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Strukturelle und funktionelle Analyse von chromosomalen Domänen mit Hilfe sequenz-spezifischer Rekombination in DrosophilaZielke, Thomas 12 June 2015 (has links)
Polytäne Riesenchromosomen von Drosophila melanogaster bieten ein ideales Modellsystem für die Untersuchung der Mechanismen zur strukturellen Bildung chromosomaler Domänen. Über Manipulation und Rekonstruktion des chromosomalen Bandenmusters polytäner Chromosomen können artifiziell kondensierte als auch dekondensierte Domänen etabliert werden. Diese Eigenschaft habe ich in meiner Arbeit genutzt für die Etablierung eines experimentellen Systems zur Analyse der strukturellen Vorraussetzungen zur Bildung offener Chromatindomänen. Dafür wurde eine transgene kondensierte Chromatindomäne ektopisch innerhalb offenen Chromatins generiert. Diese kondensierte „Modellbande“ bietet einen definierten genetischen Hintergrund für die gezielte Insertion von DNA-Sequenzen unter Ausschluss variabler Positionseffekte und ermöglicht dadurch eine vergleichende Analyse dieser Sequenzen auf ihr Vermögen offenes Chromatin zu bilden. Zu diesem Zweck wurde über Sequenz-spezifische Rekombination die 61C7/8 Interbandensequenz gezielt in die „Modellbande“ eingefügt. Die zytogenetische Untersuchung dieser Insertion zeigt, dass infolge der Insertion offenes Chromatin gebildet wird, was in einer Aufsplittung der kondensierten „Modellbande“ resultiert. Molekulare Analysen weisen darauf hin, dass auch die epigenetischen Charakteristika wie z.B. die Rekrutierung typischer Proteine oder transkriptionelle Eigenschaften zur endogenen Domäne immitiert werden. Über Deletionsanalysen konnte von mir die essentielle DNA-Sequenz zur Bildung offenen Chromatins auf ein ~490bp großes Fragment im proximalen Bereich der 61C7/8 Sequenz kartiert werden. Dieses Fragment überlappt mit Bindungsstellen spezifischer Proteine, welche dafür bekannt sind eine Rolle in der chromosomalen Domänenbildung zu spielen wie z.B. das Chromatin-Protein Chriz, die Histon-Kinase Jil1 oder das Insulator-Protein CP190. Desweiteren überlappt es mit einer Promoterregion, welche zwischen den Genen Rev1 und Med30 lokalisiert ist. / Polytene chromosomes of Drosophila melanogaster provides an ideal model-system for the analysis of the mechanisms needed for chromosomal domain formation. Condensed as well as decondensed chromosomal domains can be formed by manipulating and reconstructing the polytene banding pattern. This possibility i ha-ve used for the establishment of an experimental system to study the structural requirements for open chromatin formation. Therefor i have generated a condensed chromatin domain at ectopic positions. This condensed „model“ domain provides a defined genetic context for the targeted insertion of sequences of interest, excluding any variable position effects. This allows comarative analysis of different sequences in order to identify the structural requirements for open chromatin formation. For this purpose the 61C7/8 interband sequence was targetly integrated into the condensed „model“ domain by site-specific recombination. Thereby i could show that the 61C7/8 interband sequence maintains the capacity to form open chromatin cognizable by the splitting of the condensed „model“ domain. Furthermore the newly formed open chromatin domain also keeps epigenetic characteristica like transcriptional activity or the recruitment of typical proteins. By deletion analysis, i have mapped the essential region needed for open chromatin formation to a ~490bp fragment located in the proximal part of the 61C7/8 interband sequence. This fragment overlaps binding sites for characteristic proteins known to be involved in chromosomal domain formation like the chromatin protein Chriz, the histone kinase Jil1 or the insulator protein CP190. Furthermore the fragment overlaps a promoter region that locates between the Rev1 and Med30 genes.
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Analyse funktioneller Domänen von SEC71 und SEC72 im posttranslationalen Translokationsprozeß von Saccharomyces cerevisiaeUnger, Christian 29 March 2000 (has links)
Zusammenfassung Die hier vorgelegte Arbeit analysiert funktionelle Domänen von Sec71p und Sec72p, zwei Komponenten des posttranslationalen Transports in das ER von Saccharomyces cerevisiae. Die Kombination von Nullmutanten von SEC71, SEC72 und SBH1 führte zu den letalen Doppeldeletionsmutanten -sec71/-sbh1 und -sec72/-sbh1. Beide Hefestämme zeigen starke Akkumulation von Präkursoren verschiedener Transportsubstrate in vivo und in vitro. Ausgehend von den letalen Doppeldeletionsstämmen war es möglich, für die Funktion von Sec71p und Sec72p wesentliche Domänen zu bestimmen. Der cytosolische Bereich von Position 120-160 des Sec71p ist ausreichend für die Assoziation mit Sec62p und bildet außerdem einen Teil der Sec72p-Bindungsdomäne. Der sich anschließende C-terminale Bereich von 46 Aminosäuren ist ebenfalls ein Teil der Sec72p-Bindungsdomäne. Jede Teildomäne für sich kann Sec72p eingeschränkt anlagern, zusammen binden sie Sec72p Hochsalz-resistent und Alkali-beständig. Sowohl eine C-terminale Verkürzung von Sec71p bis Position 160, als auch eine Sec71p-Variante ohne Membrananker und luminalen Teil können Sec71p funktionell ersetzen. Fusionsproteine von cytosolischen Bereichen des Sec71p und dem Membrananker des P450 aus Candida maltosa können es nicht. Der Membrananker von Sec71p ist somit nicht essentiell, kann aber auch nicht durch einen beliebigen Membrananker ersetzt werden. Eine Sequenzanalyse von Sec72p identifizierte im C-Terminus von Sec72p eine potentielle TPR-Domäne. TPR-Domänen sind Bestanteile von Protein-Interaktionen, unter anderem auch im Protein-Targetingmechanismus von Mitochondrien und Peroxisomen. Es lag daher nahe, nach cytosolischen Interaktionspartnern von Sec72p zu suchen, die Teil eines posttranslationalen Targetingmechanismus sein könnten. Die Ergebnisse photochemischer Quervernetzungsexperimente werden genauso vorgestellt, wie die eines Screens zur Identifizierung synthetisch letaler Mutanten. Durch Coimmunpräzipitationen wurde gezeigt, daß in Abwesenheit von Sec71p, Sec72p und Sbh1p die Assoziation von Sec61p mit Sec62p nicht beeinträchtigt wird. Die hier präsentierten Daten in Kombination mit anderen Ergebnissen führen zu der Hypothese, daß Sec71p/Sec72p zusammen mit Sbh1p eine essentielle Funktion während eines frühen Schrittes der posttranslationalen Translokation ausüben. Wegen der möglichen gegenseitigen Komplementation wurden die drei Proteine bisher in genetischen Screens jedoch nie als essentiell für den posttranslationalen Transportprozeß gefunden. / Abstract This work is focused on the functional domains of Sec71p and Sec72p. These proteins are components of the posttranslational transport complex of the ER in the yeast Saccharomyces cerevisiae. Deletion mutants of SEC71, SEC72 or SBH1 are viable. However the deletion of two genes - either SEC71 and SBH1 or SEC72 and SBH1 resulted in a lethal phenotyp. Both double deletion strains accumulate different transport substrats in vivo and in vitro. Exploiting the lethal strains it was possible to investigate the function of special domains of Sec71p and Sec72p in detail. The cytosolic part of Sec71p from amino acid (aa) 120 to 160 is sufficient for the association of Sec71p with Sec62p. It is also part of the Sec72p binding domain since it binds Sec72p weakly. A tight association (resistant to high salt and alkaline pH) is achived by the additional interaction of Sec72p with the C-terminal aa 160-206 of Sec71p. The C-terminal truncation of Sec71p up to aa 160 is able to rescue a -sec71/-sbh1 deletion strain. Even a Sec71p-variation without the luminal part and membrane anchor can functionaly replace the wt-protein whereas fussion proteins of different cytosolic parts of Sec71p with a transmembrane domain of P450 of Candida maltosa are not able to do it. The transmembrane domain of Sec71p seems not to be essential for proteins function. A membrane anchor of a different protein abolishes the correct interaction of Sec71p with its partners of the translocon. A sequence analysis of SEC72 identified a C-terminal domain with similarity to a TPR-domain. TPR-domains mediat protein interactions and they participate for instance in the targeting of proteins to the mitochondria or peroxisomes. Therefore we searched for cytosolic interaction partners of Sec72p. The results of photoreactive crosslinking studies and of a screen for synthetic lethality are presented in this work. By co-immunoprecipitation we showed that the association between Sec61p and Sec62p is not altered in the abscence of Sec71p, Sec72p and Sbh1p. The results presented herein combined with other data gave rise to the hypothesis that Sec71p/Sec72p together with Sbh1p are essential for an early step of the posttranslational translocation. Because of their overlapping functions neither one of them was found to be essential for the posttranslational transport in former genetic screens.
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Mathematical modeling and kinetic analysis of cellular signaling pathwaysZi, Zhike 28 November 2008 (has links)
Aufgrund des wachsenden Interesses an der Systembiologie werden zunehmend mathematische Modelle in Kombination mit Experimenten für die Analyse von Stoffwechselnetzwerken, Genregulationsnetzwerken und zellulären Signalweiterleitungswegen verwendet. Diese Dissertationsschrift benutzt die mathematische Modellierung und kinetische Untersuchungsmethoden zum Studium von zelluären Signalwegen, insbesondere des Netzwerkes zur Festlegung der Rezeptorlokalisation und des Tumorwachstumsfaktor-beta-Signalweges. Ergänzend wurde ein Computerwerkzeug (SBML-PET) entwickelt, das die Modellentwicklung unterstützt und der Parameterschätzung dient. Mit diesem Werkzeug kann man Modelle bearbeiten, die in der Systems Biology Markup Language (SBML) formuliert sind. In dieser Arbeit wird ein quantitatives mathematisches Modell benutzt, um die Signalantwort in unterschiedlichen Rezeptorlokalisationsnetzwerken in Abhängigkeit von der Ligandenanzahl und der Zelldichte zu untersuchen. Die rechnergestützte Analyse des Modells hat ergeben, dass der Zustand eines Rezeptorlokalisationsnetzwerkes potenziell eine sigmoide Abhängigkeit von dem Verhältnis zwischen Ligandenanzahl und Oberflächenrezeptoranzahl pro Zelle zeigen. Dieses Verhältnis ist die entscheidende Kontrollgröße der Signalantwort in Rezeptorlokalisationsnetzwerken. Mit Hilfe des SBML-PET Software-Paketes haben wir eine Modellierungsmethode mit Randbedingungen vorgeschlagen, um ein umfangreiches mathematisches Modell für den Smad-abh?ngigen TGF-beta Signalweg zu erstellen und dessen Parameter aus experimentellen Daten unter Berücksichtigung qualitativer Nebenbedingungen zu fitten. Die Ergebnisse der kinetischen Untersuchung dieses Modells legen nahe, dass die Signalantwort auf einen TGF-beta-Reiz durch die Balance zwischen clathrin-abhängier Endozytose und clathrin-unabhängiger Endozytose reguliert wird. / With growing interests in systems biology, mathematical models, paired with experiments, have been widely used for the studies on metabolic networks, gene regulatory networks and cellular signaling pathways. This dissertation employs the mathematical modeling and kinetic analysis method to study cellular signaling pathways, in particular, the receptor trafficking network and TGF-beta signaling pathway. On the other hand, a systems biology markup language (SBML) based parameter estimation tool (SBML-PET), was developed for facilitating the modeling process. A quantitative mathematical model is employed to investigate signal responses in different receptor trafficking networks by simultaneous perturbations of the ligand concentration and cell density. The computational analysis of the model revealed that receptor trafficking networks have potentially sigmoid responses to the ratio between ligand number and surface receptor number per cell, which is a key factor to control the signaling responses in receptor trafficking networks. Using the SBML-PET software package, we proposed a constraint-based modeling method to build a comprehensive mathematical model for the Smad dependent TGF-beta signaling pathway by fitting the experimental data and incorporating the qualitative constraints from the experimental analysis. Kinetic analysis results indicate that the signal response to TGF-beta is regulated by the balance between clathrin dependent endocytosis and non-clathrin mediated endocytosis.
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Membrane interaction of amyloid–beta (1–42) peptide induces membrane remodeling and benefits the conversion of non–toxic Aβ species into cytotoxic aggregateJin, Sha 07 November 2016 (has links)
Das Amyloid-beta Peptid (Ab) ist der Hauptbestandteil der extrazellulären Plaques bei der Alzheimerschen Krankheit. Das Ziel der vorliegenden Arbeit ist es, die Mechanismen der Wechselwirkungen des Ab mit der Plasmamembran und der nachfolgenden zellulären Aufnahme aufzuklären. Die Aggregation, die zelluläre Aufnahme und die Zytotoxizität von Ab42 wurden durch Verwendung von fluoreszenzmarkierten Ab42 in einem Neuroblastomzellkulturmodell untersucht. Sowohl bei Inkubation mit Monomeren als auch mit Aggregaten wurde in den Zellen Ab42 detektiert. Dabei binden Ab42 Monomere und kleine Aggregate zunächst an die Zellmembran. Allerdings erfolgt keine direkte Aufnahme von Monomeren in die Zelle. Erst nach Ausbildung von Aggregaten mit geordneter Sekundärstruktur wurde Ab42 in den endozytotischen Vesikel detektiert. Voraussetzung für den an der Membran ablaufenden Aggregationsprozess ist, dass die Monomere oberhalb einer kritischen Konzentration anwesend sind, um eine Bildung von beta-Faltblatt-Strukturen (bF) und entsprechenden Aggregaten zu ermöglichen. Ab42 Aggregate, die sich durch eine bF auszeichneten, benötigten keine kritische Schwellenkonzentration für die endozytotische Aufnahme. Eng mit der Aufnahme von Ab42 Aggregaten war die Veränderung des zellulären Metabolismus verbunden. Um die Wechselwirkung zwischen Ab und der Membrannäher zu charakterisieren, wurden Modellmembransystemen einschl. riesigen Membranvesikeln genutzt. Dabei wurde beobachtet, dass sowohl Ab42 als auch Ab40 Einstülpungen in der Membran induzieren können. Kleine Aggregate beider Isoformen, die noch keine bF aufweisen, interagierten bevorzugt mit der ungeordneten Lipidphase und induzierten dabei eine negative Membrankrümmung. Diese Beobachtungen legen den Schluss nahe, dass möglicherweise das Ab selbst den endozytotischen Prozess unterstützt oder diesen sogar einleiten könnte. Dies könnte auch auf eine mögliche physiologische Funktion von Ab Aggregaten, die nicht toxisch sind, hindeuten. / The accumulation of Amyloid beta peptide 1-42 (Ab42) in extracellular plaques is one of the pathological hallmarks of Alzheimer’s disease. Several studies have suggested that a cellular reuptake of Ab42 may be a crucial step in its cytotoxicity, but mechanisms of Ab-membrane interaction and subsequent cellular uptake are not yet understood. The first aim of the present study is to answer the question whether aggregate formation is a prerequisite or a consequence of Ab-membrane interaction and of Ab endocytosis. We visualized aggregate formation of fluorescently labeled Ab42 by Förster resonance energy transfer and tracked its internalization by human neuroblastoma cells. Both monomeric and aggregated Ab42 entered the cells, however, monomer uptake faced a concentration threshold and occurred only at concentrations and time scales that allowed beta-sheet-rich (bS) aggregates to form. By uncoupling membrane binding from internalization, we found that Ab42 monomers as well as small aggregate species bound rapidly to the plasma membrane and formed bS aggregates. These structures were subsequently taken up and accumulated in endocytic vesicles. This process correlated with inhibition of cellular metabolism activities. Our data therefore imply that the formation of bS aggregates at the cell membrane is a prerequisite for Ab42 uptake and cytotoxicity. The second aim of the study is to investigate the Ab-membrane interaction in vitro by using giant unilamellar vesicles and giant plasma membrane vesicles as model membrane systems. We found that both Ab isoforms, Ab42 and Ab40, interacted with the liquid disordered phase of model membranes. Early aggregation intermediates, which did not yet bind to the amyloiddophilic dye Thioflavin T, induced negative membrane curvature. The ability of Ab to induce membrane deformation suggests that Ab may facilitate its own endocytosis. It also hints at a possible physiological function of non-toxic Ab aggregate species.
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MuRF3 binds to the retromer subunit SNX5 inhibiting its MuRF2-mediated degradation and leading to its stabilizationHamati, Jida 17 October 2016 (has links)
Die muskelspezifischen RING-Finger Ubiquitin E3 Ligasen MuRF1, MuRF2 und MuRF3 werden mit verschiedenen zellulären Prozessen in Verbindung gebracht. MuRF1 und MuRF3 beteiligen sich am Abbau mehrerer Muskelstrukturproteine über das Ubiquitin Proteasom System (UPS) und spielen somit eine wichtige Rolle bei der Aufrechterhaltung der Skelett- und Herzmuskelstruktur und -funktion. MuRF1 wurde als Atrophie-Marker identifiziert, da seine Expression während der Muskelatrophie ansteigt, und MuRF2 und MuRF3 wirken bei der Stabilisierung von Mikrotubuli und Differenzierung von Myozyten mit. Dennoch sind bisher viele Aspekte der Funktion von MuRF-Proteinen ungeklärt. Die Domänenstruktur der MuRF-Proteine zeigt mehrere hochkonservierte Domänen, die sich an Protein-Protein Interaktionen beteiligen. Die Identifizierung und Charakterisierung ihres Interaktoms ermöglicht ein besseres Verständnis ihrer Funktionen. Aus diesem Grund wurden quantitative massenspektrometrische Analysen durchgeführt, um neue Interaktionspartner und Substrate für MuRF1, 2 und 3 zu identifizieren. Sorting nexin 5 (SNX5), eine Untereinheit des Retromers in Säugetieren, wurde als Interaktionspartner von MuRF3 identifiziert. SNX5, das eine wichtige Rolle in subzellulären Transport-Signalwegen spielt, interagierte über seine BAR-Domäne mit MuRF3. SNX5 und MuRF3 co-lokalisierten und assoziierten mit vesikulären Strukturen des subzellulären Transport-Signalweges. SNX5 wurde außerdem als Substrat von MuRF2 identifiziert. MuRF2 band und ubiquitinierte SNX5 in vivo und vermittelte damit dessen Abbau über das UPS. MuRF3 stabilisierte SNX5 durch die Inhibierung dieses Abbaus. Somit konnten MuRF2 und MuRF3 mit einem in subzellulärem Transport aktiven Protein in Verbindung gebracht werden, das direkt mit Mikrotubuli assoziiert und funktionell von einem stabilen Mikrotubuli-Netzwerk abhängig ist. Dies legt eine mögliche regulatorische Rolle von MuRF2 und MuRF3 in Mikrotubuli-abhängigen subzellulären Transportwegen nahe. / Muscle specific RING-Finger ubiquitin E3 ligases MuRF1, MuRF2 and MuRF3 have been implicated in several cellular functions. MuRF1 and MuRF3 have been shown to bind and degrade muscle contractile and structural proteins via the ubiquitin proteasome system (UPS), thus playing an important role in the maintenance of skeletal and cardiac muscle structure and function. MuRF1 is considered an atrophy marker since its expression increases during muscle atrophy. MuRF2 and MuRF3 are involved in myocyte differentiation and both bind to and stabilize microtubules. Nevertheless, many aspects of the functions of the MuRF-family are unknown. The domain structure of the MuRF family implicates several highly conserved domains involved in protein-protein interaction. Accordingly, one way to better understand the role of MuRF proteins in myocyte function and protein homeostasis is to identify and characterize their interactome. Therefore, quantitative mass spectrometric analysis was used to identify novel interaction partners and target proteins of MuRF1, 2 and 3. Sorting nexin 5 (SNX5), a mammalian retromer subunit which plays an important role in subcellular trafficking pathways, was identified as a novel interaction partner of MuRF3, with which it interacted via its Bin/Amphiphysin/Rvs (BAR)-domain. SNX5 and MuRF3 co-localized and associated with early endosomes, connecting the microtubule-binding MuRF3 to structures of subcellular trafficking pathway. SNX5 was also identified as a substrate of MuRF2, which interacted with and ubiquitinated SNX5 in vivo, mediating its degradation in a UPS-dependent manner. This MuRF2-mediated degradation was inhibited by MuRF3, which stabilized SNX5. Thus, MuRF2 and MuRF3 were linked to a subcellular trafficking protein, SNX5, which is directly associated with microtubules and functionally dependent on a stable microtubule network, suggesting a possible regulatory role of MuRF2 and MuRF3 in microtubule-dependent subcellular trafficking pathways.
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Molecular functions of the ubiquitin domain protein Herp in Synoviolin mediated endoplasmic reticulum associated protein degradation (ERAD)Kny, Melanie 10 September 2010 (has links)
Die Akkumulation fehlerhafter Proteine im Endoplasmatischen Retikulum (ER) induziert den „unfolded protein response“ (UPR) - Signalweg zur Überwindung dieser zellulären Stress-Situation. Ein in Säugern stark UPR-induziertes Gen kodiert für das Ubiquitin-Domäne-Protein Herp. Herp interagiert mit der E3-Ligase Synoviolin, einer zentralen Komponente von Multiproteinkomplexen, welche die ER assoziierte Protein-Degradation (ERAD) vermitteln. Abhängig von seiner Ubiquitin-ähnlichen (‘UBL’) Domäne wird Herp für den effizienten Abbau von Synoviolin-Substraten benötigt. Der zugrundeliegende molekulare Mechanismus dieser Funktion von Herp ist kaum bekannt. In der vorliegenden Studie wurde gezeigt, dass Herp kontinuierlich an Synoviolin-basierten Komplexen umgesetzt wird, aber kein Substrat ist. Da sowohl Depletion als auch Stabilisierung von Herp zum verminderten Abbau von Synoviolin-Substraten führt, lässt sich schlussfolgern, dass der kontinuierliche Umsatz von Herp entscheidend ist für ERAD. Weiterhin regulierte Herp die Zusammensetzung Synoviolin-basierter Komplexe. Das deubiquitinierende Enzym Usp7 ist über seine Bindung an Herp mit Synoviolin assoziiert. Usp7 beeinflusste aber nicht die Stabilität von Herp oder ERAD-Substraten. Zusätzlich verstärkte Herp die Interaktion zwischen dem CUE-Domäne-Protein AUP1 und Synoviolin. In Abhängigkeit von der CUE-Domäne steigerte AUP1 den ERAD-Prozess. Auch das Herp-Homolog Herp2 war mit Synoviolin-basierten Komplexen assoziiert. Im Gegensatz zu Herp wurde Herp2 nicht durch den UPR-Signalweg induziert, war stabil und interagierte nicht Usp7. Diese Daten unterstreichen die einzigartige Funktion von Herp im ERAD-Prozess. Schlussfolgernd ist Herp eine dynamische ERAD-Komponente, welche die Rekrutierung akzessorischer Proteine an Synoviolin vermittelt und damit die Ubiquitinierung von Synoviolin-Substraten ermöglicht. Diese Daten zeigen die kritische Rolle von Herp für die Beseitigung fehlerhafter Proteine und das Überleben der Zelle. / The accumulation of aberrant proteins in the endoplasmic reticulum (ER) induces the unfolded protein response (UPR) pathway for surmounting this cellular stress situation. One of the strongly UPR-induced genes in mammalia encodes the ubiquitin domain protein Herp. Herp interacts with the E3 ligase Synoviolin, a central component of ER associated protein degradation (ERAD) mediating multiprotein complexes. Dependent on its ubiquitin-like (UBL) domain, Herp is required for the efficient degradation of Synoviolin substrates. The molecular mechanism underlying this function of Herp is poorly understood. In the present study, it was shown that Herp is continuously exchanged at Synoviolin based complexes. However, Herp did not serve as a Synoviolin substrate. Since both stabilisation and depletion of Herp resulted in the impaired degradation of Synoviolin substrates, the continuous turnover of Herp seems to be decisive for ERAD. Herp was also shown to regulate the composition of Synoviolin based complexes. The deubiquitinating enzyme Usp7 was linked to Synoviolin via its interaction with Herp. However, Usp7 did not influence the stability of Herp or ERAD substrates. In addition, Herp improved the association of the CUE domain protein AUP1 with Synoviolin. AUP1 triggered the ERAD process in a CUE domain dependent manner. Also Herp2, a homologue of Herp, was found to associate with Synoviolin based complexes. However, in contrast to Herp, Herp2 was not induced by the UPR, was stable, and did not bind Usp7 supporting the idea of Herp having a unique function in ERAD. In conclusion, Herp is a dynamic ERAD component recruiting accessory proteins to Synoviolin thus enabling Synoviolin dependent ubiquitination of substrates. These findings point out the crucial role of Herp for the elimination of misfolded proteins, which is important for cell survival.
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Elektrophysiologische Charakterisierung künstlicher Ionenkanäle in lebenden ZellenFidzinski, Pawel 03 May 2006 (has links)
Durch Ausübung physiologischer Grundfunktionen spielen Ionenkanäle eine entscheidende Rolle für die reguläre Funktion von Zellen. Zum besseren Verständnis ihrer Struktur und Funktion sind Untersuchungen natürlicher und künstlicher Ionenkanäle wichtige Werkzeuge. Großes analytisches und therapeutisches Potential ist in der Untersuchung künstlicher Kanäle in lebenden Zellen vorhanden, was bisher wenig Beachtung fand. In der vorliegenden Arbeit wurde die Wirkung der künstlichen Ionenkanäle THF-gram, THF-gram-TBDPS sowie linked-gram-TBDPS auf elektrophysiologische Eigenschaften boviner Trabekelwerkszellen des Auges anhand von Patch-Clamp-Untersuchungen im Whole-Cell-Modus analysiert. Die Untersuchung brachte folgende Erkenntnisse: 1. Die Inkorporation aller drei Verbindungen war erfolgreich, was sich durch Anstieg der Stromdichte und Verschiebung des Umkehrpotentials zeigte. 2. Einbau von THF-gram und THF-gram-TBDPS war mit dem Überleben der Zellen vereinbar, während linked-gram-TBDPS aufgrund einer sehr potenten Antwort bereits bei sehr geringen Konzentrationen zum raschen Zelltod führte. 3. Eine Asymmetrie der Stromantwort zugunsten stärkerer Auswärtsströme wurde bei THF-gram und in schwächerer Ausprägung bei THF-gram-TBDPS festgestellt. Linked-gram-TBDPS zeigte keine derartige Asymmetrie. 4. Unter Verwendung von Cs+ als Ladungsträger war der beobachtete Anstieg der Stromdichte bei allen drei Verbindungen eindeutig stärker als unter physiologischen Bedingungen (Na+/K+). 5. Die dargestellten Erkenntnisse sind ein erster Schritt zur therapeutischen Anwendung von künstlichen Ionenkanälen. Eine Weiterentwicklung in Richtung höherer Selektivität und besserer Kontrolle ist jedoch genauso erforderlich wie die Klärung der klinischen Umsetzbarkeit. / Ion channels play a pivotal role for regular cell function. To better understand their structure and function, investigation of both natural and artificial ion channels is being performed to date. Investigation of artificial channels in living cells hides a big potential, however, little attention has been paid to this field so far. In this work, the effect of the artificial ion channels THF-gram, THF-gram-TBDPS and linked-gram-TBDPS on electrophysiological properties of bovine trabecular meshwork cells was investigated with the patch-clamp-technique. Following results were obtained: 1. Incorporation of all three compounds was successful, which was proven by increase of current density and cell depolarisation. 2. The cells survived after incorporation of THF-gram and THF-gram-TBDPS but not after linked-gram-TBDPS, which resulted in cell death at very low concentrations. 3. Larger outward currents were observed with THF-gram and, at a lower extent, with THF-gram-TBDPS. Linked-gram-TBDPS did not show such an asymmetry. 4. With Cs+ as charge carrier all three compunds showed a stronger increase of current density than under physiological conditions (Na+/K+). 5. The decribed results are a first step towards therapeutic application of artificial ion channels, however, further development towards higher selectivity and better control is as necessary as clarification of clinical feasibility.
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Untersuchungen zur affinitäts-basierten Aufreinigung von tight junction-proteinen und deren potentiellen InteraktionspartnernLohrberg, Dörte 22 April 2009 (has links)
Die Epithelien vielzelliger Organismen bilden eine funktionelle Grenzschicht, die für die Homöostase innerhalb und für den spezifischen Stoffaustausch zwischen den Kompartimenten verantwortlich ist. Der interzelluläre Spalt zwischen Epithelzellen wird durch tight junctions verschlossen, die eine selektive Permeabilitätsbarriere bilden. Da viele Krankheiten auf eine Dysfunktion der Barriere zurückzuführen sind, ist eine genaue Kenntnis der molekularen Zusammensetzung der tight junctions aus pharmakologischer Sicht von großem Interesse. In dieser Arbeit wurden Anreicherungsstrategien entwickelt, die eine Proteomanalyse der tight junction-Proteine erlauben. Der Fokus wurde dabei auf die Claudine und Tricellulin gelegt, die als transmembranale Proteine das molekulare Rückgrat der tight junctions bilden. Durch Affinitätsreinigung gelang erstmals eine Anreicherung verschiedener Claudine, die durch Massenspektrometrie identifiziert wurden. Die metabolische Markierung der Proteine mit stabilen Isotopen (SILAC) erlaubte die quantitative Diskriminierung von Proteinen, die unspezifisch an das Matrixmaterial banden. Von den potentiellen Interaktionspartnern der Claudine wurden Integrin-a3, SUMO-1 und Sphingosinkinase 2 ausgewählt, um deren Interaktion mit Claudinen weiter zu verifizieren. Es wurden keine Hinweise auf Wechselwirkungen zwischen Claudinen und Integrin-a3 sowie SUMO-1 gefunden, während die Interaktion von Claudinen mit Sphingosinkinase 2 weder bestätigt noch ausgeschlossen werden konnte. Ferner wurde eine Affinitätsreinigung durchgeführt, um Interaktionspartner von Tricellulin anzureichern. Durch die quantitative massenspektrometrische Analyse wurde ausschließlich Claudin-4 nicht aber Claudin-3 und 7 als potentieller, spezifischer Interaktionspartner von Tricellulin identifiziert. Es wurde aber gezeigt, dass die Kombination aus Affinitätsreinigung und quantitativer Massenspektrometrie einen wertvollen Beitrag zur Entschlüsselung von Protein-Komplexen leisten kann. / Epithelia function as specialized barriers that separate different compartments within multicellular organisms and regulate the specific exchange of substances between them. The intercellular space between adjacent epithelial cells is sealed by tight junctions forming a permeability barrier. Dysregulation of the barrier occurs in a variety of diseases. Hence, a deeper knowledge is required of the molecular composition of tight junctions, in particular with respect to pharmacological applications. In the present study, new enrichment strategies have been established that allow the proteomic analysis of tight junction proteins. Special emphasis was placed on claudins and tricellulin as these transmembrane proteins constitute the molecular backbone of the tight junctions. For the first time, using an affinity purification, the enrichment of several claudins was accomplished that were identified by mass spectrometry. The metabolic labeling of proteins with stable isotopes (SILAC) allowed the quantitative discrimination of proteins that bound unspecifically to the matrix. Integrin-a3, SUMO 1 and sphingosin kinase 2 were chosen for further verifications from the proteins considered to potentially interact with claudins. While there was no evidence for an association of claudins with integrin-a3 and SUMO-1, an interaction of claudins with sphingosin kinase 2 could be neither confirmed nor disproved. Furthermore, an affinity purification was performed in order to enrich interaction partners of tricellulin. Claudin-4 was identified as a specific, potential interaction partner of tricellulin by quantitative mass spectrometric analysis whereas claudin 3 and -7 were determined to be enriched unspecifically. The present study demonstrates that a combination of affinity purification and quantitative mass spectrometry can substantially contribute to the elucidation of protein complexes.
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Elektrophysiologische Untersuchung des gerichteten Protonentransportes in mikrobiellen RhodopsinenVogt, Arend 06 March 2017 (has links)
Mikrobielle Rhodopsine sind lichtsensitive Membranproteine und agieren als Sensoren, Biokatalysatoren oder Ionentransporter. Die Ionentransporter unterteilen sich in lichtgetriebene Ionenpumpen und in lichtaktivierte Kanalrhodopsine. Besonders die Protonenpumpe Bakteriorhodopsin steht schon lange im Fokus biophysikalischer Untersuchungen. Obwohl die Protonenpumpen seit über 40 Jahren intensiv untersucht werden, ist das Wissen über deren elektrophysiologische Eigenschaften noch immer gering. Aus diesem Grund widmete sich diese Arbeit der elektrophysiologischen Charakterisierung der mikrobiellen Rhodopsine mit dem Fokus auf Protonenpumpen. Hierfür wurden vor allem „Two-Electrode Voltage Clamp“ -Messungen (TEVC) an Oozyten des afrikanischen Krallenfrosches Xenopus leavis durchgeführt. Die Untersuchung verschiedener Protonenpumpen hat gezeigt, dass diese eine unerwartet große Diversität in ihren elektrophysiologischen Eigenschaften aufweisen. Von besonderem Interesse war die Beobachtung, dass einige Protonenpumpen neben Pumpströmen auch passive einwärts gerichtete Photoströme zeigten. Besonders deutlich war der „Pump-Kanal-Dualismus“ bei dem Gloeobacter-Rhodopsin ausgeprägt. Andere Protonenpumpen, wie das Bakteriorhodopsin oder Coccomyxa-Rhodopsin, zeigten keine einwärts gerichteten Photoströme. Das Coccomyxa-Rhodopsin wurde aufgrund seiner hohen Photostrom-Amplituden in Oozyten für eine Mutationsanalyse ausgewählt. Diese Mutationsanalyse verhalf die strukturellen Ursachen für die funktionalen Unterschiede zu identifizieren, welche sowohl zwischen den Protonenpumpen untereinander als auch gegenüber Kanalrhodopsinen beobachtet wurden. Mutationen im Gegenion-Komplex führen zu rein passiven oder inaktiven Transportern. Dagegen übernimmt der extrazelluläre Halbkanal in Protonenpumpe die Aufgabe einen passiven Protonen-Rückfluss während des Pumpzyklus zu verhindern, denn Mutationen in dieser Region verursachen passive Photoströme zusätzlich zum aktiven Pumpstrom. / Microbial rhodopsins are light-sensitive membrane proteins and operate as sensors, enzymes or ion-transporters. The ion transporters are subdivided into light-driven ion pumps and light-gated channels. Biophysical research has put focus on the proton pump bacteriorhodopsin for long time. Despite the fact that light-driven proton pumps are investigated for over 40 years, the knowledge about their electrophysiological properties is surprisingly low. For this reason, this thesis is devoted to the electrophysiological characterization of microbial rhodopsins with special focus on light-driven proton pumps. For this purpose, “Two-Electrode Voltage Clamp”-recordings (TEVC) were primarily performed using oocytes from African clawed frog Xenopus leavis. The investigation of diverse proton pumps has shown that the differences in their electrophysiological behaviors are unexpectedly high. Special interest was laid on proton pumps which show passive inward directed photocurrents when the electrochemical load exceeds a certain level. The dualism of pump and channel activity was particularly pronounced in the proton pump Gloeobacter-rhodopsin. Other proton pumps, for instance bacteriorhodopsin or Coccomyxa-rhodopsin, do not show inward directed photocurrents. Due to high photocurrent amplitudes, the Coccomyxa-rhodopsin was selected for an efficient mutagenesis study. This study allowed the identification of structural key determinants for the differences among proton pumps themselves and for the differences of proton pumps in comparison with light-gated ion channels (channelrhodopsins). Therefore, mutations of the counter-ion-complex cause inactive or purely passive transporters. The extracellular half-channel is the key element in proton pumps which prevents passive proton-backflow during the pump-cycle. Mutations in this region lead to passive leak-currents in overlap with the remaining pump-activity.
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Zur Strukturvorhersage der MembranproteineHildebrand, Peter 27 May 2003 (has links)
Das Auffinden spezifischer Strukturmerkmale integraler Membranproteine ist eine wichtige Grundlage zum Verständnis der Stabilität und Faltung und die notwendige Voraussetzung zur Modellierung ihrer Raumstruktur. Die Aminosäurezusammensetzung der innerhalb des hydrophoben Bereichs der Membranabschnitte befindlichen alpha-Helices wird entscheidend durch dieses Milieu determiniert, wie der Vergleich mit beta-Barrel Membranproteinen und alpha-Helices globulärer Proteine zeigt. Die Untersuchung der Phi-, Psi- und Chi1-Winkel lieferte gleichwohl eine Reihe von signifikanten Besonderheiten welche speziell bei einigen polaren (Asn, Asp) bzw. aromatischen Aminosäuren (Trp, Tyr) deutlich miteinander korrelieren. Der Anteil kürzerer, der für alpha-Helices typischen i, i+4 Wasserstoffbrückenbindungen ist innerhalb der Membran insgesamt höher, was ebenfalls mit der Verschiebung der Phi- und Psi- Winkel korreliert. Die Geometrie von alpha-Helices integraler Membranproteine ist damit näherungsweise ideal. An den Enden von Membranhelices und in den Helixturns werden neben Pro und Gly häufig polare, amphiphile oder aromatische Aminosäuren gefunden. Die polaren und amphiphilen Aminosäuren liegen überwiegend in den Helixturns und im Bereich der polaren Lipidköpfchen auf der Seite der Helix, welche der Membran zugewandten ist. Zur Fettschicht im Zentrum der Membran hin ragen umgekehrt vorherrschend lipophile Aminosäureseitenketten. Dieser Gradient ist folgerichtig auch an der Aminosäurezusammensetzung der Helixcaps erkennbar, welche die transmembranen Helices zumeist intra- und extrazellulär abschließen. Helixcaps alpha-helikaler Membrandomänen sind somit spezifische, von den klassischen Caps globulärer Proteine unterscheidbare Strukturmotive. Die konsequente Trennung der Untersuchungen der alpha-helikalen Abschnitte innerhalb der hydrophoben Lipiddoppelschicht von den Helixenden im polar-wässrigen Milieu ermöglicht außerdem die Identifikation vieler Aminosäurepräferenzen für exponierte (Leu, Ile), oder verdeckte Positionen (Ser, Asn, Cys). Umgekehrt wie bei den alpha-Helices globulärer Proteine ist die Atomzusammensetzung der Solvent exponierten Aminosäureseitenketten im Zentrum der Membran doppelt so hydrophob wie im Proteininnern. / Sorting out structural patterns that are specific for integral membrane proteins is a crucial base for understanding their stability and folding and a valuable source for the modelling of their tertiary structure. The detailed comparison of alpha-helical with beta-barrel membrane proteins and alpha-helices of globular proteins pointed out, that the amino acid composition of integral membrane proteins is overwhelmingly directed by the influence of the surrounding hydrophobic milieu. Nevertheless the investigation of the phi-, psi und chi1-angles yielded remarkable peculiarities of alpha-helical membrane proteins that correlate strongly in particular for some polar (asn, asp) and aromatic (trp, tyr) amino acids. The portion of the shorter and stronger i, i+4 H-bonds, that is typically found in alpha-helices is higher within the borders of the membrane. This observation confirms the observed shift of the phi- and psi- angles as well. Consequently the geometry of alpha-helices in membrane proteins is nearly ideal. At the ends of alpha-helices and in the turns of integral membrane proteins pro, gly and those amino acids are predominant that contain polar, amphiphilic or aromatic side chains. Whilst the aromats are equally positioned at the protein inside, the polar or amphiphilic amino acids are largely found at the helix turns, or at the side of the helix that contacts the polar lipid head groups. In contrast merely hydrophobic side chains face the lipophilic tails of the fatty acids in the core of the membrane. This gradient consequently shapes the amino acid composition of the helix caps that frequently coat the transmembrane helices on both sides of the membrane, too. Hence helix caps of transmembrane domains are substantially specific structural patterns that must be distinguished from the classical caps, known from alpha-helices of globular proteins. The clear distinction of the alpha-helical parts that are in contact with the lipophilic tails of the fatty acids, from the helix ends that stretch out into the polar aqueous solvent, advances the identification of amino acid preferences either lipid-exposed (Leu, Ile) or protein-buried (Ser, Asn, Cys). Finally, in sharp contrast to the helices of globular proteins, in the core of the membrane, the atomic composition of the solvent exposed amino acid side chains is twice as hydrophobic as inside the protein.
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