrieren, die mit dem Zellzyklus interferieren, deren Schnittstellen aufzuzeigen, und dem Ziel, die molekularen Mechanismen einer ganzen Zelle abzubilden, näher zu kommen. Diese Studie zeigt zudem, dass eine auf reaction- contingency Sprache basierte Rekonstruktion geeignet ist, um ein biologisches Netzwerk konsistent mit empirischer Daten darzustellen, und gleichzeitig durch Simulation die Funktionalität des Netzwerkes zu überprüfen. / The survival of a species depends on the correct transmission of an intact genome from one generation to the next. The cell cycle regulates this process and its correct execution is vital for survival of a species. The cell cycle underlies a strict control mechanism ensuring accurate cell cycle progression, as aberrations in cell cycle progression are often linked to serious defects and diseases such as cancer. Understanding this regulatory machinery of the cell cycle offers insights into how life functions on a molecular level and also provides for a better understanding of diseases and possible approaches to control them. Cell cycle control is furthermore a complex mechanism and studying it holistically provides for understanding its collective properties. Computational approaches facilitate holistic cell cycle control studies. However, the properties of the cell cycle control network challenge large-scale in silico studies with respect to scalability, model execution and parameter estimation. This thesis presents a mechanistically detailed and executable large-scale reconstruction of the Saccharomyces cerevisiae cell cycle control network based on reaction- contingency language. The reconstruction accounts for 229 proteins and consists of three individual cycles corresponding to the macroscopic events of DNA replication, spindle pole body duplication, and bud emergence and growth. The reconstruction translated into a bipartite Boolean model has, using an initial state determined with a priori knowledge, a cyclic attractor which reproduces the cyclic behavior of a wildtype yeast cell. The bipartite Boolean model has 2506 nodes and correctly responds to four cell cycle arrest chemicals. Furthermore, the bipartite Boolean model was used in a mutational study where 37 mutants were tested and 32 mutants found to reproduce known phenotypes. The reconstruction of the cell cycle control network of S. cerevisiae demonstrates the power of the reaction-contingency based approach, and paves the way for network extension with regard to the cell cycle machinery itself, and several signal transduction pathways interfering with the cell cycle.

Der eukaryotische Zellzyklus ist auf allen Ebenen der Genexpres- sion reguliert. Sowohl breit angelegte genetische Screens als auch funktionale Studien zu den beteiligten Proteinen haben unser Ver- ständnis dieses fundamentalen Prozesses geprägt. In dieser Arbeit behandle ich räumliche Aspekte der post-transkriptionalen Regulation des Zellzyklus, die mit lichtmikroskopischen Einzelzell- und Einzel- molekülmethoden experimentell zugänglich werden. Insbesondere untersuchte ich die subzelluläre Lokalisierung der messenger RNA von CLB2, einem zentralen Regulator der Mitose im eukaryotischen Modellorganismus Saccharomyces cerevisiae (Bierhefe). Frühere Studien zeigten, dass diese RNA sich im Laufe des vegetativen Zellwachstums in der entstehenden Tochterzelle, der Knospe, anreichert. Mithilfe modernster Fluoreszenzmikroskopie charakterisierte ich die Bewe- gung und Verteilung einzelner CLB2 messenger RNA-Moleküle auf Zeitskalen von Millisekunden bis hin zur Generationszeit dieser He- fen. Ich zeigte, dass sich mit Hilfe von Multifokusmikroskopie unter Verwendung optimierter Fluoreszenzmarker und der Entwicklung objektiver Analysemethoden die Bewegung einzelner RNA-Moleküle zwischen Mutterzelle und Knospe nachvollziehen lässt. Dazu präsen- tiere ich eine Methode um die beobachteten Trajektorien der messenger RNA mathematischen Analysen der Systembiologie zugänglich zu machen. Weiterhin gab die Beobachtung der Verteilung einzelner CLB2 messenger RNA Moleküle über den Zellzyklus hinweg mittels einer neuartigen Lichtblattmikroskopie (Lattice Light Sheet Microscopy) Hinweise auf eine bisher unbekannte Dynamik in der Lokalisierung dieser messenger RNA. Die hier entwickelten Methoden ermöglichen eine quantitative Untersuchung räumlicher Aspekte der posttranskrip- tionalen Zellzyklusregulation. / The eukaryotic cell cycle is regulated on all levels of gene expression. Genetic screens and functional studies of the involved proteins have shaped our understanding of this fundamental process. In this thesis I use single cell and single molecule light microscopy methods to investigate spatial aspects of post-transcriptional cell cycle regulation. I investigated the subcellular localization of CLB2 mRNA, a central regulator of mitosis in the eukaryotic model organism Saccharomyces cerevisiae (baker’s yeast). Previous studies have shown that that this messenger RNA is enriched in the emerging daughter cell, the bud, during vegetative growth. Using pre-commercial fluorescence micro- scopes I characterized the dynamics and partitioning of single CLB2 mRNA on time scales from milliseconds to the generation time of this yeast. I demonstrate that using aberration corrected multifocus mi- croscopy, optimized fluorescent markers, and here developed objective analysis methods, the translocation of single mRNA molecules be- tween mother and bud can be observed. In addition, I report a method to make these trajectories available for the mathematical approaches of Systems Biology. Further, the observation of single CLB2 mRNA partitioning throughout the cell cycle with the use of lattice light sheet microscopy suggested a previously unknown localization behavior of the transcript. The methods developed here enable a quantitative analysis of spatial aspects of post-transcriptional cell cycle regulation.

Saccharomyces cerevisiae ist ein bekanntester Modellorganismen in der Systembiologie, der häufig zur Untersuchung des mitotischen Zellzyklus eukaryotischer Zellen verwendet wird. Des Zellzyklus wird durch Cycline, Cyclin-abhängige Kinasen (CDK) und CDK-Inhibitoren (CKI) reguliert. Der wichtigste Kontrollpunkt innerhalb des Zellzyklus reguliert den Übergang von der G1 in die S Phase und wird START genannt. Im dieser Arbeit verwenden wir einen stochastischen Modellierungsansatz, um die Auswirkungen verschiedener Synchronisationsmethoden auf den Zellzyklus zu untersuchen. Um Modellparameter zu schätzen, kombinieren wir Phasen aufgelöste mRNA-Verteilungen unsynchronisierter Einzelzellen und Protein-Zeitreihen synchronisierter Zellpopulationen. Somit können wir mRNA-Dynamiken für ausgewählte Synchronisationsmethoden vorhersagen. In einem zweistufigen Optimierungsansatz unterscheiden wir zwischen mRNA- und Protein-Ebene. Die Parameterschätzung basiert auf der Maximum-Likelihood-Methode. Die Phasen aufgelösten mRNA-Verteilungen wurden mithilfe der smFISH-Technik für SIC1, CLN2 und CLB5 gemessen. Die Protein-Zeitreihen wurden mithilfe von Western Blots für entsprechenden Proteine gemessen. Die gemessenen Moleküle sind die Hauptregulatoren des G1-S Phasenübergangs, welche die Komponenten unseres Zellzyklusmodells darstellen. Durch die erfolgreiche Integration von qualitativ unterschiedlichen Datentypen in der Parameterschätzung konnten wir eine systematische Analyse von Synchronisationseffekten auf den Zellzyklus durchführen. Der zeitlicher Ablauf des Zellzyklus ist dabei maßgeblich beeinflusst. Die stärksten zeitlichen Veränderungen weist die Synchronisation mit alpha-Faktor auf. Elutrierte Zellen sind den unsynchronisierten Zellen trotz verlängerter G1 Phase am ähnlichsten. Wir zeigen in dieser Arbeit, dass synchronisierte Zellpopulationen unzureichend sind, um Rückschlüsse auf den Zellzyklus unsynchronisierter Zellen zu ziehen. / cell cycle, G1/S transition, stochastic modeling, parameter estimation, smFISH, singel cells, Western blotting, cell populations Saccharomyces cerevisiae is a famous model organism in systems biology to study the mitotic cell cycle in eukaryotic cells. The cell cycle is a highly controlled process which is regulated by cyclins, cycline-dependent kinases (CDK) and cyclin-dependent kinase inhibitors (CKI). The main kinase involved in cell cycle regulation is Cdc28. START is the most important check point and controls the G1 to S phase transition. At this point, cells decide if they enter a new cell division cycle or not. In this study, we analyze influences of different synchronization methods on the cell cycle and differences between unsynchronized and synchronized cells by using a stochastic modeling approach. We combine phase-resolved mRNA distributions of unsynchronized single cells and protein time courses of synchronized cell populations to estimate model parameters and to predict synchronization specific mRNA dynamics. Parameter estimation is based on a maximum likelihood approach and performed in a 2-step-optimization in which we differentiate between mRNA and protein level. We measured phase-resolved mRNA distributions of mRNA species SIC1, CLN2 and CLB5 by smFISH and protein time courses of protein species Sic1, Cln2 and Clb5 by Western blotting. These molecules are key regulators of the G1 to S phase transition and represent components of our cell cycle model. By integrating qualitatively different data types in parameter estimation, we come up with a systematic analysis of synchronization effects on the cell cycle. Cell cycle timing is mainly responsible for differences between unsynchronized and synchronized cells and is mostly affected in alpha-factor synchronized cells. Ignoring the prolongation of the G1 phase, elutriated cells are most similar to unsynchronized cells. We show that synchronized cell populations are insufficient to derive general cell cycle behavior of unsynchronized cells.