Orientador: Henrique Nunes de Oliveira / Coorientador: Luis Artur Loyola Chardulo / Banca: Saulo da luz e Silva / Banca: Josineudson Augusto II de Vasconcelos Silva / Banca: Humberto Tonhati / Banca: Fernando Sebastian Baldi Rey / Resumo: A atuação das enzimas proteolíticas durante o post-mortem é um dos principais fatores que determinam a qualidade da carne, sendo as enzimas calpaína e calpastatina uma das principais atuantes neste processo. O objetivo deste estudo foi avaliar a relação entre a expressão gênica dos genes CAPN1, CAPN2 e CAST, a quantificação das enzimas µ-calpaína, m-calpaína e calpastatina, dentro de grupos contrastantes para maciez e crescimento animal. Foram utilizados dados de 90 animais machos não castrados da raça Nelore, com idade aproximada de 24 meses, permanecendo em confinamento por 95 dias. Após o abate foram colhidas amostras do músculo Longissimus thoracis entre a 9ª e 13ª costelas, da meia-carcaça esquerda. As amostras coletadas foram utilizadas para medir a área de olho de lombo (AOL), espessura de gordura subcutânea (EGS), índice de marmorização (IM), perdas por cozimento, coloração instrumental da carne e força de cisalhamento (FC). A partir do restante da carne, foram coletadas alíquotas para a realização das análises de índice de fragmentação miofibrilar (MFI) e lipídeos totais (LT). Foram coletadas alíquotas para a análise da expressão gênica e quantificação das enzimas. Os dados de força de cisalhamento foram utilizados como critério para a separação em carne macia e dura. Também foram utilizadas o ganho de peso para a separação quanto ao crescimento animal. Os seguintes grupos (n=10) foram formados: Leve, Pesado, Duro e Macio. As análises estatísticas foram realizadas ut... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: The role of proteolytic enzymes during the post-mortem is one of the main factors that determine the quality of the meat, and the enzymes calpain and calpastatin are one of the main factors in this process. The aim of this study was to evaluate the gene expression of the genes CAPN1, CAPN2 and CAST, and quantify the enzymes μ-calpain, m-calpain and calpastatin within contrasting groups animal growth, and thougness. 90 animals data were used uncastrated male Nellore, aged approximately 24 months remaining in confinement for 95 days. After slaughter were harvested Longissimus muscle samples thoracis between the 9th and 13th ribs, the left half-carcase. The samples were used to measure the ribeye area (REA), subcutaneous fat thickness (SFT), marbling index (MI), cooking loss, instrumental color of the meat and shear force (SF). From the rest of the meat, aliquots were collected to perform the myofibrillar fragmentation index analysis (MFI) and total lipids (TL). Were collected aliquots for the analysis of gene expression and quantification of enzymes. The data of shear force were used as criteria for the separation of tender and tough meat. The characteristics of weight gain for the separation on the animal growth were also used. The following groups (n=10) were formed: lightweight, Heavy, tough meat and tender meat. Statistical analyzes were performed using the GLM and MIXED procedure of Statistical Analysis System program. In this study there was no difference in the expressio... (Complete abstract click electronic access below) / Doutor

Many of today’s methods for the detection of biomolecules suffer from a high limit ofdetection due to poor signal generation upon recognition of target. By applying andoptimizing proximity ligation assay (PLA) in Western blotting (WB), the limit of detectionhas been lowered down to the picomolar range. In this report I have optimized the differentparameters that affect the signal generation and explored possibilities to increase the ease ofuse, by merging protocol steps and performing signal generating reactions at roomtemperature.

The glutathione-S-transferases (GSTs) (EC.2.5.1.18) are enzymes that participate in cellular detoxification of endogenous as well as foreign electrophilic compounds, function in the cellular detoxification systems and are evolved to protect cells against reactive oxygen metabolites by conjugating the reactive molecules to the nucleophile scavenging tripeptide glutathione (GSH, &amp / #61543 / -glu-cys-gly). The GSTs are found in all eukaryotes and prokaryotic systems, in the cytoplasm, on the microsomes, and in the mitochondria. Cytosolic GSTs have been grouped into seven distinct classes as: alpha (&amp / #61537 / ), mu (&amp / #61549 / ), pi (&amp / #61552 / ), sigma (&amp / #61555 / ), omega, theta (&amp / #61553 / ) and zeta (&amp / #61540 / ). In comparison with other GSTs, class theta enzymes have proven difficult to isolate and characterize. Two distinct theta GSTs have been identified in man, GSTT1-1 and GSTT2-2 three in the rat rGST1-1, rGSTT2-2 and 13-13 and one in the mouse. this study, a class theta GST (GSTT2-2), with high activity towards 1-MS was isolated and purified from bovine liver in 3% yield with a purification factor of 3-fold. The purification protocol included a sequential DEAE cellulose anion exchanger liquid chromatography column, S-hexylglutathione agarose affinity column, dye binding orange A and chromatofocusing columns. The enzyme activity and protein content decreased rapidly after the last step of purification. The purified GSTT2-2 showed significant activity only towards 1-MS as 77 nmole/min/mg. The GSTT2-2 purified from bovine liver had a molecular weigth (Mr) value of about 28,200 which was also confirmed by Western Blott Analysis. The purified farctions of GSTT2-2 with other kolon farctions were tested with anti GSTT2-2, antiGST alfa, antiGST mu and antiGST pi antibodies. The enzyme activities towards CDNB, 4-nitrobenzylchloride (NBC) and 1-menapthyl sulfate were measured as described by Habig and Jacoby.

O mecanismo não clássico de testosterona induz resposta celular rápida ao nível de membrana, enquanto que a ação clássica se dá pela ligação da testosterona ao seu receptor androgênico intracelular (iAR) que regula a expressão gênica. A Epitestosterona, o 17α-epímero da testosterona, tem sido descrito como um anti-andrógeno, inibindo o efeito da testosterona ou diidrotestosterona sobre o sobre o iAR. No entanto, a epitestosterona apresenta um efeito não clássico similar ao da da testosterona, despolarizando o potencial de membrana das células de Sertoli e induzindo a captação rápida de Ca2+ nos testículos. O objetivo deste estudo foi analizar o efeito do tratamento com epitestosterona e testosterona em animais castrados quimicamente com a utilização de um antagonista do hormônio liberador de gonadotrofinas (GnRH), o cetrorelix. Ratos imaturos, a partir do 7º dia de idade receberam durante 7 dias o tratamento pela via intraperitoneal de acordo com os seguintes grupos: Controle (apenas o veículo hidroxipropil-beta-ciclodextrina, castrados (Cetrorelix (500 μg/kg/dia)), castrados com reposição de testosterona (2,5mg/kg/dia) (Cetrorelix+testosterona), castrados com reposição de epitestosterona (2,5mg/kg/dia) (cetrorelix+epitestosterona) e epitestosterona. Foram observados os efeitos dos tratamentos em parâmetros de desenvolvimento sexual de ratos imaturos como: peso corporal, peso testicular e medida da distância anogenital (DAG). Também foram feitos registros eletrofisiológicos da ação no potencial de membrana da testosterona nos túbulos seminíferos de testículos de ratos de todos os tratamentos. Para a avaliação a imunorreatividade ao iAR foi utilizado o anticorpo primário anti-iAR do tipo policlonal na concentração 1:250. Para o controle-negativo da técnica cortes de todas os tratamentos incubados com PBS-T. Para expressão foi utilizado o anticorpo primário anti-iAR do tipo policlonal na concentração de 1:1000 realizada pela técnica de Western Blot. A castração química com cetrorelix resultou na redução no peso dos testículos e da DAG. O tratamento com epitestosterona e testosterona restaurou tanto o peso testicular como a DAG. O efeito despolarizante em resposta à aplicação tópica da testosterona foi observado no grupo controle e no grupo de cetrorelix. Além disso, o grupo castrado com cetrorelix com reposição de epitestosterona impediu o efeito rápido da testosterona na despolarização da membrana celular. No grupo com reposição de testosterona, a resposta eletrofisiológica da testosterona na membrana também foi alterada. O tratamento com epitestosterona nos ratos castrados com cetrorelix produziu diminuição da expressão do iAR. Foi observada redução da imunorreatividade do iAR nos animais tratados com epitestosterona. Pode-se concluir que a epitestosterona participa do desenvolvimento genital em ratos imaturos, ou seja, produziu recuperação de AGD de forma semelhante à testosterona. Este resultado sugere que ambos os hormônios atuam pela mesma via de desenvolvimento deste parâmetro, provavelmente através de um mecanismo não-clássico. Além disso, o tratamento com o antagonista de GnRH e reposição de epitestosterona suprimiu a resposta não clássica da testosterona, mudando o padrão de via de sinalização da testosterona nas células de Sertoli. / The non-classical mechanism of testosterone induces a rapid cellular response at the membrane level, while the classical action is through the binding to the intracellular androgenic receptor (iAR) and the regulation of gene expression. Epitestosterone, the 17α-epimer of testosterone, has been described as an anti-androgen, inhibiting the testosterone or dihyidrotestosterone effect on the iAR. However, epitestosterone presents a non-classical effect similar to testosterone, depolarizing the membrane potential of Sertoli cells and inducing rapid Ca2+ uptake in testes. The aim of this study was to observe the effect of the treatment with epitestosterone and testosterone in rats chemically castrated with a gonadotropin-releasing hormone (GnRH) antagonist cetrorelix. From pnd 7 to pnd 14, the rats were given daily intraperitoneal injections with (i) hormones solvent, (2-hydroxypropyl β-cyclodextrin) as the control group (CTRL); (ii) 500 μg/kg/day of the GnRH antagonist cetrorelix as the cetrorelix group (CET); (iii) 500 μg/kg/day of cetrorelix + 2.5 mg/kg/day of testosterone as the cetrorelix plus testosterone group (CET+T); (iv) 500 μg/kg/day of cetrorelix + 2.5 mg/kg/day of epitestosterone as the cetrorelix plus epitestosterone group (CET+EpiT); and (v) 2.5 mg/kg of epitestosterone alone as the epitestosterone group (EpiT). The effect of different treatments were verified on the body and testicular weight and the anogenital distance (AGD). The potential and the membrane resistance of Sertoli cells were recorded by electrophysiological technique intracellular record. The electrophysiological effect of testosterone on membrane of Sertoli cells were evaluated in seminiferous tubules in testes from rats of the all experimental groups. For evaluating the immunoreactivity to the iAR we used the anti-iAR primary polyclonal antibody type in concentration 1: 250. For the negative control technique cuts all treatments incubated with PBS-T. For iAR expression we used the anti-iAR type polyclonal primary antibody at a concentration of 1: 1000 performed by the Western Blot technique. The chemical castration induced a reduction in testicular weight and AGD. The treatment with both epitestosterone and testosterone restored the AGD and the testicular weight. The depolarizing effect in response to topical testosterone application was observed in the control group and in the GnRH antagonist cetrorelix group. Moreover, in the GnRH antagonist cetrorelix replaced with the epitestosterone group, testosterone was not capable of changing the membrane potential. In the group replaced with testosterone, the membrane response to testosterone was smaller also. The treatment with epitestosterone in castrated rats also reduced the expression of the iAR in testes. The immunoreaction of iAR was reduced in the animals treated with epitestosterone. In conclusion, the effect of epitestosterone on genital development in immature rats, namely recovering of AGD, was similar to testosterone. This result suggest that both hormones act through the same pathway on this development parameter, probably by a non-classical mechanism. Additionally, the treatment with the GnRH antagonist plus epitestosterone suppressed the non-classical testosterone response, changing the pattern of testosterone signaling pathway through a membrane mechanism in Sertoli cells.

O mecanismo não clássico de testosterona induz resposta celular rápida ao nível de membrana, enquanto que a ação clássica se dá pela ligação da testosterona ao seu receptor androgênico intracelular (iAR) que regula a expressão gênica. A Epitestosterona, o 17α-epímero da testosterona, tem sido descrito como um anti-andrógeno, inibindo o efeito da testosterona ou diidrotestosterona sobre o sobre o iAR. No entanto, a epitestosterona apresenta um efeito não clássico similar ao da da testosterona, despolarizando o potencial de membrana das células de Sertoli e induzindo a captação rápida de Ca2+ nos testículos. O objetivo deste estudo foi analizar o efeito do tratamento com epitestosterona e testosterona em animais castrados quimicamente com a utilização de um antagonista do hormônio liberador de gonadotrofinas (GnRH), o cetrorelix. Ratos imaturos, a partir do 7º dia de idade receberam durante 7 dias o tratamento pela via intraperitoneal de acordo com os seguintes grupos: Controle (apenas o veículo hidroxipropil-beta-ciclodextrina, castrados (Cetrorelix (500 μg/kg/dia)), castrados com reposição de testosterona (2,5mg/kg/dia) (Cetrorelix+testosterona), castrados com reposição de epitestosterona (2,5mg/kg/dia) (cetrorelix+epitestosterona) e epitestosterona. Foram observados os efeitos dos tratamentos em parâmetros de desenvolvimento sexual de ratos imaturos como: peso corporal, peso testicular e medida da distância anogenital (DAG). Também foram feitos registros eletrofisiológicos da ação no potencial de membrana da testosterona nos túbulos seminíferos de testículos de ratos de todos os tratamentos. Para a avaliação a imunorreatividade ao iAR foi utilizado o anticorpo primário anti-iAR do tipo policlonal na concentração 1:250. Para o controle-negativo da técnica cortes de todas os tratamentos incubados com PBS-T. Para expressão foi utilizado o anticorpo primário anti-iAR do tipo policlonal na concentração de 1:1000 realizada pela técnica de Western Blot. A castração química com cetrorelix resultou na redução no peso dos testículos e da DAG. O tratamento com epitestosterona e testosterona restaurou tanto o peso testicular como a DAG. O efeito despolarizante em resposta à aplicação tópica da testosterona foi observado no grupo controle e no grupo de cetrorelix. Além disso, o grupo castrado com cetrorelix com reposição de epitestosterona impediu o efeito rápido da testosterona na despolarização da membrana celular. No grupo com reposição de testosterona, a resposta eletrofisiológica da testosterona na membrana também foi alterada. O tratamento com epitestosterona nos ratos castrados com cetrorelix produziu diminuição da expressão do iAR. Foi observada redução da imunorreatividade do iAR nos animais tratados com epitestosterona. Pode-se concluir que a epitestosterona participa do desenvolvimento genital em ratos imaturos, ou seja, produziu recuperação de AGD de forma semelhante à testosterona. Este resultado sugere que ambos os hormônios atuam pela mesma via de desenvolvimento deste parâmetro, provavelmente através de um mecanismo não-clássico. Além disso, o tratamento com o antagonista de GnRH e reposição de epitestosterona suprimiu a resposta não clássica da testosterona, mudando o padrão de via de sinalização da testosterona nas células de Sertoli. / The non-classical mechanism of testosterone induces a rapid cellular response at the membrane level, while the classical action is through the binding to the intracellular androgenic receptor (iAR) and the regulation of gene expression. Epitestosterone, the 17α-epimer of testosterone, has been described as an anti-androgen, inhibiting the testosterone or dihyidrotestosterone effect on the iAR. However, epitestosterone presents a non-classical effect similar to testosterone, depolarizing the membrane potential of Sertoli cells and inducing rapid Ca2+ uptake in testes. The aim of this study was to observe the effect of the treatment with epitestosterone and testosterone in rats chemically castrated with a gonadotropin-releasing hormone (GnRH) antagonist cetrorelix. From pnd 7 to pnd 14, the rats were given daily intraperitoneal injections with (i) hormones solvent, (2-hydroxypropyl β-cyclodextrin) as the control group (CTRL); (ii) 500 μg/kg/day of the GnRH antagonist cetrorelix as the cetrorelix group (CET); (iii) 500 μg/kg/day of cetrorelix + 2.5 mg/kg/day of testosterone as the cetrorelix plus testosterone group (CET+T); (iv) 500 μg/kg/day of cetrorelix + 2.5 mg/kg/day of epitestosterone as the cetrorelix plus epitestosterone group (CET+EpiT); and (v) 2.5 mg/kg of epitestosterone alone as the epitestosterone group (EpiT). The effect of different treatments were verified on the body and testicular weight and the anogenital distance (AGD). The potential and the membrane resistance of Sertoli cells were recorded by electrophysiological technique intracellular record. The electrophysiological effect of testosterone on membrane of Sertoli cells were evaluated in seminiferous tubules in testes from rats of the all experimental groups. For evaluating the immunoreactivity to the iAR we used the anti-iAR primary polyclonal antibody type in concentration 1: 250. For the negative control technique cuts all treatments incubated with PBS-T. For iAR expression we used the anti-iAR type polyclonal primary antibody at a concentration of 1: 1000 performed by the Western Blot technique. The chemical castration induced a reduction in testicular weight and AGD. The treatment with both epitestosterone and testosterone restored the AGD and the testicular weight. The depolarizing effect in response to topical testosterone application was observed in the control group and in the GnRH antagonist cetrorelix group. Moreover, in the GnRH antagonist cetrorelix replaced with the epitestosterone group, testosterone was not capable of changing the membrane potential. In the group replaced with testosterone, the membrane response to testosterone was smaller also. The treatment with epitestosterone in castrated rats also reduced the expression of the iAR in testes. The immunoreaction of iAR was reduced in the animals treated with epitestosterone. In conclusion, the effect of epitestosterone on genital development in immature rats, namely recovering of AGD, was similar to testosterone. This result suggest that both hormones act through the same pathway on this development parameter, probably by a non-classical mechanism. Additionally, the treatment with the GnRH antagonist plus epitestosterone suppressed the non-classical testosterone response, changing the pattern of testosterone signaling pathway through a membrane mechanism in Sertoli cells.

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Belo Horizonte, MG, Brasil / A esquistossomose é uma doença parasitária causada por parasitos do gênero Schistosoma. Apesar das tentativas de controle e introdução do tratamento com praziquantel, a doença persiste. Desse modo, o desenvolvimento de uma vacina poderá contribuir para o controle da doença. Dentre outras evidências, o alto nível de proteção alcançado pela vacinação com cercárias irradiadas em camundongos e a presença de indivíduos naturalmente resistentes à infecção por Schistosoma mansoni em áreas endêmicas sugerem a existência de mecanismos que induzem proteção contra esquistossomose. Por meio de experimentos de Western-blotting bidimensional utilizando soro de indivíduos de área endêmica para esquistossomose e extrato proteico de vermes adultos, selecionamos a proteína fosfoglicerato mutase de S. mansoni (SmPGM) para ser testada em ensaios de imunização em camundongos, uma vez que spots correspondentes a esta proteína foram reconhecidos pelo soro de indivíduos naturalmente resistentes à infecção e também porque análises in silico do seu potencial antigênico indicaram que SmPGM é uma das proteínas de S. mansoni que mais possuem peptídeos antigênicos. A região codificadora do gene foi inserida em vetor de expressão em células de mamíferos e após certificar a expressão da proteína por Western-blotting usando anticorpo anti-His (C-term) e extrato proteico de células HEK 293T transfectadas, outra construção de DNA similar, que não expressa a proteína em fusão com 6xHis, foi usada nos ensaios de imunização gênica em camundongos. Entretanto, não houve redução no número de vermes adultos recuperados de camundongos vacinados e desafiados, bem como no número de ovos liberados nas fezes e retidos no fígado e intestino. Além disso, não houve alteração na ovoposição das fêmeas, nem no número e tamanho dos granulomas. A imunização gênica não foi capaz de induzir resposta humoral, resposta imune celular e produção de citocinas. Sendo assim, foram realizados experimentos de imunização de camundongos com dois peptídeos sintéticos de SmPGM, que também não resultou em proteção pelos parâmetros analisados. Este projeto também teve como objetivo identificar proteínas de membrana, principalmente do tegumento do parasito. Para isso, um extrato proteico de vermes adultos de S. mansoni enriquecido com proteínas de membrana foi obtido e também utilizado em experimentos de Western-blotting bidimensional. Foram detectados spots proteicos que reagiram diferencialmente aos pools de soro de indivíduos de área endêmica para esquistossomose. Entretanto, todos os spots imunorreativos foram submetidos à identificação por espectrometria de massas. / The schistosomiasis is a parasitic disease caused by parasites of genus Schistosoma. Even with the attempts to control the disease and the introduction of the treatment with the praziquantel drug, the disease persists. Thereby, the development of one long lasting protection, based in vaccine therapy, would be a great benefit for the disease control. Among others evidences, the high protection level achieved by vaccination with irradiated cercarie in mice and the presence of naturally resistant individuals to infection by S. mansoni in endemic areas suggest the existence of mechanisms that induce protection against schistosomiasis. By the two-dimensional Western-blotting experiments using pool of serum of individuals from schistosomiasis endemic area and adult worm protein extract, we selected the protein S. mansoni phosphoglycerate mutase (SmPGM) to be tested in immunization assays in mice, since your corresponding spots were recognize by the pool of serum of naturally resistant individuals to infection and also because in silico analysis of its antigenic potential indicated that SmPGM is one of the S. mansoni proteins that have more antigenic peptides. The codion region of the corresponding gene was inserted into a plasmid vector for gene expression in mammalian cells and after ensuring the protein expression by Western blotting using anti-His (C-term) antibody and protein extract of transfected HEK 293T cells, another similar DNA construction, without the 6xHis-tag, was used to DNA immunization assays in mice. However, there was no reduction in the number of adult worms recovered from vaccinated and challenged mice, as well as in the number of eggs released in feces and retained in the liver and intestine. Furthermore, there was neither change in the female oviposition, nor in the number and area of the granulomas. The DNA immunization was not able to induce humoral, cellular immune response and cytokine production. Thus, in mice immunizations were also performed with two SmPGM synthetic peptides. This immunization protocol also resulted in lack of protective immunity against S. mansoni infection according to the analyzed parameters. This project also aimed to identify membrane proteins, mainly of the S. mansoni parasite tegument. For this, a protein extract of S. mansoni adult worms enriched with membrane proteins was obtained and also used in two-dimensional Western-blotting experiments. Protein spots that reacted differentially to the serum pools of individuals from endemic area for schistosomiasis were detected. However, all immunoreactive spots were subjected to mass spectrometry identification.

Made available in DSpace on 2016-05-16T12:51:25Z (GMT). No. of bitstreams: 2 marcos_almeida_ini_mest_2014.pdf: 14714832 bytes, checksum: be975491bb39d63940e3b535442ff649 (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2014 / Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Nacional de Infectologia Evandro Chagas. Rio de Janeiro, RJ, Brasil / A histoplasmose é uma micose cosmopolita causada pelo fungo dimórfico Histoplasma capsulatum, cujo habitat é o solo rico em excretas de aves e morcegos. Esta infecção ocorre a partir da inalação de propágulos de H. capsulatum e apresenta um amplo espectro clínico, variando de formas leves a disseminadas, a depender do inóculo infectante, do status imunológico do hospedeiro e da virulência da cepa. O diagnóstico da histoplasmose é baseado em aspectos clínicos, epidemiológicos, radiológicos e laboratoriais, embora alguns sintomas possam ser confundidos com outras doenças, tais como a tuberculose e outras micoses. O teste de referência para a confirmação do diagnóstico é o isolamento e identificação de H. capsulatum em cultivo. Entretanto, na ausência dos mesmos, a sorologia tem sido utilizada para o diagnóstico presuntivo da histoplasmose através da detecção de anticorpos. O principal complexo antigênico utilizado para a detecção de anticorpos anti-H. capsulatum é a histoplasmina, constituída principalmente pelos antígenos C, H e M. Estes últimos, em sua forma nativa, são glicoproteínas contendo epítopos protéicos específicos e glicosídicos inespecíficos. Deglicosilações químicas pelo metaperiodato de sódio (NaIO4) provaram aumentar a sensibilidade e especificidade em métodos imunoenzimáticos, tais como Western blot e ELISA, reduzindo a reatividade cruzada com outros fungos O principal objetivo do presente estudo foi validar o método imunoenzimático (Western blot) para a detecção de anticorpos no diagnóstico da histoplasmose. Desta forma, foi realizado um estudo casocontrole, utilizando 118 amostras de soro de pacientes com histoplasmose e 118 amostras de soro de indivíduos com história clínico-epidemiológica compatível com micose sistêmica, saudáveis ou acometidos por outra micose ou tuberculose, residentes no estado do Rio de Janeiro. As amostras foram coletadas no período de 2000 a 2013 e encaminhadas ao Laboratório de Micologia do Instituto Nacional de Infectologia Evandro Chagas. Os parâmetros de validação diagnóstica foram calculados considerando a categorização dos resultados obtidos em uma tabela 2 X 2 e analisados pelo SPSS 17.0. O Western blot demonstrou uma sensibilidade de 94,9%, especificidade de 94,1%, acurácia de 94,5% e uma precisão quase perfeita. As fitas demonstraram-se viáveis para utilização por até cinco anos após a sensibilização com o antígeno HMIN-PT. Estes resultados comprovam a validade do ensaio imunoenzimático (Western blot) para detecção de anticorpos anti-H. capsulatum utilizando HMIN-PT como uma ferramenta de boa acurácia no diagnóstico da histoplasmose e reprodutível. Desta forma, contribuindo para o melhoramento do diagnóstico desta micose, uma vez que esta técnica permitirá a obtenção de resultados em menos de 24 horas, o que supõe um grande avanço a despeito das técnicas existentes na atualidade e poderá vir a ser implantada e disponibilizada para outros centros do Sistema Único de Saúde. / Histoplasmosis is a worldwide systemic mycosis caused by the dimorphic fungus Histoplasma capsulatum. The fungus lives in soil that contains large amounts of birds or bats droppings. This infection occurs through inhalation of spores of H. capsulatum and has a wide clinical spectrum, ranging from mild to disseminated forms that depend on the infecting inoculum, the immune status of the host and the virulence of the strain. The diagnosis of histoplasmosis is based on clinical, epidemiological, radiological and laboratory aspects; however, some symptoms may be confused with other diseases, such as tuberculosis and other mycoses. The reference test for the confirmation of the diagnosis of histoplasmosis is the isolation and identification of H. capsulatum in culture. However, in the absence of it, serology has been used for the presumptive diagnosis of histoplasmosis through antibody detection. The principal antigenic complex used to detect antibodies anti-H. capsulatum is the histoplasmin, consisting mainly of antigens C, H and M. These antigens, in their native forms, are glycoproteins containing specie-specific protein epitopes and non-specific glycosides. Chemical deglycosylations by sodium metaperiodate (NaIO4) have shown to increase the sensitivity and specificity of immunoenzymatic methods, such as Western blot and ELISA, reducing cross-reactivity with other fungi. The aim of this study was to validate the immunoassay method (Western blot) to detect antibodies in the diagnosis of histoplasmosis Therefore, a case-control study was conducted using 118 serum samples from patients with histoplasmosis, and 118 serum samples from individuals with clinical and epidemiological history compatible with systemic mycosis, either healthy or suffering from other mycosis or tuberculosis. These patients were residents in the state of Rio de Janeiro and the samples, collected from 2000 to 2013, were sent to the Mycology Laboratory of the Instituto Nacional de Infectologia Evandro Chagas. Diagnostic validation parameters were calculated based on the categorization of results obtained in a 2 x 2 table and analyzed using SPSS Statistics 17.0. The Western blot was shown sensitivity of 94.9%, specificity of 94.1%, accuracy of 94.5% and also almost perfect precision. Besides, the strips have been proved to be viable for use or at least five years after the sensitization with antigen HMIN-PT. These results prove the validity of the enzyme immunoassay (Western blot) for the detection of antibodies anti-H. capsulatum, using HMIN-PT as a good accuracy tool in the diagnosis of histoplasmosis and reproducible, contributing to improve the diagnosis of this mycosis, since this technique allows obtaining results in less than 24 hours which implies a breakthrough despite existing at present and will eventually be deployed and made available to other centers belonging to the Public Health System

O mecanismo não clássico de testosterona induz resposta celular rápida ao nível de membrana, enquanto que a ação clássica se dá pela ligação da testosterona ao seu receptor androgênico intracelular (iAR) que regula a expressão gênica. A Epitestosterona, o 17α-epímero da testosterona, tem sido descrito como um anti-andrógeno, inibindo o efeito da testosterona ou diidrotestosterona sobre o sobre o iAR. No entanto, a epitestosterona apresenta um efeito não clássico similar ao da da testosterona, despolarizando o potencial de membrana das células de Sertoli e induzindo a captação rápida de Ca2+ nos testículos. O objetivo deste estudo foi analizar o efeito do tratamento com epitestosterona e testosterona em animais castrados quimicamente com a utilização de um antagonista do hormônio liberador de gonadotrofinas (GnRH), o cetrorelix. Ratos imaturos, a partir do 7º dia de idade receberam durante 7 dias o tratamento pela via intraperitoneal de acordo com os seguintes grupos: Controle (apenas o veículo hidroxipropil-beta-ciclodextrina, castrados (Cetrorelix (500 μg/kg/dia)), castrados com reposição de testosterona (2,5mg/kg/dia) (Cetrorelix+testosterona), castrados com reposição de epitestosterona (2,5mg/kg/dia) (cetrorelix+epitestosterona) e epitestosterona. Foram observados os efeitos dos tratamentos em parâmetros de desenvolvimento sexual de ratos imaturos como: peso corporal, peso testicular e medida da distância anogenital (DAG). Também foram feitos registros eletrofisiológicos da ação no potencial de membrana da testosterona nos túbulos seminíferos de testículos de ratos de todos os tratamentos. Para a avaliação a imunorreatividade ao iAR foi utilizado o anticorpo primário anti-iAR do tipo policlonal na concentração 1:250. Para o controle-negativo da técnica cortes de todas os tratamentos incubados com PBS-T. Para expressão foi utilizado o anticorpo primário anti-iAR do tipo policlonal na concentração de 1:1000 realizada pela técnica de Western Blot. A castração química com cetrorelix resultou na redução no peso dos testículos e da DAG. O tratamento com epitestosterona e testosterona restaurou tanto o peso testicular como a DAG. O efeito despolarizante em resposta à aplicação tópica da testosterona foi observado no grupo controle e no grupo de cetrorelix. Além disso, o grupo castrado com cetrorelix com reposição de epitestosterona impediu o efeito rápido da testosterona na despolarização da membrana celular. No grupo com reposição de testosterona, a resposta eletrofisiológica da testosterona na membrana também foi alterada. O tratamento com epitestosterona nos ratos castrados com cetrorelix produziu diminuição da expressão do iAR. Foi observada redução da imunorreatividade do iAR nos animais tratados com epitestosterona. Pode-se concluir que a epitestosterona participa do desenvolvimento genital em ratos imaturos, ou seja, produziu recuperação de AGD de forma semelhante à testosterona. Este resultado sugere que ambos os hormônios atuam pela mesma via de desenvolvimento deste parâmetro, provavelmente através de um mecanismo não-clássico. Além disso, o tratamento com o antagonista de GnRH e reposição de epitestosterona suprimiu a resposta não clássica da testosterona, mudando o padrão de via de sinalização da testosterona nas células de Sertoli. / The non-classical mechanism of testosterone induces a rapid cellular response at the membrane level, while the classical action is through the binding to the intracellular androgenic receptor (iAR) and the regulation of gene expression. Epitestosterone, the 17α-epimer of testosterone, has been described as an anti-androgen, inhibiting the testosterone or dihyidrotestosterone effect on the iAR. However, epitestosterone presents a non-classical effect similar to testosterone, depolarizing the membrane potential of Sertoli cells and inducing rapid Ca2+ uptake in testes. The aim of this study was to observe the effect of the treatment with epitestosterone and testosterone in rats chemically castrated with a gonadotropin-releasing hormone (GnRH) antagonist cetrorelix. From pnd 7 to pnd 14, the rats were given daily intraperitoneal injections with (i) hormones solvent, (2-hydroxypropyl β-cyclodextrin) as the control group (CTRL); (ii) 500 μg/kg/day of the GnRH antagonist cetrorelix as the cetrorelix group (CET); (iii) 500 μg/kg/day of cetrorelix + 2.5 mg/kg/day of testosterone as the cetrorelix plus testosterone group (CET+T); (iv) 500 μg/kg/day of cetrorelix + 2.5 mg/kg/day of epitestosterone as the cetrorelix plus epitestosterone group (CET+EpiT); and (v) 2.5 mg/kg of epitestosterone alone as the epitestosterone group (EpiT). The effect of different treatments were verified on the body and testicular weight and the anogenital distance (AGD). The potential and the membrane resistance of Sertoli cells were recorded by electrophysiological technique intracellular record. The electrophysiological effect of testosterone on membrane of Sertoli cells were evaluated in seminiferous tubules in testes from rats of the all experimental groups. For evaluating the immunoreactivity to the iAR we used the anti-iAR primary polyclonal antibody type in concentration 1: 250. For the negative control technique cuts all treatments incubated with PBS-T. For iAR expression we used the anti-iAR type polyclonal primary antibody at a concentration of 1: 1000 performed by the Western Blot technique. The chemical castration induced a reduction in testicular weight and AGD. The treatment with both epitestosterone and testosterone restored the AGD and the testicular weight. The depolarizing effect in response to topical testosterone application was observed in the control group and in the GnRH antagonist cetrorelix group. Moreover, in the GnRH antagonist cetrorelix replaced with the epitestosterone group, testosterone was not capable of changing the membrane potential. In the group replaced with testosterone, the membrane response to testosterone was smaller also. The treatment with epitestosterone in castrated rats also reduced the expression of the iAR in testes. The immunoreaction of iAR was reduced in the animals treated with epitestosterone. In conclusion, the effect of epitestosterone on genital development in immature rats, namely recovering of AGD, was similar to testosterone. This result suggest that both hormones act through the same pathway on this development parameter, probably by a non-classical mechanism. Additionally, the treatment with the GnRH antagonist plus epitestosterone suppressed the non-classical testosterone response, changing the pattern of testosterone signaling pathway through a membrane mechanism in Sertoli cells.

Submitted by Mario BC (mario@bc.ufrpe.br) on 2018-05-03T14:16:07Z No. of bitstreams: 1 Marcus Vinicius Dias Falcao.pdf: 1474619 bytes, checksum: 0175beba567d6fd2060ec9dd863c927b (MD5) / Made available in DSpace on 2018-05-03T14:16:07Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Marcus Vinicius Dias Falcao.pdf: 1474619 bytes, checksum: 0175beba567d6fd2060ec9dd863c927b (MD5) Previous issue date: 2017-02-23 / Brucellosis is an infectious disease with a chronic characteristic caused by the bacteria Brucella spp. The aim of this study was to develop and standardize a Western Blotting technique for use in bovine brucellosis serodiagnosis. Two groups were used: group I with 60 samples of true positive and true negative animals being 30 positive and 30 negative in CFT and group II with 383 field samples being 90 positive and 293 negative in CFT. The analysis using WB technique revealed the molecular weight ≤20 kDa as the most characteristic and reactive area for identification and separation of animals with natural infection from vaccinated. The sensitivity and specificity of WB as compared to AAT were 93% and 99% respectively, and when compared to TFC respectively were 97% and 98%. The WB standardized in this study may be used as confirmatory test, because it is more sensitive and specific with capacity for differentiation between naturally infected and vaccinated animals. / A brucelose é uma doença infectocontagiosa de caráter crônico causada por bactérias do gênero Brucella spp. Objetivou-se desenvolver e padronizar uma técnica de Western Blotting para uso no sorodiagnóstico da brucelose bovina. Dois grupos foram utilizados: o grupo I com 60 amostras de animais verdadeiros positivos e verdadeiros negativos, sendo 30 positivas e 30 negativas no TFC e o grupo II com 383 amostras de amostras de campo, sendo 90 positivas e 293 negativas na TFC. O resultado da análise das amostras no Western Blotting revelou banda com peso molecular ≤20 kDa como sendo a banda mais reativo e propriedade para identificação e separação de animais com infecção natural dos animais vacinados. A sensibilidade e especificidade do WB quando comparadas com o AAT foi, respectivamente, 93% e 99%, e quando comparadas com a TFC foi respectivamente, 97% e 98%. O WB padronizado neste estudo poderá ser empregado teste confirmatório, pois se trata de um teste mais sensível e específico e com capacidade de diferenciação entre animais naturalmente infectados e vacinados.

Charles University in Prague Pharmaceutical Faculty in Hradec Králové Department of Pharmacology and Toxicology Student: Anastasiya Shkut Supervisors: Mgr. Jana Mandíková, Virginia Motilva Ph.D. Title of diploma thesis: The role of melatonin in SIRT1 and p-AMPK regulation in HT-29 cell line. Sirituin 1 (SIRT1) is NAD+ dependent deacetylase present in wide range of organisms including mammals. It was found to extend life span in yeasts during calorie restriction (CR) conditions. SIRT1 deacetylates many regulator proteins and thus control metabolic status of cell as well as AMP-activated kinase (AMPK), which is also energy regulator enzyme depending on NAD+ levels in cell. Both of them play roles in cancer and could influence autophagy, although the exact mechanism remains unclear. We focused our study on hormone melatonin, which has anti-inflammatory and anti-cancer effects, to study its influence on human colon cancer cell line HT-29. If it has impact on SIRT1 and AMPK and what is hierarchic relationship between SIRT1 and AMPK. Also we observed its possible influence on autophagy. We used Western blotting (WB) technique and from our results it seems that melatonin has significant effect on SIRT1, which might activate AMPK as well as autophagy. Nevertheless some of results did not have sufficient...