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Thesis (M.S.)--University of Wisconsin--Madison, 1968. / eContent provider-neutral record in process. Description based on print version record. Includes bibliographical references.

Thesis (Ph. D.)--Rutgers University, 2008. / "Graduate Program in Plant Biology." Includes bibliographical references (p. 210-225).

Thesis (Ph.D.)--University of Florida, 1987. / Includes bibliographical references.

A doença vassoura-de-bruxa do cacaueiro (Theobroma cacao L.), causada pelo basidiomiceto Moniliophthora perniciosa consiste numa importante enfermidade e apenas o uso de variedades resistentes representa uma solução econômica e ambientalmente viável. Os hormônios vegetais são imprescindíveis na rede de sinalização envolvida na resposta contra uma grande variedade de estresses bióticos e abióticos, sendo bem reconhecido o papel crucial do ácido salicílico (AS), etileno (ET) e os jasmonatos (JA) na interação planta-patógeno. O mecanismo de resistência observado em T. cacao contra o fungo hemibiotrófico M. perniciosa parece não envolver resposta de hipersensibilidade mediada pela sinalização por AS, e caracteriza-se pela menor incidência de sintomas e atenuação do crescimento micelial no material resistente. A resposta regulada por JA e/ou ET é determinada pela contenção e redução da colonização de tecidos infectados pelo patógeno, com atenuação dos sintomas manifestados, e está associada com a indução e produção de inibidores de protease, enzimas líticas da parede de fungos e enzimas do metabolismo secundário e cujo os genes demonstraram indução diferencial em amostras inoculadas com M. perniciosa. Recentemente, foi demonstrada a produção de AS pelo fungo M. perniciosa, o que poderia estar associado a um desarranjo hormonal na planta, auxiliando o pátogeno no processo infectivo. A partir destas evidências este trabalho teve como hipótese que JA e/ou ET estaria regulando a interação T. cacao e M. perniciosa. Sabe-se que a transcrição de genes codificantes das enzimas da via de biossíntese de JA é induzida por aplicação exógena de metil-jasmonato (MJ) e por patógenos, assim para verificar a participação de JA na resposta de defesa de cacau, seqüências de genes que codificam para enzimas da via de biossíntese foram identificadas, classificadas e confirmados sua identidade por seqüenciamento. A indução e expressão quantitativa destes, além dos genes Samsi, Accox, Pal, Jaz e Della, foram avaliadas entre o acesso susceptível à M. perniciosa (\'P7\') e o resistente (\'CAB 214\') de T. cacao, em experimentos de aplicação de indutores (AS, ET e MJ) e inoculação com M. perniciosa. As análises de expressão gênica relativa por RT-qPCR foram conduzidas e a resposta dos genes de biossíntese de JA, quando tratado com MJ no \'P7\' pareceu ser mais intensa e mais específica, enquanto que o acesso \'CAB 214\' apresentou resposta com menor intensidade, porém com resposta mais precoce, demonstrando que o mecanismo de regulação positiva pela aplicação exógena de MJ também ocorre em T. cacao. Em relação à inoculação, os resultados de expressão gênica sugerem uma diferença na resposta transcricional dos genes analisados sob inoculação de M. perniciosa entre o \'P7\' e o \'CAB 214\' onde os transcritos de Aos, Kat, Samsi e Jaz apresentaram elevação significativa somente no \'CAB 214\' em comparação ao \'P7\'. Em acessos resistentes, como \'CAB 214\', o efeito de AS produzido pelo fungo poderia não estar surtindo efeitos antagônicos, como indicado pelo aumento transcricional de Aos, gene codificador da principal enzima envolvida na biossíntese de JA, e embora os demais genes da via estejam sendo reprimidos, muito possivelmente a sinalização da resposta de defesa do acesso resistente \'CAB 214\' seja desencadeada por JA, devido ao papel central de AOS na sua biossíntese, e de maneira sinérgica ET estaria participando do mecanismo de resposta, indicado pela alta indução de Samsi no acesso resistente / Witches broom disease of cacao (Theobroma cacao L.), caused by the basidiomycete Moniliophthora perniciosa is an important disease and the use of resistant varieties is the only economic and environmental long-term solution. Plant hormones are essential in the signaling network involved in the response against a variety of biotic and abiotic stresses. It is well recognized the crucial role of salicylic acid (SA), ethylene (ET) and jasmonate (JA) in plant-pathogen interactions. The mechanism of resistance observed in Theobroma cacao against M. perniciosa does not appear to involve hypersensitivity response mediated by AS signaling, and it is characterized by lower incidence of symptoms and reduction of mycelial growth in resistant material. The response regulated by JA and/or ET is determined by the growth inhibition and a reduction of the colonization of infected tissues by the pathogen, together with an attenuation of symptoms. It is also associated with an induction and production of the protease inhibitors, lytic enzymes and enzymes of secondary metabolism and the genes enconding these enzymes have shown differential expression patterns in samples inoculated with M. perniciosa. It has been recently demonstrated that the production of AS by the fungus M. perniciosa could be associated with a hormonal disorder in the plant, which could therefore help the pathogen in the infective process. Considering this, the hypothesis that JA and/or ET would regulate the interaction of T. cacao with M. perniciosa was formulated in order to be tested by this research work. It is known that the transcription of genes encoding the enzymes of the JA biosynthesis pathway is induced by exogenous application of methyl jasmonate (MJ) and by pathogen, thus, in order to verify the involvement of JA in defense response of cocoa, sequences of genes that encode the enzymes of the JA biosynthesis pathway were isolated, identified, classified and had their identity confirmed by sequencing, and relative quantitative gene expression were evaluated in susceptible \'P7\' and resistant \'CAB 214\' plants of T. cacao. In addition genes Sams, Accox, Pal , Jaz and Della, were evaluated in experiments with application of inducers (AS, ET and MJ) and inoculation with M. perniciosa. Analysis of relative gene expression by RT-qPCR were conducted and \'P7\' seems to have the expression of jasmonate biosynthesis genes in a more intense and more specific manner when treated with MJ, while \'CAB 214\' shows an earlier yet lower response suggesting that the mechanism of positive regulation by the exogenous application of MJ also occurs in T. cacao. For the inoculation, the gene expression results suggest a difference in the transcriptional response from inoculation with M. perniciosa between \'P7\' and \'CAB 214\' in T. cacao. The effect of AS produced by the fungus may not have antagonistic effects in resistant materials such as \'CAB 214\', as indicated by the increase of the transcription of Aos gene that encodes the main enzyme involved in JA biosynthesis, so the defense responses of \'CAB 214\' is possibly triggered by JA signaling, because the central role of AOS in its biosynthesis, and may be part of synergistic ET signaling, indicated by high Samsi expression in resistance material

Submitted by Nathália Faria da Silva (nathaliafsilva.ufv@gmail.com) on 2017-06-13T14:19:53Z No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 786589 bytes, checksum: eb63aec8e42b5ea4321e4a66b75765e1 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-06-13T14:19:53Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 786589 bytes, checksum: eb63aec8e42b5ea4321e4a66b75765e1 (MD5) Previous issue date: 2003-08-29 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / O presente trabalho abordou a transformação genética em C. perniciosa, fungo causador da vassoura-de-bruxa no cacaueiro, investigando os fatores que podem influenciar a eficiência de transformação neste organismo, bem como a forma de integração do vetor no genoma do fungo. A transformação dos protoplastos foi realizada pelo método químico do PEG/CaCl 2 e a seleção dos transformantes foi feita com base na resistência à higromicina B. A eficiência de transformação foi analisada em função do promotor utilizado para expressar o gene marcador (se proveniente de basidiomiceto ou de ascomiceto), da forma do vetor (circular ou linear) e da presença de inibidores de nuclease (ácido aurintricarboxílico, putrecina e espermidina) na mistura de transformação. A técnica REMI (restriction enzyme mediated integration) foi realizada utilizando a enzima de restrição BamHI. Também foi construído um vetor contendo o gene que confere resistência à higromicina B (hph) sob o comando do promotor do gene gpd de Agaricus bisporus, para experimentos futuros de mutagênese insercional. A utilização do promotor gpd de Agaricus bisporus resultou em uma eficiência de transformação cinco vezes superior àquela obtida quando o promoter gpd de Aspergillus nidulans foi utilizado. Além disso, os transformantes desenvolveram- se mais rapidamente, com redução do tempo necessário para visualização das colônias nas placas em comparação aos transformantes que continham o gene hph sob o controle do promotor gpd Aspergillus. Os inibidores de nucleases putrecina e ATA (ácido aurintricarboxílico) reduziram a eficiência de transformação nas condições utilizadas, enquanto que a presença de espermidina não exerceu influência quando comparado ao controle. A linearização do vetor não influenciou a eficiência de transformação e todos os transformantes resultantes desse tratamento que foram analisados por hibridização apresentaram um padrão complexo de integração, com duas ou mais cópias do plasmídeo inseridas em posições distintas no genoma. A mais elevada eficiência de transformação foi obtida com REMI, utilizando-se 10U da enzima de restrição BamHI e 10 μg do vetor na forma circular. Nesta condição, foram obtidos cerca de 64 transformantes/μg de plasmídeo, cerca de três vezes mais transformantes que o tratamento onde BamHI não esteve presente. Não foi verificada a influência da enzima de restrição promovendo a obtenção de transformantes com uma única cópia do vetor integrada. Os transformantes mostraram alto nível de resistência à higromicina (>500 μg/mL). Dos transformantes analisados quanto à estabilidade mitótica, 100% conservaram-se resistentes após a passagem por meio não seletivo durante 40 dias. / The present work has investigated the different conditions that may influence the transformation efficiency and the way transforming DNA integrates into the genome of the fungus Crinipellis perniciosa, the causal agent of the witches' broom disease of cacao. Protoplast transformation was done by the PEG/CaCl 2 method. Transformant colonies were selected for resistance to hygromycin B. The transformation efficiency was related to the type of promoter used to express the hph gene (either from an ascomycete or from a basidiomycete fungus), vector shape (linear or circular forms), and the presence of nuclease inhibitors (aurintricarboxylic acid, putrescine or spermidine) in the transformation mix. The REMI (restriction enzyme-mediated integration) technique was employed using BamHI. For future experiments of insertional mutagenesis, a plasmid containing the hph gene controlled by the gpd gene from Agaricus bisporus was constructed. The use of the gpd promoter from Agaricus bisporus resulted in a five-fold increase in transformation efficiency compared to that obtained with the gpd promoter from Aspergillus nidulans. In addition, these transformants showed faster growth than those containing gpd from Aspergillus. Putrescine and ATA (aurintricarboxylic acid) decreased the transformation efficiency, while spermidine did not have any influence in comparison to the control. Vector linearization was not effective and a complex pattern of plasmid integrations resulted from this procedure, with two or more copies integrated throughout the genome. The highest efficiency was obtained with REMI (10U of BamHI added prior to transformation with 10 μg of circular vector). An efficiency of 64 transformants/μg of plasmid was obtained in this treatment. Under the analyzed conditions, BamHI did not induce single copy integrations in Crinipellis perniciosa, although an approximate three-fold increase in the transformation efficiency was obtained. The transformants were highly resistant to hygromycin (> 500 μg/mL). All transformants analyzed were mitotically stable after successive transfers to nonselective media for 40 days.

A doença vassoura-de-bruxa do cacaueiro (Theobroma cacao L.), causada pelo basidiomiceto Moniliophthora perniciosa consiste numa importante enfermidade e apenas o uso de variedades resistentes representa uma solução econômica e ambientalmente viável. Os hormônios vegetais são imprescindíveis na rede de sinalização envolvida na resposta contra uma grande variedade de estresses bióticos e abióticos, sendo bem reconhecido o papel crucial do ácido salicílico (AS), etileno (ET) e os jasmonatos (JA) na interação planta-patógeno. O mecanismo de resistência observado em T. cacao contra o fungo hemibiotrófico M. perniciosa parece não envolver resposta de hipersensibilidade mediada pela sinalização por AS, e caracteriza-se pela menor incidência de sintomas e atenuação do crescimento micelial no material resistente. A resposta regulada por JA e/ou ET é determinada pela contenção e redução da colonização de tecidos infectados pelo patógeno, com atenuação dos sintomas manifestados, e está associada com a indução e produção de inibidores de protease, enzimas líticas da parede de fungos e enzimas do metabolismo secundário e cujo os genes demonstraram indução diferencial em amostras inoculadas com M. perniciosa. Recentemente, foi demonstrada a produção de AS pelo fungo M. perniciosa, o que poderia estar associado a um desarranjo hormonal na planta, auxiliando o pátogeno no processo infectivo. A partir destas evidências este trabalho teve como hipótese que JA e/ou ET estaria regulando a interação T. cacao e M. perniciosa. Sabe-se que a transcrição de genes codificantes das enzimas da via de biossíntese de JA é induzida por aplicação exógena de metil-jasmonato (MJ) e por patógenos, assim para verificar a participação de JA na resposta de defesa de cacau, seqüências de genes que codificam para enzimas da via de biossíntese foram identificadas, classificadas e confirmados sua identidade por seqüenciamento. A indução e expressão quantitativa destes, além dos genes Samsi, Accox, Pal, Jaz e Della, foram avaliadas entre o acesso susceptível à M. perniciosa (\'P7\') e o resistente (\'CAB 214\') de T. cacao, em experimentos de aplicação de indutores (AS, ET e MJ) e inoculação com M. perniciosa. As análises de expressão gênica relativa por RT-qPCR foram conduzidas e a resposta dos genes de biossíntese de JA, quando tratado com MJ no \'P7\' pareceu ser mais intensa e mais específica, enquanto que o acesso \'CAB 214\' apresentou resposta com menor intensidade, porém com resposta mais precoce, demonstrando que o mecanismo de regulação positiva pela aplicação exógena de MJ também ocorre em T. cacao. Em relação à inoculação, os resultados de expressão gênica sugerem uma diferença na resposta transcricional dos genes analisados sob inoculação de M. perniciosa entre o \'P7\' e o \'CAB 214\' onde os transcritos de Aos, Kat, Samsi e Jaz apresentaram elevação significativa somente no \'CAB 214\' em comparação ao \'P7\'. Em acessos resistentes, como \'CAB 214\', o efeito de AS produzido pelo fungo poderia não estar surtindo efeitos antagônicos, como indicado pelo aumento transcricional de Aos, gene codificador da principal enzima envolvida na biossíntese de JA, e embora os demais genes da via estejam sendo reprimidos, muito possivelmente a sinalização da resposta de defesa do acesso resistente \'CAB 214\' seja desencadeada por JA, devido ao papel central de AOS na sua biossíntese, e de maneira sinérgica ET estaria participando do mecanismo de resposta, indicado pela alta indução de Samsi no acesso resistente / Witches broom disease of cacao (Theobroma cacao L.), caused by the basidiomycete Moniliophthora perniciosa is an important disease and the use of resistant varieties is the only economic and environmental long-term solution. Plant hormones are essential in the signaling network involved in the response against a variety of biotic and abiotic stresses. It is well recognized the crucial role of salicylic acid (SA), ethylene (ET) and jasmonate (JA) in plant-pathogen interactions. The mechanism of resistance observed in Theobroma cacao against M. perniciosa does not appear to involve hypersensitivity response mediated by AS signaling, and it is characterized by lower incidence of symptoms and reduction of mycelial growth in resistant material. The response regulated by JA and/or ET is determined by the growth inhibition and a reduction of the colonization of infected tissues by the pathogen, together with an attenuation of symptoms. It is also associated with an induction and production of the protease inhibitors, lytic enzymes and enzymes of secondary metabolism and the genes enconding these enzymes have shown differential expression patterns in samples inoculated with M. perniciosa. It has been recently demonstrated that the production of AS by the fungus M. perniciosa could be associated with a hormonal disorder in the plant, which could therefore help the pathogen in the infective process. Considering this, the hypothesis that JA and/or ET would regulate the interaction of T. cacao with M. perniciosa was formulated in order to be tested by this research work. It is known that the transcription of genes encoding the enzymes of the JA biosynthesis pathway is induced by exogenous application of methyl jasmonate (MJ) and by pathogen, thus, in order to verify the involvement of JA in defense response of cocoa, sequences of genes that encode the enzymes of the JA biosynthesis pathway were isolated, identified, classified and had their identity confirmed by sequencing, and relative quantitative gene expression were evaluated in susceptible \'P7\' and resistant \'CAB 214\' plants of T. cacao. In addition genes Sams, Accox, Pal , Jaz and Della, were evaluated in experiments with application of inducers (AS, ET and MJ) and inoculation with M. perniciosa. Analysis of relative gene expression by RT-qPCR were conducted and \'P7\' seems to have the expression of jasmonate biosynthesis genes in a more intense and more specific manner when treated with MJ, while \'CAB 214\' shows an earlier yet lower response suggesting that the mechanism of positive regulation by the exogenous application of MJ also occurs in T. cacao. For the inoculation, the gene expression results suggest a difference in the transcriptional response from inoculation with M. perniciosa between \'P7\' and \'CAB 214\' in T. cacao. The effect of AS produced by the fungus may not have antagonistic effects in resistant materials such as \'CAB 214\', as indicated by the increase of the transcription of Aos gene that encodes the main enzyme involved in JA biosynthesis, so the defense responses of \'CAB 214\' is possibly triggered by JA signaling, because the central role of AOS in its biosynthesis, and may be part of synergistic ET signaling, indicated by high Samsi expression in resistance material

Orientadores: Gonçalo A. Guimarães Pereira, Francisco Javier Medrano Martin / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-11T07:53:54Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Cabrera_OdalysGarcia_D.pdf: 6336814 bytes, checksum: 10a8f8e8b80239f363cbb4eda5d2746e (MD5) Previous issue date: 2007 / Resumo: A doença Vassoura-de-bruxa do cacaueiro (Theobroma cacao) é causada pelo fungo basidiomiceto Moniliophthora perniciosa e atualmente constitui um dos maiores problemas fitopatológicos do Brasil. Análises do genoma de M. perniciosa permitiram identificar três genes codificadores para proteínas indutoras de necrose e etileno (NEPs) descritas em oomicetos, bactérias e alguns fungos ascomicetos. Os genes codificadores das proteínas NEP de M. perniciosa (MpNEPs) parecem estar localizados no mesmo cromossomo e foram nomeados 1 e 2 (o terceiro gene está incompleto) segundo a descoberta no genoma (1) ou em uma biblioteca de cDNA de interação M. perniciosa-cacaueiro (2). Os genes codificadores para estas proteínas foram clonados, e expressos usando um sistema de expressão heterólogo em E. coli produzindo proteínas de fusão a cauda de histidinas. As proteínas recombinantes foram purificadas usando colunas de afinidade a metais. MpNEP1 e MpNEP2 apresentam alta similaridade em sua seqüência de aminoácidos e são capazes de induzir necrose e síntese de etileno tanto em folhas de tabaco quanto em cacau. Ambas as MpNEPs apresentam perfis de expressão diferencial nas fases de vida do fungo: MpNEP1 é expressa de forma similar nas fases biotrófica e saprofítica enquanto que MpNEP2 é mais expressa na fase biotrófica. Importantes diferenças no comportamento físico das proteínas foram detectadas: MpNEP1 se comporta como um agregado (dímero ou trímero) em solução e é sensível a tratamento térmico enquanto que MpNEP2 se comporta como monômero e mantém a atividade de necrose depois de submetida a altas temperaturas. Estas diferenças sugerem que estas proteínas podem ter funções complementares durante o desenvolvimento da doença. Esta é a primeira vez que se descreve a presença desta família de proteínas em fungos basidiomicetos e seu estudo pode ser de grande importância para a compreensão dos mecanismos da doença Vassoura-de-bruxa / Abstract: The hemibiotrophic basidiomycete Moniliophthora perniciosa is the causal agent of Witches¿ broom disease of Theobroma cacao, which constitutes one of the main phytopathological problems of Brazil. An analysis of the M. perniciosa draft genome led to the identification of three putative genes encoding Necrosis and Ethylene inducing Proteins, which have been described in oomycetes, bacteria, and some species of ascomycetous fungi. The NEP proteins of M. perniciosa (MpNEPs) are apparently located on the same chromosome and were named 1 and 2 according to their discovery in the genome (1) or in a cDNA library containing transcripts from the interaction M. perniciosa-cacao (2). The genes codifying MpNEPs were cloned and expressed using a heterologous expression system in E. coli producing recombinant proteins with a minimal N-terminal His-tagged fusion peptide. MpNEPs were purified using nickel affinity columns. MpNEP1 and 2 have highly similar amino acid sequences and are able to induce necrosis and ethylene emission in both tobacco and cacao leaves. These MpNEPs showed different expression profiles according to the developmental stage of the fungus: MpNEP1 was expressed in a similar way in the biotrophic and saprotrophic mycelias, while MpNEP2 was preferentially expressed in the biotrophic phase. Furthermore, important differences were also detected in the physical properties of these two proteins. MpNEP1 in solution behaves as an oligomer (dimer or trimer) and is very sensitive to temperature. On the other hand, MpNEP2 in solution behaves as a monomer and is able of rapid renaturation after boiling, thus keeping its necrotic activity. These differences indicate that these highly similar NEPs may have complementary roles during disease development. This is the first report of NEP1-like proteins in basidiomycetes and their study will be of great importance in order to acquire a better understanding of the molecular mechanisms underlying Witches¿ broom disease / Doutorado / Bioquimica / Doutor em Biologia Funcional e Molecular

Orientador: Gonçalo Amarante Guimarães Pereira / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-24T13:53:36Z (GMT). No. of bitstreams: 1 ReisJunior_Osvaldo_M.pdf: 4891818 bytes, checksum: f9d97822f44db63385219e9c927eaf29 (MD5) Previous issue date: 2014 / Resumo: As tecnologias de sequenciamento de segunda geração geram um grande número de sequências em um curto espaço de tempo e com baixo custo. O sequenciamento em larga escala de cDNA, conhecido como RNA-seq, tem permitido análises precisas de transcriptomas inteiros sem a necessidade de conhecimento prévio sobre sequências genômicas, conforme exigido pela tecnologia de microarranjos. No entanto, existem muitas discussões sobre os métodos utilizados para o alinhamento de reads, identificação de genes diferencialmente expressos e montagem de transcriptomas. Desde 2000, o Laboratório de Genômica e Expressão (LGE), tem estudado a doença da vassoura-de-bruxa do cacaueiro (Theobroma cacao), que é causada pelo fungo basidiomiceto Moniliophthora perniciosa. Recentemente, 54 bibliotecas RNA-seq da interação planta-patógeno foram sequenciadas pelo nosso grupo, a fim de ajudar na elucidação da complexa biologia da doença. Desta forma, este trabalho tem como objetivo gerar informações sobre o perfil de transcrição do M. perniciosa e do T. cacao durante a doença vassoura-de-bruxa. Os resultados estão divididos em três seções principais, sendo que na primeira apresentamos uma análise de alinhamento e expressão gênica nas condições e tecidos amostrados. Na segunda, analisamos o estágio inicial da doença, conhecido como vassoura-verde, onde através da análise de expressão diferencial identificamos genes relacionados aos mecanismos de interação entre o cacaueiro e o fungo M. perniciosa. Na ultima seção, desenvolvemos uma estratégia para identificar sequências de possíveis RNAs não codificantes longos (lncRNA) e aplicamos esta estratégia no fungo M. perniciosa. De uma maneira geral estes dados apresentam um importante avanço no estudo desta doença e poderão ser utilizados em trabalhos futuro / Abstract: Next-generation sequencing technologies generate large numbers of sequences in a short time and at low cost. The high-throughput sequencing of cDNA, known as RNA-seq, has allowed precise analyses of entire transcriptomes without the need of previous knowledge on genomic sequences, as required by microarrays. However, there are many discussions about the methods used for read alignment, identification of differentially expressed genes and assembly of transcriptomes. Since 2000, the Genomics and Expression Laboratory (LGE), has been studying the Witches' Broom Disease (WBD) of cacao (Theobroma cacao), which is caused by the basidiomycete fungus Moniliophthora perniciosa. Recently, 54 RNA-seq libraries of this plant-pathogen interaction were sequenced by our group in order to help in the elucidation of the complex biology of the disease. Thus, this work aims to generate information about the transcription profile of M. perniciosa and T. cacao during the Witches' Broom Disease (WBD). The results are divided into three main sections, the first is an analysis of alignment and gene expression under the conditions and sampled tissues. In the second section, we analyze the initial stage of the disease, known as green broom, where through differential expression analysis we could identify genes related to mechanisms of interaction between cacao and the fungus M. perniciosa. In the last section, we developed a strategy to identify possible sequences of long noncoding RNAs (lncRNA) and applied this strategy in the fungus M. perniciosa. In general these data present an important advance in the study of this disease and may be used in future work / Mestrado / Bioinformatica / Mestre em Genética e Biologia Molecular

Orientadores: Gonçalo Amarante Guimarães Pereira, Jorge Maurício Costa Mondego / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-25T03:53:42Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Franco_SulamitadeFreitas_D.pdf: 3383952 bytes, checksum: e4041edb080f1a645fcbd6eacdc51378 (MD5) Previous issue date: 2014 / Resumo: A cultura do cacau é de grande importância econômica em países produtores da semente e produtores de chocolate, e move um mercado que alcança hoje ao redor de U$ 50 bilhões. As doenças fúngicas são um fator importante na redução de produção de cacau. No Brasil, o principal responsável pela perda na produção é o basidiomiceto Moniliophthora perniciosa, agente etiológico da doença conhecida como vassoura de bruxa, que arrasou a produção brasileira na década de 90. A doença tem como característica a não elicitação de resposta hipersensitiva (HR), o que permite a colonização de tecidos vegetais pelo fungo. HR é uma resposta que desencadeia a indução da expressão de proteínas denominadas PRs (pahtogenesis related), que agem contra patógenos. Entre as PRs encontram-se as PR5, conhecidas como taumatinas. Análise do genoma de M. perniciosa resultou na anotação de 13 genes que codificam proteínas Taumatina- like (MpTLPs). Apesar de serem bem descritas como proteínas antifúngicas em plantas, estudos em fungos basidiomicetos apontam seu envolvimento no remodelamento celular durante a formação cogumelos. M. perniciosa é a espécie de fungo com o maior número de TLPs descritos até o momento, tendo 6 deles organizados em clusters, indicando eventos de duplicação. Análise filogenética revelou uma maior quantidade de TLPs em basidiomicetos, quando comparado a ascomicetos, indicando sua participação na formação de cogumelos. No geral, MpTLPs são transcritas durante a fase de vassoura seca da doença, onde o galho seco está sujeito a infecção de fungos oportunistas, indicado a contribuição dessas proteínas no combate contra esses fungos, além de poder estar participando no desenvolvimento de sua parede para formação de basidiocarpo e na degradação da parede celular da planta. Além das MpTLPs, análise de transcriptoma revelou um total de 35 MpCSEPs (Proteínas Candidatas a Efetores de Patogenicidade Secretados pelo fungo) com valor de RPKM >50 foram identificadas em plantas de cacau infectadas. Esses genes são expressos preferencialmente na fase inicial da doença (Vassoura verde), onde encontramos o fungo ainda em fase biotrófica. Em geral, esses genes codificam proteínas pequenas e ricas em cisteínas que são características típicas de efetores de virulência (AVRs), podendo ser uma evidência de que esses genes codificam potenciais efetores. Após triagem, 16 desses genes foram escolhidos para a caracterização estrutural. Destes, sete foram clonados para expressão de proteína heteróloga, o que resultou ao final do estudo a cristalização de 2 proteínas (MpCSEP 5 e MpCSEP 14). Os cristais obtidos até o momento foram testados em linha de luz MX1 e MX2, mas não apresentou difração e os processos de refinamento dos cristais deverão ser continuados. As proteínas obtidas nesse estudo poderão ser utilizadas em testes enzimáticos em trabalhos futuros, para sua completa caracterização estrutural e funcional / Abstract: The cocoa cultivation have great economic importance in the seed and chocolate producing countries , moving a market that presently reaches around $50 billion. Fungal diseases are the major factor in reducing cocoa production. In Brazil, the main responsible for the production loss is the basidiomycete Moniliophthora perniciosa, known as the etiological agent of witches' broom disease , which devastated the Brazilian production in the 90's disease. The disease is characterized by not eliciting a hypersensitive response (HR), which allows the plant tissue colonization by the fungus. HR is a response that triggers the induction of the expression proteins called PRs (pahtogenesis related), which act against pathogens. Among the PRs, PR5 are known as thaumatins. M. perniciosa genome analysis resulted in the annotation of 13 genes encoding proteins Thaumatin - like (MpTLPs). Despite being well described as antifungal proteins in plants, fungi basidiomycetes studies suggest its involvement in cellular remodeling during mushroom formation. M. perniciosa fungal is the species with the highest number of TLPs described so far, with 6 of them organized in clusters, indicating duplication events. Phylogenetic analysis revealed a greater number of TLPs in basidiomycetes when compared to ascomycetes, indicating their involvement in the formation of mushrooms. Overall, MpTLPs are transcribed during the dry broom disease, where the dead branch is subject to opportunistic fungal infection, indicating the contribution of these proteins in the fight against these fungi, and can be participating in the development of your wallpaper for training basidiocarp and in the cell wall degradation of the plant. Besides MpTLPs, transcriptome analysis revealed a total of 35 MpCSEPs (candidate secreted effectors of pathogenicity protein by the fungus) with RPKM value > 50 have been identified in infected cocoa plants. These genes are preferentially expressed in the early phase of the disease (Green Broom), where we found the fungus still in biotrophic phase. In general, these genes encode small and rich in cysteine that are typical characteristics of virulence effector (AVRs) proteins, which can be evidence that these genes encode potential effectors. After screening, 16 of these genes were chosen for structural characterization. Of these, seven were cloned for expression of heterologous protein, resulting at the end of the study the crystallization of 2 proteins (MpCSEP 5 and 14). The crystals obtained so far been tested in MX1 and MX2 light line, but showed no diffraction and processes of crystals refinement should continue. The proteins obtained in this study may be used in enzymatic assays in future work to its full structural and functional characterization / Doutorado / Bioquimica / Doutora em Biologia Funcional e Molecular