Xanthomonas arboricola pv. pruni is the causal agent of the bacterial spot disease of stone fruits, almond and ornamental species of Prunus. This pathogen constitutes one of the major threats to this group of species due to the economic losses it generates, and it is therefore considered as a quarantine organism in the European Union (EU). Recently, several outbreaks of the disease have been described in EU countries including Spain, where this pathogen has been detected in seven regions. Given the importance of this emerging disease and the lack of information about it, several aspects related to its diagnosis and epidemiology have been addressed in this work. Additionally, taxonomic characterization of three atypical Xanthomonas strains isolated from nectarines, causing similar symptoms to those produced by X. arboricola pv. pruni, have also been performed. First, a prototype of lateral flow immunoassay has been designed for the diagnosis of bacterial spot disease. It was developed by producing two polyclonal antibodies which were then combined with carbon nanoparticles and assembled on nitrocellulose strips. The specificity of the immunoassay was tested, obtaining a positive result with all the strains of X. arboricola pv. pruni analyzed. The limit of detection observed was 104 CFU/ml, which is sufficient for the detection of this pathogen in symptomatic samples. To demonstrate the accuracy and the reliability of the immunoassay, the prototype developed was used in the analysis of naturally infected field samples and healthy samples. Results were compared to those obtained by plate isolation and real time PCR, and a high correlation among techniques was observed. In a second step, as X. arboricola pv. pruni was first detected in Spain in 2002, and in subsequent years several outbreaks have occurred in 11 provinces, it was considered of interest to study the relationships between a collection of 239 Spanish strains of this pathogen originated from nurseries, orchards and interceptions with the technique of the Multilocus Variable Number of Tandem Repeat Analysis (MLVA). This method confirmed its high discriminatory power and the strains were grouped in 18 genetic clusters. The results obtained suggest multiple introductions of X. arboricola pv. pruni in Spain, and the leading role of the nurseries in the introduction and dissemination of this pathogen through the commercialization of contaminated plant propagation material. Finally, three strains isolated from nectarines in Murcia showing similar symptoms to those produced by X. arboricola pv. pruni, were analyzed using both phenotypic and molecular methods. The first results of biochemical tests and PCR were negative for this pathogen. Therefore, these isolates have been subjected to a taxonomic characterization through a polyphasic approach, comparing them with reference strains of other Xanthomonas species. Additionally, inoculations on peach plants demonstrated the pathogenicity of the three strains. The results obtained confirmed that these strains constitute a new species of the genus Xanthomonas, for which the name Xanthomonas prunicola has been proposed, and its main differential characteristics from the other species of this genus have been defined. Overall, the studies collected in this thesis provide a rapid method for on-site diagnosis of the bacterial spot disease, a deeper knowledge of the genetic diversity of the Spanish strains of X. arboricola pv. pruni and the development of a new methodology for its evaluation, as well as the description of a new Xanthomonas species that affects nectarine. / Xanthomonas arboricola pv. pruni es el agente causal de la mancha bacteriana de los frutales de hueso, el almendro y especies ornamentales del género Prunus. Este patógeno constituye una de las mayores amenazas para estas especies debido a las pérdidas económicas que genera, por lo que está considerado como un organismo de cuarentena en la Unión Europea (UE). Se han descrito numerosos brotes en países miembros de la UE en los últimos años y entre ellos en España, donde ha sido detectada la bacteria en siete Comunidades Autónomas. Ante la importancia de esta enfermedad emergente y la carencia de información sobre la misma, en este trabajo se han abordado aspectos relacionados con su diagnóstico y epidemiología que permitirán ampliar nuestro conocimiento sobre ella. Además, también se ha realizado la caracterización taxonómica de tres cepas atípicas de Xanthomonas aisladas de nectarino, que causan síntomas similares a los producidos por X. arboricola pv. pruni. En primer lugar, se ha desarrollado un prototipo de tiras inmunológicas de flujo lateral para el diagnóstico de la mancha bacteriana. Para su diseño, se partió de dos anticuerpos policlonales que se combinaron con nanopartículas de carbono y se ensamblaron en membranas de nitrocelulosa. Se analizó la especificidad de las tiras, obteniendo resultado positivo con todas las cepas de X. arboricola pv. pruni ensayadas. El límite de detección obtenido con las tiras de flujo lateral fue de 104 UFC/ml, que es suficiente para la detección de esta bacteria en muestras sintomáticas. Para comprobar su fiabilidad y precisión, el prototipo desarrollado se utilizó en el análisis de muestras de campo naturalmente infectadas y muestras sanas, y los resultados se compararon con los obtenidos en el aislamiento en medio de cultivo y los de PCR en tiempo real, observándose una elevada correlación entre las tres técnicas. En segundo lugar, como X. arboricola pv. pruni se detectó por primera vez en España en 2002, y desde entonces se han producido brotes de la enfermedad en 11 provincias, se consideró de interés estudiar las relaciones existentes entre una colección de 239 cepas españolas de esta bacteria procedentes de viveros, plantaciones e intercepciones, con la técnica del "Multilocus Variable Number of Tandem Repeat Analysis" (MLVA). Se demostró su gran poder de resolución ya que permitió clasificar las cepas en 18 grupos genéticos. Los resultados obtenidos sugieren que en España se han producido múltiples introducciones de la bacteria, y que los viveros han jugado un papel importante en la introducción y diseminación del patógeno a través de la comercialización de material vegetal contaminado. Por último, se analizaron fenotípica y molecularmente tres cepas aisladas en nectarinos de la provincia de Murcia, que mostraban síntomas similares a los causados por X. arboricola pv. pruni. Los primeros análisis basados en test bioquímicos y PCR resultaron negativos para este patógeno. Por tanto, se ha llevado a cabo la caracterización taxonómica de dichos aislados a través de un estudio polifásico, comparándolos con cepas de referencia de otras especies de Xanthomonas. Además, se realizaron inoculaciones que confirmaron la patogenicidad de las cepas. Los resultados obtenidos han permitido clasificar estas cepas como una nueva especie del género Xanthomonas, para la que se ha propuesto el nombre de Xanthomonas prunicola y para la que se han definido sus características diferenciales de las otras especies de este género. Los trabajos presentados en esta memoria han aportado un nuevo método rápido de diagnóstico in situ de la mancha bacteriana, el desarrollo una nueva metodología para la evaluación de la diversidad genética de una selección de cepas españolas de X. arboricola pv. pruni, así como la descripción de una nueva especie de Xanthomonas que afecta a nectarino. / Xanthomonas arboricola pv. pruni és l'agent causal de la taca bacteriana dels fruiters d'os, l'ametler i espècies ornamentals del gènere Prunus. Aquest patogen constitueix una de les majors amenaces per a aquestes espècies a causa de les pèrdues econòmiques que genera, per la qual cosa està considerat com un organisme de quarantena en la Unió Europea (UE). S'han descrit nombrosos brots en països membres de la UE en els últims anys i entre ells a Espanya, on ha sigut detectat el bacteri en set Comunitats Autònomes. Davant la importància d'aquesta malaltia emergent i la manca d'informació sobre aquest tema, en aquest treball s¿han abordat aspectos relacionats amb el seu diagnòstic i epidemiologia que permetran ampliar el nostre coneixement sobre ella. A més, també s'ha realitzat la caracterització taxonòmica de tres ceps atípics de Xanthomonas aïllats de nectariner, que causen símptomes similars als produïts per X. arboricola pv. pruni. En primer lloc, s'ha desenvolupat un prototip de tires immunològiques de flux lateral per al diagnòstic de la taca bacteriana. Per al seu disseny, es va partir de dos anticossos policlonals que es van combinar amb nanopartícules de carboni i es van assemblar en membranes de nitrocel¿lulosa. Es va analitzar l'especificitat de les tires obtenint resultat positiu amb tots els ceps de X. arboricola pv. pruni assajats. El límit de detecció obtingut amb les tires de flux lateral va ser de 104 UFC/ml, que és suficient per a la detecció d'aquest bacteri en mostres amb símptomes de la malaltia. Per a comprovar la seua fiabilitat i precisió, el prototip desenvolupat es va utilitzar en l'anàlisi de mostres de camp naturalment infectades i mostres sanes, i els resultats es van comparar amb els obtinguts en l'aïllament en medi de cultiu i els de PCR en temps real, observant-se una elevada correlació entre les tres tècniques. En segon lloc, com que X. arboricola pv. pruni es va detectar per primera vegada a Espanya en 2002, i des de llavors s¿han produït brots de la malaltia en 11 províncies, es va considerar d'interès estudiar les relacions existents entre una col¿lecció de 239 ceps espanyols d'aquest bacteri procedents de vivers, plantacions i intercepcions amb la tècnica del "Multilocus Variable Number of Tandem Repeat Analysis" (MLVA). Es va demostrar el seu gran poder de resolució ja que va permetre classificar els ceps en 18 grups genètics. Els resultats obtinguts suggereixen que a Espanya s'han produït múltiples introduccions del bacteri, i que els vivers han jugat un paper important en la introducció i disseminació del patogen a través de material vegetal contaminat. Finalment, es van analitzar fenotípicament i molecularment tres ceps aïllats en nectariners de la província de Múrcia, que mostraven símptomes similars als causats per X. arboricola pv. pruni. Les primeres anàlisis basades en test bioquímics i PCR van resultar negatius per a aquest patogen. Per tant, s'ha dut a terme la caracterització taxonòmica de dits aïllats a través d'un estudi polifàsic, comparant aquests amb ceps de referència d'altres espècies de Xanthomonas. A més, es van realitzar inoculacions que van confirmar la patogenicitat dels ceps. Els resultats obtinguts han permés classificar aquests ceps com una nova espècie del gènere Xanthomonas, per a la qual s'ha proposat el nom de Xanthomonas prunicola, i per a la que s'han definit les seues característiques diferencials de les altres espècies d'aquest génere. Els treballs presentats en aquesta memoria han aportat un nou mètode ràpid de diagnòstic in situ de la taca bacteriana, el desenvolupament d'una nova metodologia per a l'avaluació de la diversitat genètica d'una selecció de ceps espanyols de X. arboricola pv. pruni, així com la descripció d'una nova espècie de Xanthomonas que afecta al nectariner. / López Soriano, P. (2017). Especies de Xanthomonas causantes de enfermedades en frutales de hueso y almendro: diagnóstico, diversidad genética y taxonomía [Tesis doctoral no publicada]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/86200 / TESIS

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Made available in DSpace on 2014-08-20T13:32:51Z (GMT). No. of bitstreams: 1 ficha_de_caroline_borges_biotecnologia.pdf: 7018 bytes, checksum: b335f912cae89a687603fa35c4e44d7d (MD5) Previous issue date: 2007-10-16 / Xanthan yield and physical and chemical characteristics can be improved by modification in culture conditions, as well as, by post-fermentation treatments in order to obtain a xanthan with the required characteristics. The aim of this work was to study the operational conditions in xanthan production by Xanthomonas arborícola pv pruni strains 106 and 115 to be used in oilwell drilling fluids. The influence of thermal treatment applied to the fermentation broth was evaluated in the xanthan produced by strain 106 in a range of pH and stirrer speed. The thermal treatment decreased the yield between 5.8 and 14%, nevertheless, was observed increase of aqueous solution and fermentation broth viscosities. The aggregation of xanthan molecules caused by thermal treatment and determined by increase of molar mass was dependent on the sodium content. As a result, a correlation between molar mass and xanthan solution viscosity can be observed. The fermentation broth sterilization was adopted for experiment in which a pre-selection of production medium in orbital shaker was performed for subsequent pH, production medium and stirrer speed study in fermentor by strains 106 and 115. Xanthan production and viscosity was dependent on the strain of X. arborícola pv pruni and on the operational condition used. The production medium B showed the best balance of yield and viscosity results, in orbital shaker, as well as in fermentor. The best results for both strains were obtained at pH 7, 600 rpm and 66 h of fermentation. The two strains showed potential for xanthan production. In an evaluation study of, physical and chemical characteristics, the xanthan produced by strain 115 was compared to the characteristics of the commercial xanthans, Roeper and Kelzan. The former is for application in food, pharmeceutical products and cosmetics and the latter for application in oilwell drilling fluids. The results were within the literature specified patterns, except by the low piruvate content of xanthan produced by strain 115, low monovalent salt content of Roeper sample and high divalent salt content of both commercial samples. The xanthans produced by X. arborícola pv pruni were evaluated as viscosifying fluid for use in oilwell drilling, in comparison to Duo Vis, Kelzan and Xanvis commercial brands. As a whole, the results obtained in this study show that the commercial polymers are more efficient when used in aqueous solution, since these polymers contain high salt concentrations. Xanthans produced by patovar pruni, Xc 106 600 and Xc 115 600, as having low salt concentration, they show potential for application in oilwell drilling fluid, when a salt solution was used, similar to the conditions of marine exploration. / O rendimento e as características físicas e químicas da xantana podem ser melhorados através das modificações nas condições de cultivo, assim como, por tratamentos empregados após a fermentação, para a obtenção de uma xantana com características desejadas para o fim que se propõe. O trabalho objetivou estudar as condições operacionais de produção de xantana por Xanthomonas arboricola pv pruni cepas 106 e 115 para aplicação em fluidos de perfuração de poços de petróleo. A influência do tratamento térmico aplicado no caldo fermentado foi avaliada na xantana produzida pela cepa 106 em diferentes condições de pH e velocidade de agitação. O tratamento térmico reduziu o rendimento entre 5,8 e 14%, entretanto, foi observado o aumento da viscosidade da solução aquosa e do caldo fermentado. A agregação de moléculas de xantana provocada pelo tratamento térmico, e comprovada pelo aumento da massa molar foi dependente da concentração de sódio. Como resultado pode ser observada relação entre a massa molar e a viscosidade da solução de xantana. A esterilização do caldo fermentado foi adotada para o experimento posterior, em que foi realizada uma pré-seleção de meios de produção, em agitador incubador, para posterior estudo de pH, meio de produção e velocidade de agitação em fermentador pelas cepas 106 e 115. A produção e a viscosidade das xantanas sintetizadas foram dependentes da cepa de X. arboricola pv pruni e das condições operacionais. O meio de produção B apresentou o melhor equilíbrio entre produção e viscosidade, em agitador incubador, assim como no fermentador. Os melhores resultados para ambas as cepas foram obtidos em pH 7, 600 rpm e 66 h de fermentação. As duas cepas apresentaram potencial para serem utilizadas na produção de xantana. No estudo da avaliação das características físicas e químicas, a xantana produzida pela cepa 115 foi comparada as características das xantanas comerciais, Roeper e Kelzan. A primeira, para aplicação em alimentos, produtos farmacêuticos e cosméticos e a segunda, para aplicação em fluido de perfuração de poços de petróleo. Os resultados apresentaram-se dentro dos padrões especificados pela literatura, exceto pelo baixo conteúdo de piruvato da xantana produzida pela cepa 115, baixo conteúdo de sais monovalentes da amostra Roeper e alto conteúdo de sais divalentes das duas amostras comerciais. As xantanas produzidas por X. arboricola pv pruni foram avaliadas como viscosificante de fluido para aplicação na perfuração de poços de petróleo, comparando-as com amostras comerciais: Duo Vis, Kelzan e Xanvis. De uma forma geral, os resultados obtidos neste estudo mostram que os polímeros comerciais apresentaram maior eficiência quando preparados em solução aquosa, pois estes polímeros continham alta concentração de sais. Já as xantanas produzidas pelo patovar pruni, Xc 106 600 e Xc 115 600, por apresentarem baixa concentração de sais, apresentaram potencial para aplicação em fluido de perfuração de poços de petróleo, quando preparados em solução salina, condição semelhante a utilizada na exploração marítima.