Ca(2+)-Ionen sind ein universeller sekundärer Botenstoff in eukaryotischen Zellen und übertragen Information durch wiederholte, kurzzeitige Erhöhungen der cytosolischen Ca(2+)-Konzentration (Ca(2+) Spikes). Ein bekannter Mechanismus, der solche Ca(2+)-Signale erzeugt, beinhaltet die Freisetzung von Ca(2+)-Ionen aus dem endoplasmatischen Retikulum durch IP3-sensitive Kanäle. Puffs sind elementare Ereignisse der Ca(2+)-Freisetzung durch einzelne Cluster von Ca(2+)-Kanälen. Intrazelluläre Ca(2+)-Dynamik ist ein stochastisches System, allerdings konnte bisher keine vollständige stochastische Theorie entwickelt werden. Die vorliegende Dissertation formuliert die Theorie mit Hilfe von Interpuffintervallen und Pufflängen, da diese Größen im Gegensatz zu den Eigenschaften der Einzelkanäle direkt messbar sind. Die Theorie reproduziert das typische Spektrum bekannter Ca(2+)-Signale. Die Signalform und das durchschnittliche Interspikeinterval (ISI) hängen sensitiv von den genauen Eigenschaften und der räumlichen Anordnung der Cluster ab. Im Gegensatz dazu hängt die Beziehung zwischen Mittelwert und Standardabweichung der ISI weder von den Clustereigenschaften noch von der räumlichen Anordnung ab, sondern wird lediglich von globalen Feedbackprozessen im Ca(2+)-Signalweg reguliert. Diese Beziehung ist essentiell für die Funktion des Signalwegs, da sie trotz der Zufälligkeit der ISI eine Frequenzkodierung ermöglicht und den maximalen Informationsgehalt der Spikesequenzen bestimmt. Neben der theoretischen Analyse enthält die vorliegende Arbeit auch experimentelle Puff- und Spikemessungen an lebenden HEK-Zellen, die wichtige Ergebnisse verifizieren. Insgesamt wird durch die integrierte theoretische und experimentelle Untersuchung auf verschiedenen Stufen molekularer Organisation gezeigt, dass stochastische Ca(2+)-Signale verlässliche Informationsträger sind, und dass der Mechanismus durch globalen Feedback an die spezifischen Anforderungen eines Signalpfads angepasst werden kann. / Ca(2+) is a universal second messenger in eukaryotic cells transmitting information through sequences of concentration spikes. A prominent mechanism to generate these spikes involves Ca(2+) release from the endoplasmic reticulum Ca(2+) store via IP3-sensitive channels. Puffs are elemental events of IP3-induced Ca(2+) release through single clusters of channels. Intracellular Ca(2+) dynamics are a stochastic system, but a complete stochastic theory has not been developed yet. As a new concept, this thesis formulates the theory in terms of interpuff interval and puff duration distributions, since unlike the properties of individual channels, they can be measured in vivo. This leads to a non-Markovian description of system dynamics, for which analytical solutions and efficient stochastic simulation techniques are derived. The theory reproduces the typical spectrum of Ca(2+) signals. Signal form and average interspike interval (ISI) depend sensitively on detailed properties and spatial arrangement of clusters. In difference to that, the relation between the average and the standard deviation of ISIs does not depend on cluster properties and cluster arrangement, and it is robust with respect to cell variability. It can only be regulated by global feedback processes in the Ca(2+) signalling pathway. That relation is essential for pathway function, since it ensures frequency encoding despite the randomness of ISIs and determines the maximal spike train information content. Apart from the theoretical investigation, this thesis verifies key results by live cell imaging of Ca(2+) spikes and puffs in HEK cells. Hence, this work comprises a systems level investigation of Ca(2+) signals, integrating data and theory from different levels of molecular organisation. It demonstrates that stochastic Ca(2+) signals can transmit information reliably, and that the mechanism can be adapted to the specific needs of a pathway by global feedback.

In der vorliegenden Arbeit wurde die Transkription mitochondrialer Gene durch die kernkodierten Phagentyp-RNA-Polymerasen RpoTm und RpoTmp der Pflanze Arabidopsis untersucht. Im Mitochondriengenom von Arabidopsis wurden f r 12 Gene Promotoren bestimmt. Diese zeigten verschiedene Sequenzelemente und wichen meist von der f r Dikotyle publizierten Konsensussequenz ab. F r die Mehrheit der Gene wurden multiple Promotoren identifiziert. Es wurden weiterhin Promotoren nachgewiesen, welche die Transkription vermutlich nicht funktioneller Sequenzen aktivieren. Architektur, Lokalisation und Nutzung mitochondrialer Promotoren implizieren eine wenig stringente Kontrolle der Transkriptionsinitiation in Arabidopsis-Mitochondrien. Zur Analyse der Funktionen von RpoTm und RpoTmp wurde ein in vitro-Transkriptionssystem entwickelt. Da RpoT-Enzyme m”glicherweise Kofaktoren ben”tigen, wurde in Arabidopsis nach Genen potentieller mitochondrialer Transkriptionsfaktoren gesucht. Als mitochondriales Protein mit Žhnlichkeit zu mtTFB, einem essentiellen Transkriptionsfaktor in Hefemitochondrien, wurde MetA identifiziert. In in vitro-Assays initiierte RpoTm an verschiedenen Promotoren die Transkription, w„hrend RpoTmp keine signifikante Promotorspezifit„t zeigte. Die spezifische Promotornutzung durch RpoTm erforderte superhelikale DNA. Weder RpoTm noch RpoTmp wurde durch MetA stimuliert. Eine mtTFB-„hnliche Funktion von MetA ist daher unwahrscheinlich. F r MetA wurde ausserdem eine engere phylogenetische Beziehung zu nukle„ren rRNA-Dimethylasen als zu mtTFB ermittelt. Die hier vorgestellten Studien belegen die Transkription mitochondrialer Gene in Arabidopsis durch RpoTm; f r RpoTmp ist eine nicht-redundante Transkriptionsfunktion denkbar. Die Kofaktor-unabh„ngige Spezifit„t von RpoTm f r verschiedene Promotoren und die wenig stringente Initiationskontrolle in vivo legen nahe, dass eine individuelle Regulation mitochondrialer Gene in Arabidopsis auf Transkriptionsebene nicht erfolgt. / Mitochondria depend on a nucleus-encoded transcription machinery to express their genome. The present study examined the transcription of mitochondrial genes by two nucleus-encoded phage-type RNA polymerases, RpoTm and RpoTmp, in the plant Arabidopsis. For selected mitochondrial genes in Arabidopsis, transcription initiation sites were determined. Most genes were found to possess multiple promoters. The identified promoters displayed diverse sequence elements and mostly deviated from a nonanucleotide consensus derived previously for dicot mitochondrial promoters. Several promoters were detected that activate transcription of presumably non-functional sequences. Promoter architecture, distribution and utilization suggest a non-stringent control of transcription initiation in Arabidopsis mitochondria. An in vitro transcription system was set up to elucidate the roles of RpoTm and RpoTmp. Since RpoT enzymes possibly require auxiliary factors, the Arabidopsis genome was screened for potential cofactors of phage-type RNA polymerases. A mitochondrial protein (MetA) with similarity to mtTFB, an essential transcription factor in yeast mitochondria, was identified. In in vitro transcription studies, RpoTm recognized various promoters whereas RpoTmp displayed no significant promoter specificity. Promoter recognition by RpoTm depended on supercoiled DNA templates. Transcription initiation by RpoTm or RpoTmp was not affected by MetA, indicating that MetA is not functionally equivalent to mtTFB. Besides, MetA was found to be more closely related to non-mitochondrial rRNA dimethylases than to mtTFB. The present study establishes RpoTm to transcribe mitochondrial genes; RpoTmp may have a non-overlapping transcriptional role in mitochondria. The cofactor-independent promoter specificity of RpoTm and the apparently non-stringent control of transcription initiation in vivo imply that mitochondrial genes in Arabidopsis may not be regulated individually at the transcriptional level.

cpRNPs (chloroplastidäre Ribonukleoproteine) sind kernkodierte RNA-Bindeproteine, die jeweils zwei RRM (RNA recognition motif)-Domänen besitzen und in die Chloroplasten höherer Landpflanzen importiert werden. Die Mitwirkung dieser Proteine an der Reifung plastidärer mRNAs in vitro, ihre bemerkenswert hohe Abundanz sowie die Beeinflussung ihrer Funktion durch lichtabhängige posttranslationale Modifikationen weisen auf eine bedeutende Rolle der cpRNPs in der Regulierung der plastidären Genexpression hin. In dieser Arbeit erfolgte erstmals eine Analyse der in vivo bestehenden Interaktionen zwischen cpRNPs und RNA im Stroma von Chloroplasten mittels RIP-Chip-Analysen. Es konnte gezeigt werden, dass ein Großteil der plastidären mRNA-Spezies mit CP31A und CP29A kopräzipitiert. Neben der mehrheitlichen Überlappung der RNA-Interaktionen konnten spezifische Präferenzen von CP29A und CP31A für bestimmte Transkripte identifiziert werden. Um Einblicke in die molekularen Funktionen der cpRNPs zu erhalten, wurden cp29a- und cp31a- Einzel- und Doppelmutanten hinsichtlich der Akkumulation, sowie des Spleiß- und Edierungsstatus plastidärer mRNAs untersucht. Da unter Standard-Wachstumsbedingungen lediglich wenige milde Defekte innerhalb der mRNA-Reifung in den Mutanten detektiert wurden, erfolgten weitere Analysen unter Kältestress-Bedingungen, die zu einer Induktion der CP29A-Expression und zu dem Ausbleichen junger Blattgewebe in cp29a- und cp31a-Mutanten führten. In diesen chlorotischen Geweben wurden reduzierte Akkumulationen plastidärer Proteine sowie PEP-abhängig transkribierter mRNAs detektiert. Darüber hinaus Prozessierungsdefekte für einige Transkripte beobachtet: Die Reifung der 23S-rRNA findet in cp29a- und cp31a-Mutanten nur eingeschränkt statt. In cp31a-Mutanten sind zudem die Prozessierung der ycf3-RNA sowie die Spaltung eines polycistronischen rpl33-Vorläufers gestört. In cp29a-Mutanten ist unter anderem die Prozessierung der rpoC1- und der ycf3-mRNA defizitär. / cpRNPs (chloroplast ribonucleoproteins) are nuclear encoded RNA-binding proteins, which contain two RRM (RNA recognition motif) domains and reside within the chloroplasts of higher land plant species. They are involved in plastid mRNA accumulation and processing in vitro. Their involvement in multiple steps of mRNA maturation and their remarkable abundance together with their regulation via posttranslational modifications identified the cpRNPs as potential central regulators of chloroplast gene expression. This work investigated the in vivo interactions of CP29A and CP31A from Arabidopsis with RNA in isolated chloroplasts via RIP-Chip. In this approach the association of both proteins with the majority of plastid mRNA species could be shown. While the interaction profiles of CP29A and CP31A were largely overlapping, also specific preferences for some transcripts were detected. To gain insights in the molecular functions of CP29A and CP31A, null mutants for one or both cpRNPs were analyzed for mRNA accumulation, splicing and editing. Since only few mild mRNA maturation defects were detected at standard growth conditions, analyses at cold stress were performed. Cold stress leads to an increase in CP29A expression and in both cp29a- and cp31a single- and double mutants a bleaching of young leaf tissue was observed. The chlorotic tissues showed a strong decrease in plastid protein accumulation accompanied by reduced levels of PEP-dependent transcripts. In addition some processing defects were observed: The maturation of the 23S-rRNA was reduced in cp29a- and cp31a mutants. In addition the processing of the ycf3-mRNA and a polycistronic rpl33 transcript were defective in cp31a mutants. In cp29a mutants processing defects within the rpoC1- and the ycf3-mRNA were detected.

In dieser Arbeit werden zwei intrazelluläre Signalwege, betreffend den Tumorsuppressor p53 und das Signalmolekül Ca2+ , diskutiert und modelliert. Einzelzellmessungen des Tumorsuppressors p53 zeigen pulsatile Antwor- ten nach Zufügung von DNA Doppelstrangbrüchen (DSBs). Außer für sehr hohe Schadensdosen, ist das zeitliche auftreten dieser Pulse unregelmäßig. Mithilfe eines Wavelet basierten Pulsdetektors werden die einzelzell Trajek- torien untersucht und die inter-Puls Intervall (IPI) Verteilungen extrahiert. Diese weisen auf nicht-oszillatorische Regime in den Daten hin. Die Theorie der anregbaren Systeme angewendet auf regulatorische Netzwerke ermöglicht dieses komplexe Verhalten mathematisch zu beschreiben. Die Kopplung von Schadens-Sensor-Kinase Dynamik mit dem kanonischen p53 negativen feedback loop, ergibt ein anregbares p53 Modell. Detaillier- te Bifurkationsanalysen zeigen ein robustes anregbares Regime, welches durch ein starkes Schadenssignal auch in Oszillationen überführt werden kann. Treibt man das p53 Modell mit einem stochastischen DNA-Schadens-Prozess, kann sowohl das oszillatorische Verhalten nach hohem Schaden, als auch das unregelmäßige pulsatile Verhalten ohne äußere Stimulation reproduziert werden. Intrazelluläre Ca 2+ Spikes entstehen durch eine hierarchische Kaskade stochastischer prozesse. Die Anwendung einer semi-markovschen Beschreibung führt zu praktischen analytischen Lösungen des erstpassagezeiten Problems. Eine hierbei entdeckte Zeitskalenseparation ermöglicht ein neues allgemeines Ca2+ -Modell. Dieses erklärt auf äußerst prägnante Weise viele wesentliche experimentelle Ergebnisse, insbesondere die Momentenbeziehungen der inter-Spike Intervall Verteilungen. Schließlich erlaubt die hier vorgestellte Theorie Berechnungen der Stimulus-Enkodierung, also die Adaption des Ca 2+ Signals auf veränderliche extrazelluläre Stimuli. Die Vorhersage einer fold change Enkodierung kann durch Experimente gestützt werden. / In this work two signaling pathways, involving the tumor suppressor p53 and the second messenger Ca2+ , are to be discussed and modelled. The tumor suppressor p53 shows a pulsatile response in single cells after induction of DNA double strand breaks (DSBs). Except for very high amounts of damage, these pulses appear at irregular times. The concept of excitable systems is employed as a convenient way to model such observed dynamics. An application to biomolecular reaction networks shows the need for a positive feedback within the p53 regulatory network. Exploiting the reported ultrasensitive dynamics of the upstream damage sensor kinases, leads to a simplified excitable kinase-phosphatase model. Coupling that to the canonical negative feedback p53 regulatory loop, is the core idea behind the construction of the excitable p53 model. A detailed bifurcation analysis of the model establishes a robust excitable regime, which can be switched to oscillatory dynamics via a strong DNA damage signal. Driving the p53 model with a stochastic DSB process yields pulsatile dynamics which reflect different experimental scenarios. Intracellular Ca 2+ concentration spikes arise from a hierarchic cascade of stochastic events. An analytical solution strategy, employing a semi-Markovian description and involving Laplace transformations, is devised and successfully applied to a specific Ca2+ model. The new gained insights are then used, to construct a new generic Ca2+ model, which elegantly captures many known features of Ca2+ signaling. In particular the experimentally observed relations between the average and the standard deviation of the inter spike intervals (ISIs) can be explained in a concise way. Finally, the theoretical considerations allow to calculate the stimulus encoding relation, which governs the adaption of the Ca 2+ signals to varying extracellular stimuli. This is predicted to be a fold change response and new experimental results display a strong support of this idea.

Die Elektrorotation von fixierten Erythrozyten wurde im Frequenzbereich von 16 Hz bis 33 MHz untersucht. Zwischen 16 Hz und 1 kHz zeigen die fixierten Erythrozyten eine Rotation parallel zur Feldrichtung mit einer maximalen Rotationsgeschwindigkeit zwischen 30 Hz und 70 Hz. Es wurde sowohl die Abhängigkeit von der äußeren Leitfähigkeit untersucht als auch von der Oberflächenladung. Die experimentellen Resultate erwiesen sich als konsistent mit einer erst kürzlich entwickelten Theorie zur Elektrorotation im niederfrequenten Bereich (LFER). Sie zeigen, daß die Elektrorotation im niederfrequenten Bereich von der Oberflächenladung und -leitfähigkeit entscheidend mitbestimmt werden kann. Fixierte Thrombozyten wurden mittels Elektrorotation im Frequenzbereich von 16 Hz bis 33 MHz untersucht. Zur Interpretation der Daten wurde ein theoretisches Modell weiterentwickelt, welches die innere vesikuläre Struktur der Thrombozyten berücksichtigt, und mit dem niederfrequenten Modell zur Elektrorotation superponiert. In Lösungen mit Dextran unterschiedlicher Molekulargewichte und Konzentrationen wurde sowohl die elektrophoretische Mobilität als auch Elektrorotation von fixierten Erythrozyten untersucht. Es konnte gezeigt werden, daß sich im niederfrequenten Bereich Depletionschichten an Hand von Elektrorotationsspektren erfassen lassen. Diese Daten bestätigen auch die Theorie zur LFER. Messungen der elektrophoretischen Mobilität von nativen Erythrozyten wurden in Lösungen mit dem Polyelektrolyten Polystyrensulfonat in Anhängigkeit vom Molekulargewicht und der Salzkonzentration durchgeführt. Es zeigte sich, daß das Polymer zum einen reversibel adsorbiert und zum anderen einen deutlichen Depletioneffekt herbeiführt. Im letzten Teil der Arbeit wurde ein Verfahren entwickelt, welches die Herstellung von Polyelektrolyt-Kapseln auf der Grundlage von biologischen Zellen ermöglicht, welche in Form und Größe identisch mit den verwendeten biologischen Templaten sind. / Electrorotation of fixed red blood cells (RBC) has been investigated in a frequency range between 16 Hz and 33 Mhz. Between 16 Hz and 1 kHz fixed red blood cells undergo co-field rotation with a maximum of rotation betwen 30 and 70 Hz. The rotation was studied as a function of electrolyte conductivity and surface charge density. These observations are consistent with a recently developed theory of the low frequency electrorotation (LFER) and demonstrate that the surface charge and the surface conductivity can play a significant role in this frequency range. Fixed platalets were investigated by means of electrorotation in the frequency range from 16 Hz to 33 Mhz. For the interpretation of the data a model which takes into account the inner structure of the platalets was developed and added to the theory which describes the rotation in the low frequency range. In solutions with Dextran and fixed platalets the electrophoretic mobility as well as the electrorotation was measured. It was shown that in the low frequency range depletion layers are detectable. Furthermore this results verify the LFER theory. Measurements of the electrophoretic mobility of native RBC were carried out in solutions of the polyelectrolyte Polystyrenesulfonate in dependence on the molecular weight and the ionic strength. It was shown that the polymer adsorbs reversible and forms a significant depletion effect. In the last part of this work a method was developed, which allows the construction of polyelectrolyte caspules with biological cells as template, which are identical in size and shape with the templates used.

Sowohl die kotranslationale Translokation von sekretorischen Proteinen durch die Membran als auch die Insertion von Membranproteinen sind essentielle Prozesse in allen lebenden Zellen. Sie erfordern die Sortierung des translatierenden Ribosoms zur Membran mittels des Signalerkenungspartikels (SRP), eines im Verlauf der Evolution konservierten Ribonukleoprotein-Partikels. SRP erkennt die Signalsequenz einer wachsenden Proteinkette, sobald diese aus dem Ribosom hervortritt. Die Bindung von SRP führt zum Anhalten der Peptidelongation (Elongationsarrest) und zum Andocken an den membrangebundenen SRP-Rezeptor (SR). In dieser Arbeit wird die 12 Å Kryo-Elektronenmikroskopie-Struktur eines Sortierungs-Komplexes dargestellt, der aus dem Säugetier-SRP gebunden an ein aktives Ribosom mit Signalsequenz besteht. Ein erstes molekulares Modell von SRP in dieser Konformation wurde erzeugt. Es zeigt wie die S-Domäne von SRP die große ribosomale Untereinheit nahe dem Peptidtunnel-Ausgang kontaktiert, um dort die Signalsequenz zu binden. Außerdem wird deutlich wie die Alu-Domäne von SRP in die Bindungsstelle für Elongationsfaktoren hineinreicht, wodurch die Elongationsarrest-Aktivität der Alu-Domäne erklärt wird. Auf dieser Basis konnte ein erstes Struktur-basiertes Modell der ersten Schritte der kotranslationalen Proteinsortierung entworfen werden. Darüberhinaus wurde auch der Schritt des Andockens an die Membran visualisiert, indem die Struktur des Ribosom-SRP-SR-Komplexes durch Kryo-EM gelöst wurde. Erste Schlüsse hinsichtlich des Mechanismus, der das Ribosom vom SRP zum Translokon transferiert, können hier gezogen werden. Als Nebenergebnis konnte durch die erreichte hohe Auflösung die Position des wichtigen ribosomalen Proteins L30e in der Kryo-EM-Struktur des Weizenkeim-Ribosoms idenifiziert werden. / Cotranslational translocation of proteins across or into membranes is a vital process in all kingdoms of life. It requires targeting of the translating ribosome to the membrane by the signal recognition particle (SRP), an evolutionary conserved ribonucleoprotein particle. SRP recognizes signal sequences of nascent protein chains emerging from the ribosome. Subsequent binding of SRP leads to pausing of peptide elongation and docking to the membrane-bound SRP receptor. Here, the 12 Å cryo-electron microscopy structure of a targeting complex is presented consisting of mammalian SRP bound to an active 80S ribosome carrying a signal sequence. A molecular model of SRP in this functional conformation was generated. The model reveals how the S-domain of SRP contacts the large ribosomal subunit at the nascent chain exit site to bind the signal sequence, and that the Alu-domain reaches into the elongation factor binding site of the ribosome explaining its elongation arrest activity. A molecular model of the first steps of protein targeting is presented. Moreover, also the docking step has been visualized by solving a cryo-EM structure of the ribosome-SRP complex bound to the SRP receptor. This structure provides first hints regarding the mechanism of ribosome transfer to the translocon. As a side result the position of the functionally significant ribosomal protein L30e has been identified in the high resolution maps of the wheat germ ribosome.

Die zelluläre Antwort auf einen spezifischen Stimulus wird nicht nur durch den Stimulus selbst, sondern auch von dem Zustand der Zelle bestimmt. Um ein tieferes Verständnis für die Variabilität in einer Zellpopulation zu gewinnen, ist es notwendig, die verschiedenen zellulären Antworten mit definierten zellulären Zuständen zu verbinden. In dieser Arbeit wurde ein System etabliert, welches es ermöglicht, die zelluläre Antwort auf DNA-Schäden und den Einfluss unterschiedlicher zellulärer Zustände zu studieren sowie die zu Grunde liegenden molekularen Mechanismen zu identifizieren. Im Zuge dessen wurde eine auf CRISPR/Cas9 basierende Methode entwickelt, mit der Fluoreszenzreporter für endogene Signalproteine in nicht transformierten Brustepithelzellen (MCF10A) generiert wurden. Anhand dieses Reportersystems konnte durch time-lapse Mikroskopie die Dynamik des Tumorsuppressors p53 und eines seiner Zielgene, des Zellzyklusinhibitors p21, verfolgt werden. Dabei wurde deutlich, dass die p21 Antwort der einzelnen Zellen auf DNA-Schäden sehr heterogen ausfällt. Über eine Form-basierte Gruppierungsmethode wurden vier verschiedene Subpopulationen mit charakteristischen p21 Dynamiken identifiziert. Um den Einfluss der Zellzyklusphase zu untersuchen, wurde die Zellteilung vor Bestrahlung analysiert und so Rückschlüsse auf die initiale Zellzyklusphase gezogen. 24h nach Bestrahlung wurde ein EdU labeling durchgeführt und der Zellzyklus mittels semi-supervised Klassifizierung bestimmt. Durch Einführen einer Mutation in der Bindedomäne von p21 wurde gezeigt, dass proliferating cellular nuclear antigen (PCNA) für die Heterogenität der p21 Antwort verantwortlich ist. Alles in allem bietet mein Projekt eine Pipeline, um auf Einzelzellebene zu erforschen, wie zelluläre Antworten durch den Zellzyklus beeinflusst werden. Dieser Ansatz könnte zukünftig Anwendung in der Erforschung von Medikamentenresistenz finden, zumal zelluläre Heterogenität in der Tumortherapie zu fractional killing führt. / The cellular response to a given stimulus is not only governed by the stimulus itself, but also depends on the state of the cells. However, it remains obscure how cellular states influence cell fate decisions. In this thesis, I established a framework to study how the cellular response to DNA damage is affected by varying cell states and to identify the underlying molecular mechanisms. To this end, I generated fluorescent reporters using CRISPR/Cas9 in non-transformed breast epithelial cells (MCF10A) and measured the dynamics of the tumor suppressor p53 and one of its target genes, the cell cycle inhibitor p21 using time-lapse microscopy. I found DNA damage induced highly diverse p21 dynamics in individual cells. A shape-based clustering identified four subpopulations of characteristic p21 dynamics. To examine the source of variability, I analyzed initial cell cycle states by monitoring cell division prior to damage, and determined final cellular state by EdU labelling and a semi-supervised classification 24h post damage. The results suggested that p21 dynamics depend on cell cycle phases and determine cell cycle progression. Furthermore, proliferating cellular nuclear antigen (PCNA)--a cell cycle dependent factor-- was shown to determine p21 heterogeneity using a mutant p21 deficient in interaction with PCNA. Overall, my project provides a pipeline to study at the single cell level how cellular response is affected by cellular states. Considering that cellular heterogeneity leads to fractional killing in tumor therapies, this approach also suggests future application on studying drug-resistance in cancer therapy.

Weltweit kommt es jährlich zu 90 Mio. Neuinfektionen mit dem sexuell übertragbaren Erreger Chlamydia trachomatis. Allerdings sind die Faktoren, die eine erfolgreiche bakterielle Vermehrung ermöglichen, weitgehend unbekannt. Während ihrer obligat intrazellulären Entwicklung sind Chlamydien auf die Errichtung und Erhaltung ihrer Nische, der Inklusion, angewiesen. Durch Interaktionen mit vesikulären Transportwegen der Wirtszelle, welche z.B. Sphingolipide transportieren, sichern die Bakterien ihr Überleben. In der vorliegenden Arbeit konnte gezeigt werden, dass Chlamydien während einer Infektion die Auflösung der Struktur des Golgi-Apparates induzieren. Mit Hilfe der RNA-Interferenz-Technik (RNAi) wurden die Auswirkungen des Verlustes von Golgi-Strukturproteinen auf die bakterielle Vermehrung untersucht. Der funktionelle Ausfall von Golginen, wie z.B. Golgin-84 führte zu einer Fragmentierung des Golgi-Apparates. Diese begünstigte die chlamydiale Produktion neuer infektiöser Partikel, was eine verbesserte Versorgung mit Nährstoffen nahelegt. Im vesikulären Transport von Nährstoffen übernehmen Rab-Proteine eine Schlüsselrolle. Interessanterweise konnte in dieser Arbeit gezeigt werden, dass der Verlust von Rab6 und Rab11 durch RNAi zu einer signifikanten Verringerung der Anzahl infektiöser Nachkommen führte. In diesen Zellen wurde der Golgi-Apparat nicht fragmentiert und der Transport von Sphingolipiden zu den Bakterien war stark vermindert. Untersuchungen nach simultaner Herunterregulation von Golgin-84 und Rab6 oder Rab11 demonstrierten abschließend, dass eine Kontrolle der Golgin-84-induzierten Golgi-Fragmentierung über Rab-Proteine möglich sein könnte. Die Ergebnisse dieser Arbeit offenbaren einen neuen Zusammenhang zwischen der Struktur des Golgi-Apparates und dessen Kontrolle über Rab-Proteine und ermöglichen einen tieferen Einblick in die Funktion des Golgi-Apparates während einer Chlamydien-Infektion. / Worldwide, approximately 90 mio. people are infected with the obligate intracellular bacterium Chlamydia trachomatis. However the factors involved in its successful infection and replication remain unknown. Chlamydia survive and replicate within a membrane bound niche inside host cells, termed the inclusion. To ensure survival, the chlamydial inclusion intercepts vesicular trafficking pathways of the host cell to acquire essential nutrients, such as sphingolipids. However, the exact mechanisms by which Chlamydia acquire these lipids have not been elucidated. The present work established that infection of host mammalian cells with C. trachomatis induced fragmentation of the Golgi-apparatus, but details of the mechanism to the bacterium’s pathogenesis are still required. Using RNA-Interference the role of specific Golgi-apparatus structural proteins in bacterial infectivity was investigated. Knockdown of Golgins in host cells resulted in a fragmented Golgi-apparatus and an associated increase in chlamydial replication, suggesting an enhanced acquisition of nutrients. Since Rab-proteins are known to co-ordinate the intracellular vesicular transport of nutrients, their importance in chlamydial infectivity was also investigated. Interestingly, knock down of Rab6 and Rab11 led to a significant reduction in infectious progeny. Surprisingly, upon knock down of Rab6 or Rab11 the Golgi-apparatus remained intact and sphingolipid transport into the inclusion was severely perturbed. Finally, analysis of cells simultaneously depleted of golgin-84 and Rab6 or Rab11 suggested a possible role of Rab-proteins in the control of golgin-84-induced Golgi fragmentation. These data demonstrate a yet unknown relationship between the structure of the Golgi-apparatus and its regulation and control by Rab-proteins. Furthermore, this work contributes to the existing knowledge regarding the function of the Golgi-apparatus during chlamydial infections.

Der Endozytoserezeptor Megalin gehört zu einer Gruppe von strukturell und funktionell verwandter Rezeptoren, der LDL R Gen Familie. Es sind zwei Arten von Lipidtransportpartikel beschrieben worden, die durch Megalin in Zellen aufgenommen werden. Zum einen werden Lipoproteine über ihre Apoproteine von Megalin erkannt und endozytiert. Zum anderen nimmt Megalin die hydrophoben Vitamine A und D über ihre Carrierproteine in ihre Zielzellen auf. Es handelt sich um Vitamin D bindendes Protein (DBP) und Retinol bindendes Protein (RBP). Zweck dieser Arbeit war es zu untersuchen, ob die Endozytose von Steroidcarriern durch Megalin ein genereller Mechanismus ist oder ob DBP und RBP Ausnahmen darstellen. Hierzu wurden exemplarisch drei Carrierproteine (24p3, Apo D und CCSP) für Steroide ausgesucht, die in Megalin-exprimierende Gewebe aufgenommen werden. Der (rekombinante) Retinolcarrier 23p3 zeigte bei surface plasmon resonance Analysen keine direkte Bindung an Megalin. Der Progesteron-Carrier Apo D hingegen bindet Megalin, ferner konnte in Zellkulturversuchen Endozytose und lysosomale Degradation von Apo D in Megalin-exprimierende Zellen nachgewiesen werden. Auch der Progesteron-Carrier CCSP wird durch Megalin in Zellen aufgenommen, allerdings ist zur Endozytose von CCSP ein Co-Rezeptor notwendig. Mit dieser Arbeit ist die erste in vivo-Beschreibung eines dualen Rezeptorsystems aus Megalin und einem peripheren Membranprotein namens Cubilin gelungen, welches u.a. im proximalen Tubulus der Niere existiert. Abschließend wurde exemplarisch für ein Steroidhormon-abhängiges Gewebe der murine Uterus hinsichtlich seiner Megalin-Expression untersucht. Es konnte ein bereits bekannter Ligand Megalins, das Glykoprotein Laktoferrin, aus der uterinen, luminalen Flüssigkeit aufgereinigt werden. Ferner konnte gezeigt werden, dass die Expression von Laktoferrin im Uterus strenger hormoneller Kontrolle unterliegt. / The endozytic receptor Megalin belongs to a group of structurally and functionally related receptors called LDL R gene family. Two different types of lipid particles are taken up by Megalin into target cells. The first type, lipoproteins are recognized and internalized by Megalin via their apoproteins. In addition, Megalin mediates the endocytosis of the lipophilic vitamins A and D into target cells by means of their carrier proteins. These proteins are the vitamin D binding protein (DBP) and retinal binding protein (RBP). The aim of the investigations was to determine, if the endocytosis of steroid hormone carriers by Megalin is a common occurrence or restricted only to DBP and RBP. Therefore, three carrier proteins for steroids (24p3, Apo D and CCSP) were chosen as an example. All of them are known to be taken up in Megalin expressing tissues. In surface plasmon resonance analysis recombinant 24p3, a carrier of retinol, showed no affinity to Megalin. Whereas the progesterone carrier Apo D bound to Megalin. Furthermore, it was endozytosed and degraded in lysosomes by Megalin expressing cells. The cellular uptake of the progesterone carrier CCSP is mediated by Megalin as well, however a co-receptor is needed. This work demonstrates for the first time the existence of a dual receptor pathway consisting of Megalin and a peripheral membrane protein named Cubilin in vivo. This systems is functional in addition to other tissues in the proximal tubule of the kidney. Finally, the Megalin expression in the murine uterus as an example of a steroid dependent tissue was investigated. Lactoferrin a known Megalin ligand was purified from the luminal uterine fluid. Furthermore, Lactoferrin expression in the uterus was shown to be under tight hormonal control.

Der CCAAT enhancer binding protein beta (C/EBPβ) Transkriptionsfaktor reguliert die Differenzierung, Proliferation und Funktion vieler Zelltypen, einschließlich verschiedener Zellen des Immunsystems. Eine detaillierte molekulare Analyse des Mechanismus, wie C/EBPβ alternative Zellschicksale steuert, wurde jedoch bisher noch nicht unternommen. Es wurde gezeigt, dass die ektopische Expression von C/EBPβ in determinierten B- Vorläuferzellen diese zu inflammatorischen Makrophagen reprogrammieren kann. Wir haben dieses Reprogrammierungsystem verwendet, um die Strukturelemente in C/EBPβ, die für die Regulation der (Trans)Differenzierung durch C/EBPβ wichtig sind, zu untersuchen. Um die maßgeblichen C/EBPβ Proteinmodule für die Reprogrammierung zu bestimmen, wurden entweder C/EBPβ Wildtyp Isoformen oder Mutanten in primären murinen B-Vorläuferzellen ektopisch exprimiert. Die Analysen ergaben, dass die translational regulierten langen Isoformen LAP* and LAP, jedoch nicht die kurze Isoform LIP lymphoide Zellen zu myeloischen Zellen reprogrammieren können. Des weiteren haben wir gezeigt, dass die konservierten Regionen 2, 3 und 4 der C/EBPβ Transaktivierungsdomäne essentiell und ausreichend für die Konvertierung von B Zellen zu myeloischen Zellen sind. Die reprogrammierten myeloischen Zellen setzten sich aus einer heterogenen Population verschiedener myeloischer Zelltypen zusammen. Detaillierte Analysen von CD11b+ reprogrammierten Zellen zeigten, dass diskrete konservierte Regionen von C/EBPβ verschiedene pro- und anti-inflammatorische Gene und divergente Entwicklungsprogramme aktivierten. Des Weiteren führten nicht nur strukturelle C/EBPβ Mutanten sondern auch Puktmutationen an Stellen, die posttranslationalen Modifikationen (PTM) unterliegen, zu verschiedenen Reprogrammierungsergebnissen. Diese Daten zeigen, dass die C/EBPβ abhängige myeloische Diversifikation durch die Integration von strukturellen C/EBPβ Proteinmodulen und deren signalabhängigen PTMs erreicht wird. / The CCAAT enhancer binding protein beta (C/EBPβ) transcription factor regulates differentiation, proliferation, and functionality of many cell types, including various cells of the immune system. A detailed molecular understanding of how C/EBPβ directs alternative cell fates remains largely elusive. Ectopic expression of C/EBPβ has been previously shown to reprogram committed B cell progenitors into inflammatory macrophages. We took advantage of this reprogramming system in order to examine how C/EBPβ regulates (trans)differentiation. To determine which C/EBPβ protein modules are important for reprogramming, C/EBPβ wild type isoforms and mutants were ectopically expressed in primary mouse B cell progenitors. The data showed that the translationally regulated long isoforms LAP* and LAP, but not the N-terminally truncated isoform LIP can reprogram lymphoid cells into myeloid cells. Furthermore, we found that conserved regions 2,3 and 4 in the C/EBPβ protein transactivation domain are necessary and sufficient for B-to-myeloid cell conversion. Interestingly, the reprogrammed myeloid cells were found to represent a heterogeneous mixture of different myeloid cell types. Detailed analyses of the reprogrammed CD11b+ cells revealed that discrete conserved regions in C/EBPβ activated distinct pro- and anti-inflammatory genes and triggered divergent differentiation programs. Moreover, not only structural C/EBPβ mutants, but also post-translational modification (PTM) site mutations led to different reprogramming outcomes. These data suggest that C/EBPβ orchestrates myeloid diversification by integrating PTMs with structural plasticity as signal dependent adaptable modular properties to determine cell fate.