A inativação do cromossomo X (ICX) em fêmeas é um exemplo de regulação epigenética. O silenciamento de um dos cromossomos X leva à formação estável da heterocromatina facultativa através da aquisição de múltiplas modificações na cromatina que são mantidas nas subsequentes divisões celulares. Atualmente, algumas características epigenéticas associadas à manutenção da ICX têm sido descritas, contudo os mecanismos de ação e a identidade dos diferentes fatores envolvidos na manutenção da ICX ainda são desconhecidos ou pouco compreendidos. Nosso laboratório realizou uma triagem funcional genômica por bibliotecas de shRNAs (short harpin RNAs) para encontrar genes envolvidos na manutenção da ICX em humanos. A partir deste estudo foram identificados 20 novos genes candidatos a estarem envolvidos na manutenção da ICX. Assim, o objetivo deste trabalho foi validar o grau de envolvimento de dois destes genes candidatos (H3F3B e ASF1A) no processo de controle epigenético do cromossomo X. Para isto, foi realizado o silenciamento dos genes candidatos através da utilização de partículas lentivirais portando shRNAs específicos em fibroblastos primários femininos heterozigotos para uma mutação no gene HPRT e com desvio total de ICX, onde o único alelo normal do gene HPRT está no Xi. A reativação do Xi nestas células foi avaliada por cultivo das mesmas em meio HAT, que seleciona células HPRT+. Só sobreviveram os fibroblastos que foram silenciados para o gene H3F3B. Nestes, as células transduzidas com o shH3F3B.2 expressam o alelo selvagem do gene, presente no Xi, além do gene mutante. Ensaios de RNA-FISH e trimetilação de histonas foram feitos nessas células para avaliar a perda das marcas de cromatina inativa. Foi observada uma perda da nuvem de XIST nas células transduzidas com o shH3F3B.2 e selecionadas em HAT em passagens altas. Por último, análises de expressão alelo-específica de genes ligados ao X comprovaram que dois genes que são submetidos à ICX apresentaram expressão do alelo inativado (FLNA e FHL1). Porém, também foi observada uma mudança no padrão de expressão alelo-específica em genes autossômicos. Finalmente, as análises de expressão geral do cromossomo X mostraram que as células transduzidas com o shH3F3B.2 e selecionada em HAT tinham uma expressão gênica aumentada em relação ao controle. Em conclusão, nossos resultados sugerem uma descondensação da cromatina no cromossomo Xi e portanto um provável envolvimento do gene H3F3B na manutenção da ICX. / The X chromosome Inactivation (XCI) in females is an example of epigenetic regulation. Silencing of one of the X chromosomes leads to the stable formation of the facultative heterochromatin through the acquisition of multiple modifications in the chromatin that are maintained in the subsequent cell divisions. Currently, some epigenetic features associated with the maintenance of XCI have been described. Nonetheless, the mechanisms of action and the identity of the different factors involved in the maintenance of XCI are still unknown or poorly understood. Our laboratory performed a genomic functional screening by shRNA (short harpin RNAs) libraries to find genes involved in the maintenance of XCI in humans. From this study, we identified 20 new candidate genes to be involved in the maintenance of XCI. Thus, the objective of this work was to validate the degree of involvement of two of these candidate genes (H3F3B and ASF1A) in the epigenetic process control of the X chromosome. For this, the silencing of the candidate genes was performed in female heterozygous primary fibroblasts for a mutation of the HPRT gene and with a total XCI shift through the use of lentiviral particles carrying specific shRNAs, where the only normal allele of the HPRT gene is in the Xi (inactivated X). Xi reactivation was evaluated in these cells by culturing them in HAT medium, which selects HPRT + cells. Only the fibroblasts that were silenced for the H3F3B gene survived. Furthermore, the cells transduced with shH3F3B.2 express the HPRT wild gene allele, present in Xi, in addition to the mutant gene. RNA-FISH and histone trimethylation assays were performed on these cells to evaluate the loss of inactive chromatin marks. A loss of the XIST cloud was observed in cells transduced with shH3F3B.2 and selected in HAT at high passages. Finally, allele-specific expression analyzes of X-linked genes showed that two genes that undergo XCI showed expression of the inactivated allele (FLNA and FHL1). However, a change in allele-specific expression pattern was also observed in autosomal genes. Finally, the X chromosome general expression analyses showed that cells transduced with shH3F3B.2 and selected on HAT had increased gene expression relative to the control. In conclusion, our results suggest a decondensation of the chromatin in the Xi chromosome and therefore a probable involvement of the H3F3B gene in the maintenance of ICX.

Genes novos, definidos como aqueles presentes em um grupo ou espécie mas ausentes em seu grupo irmão e grupo externo, são conhecidos por terem mais marcadores de seleção positiva que genes antigos. Sabe-se também que a seleção positiva ocorre de forma mais rápida em sistemas haplóides do que em sistemas diplóides. Aqui unimos esses dois sistemas para propor um modelo de seleção haplóide de genes novos. Para isso utilizamos dados de expressão, idade evolutiva, e assinatura de seleção provenientes de genes de Drosophila melanogaster. Mostramos que genes novos adquirem uma vantagem seletiva se expressos nas fases tardias da espermatogênese, que são haplóides. Não só há mais genes novos com alta expressão nas fases haplóides (meiótica e pós-meiótica) da espermatogênese em relação à fase diplóide (mitótica), mas também os genes novos possuem expressão mais acentuada que genes antigos nessas fases haplóides. Mostramos que os genes com alta expressão nas fases haplóides possuem mais marcadores de seleção positiva, e.g. valores de dN/dS, alpha e para outros modelos que estimam seleção positiva. Dessa forma, propomos um modelo que explica a maior expressão de genes novos nos testículos (fases haplóides da espermatogênese) e como tais genes se fixam na espécie. Por fim, explicamos a maior incidência de genes extremamente novos ligados ao X e com expressão preferencial em machos. Isso ocorre por que genes ligados ao cromossomo X em machos tem expressão funcionalmente haplóide, visto que o X está em hemizigose em todas as células somáticas de machos. Essa situação torna benéfico para genes muito novos ligados ao X que sua seleção em machos ocorra, pois em todas as células tais genes tem o benefício da seleção haplóide. Em particular, genes extremamente novos, ao contrário de genes antigos, do cromossomo X são capazes de burlar a inativação do cromossomo sexual durante a meiose. Isso os torna um bom sistema para novos alelos recessivos e com antagonismo sexual serem expressos e selecionados / New genes, those present in one group or species but absent in their sister group and outgroup, are frequently under positive selection, as shown by their higher rates and values of positive selection markers. It is also known that beneficial genes in haploid systems tend to be fixed more quickly than in diploid ones. Here we propose to merge this two systems by proposing a model for new genes selection in haploid systems. To do so we use Drosophila melanogaster\'s spermatogenesis process. We show that new genes have a selective advantage if they are expressed in the haploid (meiotic and post-meiotic) phases of spermatogenesis. This is shown not only by the greater proportion of new genes with high expression in those phases against the diploid (mitotic) phase, but also by the intensity of the expression of new genes being greater than that of old genes during the haploid phases. We also show that genes with higher expression in the haploid phases present more markers of positive selection. They have both a greater value of dN/dS, alpha and a greater proportion of genes that best fit a model with selection than one without it. Therefore, we propose a model explaining the higher expression of new genes in the testis (haploid phases of spermatogenesis) and how those genes become fixed in the population and species. At last we explain the abundance of new male-biased genes on the X. This enrichement is due to the functionally haploid expression of the X-linked genes in males. This assures an advantage to those genes, as they will benefit from haploid selection system in the X on males. It is then beneficial for X-linked genes to be selected uppon in the males, as it will resemble haploid selection. Also, extremely new X-linked genes, as opposed to old ones, can bypass the sex cromosome inactivation, being a good system for new antagonistic recessive alleles to be expressed and sellected upon

Eventos epigenéticos como o imprinting genômico e a inativação do cromossomo X (ICX), já foram amplamente estudados em camundongos. Nesses animais muitos dos processos epigenéticos que levam à ICX já estão profundamente esclarecidos. Em humanos entretanto, o conhecimento sobre a ICX é mais limitado, em particular os eventos iniciais do processo durante o desenvolvimento embrionário. O desenvolvimento e aprimoramento de ensaios que envolvem o sequenciamento em larga escala do transcriptoma (RNA-Seq) de células únicas iniciam uma nova era nos estudos sobre a ICX. São crescentes os dados de RNA-Seq depositados em bancos de dados públicos e em 2013 os trabalhos de Xue e colaboradores e de Yan e colaboradores tornaram disponíveis os resultados de RNA-Seq de células individuais isoladas de embriões humanos a partir do estágio de duas células até a fase de blastocisto. Através de técnicas de bioinformática avaliamos o nível de expressão do gene XIST, intimamente envolvido no processo de ICX, nos diferentes estágios do desenvolvimento. Alinhamos também as leituras geradas por RNA-Seq contra o genoma humano de referência no intuito de se identificar variantes em regiões transcritas e assim verificar a origem do alelo expresso. Com isso, pudemos observar que o gene XIST tem sua expressão iniciada em embriões humanos no estágio de oito células, e que o silenciamento transcricional dos genes do cromossomo X já se iniciou no estágio de blastocisto de forma aleatória mas ainda não se disseminou, i.e. a ICX não está completa. Devido ao fenômeno de ICX, a caracterização de genes \"imprintados\" neste cromossomo é desafiadora. Ainda assim em camundongos foram relatados alguns genes do X que são assim regulados. Mulheres portadoras da síndrome de Turner (45,X) apresentam diferenças fenotípicas dependentes da origem parental do cromossomo X herdado, sugerindo a existência de genes \"imprintados\" no X humano. Em particular os genes MAOA, MAOB e USP9X foram indicados como candidatos a serem regulados por imprinting. Através do sequenciamento de regiões transcritas contendo SNPs em heterozigose foram avaliados o padrão de expressão alelo-específico dos três genes indicados. Nenhum sinal de regulação por imprinting pôde ser detectado nem em placenta nem em cérebro humano, pois a procedência dos alelos expressos era independente da origem parental. Isso não significa que a variabilidade fenotípica em mulheres com Turner não possa ser explicada por imprinting em genes do X. Experimentos de RNA-Seq em diversos tecidos humanos ou a partir de células únicas são uma abordagem conveniente para se elucidar este fenômeno / Epigenetic phenomena as genomic imprinting and X chromosome inactivation (XCI) have been widely studied in mice. While most of the processes and steps involved in XCI in mice are well studied, in humans our knowledge is still very limited, specially during early embryo development. Advances in single-cell whole transcriptome high troughput sequencing techniques (RNA-Seq) bring a new era to the XCI field. Single-cell RNA-Seq results of from 2-cell to the blastocyst stage of human embryos were published by Xue et cols and Yan et cols in 2013. Using bioinformatics techniques we searched for the XIST gene expression level (a gene closely involved in XCI) throughout the human pre-implantation embryo development. We aligned reads generated by RNA-Seq assays to the human reference genome looking for variants in gene transcriptional regions and to identify the origin of the expressed allele. Our results show that XIST expression starts from the 8-cell stage and is stabilized and upregulated at the female blastocyst stage. We also show that the transcriptional silence of X-linked genes started at the blastocyst stage and is independent of parental origin but this does not apply for all genes. We concluded that the completion of the transcriptional silence step is probably established during post-implantation stage. The search for X-linked imprinted genes is challenging due to the XCI phenomenon. Nevertheless, X-imprinted genes were reported in mice. In humans, no X-imprinted genes were found so far, but phenotypic differences reported in Turner\'s syndrome (45,X) women was related to the parental origin of the X chromosome inherited. This suggests the existence of X-linked imprinted genes, in particular MAOA, MAOB and USP9X seemed good candidates. By sequencing transcript regions containing heterozygous SNPs in these genes we could access their expression pattern. Our results show no sign of imprinting regulation of MAOA, MAOB and USP9X, neither in human brain nor in human term placenta. This does not rule out the possibility that the phenotypic differences observed in Turner\'s syndrome women could be the consequence of other unknown X-linked imprinted genes. RNA-Seq of different human female tissues is a powerful approach to finally find the genes involved in such phenotypes

Na inativação do cromossomo X (ICX) um dos dois cromossomos X presentes nas fêmeas de mamíferos placentários é silenciado transcricionalmente. Esse é um mecanismo de compensação de dose que assegura que a quantidade dos produtos gênicos oriundos do cromossomo X esteja em equilíbrio entre machos e fêmeas. A ICX pode ocorrer de modo aleatório, onde cada célula escolhe ao acaso qual será o cromossomo X inativado: cromossomo X paterno ou cromossomo X materno; ou de forma \"imprintada\" (termo adaptado do inglês imprinted), ou seja, dependente da origem parental do cromossomo X. Enquanto nas fêmeas marsupiais a inativação ocorre de forma \"imprintada\", sendo o X paterno inativado em todos os tecidos, nos mamíferos eutérios a ICX nos tecidos somáticos ocorre de modo aleatório. Porém alguns eutérios mantiveram o mecanismo \"imprintado\" de ICX exclusivamente nos tecidos extraembrionários, como ratos e camundongos. Em humanos, o estado controverso da ICX em tecidos extraembrionários foi reavaliado por nosso grupo utilizando uma análise mais ampla e identificou-se um padrão aleatório (Moreira de Mello et al., 2010), demonstrando a importância de se realizar uma análise global para se determinar o perfil de atividade do cromossomo X. Em bovinos o padrão de ICX em placenta não está claro. Ele foi verificado analisando-se a expressão de um único gene, e os autores concluíram que o padrão era \"imprintado\" (Xue et al., 2002). Porém a análise de um único gene pode não representar o estado epigenético de um cromossomo inteiro. Assim o padrão de ICX em tecidos extraembrionários bovinos se mostra uma questão importantíssima para ser esclarecida. No presente trabalho o cromossomo X bovino foi analisado em busca de SNPs (polimorfismos de base única) localizados em regiões codificadoras em genes expressos no tecido extraembrionário, permitindo assim através da análise da expressão alelo-específica determinar o padrão de expressão do cromossomo X. Os resultados apresentados neste trabalho mostram um padrão de expressão bialélica, indicando que em populações diferentes de células, diferentes cromossomos X estavam ativos. Portanto a ICX em tecidos extraembrionários bovinos ocorre de modo aleatório, padrão semelhantes àquele encontrado em humanos, e diferente daquele encontrado em ratos e camundongos. Este trabalho mostra a importância de uma análise global da expressão gênica no cromossomo X, permitindo assim traçar um perfil de atividade mais próximo possível da realidade. / In X chromosome inactivation (XCI), one of the two X chromosomes present in female mammals is transcriptionally silenced, resulting in a dosage compensation mechanism. The XCI can occur randomly, so that each cell chooses randomly which one will be the inactivated X chromosome: paternal (pX) or maternal (mX); or dependent on parental origin of X chromosome, ie, imprinted. While in female marsupials the inactivation occurs in an imprinted fashion, with the Xp inactivated in all tissues, both somatic and extra-embryonic, in the mammalian eutherians XCI in the somatic tissues occurs randomly. However some eutherians still retain the imprinted XCI mechanism exclusively in extra-embryonic tissues, such as rats and mice. In humans, the controversy of the XCI in placenta was re-evaluated by our group. Using a broader analysis, a random pattern was identified, in contrast to the previously published works. It demonstrated the importance of conducting a comprehensive analysis to determine the profile of X chromosome (Moreira de Mello et al., 2010). In cattle the pattern of XCI in bovine placenta is unclear. It was verified by analyzing the expression of a single gene, and the authors concluded that the pattern was imprinted (Xue et al., 2002). Because the analysis of a single gene may not represent the epigenetic state of an entire chromosome, the pattern of XCI in cattle extra-embryonic tissues is an important issue to be clarified. In the present study the cattle X chromosome was analyzed searching for SNPs (single nucleotide polymorphisms) located in coding regions of genes expressed in extra-embryonic tissue. So that, by analyzing the allele-specific expression it is possible to determine the X chromosome expression patter. The preset results show a bi-allelic expression pattern. This indicates that in different cells populations, different X chromosomes are active. Thus, the XCI in extra-embryonic tissues of bovines occurs randomly, similar to the human pattern but different to that verified in rats and mice. This work shows the importance of a global analysis of the gene expression in X chromosome, through which it can trace the closest activity profile as possible to reality.

Em fêmeas de mamíferos, um dos cromossomos X é inativado proporcionando compensação de dose entre os produtos gênicos de machos e fêmeas. A inativação do cromossomo X (ICX) ocorre no embrião em desenvolvimento, e se caracteriza pela aquisição de marcas heterocromáticas no cromossomo X inativado (Xi), que são mantidas nas células somáticas ao longo das divisões celulares. O melhor modelo para estudo do início da ICX são as células-tronco embrionárias femininas. Provenientes da massa celular interna de blastocistos, elas representam um embrião em desenvolvimento e possuem os dois X ativos; a diferenciação das células promove a ICX in vitro, o que permite a identificação dos fatores e mecanismos moleculares envolvidos. A derivação de linhagens de célulastronco embrionárias humanas (human embryonic stem cells - hESCs) em 1998 permitiu novas possibilidades de estudo da ICX, pois a maioria dos trabalhos procurou esclarecer o mecanismo da ICX no modelo murino. Tradicionalmente, a manutenção da ICX em humanos tem sido investigada em células somáticas híbridas ou transformadas; porém, sabe-se que estas não representam um contexto celular natural. Assim, o presente trabalho teve como objetivos principais explorar a potencialidade de hESCs no estudo do início da ICX, e ainda investigar a função de três fatores na manutenção da ICX em células humanas imortalizadas: DNMT1 (enzima responsável pela manutenção da metilação do DNA), SMCHD1 (proteína da família de coesinas/condensinas), e XIST (um RNA não-codificador que inicia o processo de heterocromatinização do futuro Xi) foram selecionados para este estudo, uma vez que todos participam da manutenção da ICX em camundongos. Até o momento foram derivadas em nosso laboratório quatro linhagens de hESCs, as primeiras da América Latina. A caracterização das linhagens mostrou que, apesar de se manterem indiferenciadas, as hESCs femininas encontram-se em estágio pós-ICX, pois mesmo indiferenciadas já apresentam um dos X inativado. Nossos dados indicam que, submetidas às atuais condições de cultivo, as hESCs não são bons modelos para o estudo do início da ICX, e é possível que a inativação de um cromossomo X durante o cultivo confira alguma vantagem seletiva às células. A estratégia utilizada no estudo da manutenção da ICX foi o silenciamento dos três genes por interferência de RNA (RNAi). Não foi possível diminuir significativamente a expressão dos genes XIST e SMCHD1. Porém, o silenciamento de DNMT1 foi expressivo, e em resposta foi observada reativação do gene MAOA, localizado no cromossomo X e submetido à inativação. Apesar de nossas análises mostrarem que os efeitos da diminuição de DNMT1 foram restritos ao gene MAOA, estes resultados sugerem a existência de diferentes hierarquias de controle epigenético dos genes submetidos à ICX em células humanas / In female mammals, one of the X chromosomes is inactivated to achieve dosage compensation between males and females. The X chromosome inactivation (XCI) occurs early during embryogenesis and is characterized by the acquisition of heterochromatic features on the inactive X (Xi), which are maintained during all the subsequent cell divisions. Embryonic stem cells are the most suitable cells to study the establishment of XCI. They are obtained from the inner cell mass (ICM) of blastocysts, and can represent a developing female embryo, possessing two active X-chromosomes; when differentiated, these cells recapitulate XCI in vitro, and thus one can identify XCI regulators and factors involved. The derivation of human embryonic stem cells (hESCs) in 1998 offered new possibilities to study XCI, since most of the mechanistic studies of XCI have so far been investigated in the mouse model system. Traditionally, maintenance of XCI in humans has been addressed in somatic cell hybrids or transformed cells; however, they do not represent a natural cellular context. The main goals of the present work were to verify the potential of hESCs as models of XCI, and also to study the function of three important factors in XCI maintenance in immortalized human cells. DNMT1 (DNA-methyltransferase 1), SMCHD1 (a cohesin/condensin protein family member) and the XIST gene (a non-coding RNA which triggers XCI and promotes X heterochromatin formation on the future Xi) were selected, as they are key factors in XCI maintenance in the mouse. Until now four hESCs lines were derived in our lab. Their characterization showed that, in spite of been undifferentiated, the female hESCs have already undergone XCI. Our data suggest that, under the actual culture conditions, hESCs are not good models to study XCI, and it is also possible that X inactivation confers selective advantage to hESCs. Knockdown by RNA interference was used to study the roles of three genes in XCI maintenance. We could not efficiently knockdown XIST or SMCHD1. However, the DNMT1 silencing was substantial, and led to the reactivation of MAOA, an X-linked gene subjected to XCI. Although the effect of DNMT1 silencing was restricted to MAOA, our data suggest that there are different epigenetic hierarchies to control the expression of the genes subjected to XCI in human cells.

A inativação do cromossomo X (ICX) é o fenômeno através do qual um dos cromossomos X das fêmeas de mamíferos é silenciado para atingir compensação de dose em relação aos machos. Ela envolve a expressão do gene XIST exclusivamente no X inativo, e a associação em cis de seu RNA nesse cromossomo. Isso inicia a imposição de várias marcas epigenéticas no cromossomo X inativo, que garantem a manutenção deste estado de silenciamento transcricional de maneira estável durante todas as mitoses num organismo. Uma dessas modificações epigenéticas é a metilação do DNA, desempenhada principalmente pela enzima DNMT1. Os papéis de XIST e DNMT1 na manutenção da inativação do cromossomo X ainda são controversos em humanos, e nesse sentido foi objetivo desse trabalho analisar a possível função desses genes nesse processo em células humanas não transformadas. Foi otimizado um sistema experimental para o estudo de possíveis perturbações na manutenção da inativação do cromossomo X, onde a re-expressão de genes submetidos a esse processo pode ser monitorada. Nesse sistema foram identificados dois genes, MAOA e GYG2, cujo padrão de expressão no X inativo difere do previamente descrito. Demonstrou-se que baixos níveis de expressão do gene XIST foram suficientes para manter seu RNA associado ao X inativo, conservando o estado silenciado desse cromossomo. Além disso, foram obtidos indicativos de que a inibição de XIST em fibroblastos humanos gera uma diminuição da viabilidade celular. Foi possível demonstrar que DNMT1 é necessária para a manutenção da metilação global do genoma em células humanas não transformadas, e que eXISTe um mecanismo de compensação da inibição desse gene que leva ao aumento da expressão de DNMT3B. Ainda se observou que a repressão de DNMT1 não é suficiente para levar à reativação de genes no cromossomo X inativo. Além disso, a desmetilação encontrada nos promotores de MAOA e XIST não foi suficiente para levar à expressão destes genes nos cromossomo X inativo e ativo, respectivamente. Estes resultados enfatizam a necessidade de se estudar os mecanismos moleculares da ICX em humanos utilizando sistemas experimentais adequados para a análise de herança epigenética. / X chromosome inactivation (XCI) is the phenomenon through which one of the X chromosomes in female mammals is silenced to achieve dosage compensation related to males. It involves the expression of XIST gene exclusively from the inactive X, and the association of its RNA in cis in this chromosome. This leads to a series of epigenetic modifications in the chromatin of the inactive X (Xi) that guarantee a stable maintenance of the transcriptional silence through all the mitoses in the organism. One of these epigenetic modifications is DNA methylation, achieved mainly by the maintenance DNA methylase DNMT1. The roles of XIST and DNMT1 in the maintenance phase of XCI are controversial in humans. Therefore, the main goal of this present work was to analyze some of the possible functions of these genes in this process in untransformed human cells. An experimental system was optimized to study possible disturbances in maintenance of XCI, where the re-expression of genes submitted to this process could be monitored. In this system we identified two genes, MAOA and GYG2, whose pattern of expression on the Xi, differed from what had been previously described. It was demonstrated that low levels of XIST expression were sufficient to keep its RNA associated to the Xi, assuring the silenced state of this chromosome. Besides, evidences have been found that XIST inhibition in human fibroblasts reduces cellular viability. It was possible to demonstrate that DNMT1 is necessary to the maintenance of global genome methylation in untransformed human cells, and the eXISTence of a compensation mechanism involving DNMT3B upregulation. It was also observed that repression of DNMT1 was not sufficient to reactivate genes of the Xi chromosome. Additionally, demethylation of MAOA and XIST promoters was not enough to cause expression of these genes on the inactive and active Xs, respectively. All these results emphasize the requirement of studying the molecular mechanisms of XCI in humans using experimental systems appropriate for the analysis of epigenetic inheritance.

A identificação forense através da análise de ácidos nucléicos é realizada, freqüentemente, pelo estudo de regiões polimórficas do DNA, tais como os STRs, regiões que apresentam repetições consecutivas curtas. Para a utilização destes marcadores na identificação humana é necessário conhecer a distribuição de seus alelos na população a qual o indivíduo pertence, visto que essa varia entre diferentes populações. Desta forma, o presente trabalho teve como objetivo determinar a freqüência alélica de cinco STRs do cromossomo X (DXS6854, DXS7424, DXS101, DXS6808 e DXS7132), a fim de avaliar a contribuição destes marcadores, através de cálculos estatísticos, na prática forense e em testes de paternidade. Foram coletadas amostras de esfregaço bucal, através de swab bucal, sendo depositado em cartão de coleta, e/ou sangue, através de punção digital depositada em cartão de coleta, em 243 sujeitos da pesquisa, sendo estes indivíduos não aparentados, residentes no Estado de São Paulo. A extração do DNA foi realizada a partir do Kit DNA IQ® (Promega), de acordo com as normas do fabricante e, na reação de PCR, utilizou-se um multiplex desenvolvido pela empresa BIOCOD (Belo Horizonte, MG), sendo a tipagem dos loci obtida através de corrida eletroforética, em gel de poliacrilamida desnaturante, no seqüenciador automático AlfExpress® (Amersham Biosciences). Os resultados foram analisados através dos programas PowerStats ver. 12 (Promega®) e Arlequin ver. 3.1. Como resultados principais foram observados: a grande variabilidade de alelos presentes na população estudada para os STRs selecionados; que o Poder de Discriminação em mulheres variou de 0,658 (DXS6808) a 0,975 (DXS101), assim como em homens entre 0,451 (DXS6808) e 0,881 (DXS101); as chances de exclusão foram calculadas em duas situações, par pai/filha (MECD) e trio pai/mãe/filha (MECT), sendo os melhores resultados apresentados pelo DXS101; além de verificar que a diversidade haplotípica (nas amostras masculinas) foi de 0,9993, indicando uma Probabilidade de Coincidência menor que 0,0007. Sendo assim, é possível concluir que, com exceção do DXS6808, os demais loci STR permitem uma boa aplicação na prática forense, permitindo sua utilização para cálculo estatístico em análises de identificação humana e testes de parentesco. / The forensic identification through DNA analysis is, frequently, done by the study of DNA?s polymorphic regions, such as STR, short tandem repeats. In order to use these markers in human identification, it?s necessary to know the allelic distribution in the population in wich the person belongs. This research aimed to settle the allelic frequencies of five X-chromosome?s STR (DXS6854, DXS7424, DXS101, DXS6808 e DXS7132) and analysis the contribution of these markers, through statistical parameters, in forensic activities and paternity tests. For this, samples of oral rub were collected by oral swab, being deposited on collect card, and/or blood by digital punction, deposited on collect card, with 243 research subject, being not related, living at Sao Paulo State, Brazil. The DNA extraction was performed using Kit DNA IQ® (Promega), according to manufacturer rules and, at PCR, was used a multiplex developed by BIOCOD (Belo Horizonte, Minas Gerais State), being the loci typifying obtained by eletrophoretical procedure, on polyacrilamid gel, using AlfExpress® (Amersham Biosciences). The results were statistically analyzed by PowerStats ver. 12 (Promega®) and Arlequin ver. 3.1 programs. The principal results showed: the great allele variability in this population sample to the selected STRs; that Power of Discrimination in women varied from 0.658 (DXS6808) to 0.975 (DXS101), as well as in men between 0.451 (DXS6808) and 0.881 (DXS101); the mean exclusion chance were calculated at two conditions, pair father/daughter (MECD) and trios involving daughters (MECT), being the best results performed by DXS101; and verify that haplotipical diversity (in men samples) was 0.9993, showing a Chance of Coincidence under 0.0007. In this way, it?s possible to conclude that, with exception of DXS6808, the other STRs loci studied can be used at forensic practice, using for statistical math in human identification and kinship testing.

A epigenética aborda o controle da expressão gênica através de diversos fatores que agem sob a cromatina, os melhor estudados são a metilação do DNA e a acetilação em histonas, relacionadas à repressão e ativação gênica, respectivamente. Em mamíferos, existem dois fenômenos epigenéticos interessantes: a inativação do cromossomo X (ICX) em fêmeas, que garante o equilíbrio transcricional gênico entre os sexos, e o imprinting genômico, caracterizado pela expressão monoalélica dependente da origem parental. No presente estudo, propusemos verificar a manutenção do controle epigenético em células humanas normais e transformadas em condições semelhantes de hipometilação do DNA e hiperacetilação em histonas (após uso das drogas 5-aza-2-\'deoxicitidina (5-aza-dC) e ácido valproico, respectivamente), através do monitoramento da expressão alelo-específica pelo uso de polimorfismos de única base presentes em regiões codificadoras. Em células normais houve manutenção da ICX e do imprinting genômico, enquanto que em células transformadas hipometiladas foram observadas indução de XIST, e perda de imprinting dos genes IGF2, H19 e PEG10. Observamos que ambas as drogas podem diminuir a expressão de DNMT1, e 5-aza-dC altera o equilíbrio entre acetilação e desacetilação da histona H4. Ainda, a ordem de adição dos reagentes ocasionou diferenças no nível de acetilação da histona H4 e na expressão gênica de XIST e PEG10. Nossos dados sugerem que: células humanas normais apresentam maior estabilidade do controle epigenético comparadas às células humanas transformadas, genes submetidos à ICX e \"imprintados\" não apresentam diferenças na rigidez do controle de expressão, e a cascata de reação seguida após perturbação de marcas epigenéticas pode ser alterada dependendo da modificação inicial. / Epigenetics refers to mechanisms related to gene activity through conformational modifications in DNA without changes in the nucleotide sequence. Key players in the epigenetic control are DNA methylation and histone acetylation, which are related to gene activation and repression, respectively. Two striking epigenetic phenomena in mammalians are X chromosome inactivation (XCI) and genomic imprinting. XCI triggers the transcriptional silencing of all but one X chromosome in each female cell, while genomic imprinting is a process that leads to mono-allelic gene expression based on parental origin. In the present study, we intended to verify the maintenance of epigenetic control in normal and transformed human cells under the same conditions of epigenetic disturbance. For this purpose, 5-aza-2\'-deoxycytidine (5-aza-dC) and valproic acid (VPA) were used to cause DNA hypomethylation and histone hyperacetylation, respectively. By monitoring allelic-specific expression using single nucleotide polymorphisms present in coding regions, we were able to check the effects of the modifications in the expression pattern of imprinted or subjected to XCI genes. While in female normal cells XCI and genomic imprinting were not affected by VPA or 5-aza-dC treatments, transformed male cells showed XIST activation and loss of imprinting of PEG10, IGF2 and H19 genes in the hypomethylation scenario. In addition, both drugs can decrease the expression of DNMT1, and 5-aza-dC alters the balance between acetylation and deacethylation of histone H4. Furthermore, we could see different degrees of histone H4 acetylation levels and of XIST and PEG10 expression, depending on which of the drugs was added first. Our data suggest that the epigenetic control in normal human cells is more stable when compared to transformed human cells. In addition, both XCI and genomic imprinting are epigenetic features equally hard to disturb. Finally, depending on the initial epigenetic modification (global demethylation or acethylation), it will induce different epigenetic control networks, with consequence to the final status of gene expression.

A inativação do cromossomo X (ICX) é o fenômeno através do qual um dos cromossomos X das fêmeas de mamíferos é silenciado para atingir compensação de dose em relação aos machos. Ela envolve a expressão do gene XIST exclusivamente no X inativo, e a associação em cis de seu RNA nesse cromossomo. Isso inicia a imposição de várias marcas epigenéticas no cromossomo X inativo, que garantem a manutenção deste estado de silenciamento transcricional de maneira estável durante todas as mitoses num organismo. Uma dessas modificações epigenéticas é a metilação do DNA, desempenhada principalmente pela enzima DNMT1. Os papéis de XIST e DNMT1 na manutenção da inativação do cromossomo X ainda são controversos em humanos, e nesse sentido foi objetivo desse trabalho analisar a possível função desses genes nesse processo em células humanas não transformadas. Foi otimizado um sistema experimental para o estudo de possíveis perturbações na manutenção da inativação do cromossomo X, onde a re-expressão de genes submetidos a esse processo pode ser monitorada. Nesse sistema foram identificados dois genes, MAOA e GYG2, cujo padrão de expressão no X inativo difere do previamente descrito. Demonstrou-se que baixos níveis de expressão do gene XIST foram suficientes para manter seu RNA associado ao X inativo, conservando o estado silenciado desse cromossomo. Além disso, foram obtidos indicativos de que a inibição de XIST em fibroblastos humanos gera uma diminuição da viabilidade celular. Foi possível demonstrar que DNMT1 é necessária para a manutenção da metilação global do genoma em células humanas não transformadas, e que eXISTe um mecanismo de compensação da inibição desse gene que leva ao aumento da expressão de DNMT3B. Ainda se observou que a repressão de DNMT1 não é suficiente para levar à reativação de genes no cromossomo X inativo. Além disso, a desmetilação encontrada nos promotores de MAOA e XIST não foi suficiente para levar à expressão destes genes nos cromossomo X inativo e ativo, respectivamente. Estes resultados enfatizam a necessidade de se estudar os mecanismos moleculares da ICX em humanos utilizando sistemas experimentais adequados para a análise de herança epigenética. / X chromosome inactivation (XCI) is the phenomenon through which one of the X chromosomes in female mammals is silenced to achieve dosage compensation related to males. It involves the expression of XIST gene exclusively from the inactive X, and the association of its RNA in cis in this chromosome. This leads to a series of epigenetic modifications in the chromatin of the inactive X (Xi) that guarantee a stable maintenance of the transcriptional silence through all the mitoses in the organism. One of these epigenetic modifications is DNA methylation, achieved mainly by the maintenance DNA methylase DNMT1. The roles of XIST and DNMT1 in the maintenance phase of XCI are controversial in humans. Therefore, the main goal of this present work was to analyze some of the possible functions of these genes in this process in untransformed human cells. An experimental system was optimized to study possible disturbances in maintenance of XCI, where the re-expression of genes submitted to this process could be monitored. In this system we identified two genes, MAOA and GYG2, whose pattern of expression on the Xi, differed from what had been previously described. It was demonstrated that low levels of XIST expression were sufficient to keep its RNA associated to the Xi, assuring the silenced state of this chromosome. Besides, evidences have been found that XIST inhibition in human fibroblasts reduces cellular viability. It was possible to demonstrate that DNMT1 is necessary to the maintenance of global genome methylation in untransformed human cells, and the eXISTence of a compensation mechanism involving DNMT3B upregulation. It was also observed that repression of DNMT1 was not sufficient to reactivate genes of the Xi chromosome. Additionally, demethylation of MAOA and XIST promoters was not enough to cause expression of these genes on the inactive and active Xs, respectively. All these results emphasize the requirement of studying the molecular mechanisms of XCI in humans using experimental systems appropriate for the analysis of epigenetic inheritance.

Eventos epigenéticos como o imprinting genômico e a inativação do cromossomo X (ICX), já foram amplamente estudados em camundongos. Nesses animais muitos dos processos epigenéticos que levam à ICX já estão profundamente esclarecidos. Em humanos entretanto, o conhecimento sobre a ICX é mais limitado, em particular os eventos iniciais do processo durante o desenvolvimento embrionário. O desenvolvimento e aprimoramento de ensaios que envolvem o sequenciamento em larga escala do transcriptoma (RNA-Seq) de células únicas iniciam uma nova era nos estudos sobre a ICX. São crescentes os dados de RNA-Seq depositados em bancos de dados públicos e em 2013 os trabalhos de Xue e colaboradores e de Yan e colaboradores tornaram disponíveis os resultados de RNA-Seq de células individuais isoladas de embriões humanos a partir do estágio de duas células até a fase de blastocisto. Através de técnicas de bioinformática avaliamos o nível de expressão do gene XIST, intimamente envolvido no processo de ICX, nos diferentes estágios do desenvolvimento. Alinhamos também as leituras geradas por RNA-Seq contra o genoma humano de referência no intuito de se identificar variantes em regiões transcritas e assim verificar a origem do alelo expresso. Com isso, pudemos observar que o gene XIST tem sua expressão iniciada em embriões humanos no estágio de oito células, e que o silenciamento transcricional dos genes do cromossomo X já se iniciou no estágio de blastocisto de forma aleatória mas ainda não se disseminou, i.e. a ICX não está completa. Devido ao fenômeno de ICX, a caracterização de genes \"imprintados\" neste cromossomo é desafiadora. Ainda assim em camundongos foram relatados alguns genes do X que são assim regulados. Mulheres portadoras da síndrome de Turner (45,X) apresentam diferenças fenotípicas dependentes da origem parental do cromossomo X herdado, sugerindo a existência de genes \"imprintados\" no X humano. Em particular os genes MAOA, MAOB e USP9X foram indicados como candidatos a serem regulados por imprinting. Através do sequenciamento de regiões transcritas contendo SNPs em heterozigose foram avaliados o padrão de expressão alelo-específico dos três genes indicados. Nenhum sinal de regulação por imprinting pôde ser detectado nem em placenta nem em cérebro humano, pois a procedência dos alelos expressos era independente da origem parental. Isso não significa que a variabilidade fenotípica em mulheres com Turner não possa ser explicada por imprinting em genes do X. Experimentos de RNA-Seq em diversos tecidos humanos ou a partir de células únicas são uma abordagem conveniente para se elucidar este fenômeno / Epigenetic phenomena as genomic imprinting and X chromosome inactivation (XCI) have been widely studied in mice. While most of the processes and steps involved in XCI in mice are well studied, in humans our knowledge is still very limited, specially during early embryo development. Advances in single-cell whole transcriptome high troughput sequencing techniques (RNA-Seq) bring a new era to the XCI field. Single-cell RNA-Seq results of from 2-cell to the blastocyst stage of human embryos were published by Xue et cols and Yan et cols in 2013. Using bioinformatics techniques we searched for the XIST gene expression level (a gene closely involved in XCI) throughout the human pre-implantation embryo development. We aligned reads generated by RNA-Seq assays to the human reference genome looking for variants in gene transcriptional regions and to identify the origin of the expressed allele. Our results show that XIST expression starts from the 8-cell stage and is stabilized and upregulated at the female blastocyst stage. We also show that the transcriptional silence of X-linked genes started at the blastocyst stage and is independent of parental origin but this does not apply for all genes. We concluded that the completion of the transcriptional silence step is probably established during post-implantation stage. The search for X-linked imprinted genes is challenging due to the XCI phenomenon. Nevertheless, X-imprinted genes were reported in mice. In humans, no X-imprinted genes were found so far, but phenotypic differences reported in Turner\'s syndrome (45,X) women was related to the parental origin of the X chromosome inherited. This suggests the existence of X-linked imprinted genes, in particular MAOA, MAOB and USP9X seemed good candidates. By sequencing transcript regions containing heterozygous SNPs in these genes we could access their expression pattern. Our results show no sign of imprinting regulation of MAOA, MAOB and USP9X, neither in human brain nor in human term placenta. This does not rule out the possibility that the phenotypic differences observed in Turner\'s syndrome women could be the consequence of other unknown X-linked imprinted genes. RNA-Seq of different human female tissues is a powerful approach to finally find the genes involved in such phenotypes